Эффективность очищающего отбора в геномах митохондрий и протеобактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.28, кандидат биологических наук Мамирова, Лейла Абдумажетовна

• Мамирова, Лейла Абдумажетовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эффективность очищающего отбора в геномах митохондрий и протеобактерий»

В геноме каждой клетки каждого организма постоянно возникают новые мутации. Мутации, появившиеся в клетках соматических тканей важны лишь для отдельно взятой особи, несущей их, поскольку погибают вместе с ней. Мутации же, появившиеся в линиях половых клеток, имеют небольшие шансы передаться следующему поколению, и далее, имеют мизерные шансы зафиксироваться во всей популяции, внеся свой вклад в межпопуляционную дивергенцию. Только такие мутации могут влиять на эволюцию, и только такие мутации мы можем изучать при сравнительно-видовом подходе.

Подавляющее большинство новых мутаций, возникающих в линии половых клеток, либо не влияет на приспособленность вообще (абсолютно нейтральные мутации) либо уменьшает приспособленность будущего организма (вредные и слабовредные мутации). Нейтральные мутации, по определению, никак не влияют на приспособленность организма и поэтому фиксируются случайным образом со скоростью, пропорциональной темпу мутирования(Кимура 1985). Вредные же мутации, сильно понижая приспособленность организма, удаляются из популяции, не оставляя никакого следа в эволюции. Нас будет интересовать промежуточный класс мутаций: слабовредные мутации, которые, незначительно уменьшая приспособленность организма, всё ещё имеют шансы зафиксироваться в популяции в результате случайного генетического дрейфа или эффекта бутылочного горлышка, внося свой вклад в межвидовую дивергенцию и влияя на приспособленность организмов.

Вероятность мутирования одного нуклеотида в ядерном геноме человека на поколение равна 2.5* 10'8 (Kondrashov 2001). Поскольку в геноме человека содержится около 3x109 нуклеотидов, то на диплоидный геном, на поколение, получается 2.5х Ю-8х2хЗхЮ9 = 150 новых мутаций. Около 2% новообразовавшихся мутаций попадает в ненейтральные области генома, а это значит, что у человека на геном на поколение появляются 1-3 новые слабовредные мутации (U - темп появления новых слабовредных мутаций на геном на поколение).

Таким высоким темпом мутирвоания обладает не только человек но и все человекообразные обезьяны, характеризующиеся длинными поколениями (Keightley and Caballero 1997). В этих видах ядерная ДНК в клетках зародышевой линии половых клеток (особенно в линии самцов: от сперматогония до сперматозоида) успевает реплицироваться сотни раз, приводя к появлению нескольких новых слабовредных мутаций на геном на поколение. Причём чем выше возраст отца, тем выше вероятность некоторых доминантных наследственных болезней, обусловленных мутациями в ДНК сперматозоида (Crow 1993).

Что же происходит с новыми мутациями? При мутационно-селективном равновесии каждая новая слабовредная мутация рано или поздно должна быть удалена или скомпенсирована другой мутацией. Доля потомков, удаляемая из популяции из-за новых слабовредных и вредных мутаций, называется мутационным грузом, и этот груз увеличивается с увеличением темпа мутирования. В связи с высоким темпом мутирования человекообразных обезьян встаёт проблема высокого мутационного груза. Если мутации взаимодействуют друг с другом аддитивно (то есть их эффекты складываются независимо) то для элиминации новых мутаций необходимо элиминировать все организмы хотя бы с одной мутацией. Полагая, что мутации распределены по закону Пуассона, получается, что только ЕХР(~и) организмов не будут иметь новых мутаций вообще (если темп мутирования равен двум новым вредным мутациям на геном на поколение, то доля организмов без вредных мутаций составит 0.135). При этом мутационный груз будет составлять 1 — 0.135, то есть 0.865 доля потомства, соответствующая организмам, имеющим по крайней мере одну новую мутацию, должна быть элиминирована каждое поколение для поддержания неизменного мутационно-селективного равновесия. Получается что для поддержании постоянной численности популяции (2 потомка доживших до половой зрелости на 2-ух родителей) необходимо производить как минимум 13 потомков, чтобы 2 из них оказались без мутаций и выжили. Реальная ли это цифра? Конечно, редко в каких случаях у человека или человекообразных обезьян рождается большое число детей, и до половой зрелости доживает в среднем намного большая доля потомства, чем 0.135. Когда же тогда и где элиминируются эти новые вредные мутации? Возможны два ответа.

1) Необходимо вспомнить об отборе на уровне оогенеза и сперматогенеза, который потенциально может быть очень cnjibHbiM(Stewart, Freyer et al. 2008; Stewart, Freyer et al. 2008). Видимо, он и играет ключевую роль в очищении популяции от вредных мутаций.

2) В качестве другого решения проблемы высокого мутационного груза у эукариот с большой продолжительностью жизни обсуждается возможность эпистатического взаимодействия мутаций (когда эффект двух мутаций больше чем прямая сумма эффектов двух мутаций) в рекомбинирующих геномах.

Эпистатическое взаимодействие мутаций на фоне рекомбинации позволяет элиминировать мутации группами, а не поодиночке (Kimura and Maruyama 1966), уменьшая, таким образом, мутационный груз (долю особей элиминируемых из-за слабовредных и вредных мутаций) на фоне постоянного высокого темпа мутирования (Kondrashov 1982) (Kondrashov 1988). Механизм этого процесса следующий: рекомбинация, случайно перемешивает мутации и дают на выходе распределение организмов с большим и меньшим числом вредных мутаций, чем до рекомбинации. То есть рекомбинация способна увеличить дисперсию числа вредных мутаций, что даёт две возможности: 1) отсекающий отбор может элиминировать только правый "хвост" распределения - организмы, содержащие много вредных мутаций - и, таким образом, обеспечить поддержание мутационно-селективного равновесия малым числом жертв; 2) в результате рекомбинации могут получиться организмы, содержащие меньшее число вредных мутаций, чем родители, - это защищает рекомбинирующие геномы от необратимого накопления вредных мутаций, которое наблюдается у некоторых бесполых организмов.

Поддержание мутационно-селективного равновесия является допущением большинства эволюционных моделей, и такое допущение, видимо, вполне разумно в долгосрочной перспективе. Однако в каждый конкретный момент времени определённый вид может либо накапливать мутации, либо, наоборот, удалять их быстрее, чем они появляются. Если отбор недостаточно эффективен, чтобы удалять все новые слабовредные мутации, данный вид будет накапливать слабовредные мутации, понижая свою общую приспособленность (число потомков, доживших до половой зрелости). Поскольку в природе преобладает мягкий отбор, при котором важна не абсолютная приспособленность организма, а относительная (не важно, что жертва бегает медленнее хищника — важно, что она бегает быстрее другой жертвы), постепенное накопление вредных мутаций и постепенное падение общей приспособленности всего вида может быть не очень заметно. Однако в тот момент, когда среднее число потомков от пары организмов, доживших до половой зрелости, опустится ниже двух, и данная популяция будет не способна к дальнейшему поддержанию своей численности на прежнем уровне, начнётся процесс мутационного плавления (mutational meltdown), ведущего к вымиранию вида (Lynch, Burger et al. 1993).

Мутационное плавление происходит в результате существования положительной обратной связи между уменьшением численности популяции и увеличением темпа накопления слабовредных мутаций - если от каждой пары организмов до состояния половой зрелости доживает менее двух потомков, то численность популяции начинает падать, что автоматически увеличивает силу генетического дрейфа, в результате которого фиксируется большая доля слабовредных мутаций. После накопления дополнительных слабовредных мутаций, приспособленность организмов падает ещё сильнее, и количество потомков, доживших до половой зрелости, уменьшается ещё быстрее, приводя к дальнейшему падению численности и увеличению силы генетического дрейфа и т.д. Такой процесс должен приводить к вымиранию вида. Однако ещё никто не наблюдал процесс вымирания видов из-за мутационного плавления, и пока это лишь математическая абстракция (Lynch, Burger et al. 1993).

Митохондриальный геном, который выбран основным объектом данной работы, является очень интересным и важным с точки зрения отбора против слабовредных мутаций из-за существования трёх принципиальных отличий от ядерного генома. Во-первых, в митохондриальном геноме из-за отсутствия генетической рекомбинации между геномами, произошедшими от разных родителей, невозможно перераспределение вредных мутаций и, таким образом, мутационный груз не может быть уменьшен за счёт удаления сразу нескольких мутаций с одной элиминированной особью. Другими словами, в митохондриальном геноме правило Мёллера «одна мутация — одна генетическая смерть» является неоспоримой истиной. Во-вторых, митохондриальный геном наследуется только по материнской линии, поэтому его гены имеют низкую эффективную численность (такую же, как У хромосома), в связи с чем они сильнее подвержены накоплению слабовредных мутаций в результате генетического дрейфа. В-третьих, из-за агрессивной внутренней среды (активные формы кислорода) и большого числа раундов репликации митохондриального генома темп мутирования митохондриальной ДНК (мтДНК) на нуклеотид на поколение увеличен примерно на три порядка и составляет около 1.5x10"5. На поколение на митохондриальный геном мы получаем около 1.5х10*5х16500 = 0.25 мутаций. Хотя точных цифр пока не известно (более детальное оценивание темпа мутирования митохондриального генома см. в разделе 2.2), но примерно можно говорить о том, что на митохондриальный геном на поколение образуется около 1-0.1 новой слабовредной мутации — значения, хотя и меньшие чем для ядерного генома, но всё же сопоставимые, особенно учитывая необходимость удаления каждой мутации в одиночку, а не группами, как возможно происходит в случае с ядром. Дальнейшая судьба каждой новой мутации зависит от множества факторов: (¡) она может быть удалена из популяции митохондриальных геномов внутри данной яйцеклетки, так и не достигнув фиксации (100% частоты), (и) она может быть удалена вместе с самой яйцеклеткой до оплодотворения, например в результате апоптоза яйцеклетки, или же (ш) потомок данной яйцеклетки может оказаться неплодовитым или слабо приспособленным, или он может оказаться самцом, или же (IV) данный митохондриальный тип так и не достигнет фиксации во всей популяции рассматриваемых организмов. С другой стороны, возможно, что все эти четыре этапа пройдут успешно, и тогда уже данную мутацию будет невозможно удалить из митохондриального генома (если не брать в расчет обратные и компенсаторные замены).

Итак, митохондриальный геном должен быть подвержен наиболее интенсивному накоплению слабовредных мутаций из-за высокого темпа мутирования, низкой эффективной численности популяции из-за материнского наследования, невозможности эффективного удаления вредных мутаций из-за отсутствия гомологичной рекомбинации. Все эти причины могут приводить к очень высокому мутационному грузу и возможно даже к деградации всего генома. С точки зрения популяционной генетики ожидается, что именно митохондриальный геном (а также нерекомбинирующий участок У-хромосомы) может быть наиболее критичным местом, определяющим приспособленность организма и предрасположенным к накоплению вредных мутаций (СоЛоравэ! 2002). В связи с этим было опубликовано несколько работ, в которых Майкл Линч с коллегами оценивал эффективность удаления слабовредных мутаций из митохондриального генома по сравнению с ядерным (Lynch, Burger et al. 1993; Lynch 1996; Lynch 1997; Lynch and Blanchard 1998). Результат этих исследований подтвердил потенциальную роль митохондрий в падении приспособленности организмов и в последующем вымирании видов (Lynch 1996) (Lynch 1997). В данной работе мы решили проанализировать адекватность выводов, сделанных Линчем, и изучили эффективность отбора, действующего в митохондриальном геноме на большем объеме данных, сравнив силу очищающего отбора не между случайным набором генов из ядра и митохондрий, а между ортологичными генами, выполняющими одни и те же функции.

Таким образом, целью данной работы стала оценка эффективности очищающего отбора в белок-кодирующих генах митохондрий млекопитающих и их протеобактериальных ортологов, характеризующихся разной эффективной численностью и частотой рекомбинации.

Перед собой мы поставили следующие задачи:

1. Оценить силу очищающего отбора у млекопитающих с различной популяционной численностью (глава 3);

2. Оценить силу очищающего отбора у протеобактерий с различным образом жизни (облигатные паразиты, эндосимбионты, свободноживущие) (глава 4);

3. Сравнить силу очищающего отбора в митохондриях млекопитающих и их протеобактериальных ортологах (глава 4);

2.1 ПРОИСХОЖДЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ МИТОХОНДРИЙ

Когда-то древние свободноживущие бактерии вступили в симбиоз со свободноживущей линией архебактерий, начав процесс слияния генетического материала, который привел к наиболее успешному мутуалисту на планете: эукариотической клетке. Впоследствии митохондрии утеряли большую часть своего генома, возложив его репликацию на клетку хозяина. Всё, что осталось в митохондриальном геноме плацентарных млекопитающих, это 13 генов, кодирующих критические компоненты дыхательной цепи, 22 тРНК и 2 рРНК. В настоящий момент выдвинуто несколько гипотез, которые пытаются объяснить, почему набор из 13 генов остался зависимым от белок-кодирующей машины митохондрий, и почему эти 13 генов не мигрировали в ядерный геном, как остальные митохондриальные гены. Наследование по материнской линии привело к прекращению рекомбинации и обмена генетическим материалом.

Поскольку митохондрии обеспечивают очень важный процесс в клетке — клеточное дыхание — предполагалось, что гены, кодирующиеся в митохондриях, должны иметь очень низкую скорость молекулярной эволюции. Поэтому высокая скорость молекулярной эволюции митохондриального генома, показанная 30 лет назад, оказалась большой неожиданностью (Brown, George et al. 1979). Сложно объяснить, как гены, несущие крайне важную функцию, не обладая при этом преимуществами рекомбинации, могли выдерживать последствия высокого мутационного давления и подвергаться нуклеотидным замещениям между видами. Теоретически, митохондрии должны были накапливать мутации через случайные потери наименее мутированных геномов, через процесс, называемый «храповик Мёллера» (Lynch 1996) (Lynch, Koskella et al. 2006). Непонятно, как митохондриям удалось избежать (и удалось ли им избежать) мутационного плавления или, по крайней мере, значительного падения приспособленности.

Как правило, эти вопросы не волновали тех исследователей, которые использовали быстро эволюционирующие, нерекомбинирующие, наследуемые по материнской линии и легко секвенируемые митохондриальные гомологичные гены, как прекрасный объект при изучении эволюционной истории популяций и близкородственных видов (Avise 1986). Действительно, до сих пор митохондриальная ДНК лидирует в эволюционных анализах. Например, митохондриальная ДНК сыграла критическую роль в выяснении эволюционной истории разнообразных организмов. В частности, на митохондриальной ДНК было продемонстрировано происхождение человека из Африки (Ingman, Kaessmann et al. 2000) (Pakendorf and Stoneking 2005). Высокая скорость эволюции митохондриальной ДНК может навести на мысль, что большая часть мутаций в митохондриальной ДНК нейтральна и не подвержена действию естественного отбора. Но в последнее время существует большой интерес к тому, как митохондрии могли выдерживать высокое эволюционное давление и критический анализ данных свидетельствует о том, что естественный отбор мог сильно повлиять на эволюцию митохондриального генома (Wallace 2007) (Nabholz, Giemin et al. 2008). Сейчас очевидно, что многие митохондриальные мутации являются причинами генетических заболеваний (Wallace 2005) (Taylor and Turnbull 2005). Популяционный и эволюционный анализ показал, что большая часть вариабельности в митохондриальной ДНК не связана с моделью нейтральной эволюции. На данный момент остается открытым вопрос об относительном вкладе случайного дрейфа генов, положительного дарвиновского отбора и очищающего отбора в эволюцию митохондриальной ДНК (Bazin, Glemin et al. 2006) (Meiklejohn, Montooth et al. 2007).

Высокая скорость эволюции нуклеотидной последовательности может быть следствием высокой скорости мутирования и/или низких функциональных ограничений. Оценка скорости мутирования из межвидовой дивергенции или даже внутривидовой вариабельности может быть затруднена, поскольку необходимо сделать предположение о нейтральности мутаций. Когда мутации абсолютно нейтральны, они не имеют никакого влияния на выживаемость или репродукцию организма, и закрепляются в популяции случайно. Поскольку большая часть мутаций вредна и удаляется отбором, то всегда мутаций происходит больше, чем мы можем увидеть полиморфизмов внутри популяции. Мутации, которые поступают в популяцию через отдельных индивидуумов, достаточно приспособленных, чтобы оставить потомство, должны оставаться в популяции в течение многих поколений до того, как они зафиксируются в ней.

В популяции ограниченного размера слабовредные аллели могут оставаться и даже закрепиться в результате случайного дрейфа генов. Равным образом, больше мутаций будет наблюдаться в виде полиморфизмов внутри вида, чем в виде зафиксированных замещений между видами. Если мутации в основном вредные, то их число будет превышать полиморфизмы внутри вида, а последнее — превышать замещения между видами. Если мутации в основном положительные, то уровни полиморфизма или дивергенции могут быть выше, чем для вредных мутаций, на величину, которая зависит от популяционно-генетических факторов (сила отбора, размер популяции, скорость рекомбинации и т.д.) Таким образом, скорость мутирования можно оценить из уровней полиморфизма внутри или замещений между видами только в случае нейтральных мутаций. Но как мы можем определить, какие мутации нейтральны? И как мы можем оценить эволюционное время, если скорость мутирования отличается от скорости замещения? Вопрос аккуратности эволюционного вывода встает во многих проблемах эволюционной генетики (Nabholz, Glemin et al. 2008) (Ho, Phillips et al. 2005).

Существует два простых решения для данной проблемы: использовать ДНК -тесты нейтральности, которые сравнивают характер полиморфизма и фиксации в нуклеотидных сайтах с разными функциональными ограничениями (тест МакДональда-Крейтмана или МК тест несинонимичных против синонимичных замещений в белок-кодирующем регионе) (McDonald and Kreitman 1991), или рассматривать мутации в родословных или в линиях, накапливающих мутации, в которых отбор был ослаблен или отсутствовал. В случае митохондриальной ДНК оба подхода продемонстрировали отбор против слабовредных мутаций. В митохондриальных белок-кодирующих генах отношение несинонимичных к синонимичным полиморфизмам внутри видов выше, чем это отношение для замен между видами, что соответствует частичному удалению слабовредных полиморфизмов (Nachman 1998) (Rand and Капп 1998). В работах с родословными скорость мутирования оценивалась частотой появления новых митохондриальных ДНК-вариантов в выборке потомков, произошедших от одной матери-основательницы. Такие анализы показывали, что «родословная скорость» мутирования превышает оцененную «филогенетическую скорость» мутирования на десятичный порядок (Parsons, Muniec et al. 1997) (Howell, Smejkal et al. 2003). Поскольку филогенетическая скорость мутирования оценивается сравнением замещений между видами, она говорит о числе замещений, но не о скорости мутирования. Вместе эти данные подразумевают, что мутации, появившиеся в родословной, удаляются очищающим отбором до того, как они становятся зафиксированными внутри вида.

Некоторые исследования комбинировали оба подхода, анализируя митохондриальные геномы из совокупности линий, аккумулирующих мутации (Denver, Morris et al. 2000), или из линий с разными размерами популяций (Paland and Lynch 2006). У нематоды Caenorhabditis elegans отношение Dn/Ds между линиями, аккумулирующими мутации, превышало Dn/Ds, наблюдаемое между дикими линиями, что свидетельствует об ослаблении очищающего отбора в линиях, аккумулирующих мутации (Denver, Morris et al. 2000). У рачков Daphnia виды, имеющие половое размножение, с большой эффективной численностью популяции, демонстрировали более низкое значение Dn/Ds в митохондриальной ДНК, чем бесполые виды с меньшей эффективной численностью популяций, что свидетельствует о действии очищающего отбора на митохондриальный геном дафний (Paland and Lynch 2006) (Barraclough, Fontaneto et al. 2007). Подобный эффект наблюдался и в нашей работе, где Dn/Ds в митохондриальном геноме мелких млекопитающих, с высокой эффективной численностью популяций, оказался ниже, чем Dn/Ds крупных млекопитающих, обладающих более низкой эффективной численностью популяций (Popadin, Polishchuk et al. 2007).

Как же нерекомбинирующие митохондриальные геномы могут противостоять высокому темпу мутирования? Накопление вредных мутаций может замедлять эффект бутылочного горлышка. Феномен бутылочного горлышка позволяет на уровне индивидуума экспонировать отбору новопоявившиеся варианты митохондриальной ДНК за быстрые эволюционные сроки и, таким образом, может защищать популяцию от мутационного плавления. В одном ооците млекопитающих содержатся около 100 ООО молекул митохондриальной ДНК, и эти молекулы не подвергаются репликации в течение ранних этапов эмбриогенеза. Поэтому эти молекулы митохондриальной ДНК, унаследованные от матери, случайно распределяются во время клеточного деления, и, в результате, образуется зародышевая линия стволовых клеток, имеющих неодинаковый набор из -950-1550 молекул митохондриальной ДНК. Репликация митохондриальной ДНК возобновляется после миграции зародышевых клеток и их дифференциации в ооциты, передающие митохондриальную ДНК следующим поколениям. Эффект бутылочного горлышка митохондриальной ДНК приводит к репликации незначительной фракции молекул митохондриальной ДНК в каждом отдельно взятом ооците.

Также очень важно учитывать и ранние этапы мутационного процесса. Новые мутации в митохондриальной ДНК приводят к гетероплазмии или к смешанной популяции митохондриальной ДНК внутри клетки. Поскольку новые мутации вложены в иерархию популяции (множество митохондриальных ДНК внутри каждой митохондрии, множество митохондрий внутри каждой клетки, множество ооцитов в женской особи, которая может дать потомство, и, наконец, различное число плодовитых особей женского пола в естественной популяции), мутации и отбор близко связаны. На любой стадии передачи через такую иерархию популяций бутылочные горлышки или генетический дрейф генерируют вариации среди более низких единиц внутри более высокой единицы (митохондрии внутри клетки или ооциты внутри особи), что обеспечивает исходный материал для действия естественного отбора. Аккумуляция мутаций в зародышевой линии митохондрий в результате бутылочного горлышка позволяет удалять вредные мутации более эффективно, чем в условиях клональной передачи нерекомбинирующей митохондриальной ДНК (Bergstrom and Pritchard 1998). Это позволяет замедлить храповик Мёллера - необратимое накопление слабовредных мутаций в нерекомбинирующих геномах (Muller 1964) (Felsenstein 1974). Чтобы наглядно представить, как отбор удаляет новые митохондриальные мутации, необходимо понять характер мутаций, полиморфизмов и фиксации в единицах этой иерархии.

В работе Стюарта и соавторов (Stewart, Freyer et al. 2008) проанализировали, как естественный отбор удаляет мутации из материнских линий мышей. Эти данные очень наглядно демонстрируют естественный отбор в действии. Работа была сделана на модельной линии мышей, мутантных по активности исправления ошибок митохондриальной гамма-ДНК-полимеразы (Trifünovic, Hansson et al. 2005) (Trifunovic, Wredenberg et al. 2004). Эти мыши имеют повышенную скорость мутирования митохондриальной ДНК, ускоренное старение и фенотипы, ассоциированные с митохондриальными болезнями. Мышей, гомозиготных по данной мутации, скрещивали со стандартной лабораторной линией мышей для получения дикого гомозиготного типа F2 с нормальной функцией митохондриальной ДНК-полимеразы. Поскольку поколение F2 произошло от гомозиготной мутантной матери, они несут смешанную популяцию мутантных митохондриальных ДНК в стволовых клетках и соматических тканях.

В работе полностью отсеквенировали митохондриальные геномы из 190 мышей в поколениях F2-F6. Большая часть мутаций наблюдалась в третьей позиции кодонов белок-кодирующих генов, что соответствует отбору, направленному против замещений, ведущих к замене аминокислоты (эти замещения чаще встречаются по первому и второму положениям). В целом, в работе был продемонстрирован очень быстрый и эффективный очищающий отбор, действующий на митохондриальную ДНК в зародышевой линии ооцитов.

2.2. ТЕМП МУТИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА

Темп мутирования митохондриального генома заслуживает специального обсуждения. Однако уже в самом определении темпа мутирования как скорости появления новых мутаций на нуклеотид на поколение кроется две проблемы: (i) гетероплазмия и (и) неравномерный темп мутирования вдоль генома. i) С яйцеклеткой передаётся несколько сотен тысяч митохондриальных геномов, и, хотя подавляющее большинство этих геномов идентичны, всё же существует около 20 разных типов геномов с точечными мутациями. Таким образом, новая мутация может наследоваться лишь частично - например, в 30% от всех митохондриальных геномов и, более того, такая гетероплазмия может передаваться из поколения в поколение, до тех пор, пока не фиксируется или не исчезнет. (И) Вторая проблема связана с неравномерным темпом мутирования вдоль митохондриального генома (Faith and Pollock 2003; Krishnan, Seligmann et al. 2004; Raina, Faith et al. 2005). Известно, что репликация митохондриального генома идёт ассиметрично. Начинаясь с точки начала репликации тяжёлой цепи, репликационная вилка движется только по одной, по родительской лёгкой цепи с образованием новой тяжёлой цепи, оставляя родительскую тяжёлую цепь в одноцепочечном состоянии. Родительская тяжёлая цепь становится двуцепочечной только тогда, когда репликационная вилка достигает точки начала репликации лёгкой цепи и вторая молекула гамма-полимеразы начинает синтез новой лёгкой цепи на матрице родительской тяжёлой. Таким образом, ДНК родительской тяжёлой цепи проводит существенное время (2/3 от одного часа, в течение которого происходит репликация ДНК) в одноцепочечном состоянии, что увеличивает темп мутирования (в основном темп транзиций: A—»G и С—>Т) родительской тяжелой цепи. Таким образом, на генах родительской тяжёлой цепи существует градиент времени пребывания в одноцепочечном состоянии - гены, близко расположенные к Он (точке начала репликации тяжёлой цепи) проводят максимальное время в одноцепочечном состоянии, тогда как гены, расположенные близко к Ol (точке начала репликации лёгкой цепи) проводят минимальное время в одноцепочечном состоянии. Так, например, ген CYTB, проводящий максимальное время на родительской тяжёлой цепи в одноцепочечном состоянии, имеет вероятность транзиции С—>Т в два раза большую по сравнению с геном СОХ1, проводящим минимальное время на одноцепочечной родительской тяжёлой цепи. iii) Помимо описанного выше плавного градиента в темпе мутирования существуют и локальные горячие точки мутирования, такие как однонуклеотидные повторы и прямые повторы, которые приводят к образованию делеций. iv~) Высокий соматический темп мутирования приводит к мозаицизму - накоплению разных мутаций в разных тканях, что также осложняет оценку темпа мутирования в клетках зародышевой линии. Считается, что почти во всех тканях человека в течение жизни происходит клональная экспансия мутаций, изначально появившихся лишь в одной копии митохондриального генома, и далее увеличивающих свою частоту. При этом разные ткани обладают своим спектром мутаций - постмитотические ткани (нервы, скелетная мускулатуры) преимущественно накапливают делеции, а пролиферирующие ткани накапливают точечные мутации. Интересно, что появившаяся внутри соматической клетки вредная мутантная мтДНК имеет высокие шансы для фиксации внутри клетки, нарушая допущение о том, что она должна быть подвержена случайному дрейфу или даже подвергаться элиминации в результате действия очищающего отбора. Такое поведение мутантных митохондриальных геномов можно объяснить несколькими причинами. Во-первых, сильного очищающего отбора мы не должны увидеть до тех пор, пока частота мутантной ДНК не достигла фенотипически важного порога (например 60%)', поскольку до этого момента эффект вредной мутации компенсируется митохондриальными геномами дикого типа). Во-вторых, почти все вредные мутации митохондриального генома приводят к ухудшению работы дыхательной цепи, в результате чего падает активность переноса электронов, уменьшается протонный градиент и, соответственно, падает синтез АТФ. Вместе с этим уменьшается производство побочного продукта работы дыхательной цепи - активных форм кислорода (АФК), благодаря чему данная клетка (митохондрия) не подвергается апоптозу (митоптозу), а продолжает существовать внутри организма. Таким образом, если элиминация дефектных митохондрий основана на детекции высокого производства АФК, а не на низком производстве АТФ, большинство митохондриальных мутаций

1 однако недавно появились данные о существовании доминантных митохондриальных мутациий, вредный эффект которых проявляется сразу же вне зависимости от их концентрации (Khrapko, К. and J. Vijg (2009). "Mitochondrial DNA mutations and aging: devils in the détails?" Trends Genet 25(2): 91-8.) Считается, что эти мутации, имитируют сигнал апоптоза. увеличивают свою частоту внутри митохондрии и клетки в течение жизни (Nekhaeva, Bodyak et al. 2002). В-третьих, митохондриальные геномы с крупными делециями получают прямой выигрыш в скорости репликации и потому легко и быстро фиксируются в медленно делящихся клетках. Соматический темп мутирования хорошо изучен на нескольких видах тканей, однако, поведение мутантных митохондриальных геномов в клетках зародышевой линии самок изучено хуже, поскольку здесь ситуацию осложняет узкое бутылочное горлышко (возможно, селективное), через которое проходят все мтДНК, а также последующая активная репликация мтДНК до числа нескольких сотен тысяч. Однако, есть сведения о том, что с возрастом женщины в митохондриальных геномах яйцеклетки накапливаются как точечные мутации, так и делеции (Reynier, Chretien et ai. 1998; Barritt, Brenner et al. 1999; Barritt, Brenner et al. 2000; Hsieh, Tsai et al. 2002; Au, Lin et al. 2005) (Chen, Prosser et al. 1995; Keefe, Niven-Fairchild et al. 1995; Jansen and de Boer 1998; Schon, Kim et al. 2000; Cummins 2001; Jansen and Burton 2004).

Существует два подхода к оцениванию темпа мутирования — филогенетический и родословный. При филогенетическом подходе некоторые слабовредные мутации могут быть элиминированы в результате эволюции, что приводит к заниженным оценкам темпа мутирования. Действительно, первая работа, анализирующая темп накопления мутаций в контрольном регионе митохондриального генома на родословной человека показала в 10 раз большую оценку темпа мутирования (Howell, Kubacka et al. 1996), чем было принято в филогенетических работах. Ховелл с соавторами дали оценку темпа мутирования как 1.9 мутаций на сайт на миллион лет. Полагая, что средний возраст поколения равен 25 лет, мы получаем [1000000 лет / 25 лет = 40000 поколений; 1.9 /

40000 = 0,0000475 мутаций на поколение на сайт; 0,0000475x16500 = 0,78375 мутаций на поколение на геном] 0.78 мутаций на митохондриальный геном на поколение. Другие исследования (Santos, Montiel et al. 2005) получали в 10 раз меньшие величины (0.24 новых мутаций на сайт на миллион лет, что соответствует 0.1 новой мутации на геном на поколение). Недавно, изучая темп мутирования mtDNA на примере 10 патогенных мутаций, Эллиотт с соавторами (Elliott, Samuels et al. 2008) обнаружила по крайней мере 0.001 de novo мутаций (по крайней мере 3 из 3168 образцов крови из пуповины новорождённых). В крови матерей эти мутации отсутствовали, а в клетках крови пуповины они присутствовали по крайней мере в состоянии гетероплазмии > 10% (точность метода). Если мы предположим, что выбранные 10 точечных мутаций случайны и представляют собой усреднённый темп мутирования всего митохондриального генома, то темп мутирования на нуклеотид на поколение равен 0.001/10 = 0.0001. Далее эту цифру мы умножаем на длину митохондриального генома (16500) и получаем 1.65 новых мутаций на геном на поколение. Это значение оказалось выше остальных оценок, полученных другими подходами, возможно, потому, что выбранные мутации не являются случайными, а взяты из базы данных, характеризующей частые мутации человека. Более того, эти мутации выявлены в состоянии низкой частоты гетероплазмии, что было раньше не исследовано. Возможно, в популяционной динамике митохондриальной мутации внутри клетки наблюдается картина, аналогичная распределению вредных мутаций в популяции - вредные мутации сегрегируют на очень низкой частоте, и, чем более нейтральна мутация, тем выше может быть её частота в популяции. Таким образом, изучение гетероплазмии может показать более высокий темп мутирования, который, однако, не проявляется в фенотипе и эволюции, поскольку не достигает высокого процента гетероплазмии и не может фиксироваться. Выводя из трёх упомянутых работ что-то среднее, можно сказать, что темп появления новых слабовредных мутаций митохондриального генома человека лежит в пределах от 1 до 0.1 новых мутаций на геном на поколение.

3. НАКОПЛЕНИЕ СЛАБОВРЕДНЫХ МУТАЦИЙ В МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ БЕ ЛОК-КОДИРУЮЩИХ ГЕНАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Естественный отбор более эффективен в больших популяциях. В популяции с эффективной численностью Ne мутации с коэффициентом отбора s таким, что |s| < 1/Ne, являются эффективно-нейтральными, и их динамика, большей частью, определяется случайным дрейфом (Wright 1931) (Kimura 1979). Эффективно-нейтральные мутации, как слабовредные, так и слабополезные, играют важную роль в эволюции на молекулярном уровне (Ohta 1995; Ohta and Gillespie 1996; Ohta 1998; Ohta 2003). Учитывая, что распределение коэффициентов отбора не зависит от эффективной численности популяции (Ne), фракция эффективно-нейтральных мутаций должна быть выше в популяциях с более низкой Ne. В эволюции большая часть новых мутаций слабовредные (распределение коэффициентов отбора мутаций смещено влево относительно нуля). В популяциях с низкой Ne достичь фиксации может большая доля мутаций, чем в популяции с высокой Ne (Рис. 1).

1.'(Ыг N0)

Рис. 1. Функция плотности вероятности /(ф для коэффициента отбора 5 для новой мутации. Предполагается, что распределение коэффициентов отбора одинаково для популяций с низкой и высокой популяционными численностями Ые. Согласно эффективно-нейтральной теории эволюции, мутации в окрашенных зонах (здесь и далее эффективно-нейтральная зона определяется как |$| < должны находиться под влиянием случайного генетического дрейфа: темно-серая зона - это эффективно-нейтральная зона для популяции с высокой светло-серая зона - это эффективно-нейтральная зона для популяции с низкой Ые. Можно видеть, что: (1) фракция эффективно-нейтральных мутаций и, следовательно, скорость молекулярной эволюции

HowNe \lhighNe выше для популяции С НИЗКОЙ Ые\ |/> |/(я)с15 ,

-\llowNc -\lhghNe

2) если эффект положительного отбора пренебрежимо мал, мутации, которые зафиксировались в популяции с низкой в среднем более вредные, чем мутации, которые зафиксировались в популяции с высокой Ме : < .

Существует несколько способов оценить эффективность очищающего отбора, действующего на белок-кодирующие гены:

1). Очищающий отбор намного сильнее действует на несинонимичные замещения (с аминокислотным замещением), чем на синонимичные (молчащие) (Bachtrog 2005) (Paland and Lynch 2006) (Mamirova, Popadin et al. 2007). Действительно, когда отношение темпа фиксации несинонимичных замещений к темпу фиксации синонимичных Ka/Ks меньше единицы, это говорит о действии очищающего отбора на несинонимичные замещения и отражает его силу: чем ближе Ka/Ks к единице, тем слабее очищающий отбор.

2). Другой параметр силы очищающего отбора - это отношение темпа фиксации радикальных (более вредных) аминокислотных замещений к темпу фиксации консервативных (менее вредных) (Рис. 2) (Zhang 2000) (Eyre-Walker, Keightley et al. 2002).

Рис. 2. Пример деления аминокислот на 2 группы по полярности. Аминокислотные замещения между группами (красная стрелка) расцениваются как радикальные, внутри групп (зеленые стрелки) - как консервативные.

Агд Lys Asp Glu

His

Cys

Туг

Gly

Ser

Thr

Asn ^ Gin

3). Более того, поскольку виды с более низкой Nc подвержены более слабому очищающему отбору, ожидается, что они будут накапливать более вредные мутации и, соответственно, будут демонстрировать более сильное аминокислотное различие с их последним восстановленным предком. Мерилом аминокислотного различия служит расстояние Грантама (Grantham 1974), которое часто используется при сравнении белковых последовательностей (Yampolsky, Kondrashov et al. 2005).

Целью нашей работы стала сравнительная оценка эффективности очищающего отбора у млекопитающих с разной популяционной численностью. Для этого мы проанализировали шесть молекулярных параметров: Ka/Ks, четыре вида Кг/Кс с разными классификациями аминокислотных остатков (полярность, объем, полярность-объем, заряд) и расстояние Грантама. Мы предположили, что хотя бы некоторые из этих шести параметров будут увеличиваться с уменьшением Ne в результате менее эффективного очищающего отбора в маленьких популяциях.

Таким образом, целью данного исследования является (i) оценка скорости накопления слабовредных мутаций (выраженных в виде Ka/Ks и Кг/Кс) и (И) оценка аминокислотного различия (расстояние Грантама) между современными видами и их наиболее близкими восстановленными предками в крупных по сравнению с мелкими млекопитающими.

3.1. Материалы и методы

Исходные данные и их первичная обработка

Полностью отсеквенированные митохондриальные геномы 138 видов млекопитающих, доступные на момент лета 2005 года, были загружены с базы данных

Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ORGANELLES/anirnalabout.html'). Все 13 белок-кодирующих гена были извлечены из каждого генома и транслированы в аминокислотные последовательности. Выравнивания аминокислотных последовательностей были сделаны для каждого гена с использованием ClustalX (Thompson, Gibson et al. 1997), с параметрами по умолчанию, и затем откартированы обратно на геном, чтобы получить нуклеотидные выравнивания, согласованные с белковыми. Выровненные 13 аминокислотных и 13 соответствующих нуклеотидных последовательностей без стоп-кодонов были конкатенированы в одну аминокислотную и соответствующую нуклеотидную последовательность для каждого вида. Филогенетическое дерево млекопитающих было построено по сшитым аминокислотным последовательностям с использованием метода набольшего правдоподобия, реализованного в программе PHYML (Guindon and Gascuel 2003). Сшитые нуклеотидные последовательности были использованы при изучении нуклеотидных замещений.

Отношение несинонимичных к синонимичным замещениям CKa/Ksl

Отношение скоростей фиксации несинонимичных и синонимичных замещений были оценены для каждой ветви филогенетического дерева млекопитающих с помощью программы codeml из пакета PAML (Yang 1997). Поскольку независимый анализ Ka/Ks для каждой ветви всего дерева занял бы неприемлемо много времени, дерево было поделено на 11 монофилетических поддеревьев (Murphy, Eizirik et al. 2001), каждое из которых анализировалось отдельно. 16 видов с неопределенным положением на дереве с низким значением bootstrap) были удалены из дальнейшего рассмотрения. Оставшиеся 122 вида были распределены между следующими 11 поддеревьями: Afrotheria (13), Artiodactyla (9), Carnivora (12), Cetacea (22), Chiroptera (8), насекомоядные (ежи, землеройки и кроты) (6), Rodentia (7), Lagomorpha (4), Metatheria (19), Perissodactyla (5), Primates и Dermoptera (17). Для каждого поддерева были протестированы две эволюционные модели: модель 0 (Ka/Ks постоянное по всему дереву) и модель 1 (свободное Ka/Ks, оцениваемое независимо для каждой ветви поддерева) (названия моделей как в PAML). Модель 1 была применена для двух разных условий: i) отношение частот транзиции и трансверсии (параметр к согласно обозначению Кимуры) (Kimura 1980) было зафиксировано по всем поддеревьям и равно трем (Eyre-Walker, Keightley et al. 2002); ii) параметр отношения частот транзиции и трансверсии был свободным и оценивался для каждого поддерева отдельно.

В дальнейшей работе были использованы только значения Ka/Ks, оцененные для внешних ветвей.

Отношение радикальных к консервативным аминокислотным замещениям (Кг/Кс)

Основываясь на алгоритме Хьюза и соавторов (Hughes, Ota et al. 1990), который был модифицирован для учёта разницы частот транзиций и трансверсий (transition/ transvertion bias) (Zhang 2000), мы оценили скорости консервативных (Кс) и радикальных (Кг) несинонимичных замещений в нуклеотидных последовательностях современных видов и их наиболее близких реконструированных предков. Предковые нуклеотидные последовательности были восстановлены с использованием метода, разработанного Янгом в PAML. Поскольку значения Кг и Кс были достаточно низкими (<0.3), была использована формула Джукса-Кантора для корректировки повторных замен, и таким образом наше отношение Кг/Кс соответствует отношению dr/dc в определении Чжана (Zhang 2000).

Двадцать аминокислот были классифицированы в группы четырьмя разными способами, согласно их физико-химическим характеристикам. Мы использовали классификацию Чжана, согласно которой аминокислоты отличаются по заряду, полярности и полярности-объему (Zhang 2000). Дополнительно мы использовали классификацию Тейлора, которая классифицирует аминокислоты только по объему (Taylor 1986). Аминокислотные замещения внутри групп (когда предковая и современная аминокислоты принадлежат одной группе) рассматривались как консервативные, а замещения между группами - как радикальные.

Сравнение эволюционных моделей

Наш анализ альтернативных эволюционных моделей (Ka/Ks, оцененные для каждой ветви, против Ka/Ks, постоянной по всем веткам поддерева; параметр к, специфичный для каждого поддерева, против фиксированного со значением 3 по всем поддеревьям) показал, что наиболее адекватным является вычисление Ka/Ks и Кг/Кс для каждой ветви отдельно и установка к для каждого поддерева отдельно. Поэтому в данной работе анализировались Ka/Ks и Кг/Кс, полученные для каждой ветки.

В результате для 110 из 122 видов были получены значения Ka/Ks и Кг/Кс. Оставшиеся 12 видов не вошли в дальнейший анализ из-за слишком малого количества (<20) несинонимичных замещений на 13 белок-кодирующих генов, произошедших с момента наиболее близкого восстановленного предка.

Усредненное расстояние Грантама

Чтобы оценить аминокислотное различие, мы вычислили среднее физико-химическое расстояние между современными видами и их наиболее близкими реконструированными предками. Различие между двумя аминокислотами (если произошло несинонимичное замещение) в современном и предковом состоянии оценивалось с использованием матрицы Грантама (Grantham 1974) и усреднялось по всем парам замещений для каждой внешней ветки.

Масса тела

Поскольку для большинства млекопитающих нет прямых данных по эффективной численности их популяций, мы использовали массу тела половозрелой самки, как показатель эффективной численности, основываясь на почти универсальной обратной зависимости между массой тела и Ne (Damuth 1993).

Информация по массам тела взрослых особей для большинства проанализированных видов была взята из базы данных Смита (Smith 2003). В случае различных масс тела для одного вида на различных континентах масса тела усреднялась.

Статистическая обработка

Было проведено несколько статистических анализов. Во-первых, мы проанализировали средние величины исследуемых молекулярных параметров, принадлежащих мелким и крупным млекопитающим (с массой тела ниже и выше медианы, соответственно). Далее, мы построили стандартные линейные регрессии молекулярных параметров в зависимости от массы тела. Тем не менее, параметры, которые мы анализировали, возможно, не являются независимыми среди видов, в связи с филогенетической инерцией, что может отразиться на межвидовом анализе (Fisher and Owens 2004).

Стандартный путь решения подобных проблем - это метод филогенетически независимых контрастов. Он основан на модели броуновского движения эволюционных характеристик и предполагает, что увеличения и уменьшения параметра одинаково возможны, таким образом, среднее значение характеристики не изменяется с течением времени (Ives and Zhu 2006). Изменения массы тела не всегда согласуются с моделью броуновского движения, поскольку, согласно правилу Копа (Alroy 1998; Van Valkenburgh, Wang et al. 2004), масса тела увеличивается в процессе эволюции и поэтому демонстрирует направленное изменение. Существуют более сложные эволюционные модели, допускающие направленное изменение параметра в эволюции, которые используются в контексте филогенетически независимых контрастов (Diaz-Uriarte and Garland 1998).

Более серьезная проблема связана с тем, что такие молекулярные характеристики как значения Ka/Ks, специфичные для ветки, уже контрастированы (т.к. они подсчитаны на основе разницы в последовательностях между двумя узлами ветки), тогда как такой филогенетический параметр, как масса тела, конечно, не контрастировав и несет в себе филогенетическую инерцию. Более того, если мы пытаемся ассоциировать Ka/Ks с контрастами, основанными на массе тела, мы обнаружим, что они неконгруентны, поскольку первый параметр основан на различии современных и предковых нуклеотидных последовательностей, тогда как второй основан на разнице у современных видов. Такие соображения препятствуют использованию молекулярных параметров и массы тела в филогенетически независимых контрастах.

Чтобы контролировать эффект ненезависимости данных, мы провели регрессионный анализ, используя линейные модели со смешанным эффектом, которые не требуют модели эволюции параметра и не основываются на контрастах. Вместо этого модель явно учитывает иерархическую (вложенную) и, таким образом, взаимосвязанную (коррелированную) сравнительно-видовую структуру данных. Этот метод широко используется в социологических и медицинских науках, и недавно стал использоваться в сравнительно-видовых исследованиях (Blackburn and Duncan 2001) (Brook, Traill et al. 2006). В нашей работе он был применен с использованием функции lme в пакете nlme в языке R (R Development Core Team 2005). Наши данные сгруппированы в следующие уровни: виды внутри рода, внутри семейства и внутри отряда. Мы использовали модель со смешанным эффектом, которая включает два случайных параметра: точку пересечения с осью Y и наклон.

Проверка на эффект насыщения

Был проведен дополнительный анализ на эффект насыщения. После удаления видов с длинными ветвями (более одного замещения на кодон) и анализа оставшихся данных (п=89), зависимости между молекулярными параметрами и массой тела остались практически неизмененными. 3.2. Результаты

Средние величины Кэ/Кб и Кг/Кс.

Полученные величины Кэ/Кб для всех видов намного ниже единицы (0.03-0.06, табл. 1). Эти величины говорят о том, что большая часть несинонимичных замещений (по крайней мере, 94-97%), возникших в результате мутационного процесса подвержены очищающему отбору, и, следовательно, — вредные. Большинство полученных значений Кг/Кс также меньше единицы, и нет значений Кг/Кс значимо больших единицы (табл. 1), что говорит о более сильном очищающем отборе, действующем на радикальные аминокислотные замещения, по сравнению с консервативными аминокислотными замещениями (табл. 1).

Табл. 1. Средние, среднеквадратичные отклонения, параметры и значения Р стандартных линейных моделей и моделей смешанных эффектов для регрессий каждого изучаемого параметра от логарифма массы тела. (БЕ) - стандартная ошибка.

Параметр Стандартные линейные модели Модели смешанных эффектов

Среднее (SE) точка пересечения с осью У Наклон Р точка пересечения с осью Y Наклон Р

Ка/Кл 0.046 (0.002) 0.028 0.0020 <0.001 0.023 0.0024 0.010

Кг/Кс по полярности 0.846 (0.028) 0.525 0.0348 <0.001 0.475 0.0369 0.002

Кг/Кс по объему 0.872 (0.027) 0.528 0.0373 <0.001 0.547 0.0337 0.001

Кг/Кс по полярности и объему 0.504 (0.012) 0.443 0.0066 0.013 0.449 0.0057 0.061

Кг/Кс по заряду 0.420 (0.016) 0.330 0.0097 0.007 0.353 0.0066 0.157

Расстояние Грантама 56.940 (0.462) 52.614 0.4692 <0.001 52.314 0.4784 0.001

Сравнение крупных и мелких млекопитающих

Мы разделили всю выборку на две группы, каждая по 55 видов: мелкие млекопитающие (логарифм массы тела LnW<9.04) и крупные млекопитающие (логарифм массы тела Ьп\\^>9.04), где 9.04 (8400 гр) - это медиана логарифма массы тела XV (в граммах). Три параметра (Ка/Кв, Кг/Кс по полярности и Кг/Кс по объему) оказались значимо меньше у мелких млекопитающих по сравнению с крупными млекопитающими; параметр Кг/Кс по полярности-объему оказался почти значимо (Р=0.07) меньше в мелких по сравнению с крупными млекопитающими; Кг/Кс по заряду не показал значимых различий при 5%-ом уровне значимости ^-тест, Рис. 3, А-Е).

0.058 0.054 0.050 0.046 0.042 0.038 0.034 0.030

0.58 0.56 0.54 0.52 0.50 0.48 0.46 0.44 мелкие крупные мелкие крупные мелкие крупные мелкие крупные

Рис.З. Сравнение шести молекулярных параметров, усредненных по 55 мелким (\nW< 9.04) и 55 крупным (InfF >9.04) млекопитающим, 9.04 - медиана логарифма массы (в граммах). (A) Ka/Ks, Р = 0.001. (В) Кг/Кс по полярности, Р = 0.001. (С) Кг/Кс по объему, Р = 0.001. (D) Кг/Кс по полярности и объему, Р = 0.069. (Е) Кг/Кс по заряду, Р = 0.20. (F) расстояние Грантама, Р = 0.001 (t test). Маленькие квадраты: среднее значение; прямоугольники: ± а среднеквадратичное отклонение; усы: 95% доверительный интервал.

Стандартные линейные модели

Анализ стандартных линейных зависимостей (регрессий) показал статистически значимую (на 5% уровне значимости) положительную зависимость Ka/Ks и Кг/Кс от логарифма массы тела (табл. 1), хотя со значительным разбросом (i*=0.16, 0.28, 0.32, 0.6 и 0.07, Рис. 4 А-Е, соответственно). Такой разброс связан с влиянием сразу многих факторов на изучаемые параметры, но, тем не менее, тенденция увеличения изучаемых параметров с увеличением массы тела явно подтверждается.

1од.(масса тела) 1од.(мзсса тела) 1од.(масса тела)

Рис. 4. Стандартные линейные регрессии молекулярных параметров от логарифма массы 110 видов млекопитающих.

А) Ка/К$. (В) Кг/Кс по полярности. (О Кг/Кс по объему. (£>) Кг/Кс по полярности и объему. (Е) Кг/Кс по заряду. (К) расстояние Грантама. Параметры регрессий указаны в табл. 1.

Зависимость данных и смешанные линейные модели.

Результаты, которые получены с использованием смешанных линейных моделей, учитывающих зависимость данных, связанную с эффектом филогенетической инерции, лишь незначительно отличаются от результатов, которые получены для стандартных линейных моделей, за исключением случая с Кг/Кс по заряду (табл. 1). Но следует отметить, что смешанные линейные модели показывают более высокое значение Р, что свидетельствует о том, что при учете зависимости видов взаимосвязь молекулярных параметров с массой тела становится менее достоверной, чем это следует из стандартных линейных моделей (табл. 1). Данный результат может быть связан с меньшим числом степеней свободы при анализе смешанными линейными моделями. Наибольшее расхождение в значениях статистической значимости наблюдается для Кг/Кс по заряду и Кг/Кс по полярности-объему, которые показали статистически значимую зависимость в стандартных линейных моделях (на 5% уровне значимости), но оказались незначимо (Кг/Кс по заряду) или слабо значимо (Кг/Кс по полярности-объему) связаны с массой тела в смешанных линейных моделях (табл. 1). Все остальные зависимости (Ka/Ks, Кг/Кс по полярности, Кг/Кс по объему и расстояние Грантама) значимы согласно обеим использованным моделям.

Относительная эффективность очищающего отбора

В качестве оценки относительной эффективности очищающего отбора в крупных по сравнению с мелкими млекопитающими мы сравнили Ka/Ks и Кг/Кс в животных разного размера. Loge массы тела типичного мелкого млекопитающего приняли за 5.62 (что соответствует 275 граммам), а типичного крупного млекопитающего - за 12.82 (что соответствует 369500 граммам), данные величины - это средние Loge массы тела среди 55 мелких и 55 крупных млекопитающих из нашей выборки. Ka/Ks оказался на 45% выше у крупных по сравнению с мелкими млекопитающими, тогда как Кг/Кс - на 8

40% выше, в зависимости от типа используемой аминокислотной классификации (табл. 2). Эти результаты очень близки для стандартной линейной модели и смешанной линейной модели (табл. 2).

Табл. 2. Отношения скоростей несинонимичных к синонимичным (Ка/Кя) и радикальных к консервативным (Кг/Кс) замещениям, и аминокислотное расстояние (расстояние Грантама) между современными видами и их наиболее близкими

Kr/Kc модель Ka/Ks no полярности no объему no полярности и объему по заряду Расстояние Грантама

OLM 0.054/0.039 0.97/0.72 1.01/0.74 0.53/0.48 0.45/0.38 58.63/55.25

MEM 0.054/0.036 0.95/0.68 0.98/0.74 0.52/0.48 0.44/0.39 58.45/55.00

Величины слева соответствуют крупным (средняя масса тела - 369.5 кг), величины справа — мелким (средняя масса тела - 275 г) млекопитающим. Величины были получены из стандартных линейных моделей (OLM) и моделей смешанных эффектов (MEM).

Аминокислотные различия между современными видами и их наиболее близкими реконструированными предками в крупных по сравнению с мелкими млекопитающими

Поскольку, как было показано выше, очищающий отбор действует на большинство несинонимичных замещений в противоположность молчащим замещениям, и менее эффективен в крупных млекопитающих, мы ожидаем, что крупные млекопитающие накопили больше вредных мутаций и, таким образом, эволюционировали дальше от своих наиболее современных предков. Анализ расстояния Грантама поддерживает данное предположение: оно больше у крупных млекопитающих в случае средних (рис. 1F), стандартных линейных моделей (рис. 2F) и смешанных линейных моделей (табл. 1). Количественно, аминокислотные различия между современными и предковыми последовательностями на 6% выше у крупных по сравнению с мелкими млекопитающими (табл. 2).

3.3. Обсуждение полученных результатов

Наш анализ показывает, что в большинстве случаев митохондриальные белок-кодирующие гены крупных млекопитающих имеют более высокую скорость накопления несинонимичных замещений по отношению к синонимичным, а среди несинонимичных замещений - более высокую скорость накопления радикальных замещений по отношению к консервативным. Поскольку несинонимичные замещения должны быть более вредными, чем синонимичные, а радикальные должны быть более вредными, чем консервативные, это подразумевает, что крупные млекопитающие подвержены менее эффективному очищающему отбору, чем мелкие млекопитающие. Следовательно, крупные млекопитающие накапливают более вредные мутации, что приводит к более сильному аминокислотному различию между современными видами и их наиболее близкими реконструированными предками, что и наблюдалось в данном исследовании.

Кг/Кс по заряду - это единственный параметр, который не показал значимого различия между крупными и мелкими млекопитающими в случае средних и в случае смешанной линейной модели (хотя различается в случае стандартной линейной модели). Мы заметили, что среди четырех параметров Кг/Кс, Кг/Кс по заряду имеет наименьшее среднее значение (табл. 1), что свидетельствует о действии сильного очищающего отбора на замещения, связанные с изменением заряда, в исследуемых белках. Коэффициент отбора э<0 так велик по абсолютному значению, что не только мелкие млекопитающие (с высоким Ме), но и крупные млекопитающие (с низким испытывают СИЛЬНЫЙ очищающий отбор, Б < -1/Ые, крупные < мелкие, И ПОЭТОМУ освобождаются от таких мутаций. В противоположность этому, очищающий отбор, который действует на замещения, ведущие к изменению по полярности или объему — относительно слабый (значения соответствующих параметров Кг/Кс максимальные, табл. 1), и коэффициент отбора находится в эффективно-нейтральной зоне в случае крупных млекопитающих, но ниже ее в случае мелких млекопитающих, то есть -1/Ыс крупные < в <-Ше, мелкие- Следовательно, радикальные замещения, ведущие к изменениям в полярности и объеме, закрепляются у крупных млекопитающих, как консервативные. Заметим, что для крупных млекопитающих значения Кг/Кс по полярности и объему лежат около единицы (рис. 1 В и С), но такие аминокислотные замещения подвержены элиминации у мелких млекопитающих. Слабовредные мутации с таким промежуточным коэффициентом отбора б будут аккумулироваться в основном у крупных млекопитающих.

В предыдущих рассуждениях рассматривались только те слабовредные мутации, которые зафиксированы в популяции. Но всё же в данной работе мы имеем дело не только с теми замещениями, которые зафиксировались в популяции и, таким образом, связаны с межвидовой дивергенцией, но также с мутациями, которые еще не зафиксированы и не удалены и, таким образом, выражаются как внутривидовой полиморфизм. Это связано с тем, что все параметры были оценены на внешних ветвях дерева, где вклад вносят обе компоненты (межвидовая дивергенция и внутривидовой полиморфизм). Значения Кэ/Кб на внутренних ветках, где вклад вносят только зафиксированные мутации, не представляют большого интереса в данной работе, поскольку недоступна информация по массам тела древних млекопитающих на внутренних ветках дерева. Проблема вклада двух видов мутаций в наши данные связана с тем, что иногда полиморфизмы могут доминировать над зафиксированными мутациями (Nachman 1998) (Nielsen and Weinreich 1999) (Hasegawa, Cao et al. 1998) (Gerber, Loggins et al. 2001), но только фиксированные мутации имеют долговременный эволюционный эффект (Petrov 2001). Наши данные не позволяют нам различить эти два класса мутаций, поэтому возникает вопрос, отражают ли полученные значения Ka/Ks и Кг/Кс оба класса мутаций, или в большей степени один из них. Очевидно, что оба класса близко взаимосвязаны, поскольку ныне зафиксированные мутации были когда-то полиморфизмами и современные полиморфизмы включают в себя те, которые будут зафиксированы в популяции и внесут вклад в дивергенцию. Более того, оба класса мутаций должны изменяться в одном направлении: при увеличении массы тела происходит уменьшение эффективной численности, что приводит к увеличению вероятности фиксации полиморфизмов и увеличению вероятности появления новых полиморфизмов в связи с менее эффективным очищающим отбором по отношению к слабовредным мутациям в малых популяциях. Поскольку менее эффективный очищающий отбор приводит к увеличению обеих компонент генетической изменчивости, то они изменяются в одном направлении, так что зафиксированные мутации, скорее всего, будут иметь тот же положительный тренд с увеличивающейся массой тела, что и Ka/Ks. Этот довод говорит о возможности накопления слабовредных мутаций у крупных млекопитающих, что может быть угрозой их существованию.

Можно косвенно оценить вклад полиморфизмов в Ka/Ks, оценив S=sxNe из наших расчетов Ka/Ks. Данная оценка может быть сделана с использованием хорошо известного уравнения вероятности фиксации новой мутации (Kimura 1962). Предполагая, что молчащие сайты эволюционируют нейтрально, отношение вероятности фиксации мутации с коэффициентом селекции s^O к вероятности фиксации нейтральной мутации с s=0 может быть вычислено с помощью отношения Ka/Ks (Nielsen and Yang 2003)

Ka/Ks = 2S/ (1 -exp (-2S)) [1]

Используя функцию uniroot в пакете R, мы оценили S из уравнения (1) для каждого из 110 видов млекопитающих. Все значения S оказались отрицательны, что еще раз показывет преобладание очищающего отбора. Значения лежат в достаточно узкой области от -2.97 до -1.69, со средним значением S—2.38 (5=0.03, п=110). По определению эффективно нейтральные мутации должны иметь коэффициент отбора s < 1/Ne. Однако, по нашим результатам получается Nexs = |S|>1, что отражает вклад достаточно вредных мутаций с коэффициентом отбора s > 1/Ne. Мы полагаем, что таким образом отражается эффект полиморфных мутаций. Этот эффект, тем не менее, не представляется очень сильным, поскольку оценки |S| ближе к нижней границе диапазона для |S|, 1 < |S| < 10, что характерно для полиморфных мутаций (Eyre-Walker, Woolfit et al. 2006; Eyre-Walker and Keightley 2007) (Nachman 1998).

Митохондриальные гены сильно предрасположены к накоплению слабовредных мутаций. Поскольку митохондрии имеют низкую эффективную численность, молекулярная эволюция митохондриальных генов должна быть ассоциирована с более высокой скоростью накопления слабовредных мутаций по сравнению с ядерными генами (Cortopassi 2002). Согласно модели храповика Мёллера, отсутствие рекомбинации должно дополнительно увеличивать скорость деградации митохондриальной ДНК (Hoekstra 2000). Несколько работ по сравнению видов подтверждают эти теоретические ожидания (Lynch 1996; Lynch 1997). Менее ясно, может ли высокая скорость деградации митохондриального генома приводить к более высокой скорости вымирания (Lynch and Blanchard 1998).

Различие между мелкими и крупными современными млекопитающими, проанализированное в данной работе, может быть рассмотрено с точки зрения долговременной эволюционной перспективы, учитывая общий эволюционный тренд в сторону увеличения массы тела, известный как правило Копа. Хотя существуют исключения, данный тренд детально описан для млекопитающих (Alroy 1998) (Van Valkenburgh, Wang et al. 2004): достаточно того примера, что все предковые формы млекопитающих были маленькими существами размером с землеройку, тогда как современные млекопитающие включают в себя таких гигантов, как голубой кит и африканский слон. Мы предполагаем на основании современных данных, что эволюция млекопитающих в сторону увеличения массы тела сопровождалась увеличением ширины селекционного сита (проявляющееся увеличение Ka/Ks и других молекулярных черт, в связи более слабым естественным отбором (Lynch and Blanchard 1998), что приводило к деградации митохондриальных белок-кодирующих генов и могло вносить вклад в вымирание крупных млекопитающих. Два дополнительных наблюдения поддерживают данную гипотезу. Во-первых, многие теоретические работы (Lynch, Burger et al. 1993) (Kondrashov 1995) говорят о том, что малые популяции (в основном у крупных млекопитающих) могут вымирать в связи с накоплением слабовредных мутаций, приводящим к мутационному плавлению (mutational meltdown) (Lynch, Burger et al. 1993). Во-вторых, крупные животные, включая млекопитающих

Purvis, Gittleman et al. 2000) (Polishchuk 2002) (Cardillo, Mace et al. 2005) более подвержены вымиранию. Бесспорно, необходимы дополнительные исследования, чтобы оценить роль менее эффективного очищающего отбора в увеличении риска вымирания крупных млекопитающих.

Итак, в нашей работе мы показали, что крупные млекопитающие (369,5 кг, с низкой Ne) по сравнению с мелкими млекопитающими (275 гр., с высокой Ne) имеют более высокое (на 43%) отношение скоростей накопления несинонимичных нуклеотидных замещений к синонимичным (Ka/Ks) и более высокое (на 8-40%) отношение скорости накопления радикальных аминокислотных замещений к скорости накопления консервативных аминокислотных замещений (в зависимости от используемой аминокислотной классификации). Более высокие скорости накопления замещений приводят к более сильному (на 6%) аминокислотному различию между современными млекопитающими и их наиболее близкими восстановленными предками у крупных млекопитающих по сравнению с мелкими. Поскольку несинонимичные замещения более вредны чем синонимичные, а радикальные аминокислотные замещения более вредны чем консервативные, наши результаты говорят о том, что крупные млекопитающие испытывают менее эффективный очищающий отбор, по сравнению с мелкими. И, более того, поскольку в процессе эволюции размер млекопитающих увеличивался, и, соответственно, размер эффективной численности уменьшался, эволюция млекопитающих в сторону увеличения массы тела могла сопровождаться накоплением слабовредных мутаций в митохондриальных белок-кодирующих генах, что могло внести вклад в вымирание крупных млекопитающих.

4. ОЧИЩАЮЩИЙ ОТБОР В МИТОХОНДРИЯХ СВОБОДНОЖИВУЩИХ И ОБЛИГАТНЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ БАКТЕРИЯХ

В предыдущей главе мы показали, что удаление слабовредных мутаций должно быть эффективнее в видах с высокой эффективной популяционной численностью (Ne) (Wright 1931) в связи со слабым дрейфом генов. Также, согласно теории, мейотическая сегрегация и рекомбинация обеспечивают независимое смешивание аллелей и, таким образом, обеспечивают более эффективное удаление слабовредных мутаций (Kimura and Maruyama 1966) (Kondrashov 1982; Kondrashov 1988) (Cortopassi and Arnheim 1990; Charlesworth 2007) и остановку храповика Меллера (Muller 1964) (Felsenstein 1974). Таким образом, и популяционная численность, и уровень рекомбинации определяют эффективность очищающего отбора.

Несмотря на то, что влияния эффективной численности популяции и уровня рекомбинации взаимосвязаны и, возможно, могут усиливать друг друга, можно провести различие между ними, сравнивая виды с разной эффективной численностью и/или уровнем рекомбинации. Например, влияние только эффективной численности на силу очищающего отбора было изучено на приматах и грызунах (Li, Tanimura et al. 1987) (Eyre-Walker, Keightley et al. 2002) (Ohta 1995), млекопитающих, птицах и дрозофилах (Keightley and Eyre-Walker 2000), островных и материковых популяциях одного и того же вида (Woolfit and Bromham 2005), на крупных и мелких млекопитающих (Popadin, Polishchuk et al. 2007). Преимущественно только роль рекомбинации, без влияния эффективной численности, была изучена при сравнении половых и бесполых дафний (Paland and Lynch 2006). Скорее всего, влияние обоих факторов - эффективной численности и рекомбинации — прослеживается в различии молекулярной эволюции эндосимбиотических и свободноживущих бактерий (Wernegreen and Moran 1999) (Wernegreen 2002) (Woolfit and Bromham 2003), а также в деградации нео-У-хромосомы Drosophila miranda (Bachtrog 2005).

Структурные и функциональные ограничения белка определяют силу очищающего отбора, действующего на его ген. В то же время, ортологичные белки в близкородственных видах, скорее всего, функционируют под влиянием одинаковых ограничений, поэтому существует возможность более подробного изучения взаимосвязи скорости эволюции, эффективной популяционной численности и уровня рекомбинации в ортологичных генах. Мы провели всесторонний анализ очищающего отбора в различных группах протеобактерий и в митохондриях млекопитающих.

Относительная эффективность очищающего отбора была оценена как скорость фиксации несинонимичных замещений и радикальных аминокислотных замещений в семи ортологичных генах, кодирующих субъединицы белкового комплекса из дыхательной цепи (Ъ1АОН:убихинон-оксидоредуктаза или Комплекс I) бактериальных" и митохондриальных геномов. Эти гены кодируют субъединицы одного полисубъединичного белкового комплекса и представляют большую часть от всех белок-кодирующих генов митохондрий. Ортологичные гены, кодирующие субъединицы Комплекса I, присутствуют во всех аэробных бактериях. Поскольку белки дыхательной цепи высококонсервативны, мы предполагаем, что роль положительного отбора в них несущественна, и поэтому эти гены подходят для изучения очищающего отбора.

Во-первых, мы сравнили митохондрии млекопитающих и бактерий. Поскольку митохондрии произошли от древних эндосимбиотических протеобактерий, интересно сравнить очищающий отбор в ортологичных митохондриальных и протеобактериальных генах, учитывая различия в их экологии. Митохондрии позвоночных наследуются строго по материнской линии, и поэтому бесполы и имеют низкую эффективную численность (Birky 1995). Напротив, бактерии, особенно свободноживущие, характеризуются ненулевым уровнем рекомбинации и высокой эффективной численностью. Поэтому, мы ожидаем, что митохондрии должны быть подвержены более слабому очищающему отбору.

Во-вторых, мы оценили уровень очищающего отбора в различных группах протеобактерий, учитывая особенности их экологии. С этой точки зрения, проанализированная выборка бактерий состоит из двух основных групп: облигатные внутриклеточные виды (паразиты и эндосимбионты) и свободноживущие виды, способные жить вне клетки-хозяина. Свободно живущие протеобактерии характеризуются более высокой эффективной численностью и уровнем рекомбинации, поэтому следует ожидать, что они подвержены более эффективному очищающему отбору по сравнению с облигатными внутриклеточными протеобактериями (Woolfit and Bromham 2003).

В-третьих, мы сравнили уровень очищающего отбора у облигатных внутриклеточных симбионтов (гамма-протеобактерии) и облигатных внутриклеточных паразитов (альфа-протеобактерии). Широко принято, что среди облигатных внутриклеточных бактерий симбионты со строгим внутриклеточным наследованием (Buchner а и Blochmannia spp., которые нуждаются в питательных веществах, поступающих от клетки-хозяина) характеризуются более низким уровнем рекомбинации по сравнению с паразитами (патоген человека Rickettsia и репродуктивный паразит членистоногих и некоторых других беспозвоночных Wolbachia), которые способны переходить из одного хозяина в другого, и, таким образом, контактировать и рекомбинировать с новым геномным пулом (Bordenstein and Reznikoff 2005). Мы протестировали, могут ли различия в передаче облигатных внутриклеточных бактерий, определяемые различными особенностями их экологии, влиять на эффективность очищающего отбора посредством частоты рекомбинации.

В-четвертых, мы проанализировали взаимосвязь силы очищающего отбора с плотностью мобильных элементов в бактериальных геномах. Мы ожидали, что плотность мобильных элементов должна положительно коррелировать с уровнем рекомбинации, поскольку эти факторы взаимно усиливают друг друга. Уровень внутригеномной рекомбинации у бактерий в основном определяется активностью мобильных элементов, которые способны осуществлять конъюгацию (коньюгативные плазмиды и коньюгативные элементы) или трансдукцию (профаги или умеренные фаги) (Thomas and Nielsen 2005). Другие мобильные элементы бактерий и эукариот (Hickey 1982) (Arkhipova and Meselson 2000) (Schon and Martens 2000) (Sullender and Crease 2001), неспособные индуцировать рекомбинацию, эволюционно поддерживаются в геноме в соответствии с существующим уровнем рекомбинации: чем чаще рекомбинация, тем больше мобильных элементов (Bordenstein and Reznikoff 2005). Таким образом, мы использовали плотность всех мобильных элементов как приблизительную оценку рекомбинационной активности в бактериальных геномах.

Оказалось неожиданным, что уровень очищающего отбора в митохондриях значимо выше, чем в облигатных внутриклеточных бактериях, и почти значимо выше, чем в свободноживущих протеобактериях. Данное наблюдение противоречит общепринятому мнению о деградации митохондриальных геномов, и в связи с этим мы обсуждаем дополнительные факторы, которые могут увеличить селекционные ограничения, действующие на митохондриальные гены. Сравнение бактерий показало более эффективное удаление слабовредных мутаций у свободно живущих видов по сравнению с облигатными внутриклеточными, имеющими более низкую эффективную численность популяции и низкий уровень рекомбинации. Очищающий отбор в паразитических облигатных внутриклеточных бактериях оказался более эффективным по сравнению с симбиотическими, возможно, из-за более высокого уровня рекомбинации в паразитах. Чтобы выявить очищающий эффект рекомбинации, мы показали, что эффективность очищающего отбора (ЬКа/Кэ) положительно коррелирует с плотностью мобильных элементов, т.е. с частотой рекомбинации.

4.1. Материалы и методы

Данные и их обработка Последовательности семи ортологичных генов (митохондриальные: N01-6 и N041,; бактериальные: пиоА, пиоН, пиоЗ, пиоК, пиоЬ, пиоМ и пиоЩ из альфа-, бета- и гамма-протеобактерий и из митохондрий приматов и грызунов (Яос1епМа и Lagomorphd), были загружены с базы данных Национального центра биотехнологической информации США (ИСВ1) (http://ncbi.nlm.nih.gov/genoines/QRGANELLES/animalabout.html'> с использование Ь^р (Акзс1ш1 1990) с генами из Е.соИ К12 в качестве генов-запросов. В результате мы получили данные по 83 видам бактерий и по митохондриям 34 видов млекопитающих. Затем эти гены были транслированы т яШсо в аминокислотные последовательности. Аминокислотные последовательности, для каждого гена отдельно, были выравнены с использованием модели E-INS-i-MAFFT (Katoh, Misawa et al. 2002) (Katoh, Kuma et al. 2005) и затем откартированы обратно на геном, чтобы получить нуклеотидные выравнивания, согласованные с белковыми. Нуклеотидные либо аминокислотные выравнивания были сшиты в одну нуклеотидную (соответственно, аминокислотную) последовательность для каждого вида. Сшитые аминокислотные последовательности были использованы для построения филогенетического дерева для каждой монофилетичной группы (альфа-, бета- и гамма-протеобактерии, грызуны и приматы) с использованием PHIML (Guindon and Gascuel 2003) (Guindon, Lethiec et al. 2005). Все бактериальные деревья были укоренены с митохондриальными генами Homo sapience, как с внешней группой. Деревья митохондрий приматов и грызунов были укоренены с Rickettsia rickettsia, как с внешней группой. Деревья изображены на рис 5. Гомологичные кодонные позиции, которые были только у бактерий (или митохондрий), и соответственно, отсутствовали у всех митохондрий (или бактерий), были удалены из всех последовательностей. Сшитые нуклеотидные последовательности были использованы для изучения нуклеотидных замещений на внутренних узлах дерева.

Отношения скоростей несинонимичных и синонимичных нуклеотидных замещений. Ka/Ks

Модель правдоподобия, основанная на кодонах, (codon-based likelihood model) Голдмана и Янга (Goldman and Yang 1994), и примененная в программе codeml пакета PAML (Yang 1997), обеспечивает основу для подсчета отношения скоростей синонимичных и несинонимичных замещений (Ka/Ks). Известно, что учет сдвига транзиций/трансверсий и неравномерности в использовании синонимичных кодонов оказывает значительный эффект при подсчете скоростей синонимичных и несинонимичных замещения, и приблизительные методы не могут адекватно учесть эти сдвиги (Yang and Nielsen 1998) Поэтому предпочтителен подход правдоподобия, основанный на кодонах (codon-based likelihood approach), способный учитывать данные параметры. В нашей работе для подсчета Ka/Ks мы использовали программу codeml из пакета PAML (Yang 1997).

Чтобы учесть разницу частот транзиций и трансверсий (transition/transversion bias) в различных видах, параметр отношения транзиции/трансверсии был свободным и подсчитывался из данных нуклеотидных выравниваний в каждой отдельной модели. Чтобы учесть различия по использованию кодонов, все частоты по кодонам также были свободными параметрами.

Для оценки Ka/Ks было применено несколько моделей: модель 0 - с одним значением Ka/Ks для всех ветвей дерева; модель 2а - с двумя значениями Ka/Ks, оцениваемыми отдельно для всех наружных и всех внутренних ветвей дерева; модель 2Ь - с оценкой значений Ka/Ks для групп наружных ветвей и с одним значением Ka/Ks для всех внутренних ветвей дерева. В модели 2Ь бактериальные наружные ветви были сгруппированы по экологии (свободноживущие и облигатные внутриклеточные) или по таксономии и экологии (свободноживущие альфа-протеобактерии, облигатные внутриклеточные (паразиты) альфа-протеобактерии, свободноживущие бета-протеобактерии, свободноживущие гамма-протеобактерии, облигатные внутриклеточные (симбионты) гамма-протеобактерии). модель 2с - с оценкой значения Ka/Ks для каждой наружной ветви дерева отдельно и одного значения Ka/Ks для всех внутренних ветвей дерева

Поскольку митохондрии - это облигатный внутриклеточный симбионт со строго вертикальным наследованием, наружные ветви дерева млекопитающих в модели 2Ь были сгруппированы только по таксономии (приматы и грызуны).

В связи с тем, что подсчет значения Ka/Ks для каждой наружной ветви дерева занял бы очень много времени, бактериальное дерево было разделено на три монофилетических поддерева (альфа-, бета- и гамма-протеобактерии), а дерево млекопитающих было разделено на поддеревья приматов и грызунов. Далее, для каждого поддерева были подсчитаны значения Ka/Ks для каждой наружной ветки. В целом, для каждого поддерева было применено три модели: 0 и 2а (как описано выше), а также модель 2с, с оценкой значения Ka/Ks для каждой наружной ветви дерева отдельно и одного значения Ka/Ks для всех внутренних ветвей дерева. Результирующие значения максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) сравнивались с использованием теста максимального правдоподобия (likelihood-ratio test).

Положительный отбор Поскольку действие положительного отбора может быть направлено всего на несколько кодонов, в то время как остальная часть гена может находиться под действием очищающего отбора, с большой вероятностью результирующее значение Ka/Ks может быть все равно меньше единицы, несмотря на влияние положительного отбора. Все ранее упомянутые модели допускают одно отношение Ka/Ks для всех кодонов, и поэтому нечувствительны при поиске положительного отбора, действующего на отдельные кодоны гена. Если учесть, что существует, по крайней мере, два класса кодонов с разными значениями Ka/Ks, то можно попытаться выявить кодоны, находящиеся под положительным отбором (Yang, Nielsen et al. 2000) (Yang and Swanson 2002). Для этой цели мы применили модели 7 и 8 из программы codeml. Нейтральная модель (7) с бета-распределеним значений Ka/Ks на интервале (0; 1) была сравнена с селекционной моделью (8) с дополнительным классом сайтов, которые могут иметь значение Ka/Ks, превышающее 1. Если значение Ka/Ks дополнительного класса сайтов окажется выше 1 и тест максимального правдоподобия (likelihood ratio test, LRT) будет статистически значимым, то можно сделать вывод о наличии положительного отбора. LRT оценивается как отрицательное удвоенное значение разницы логарифмов максимального правдоподобия двух сравниваемых моделей (7 и 8), которое сравнивается с распределением х? с двумя степенями свободы.

Отношение радикальных к консервативным аминокислотным замещениям, КЛС

См. 3.1. Материалы и методы.

Гены мобильных элементов

Для бактериальных видов с полностью отсеквенированным геномом было определено число генов с функциями мобильной ДНК. Для этого мы использовали автоматическую аннотацию из Comprehensive Microbial Resource of the Institute of Genomic Research (TIGR). Согласно этой аннотации гены классифицируются на 19 функциональных категорий, среди которых есть категория мобильной ДНК, различающая внутри себя гены плазмид, профагов и транспозирующих элементов

Peterson, Umayam et al. 2001). Мы использовали число генов данной категории, деленное на размер генома в миллионах пар оснований, как оценку плотности мобильных элементов в каждом виде.

Статистический анализ

Все статистические исследования были выполнены в языке R (R Development Core Team 2005) (http://www.R-project.org). Значения Ka/Ks, полученные из моделей 2а и 2Ь, сравнивались с использованием значений стандартной ошибки из PAML. Распределения значений Ka/Ks, полученные из модели 2с для пар групп с разной экологией, сравнивались с использованием параметрического t-теста. Зависимость Ka/Ks и плотности мобильных элементов была проанализирована с использованием трех подходов: (i) ранговая корреляция Кендалла, устойчивая к нелинейности зависимостей, (ii) стандартная линейная регрессия для логарифмированных данных (loge transformed data), а также (iii) регрессионный анализ, который учитывает возможную нелинейность данных. В связи с тем, что число мобильных элементов может нести в себе филогенетическую инерцию, и, таким образом, может быть не независимо между видами, имеющими недавнего общего предка, мы провели регрессионный анализ, базирующийся на модели смешанных эффектов (функция lme в пакете nlme языка R (R Development Core Team 2005). Эта модель явно учитывает иерархическую (вложенную) структуру данных, полученных из проанализированных видов. В нашем исследовании данные были вложены в следующие два уровня: виды внутри семейств (Rhizobiales, Rickettsiale, Burkholderiales, Neisseriales, Enterobacteriales и Рзеис1отопо(1а1е8) и внутри отряда (альфа-, бета- и гамма- протеобактерии, соответственно)).

4.2. Результаты

Эволюционные модели

Полученное дерево (см. материалы и методы, раздел 4.1.) изображено на Рис. 5.

Neisserla menlngitidis Z24B1 -Г Netsseria meningitis MC58 M Neisseria gononhoeae FA 1090 Bórdetela parapertuaais Borde teNa pertusais Tohama I TBordalefla bronchiseptlca RB50

Reislortfa soianacearum UW551 Ralatonia solanaceerum GM11000 ЪЫоЫа metaHidurane СИ 34 Raistonia eutropha JMP134 Burkhotdnria fungorum LB400 BurkholcJer a thailandensis E26 Burkhoideria pseudomellei K96 BurVhoWena pseudomalei 1655 BurkhokJena malte« NCTC trokleria vietnamiensis G4 Burkhoideria dolosa AU0158 Burkhoideria ambMaria AMMD 383 cenocepatíe PC Burid»olderte сапосерасш Hl

Psyciuobacler arcticus 273-4 Psychrobacter cryohaloleniis

Azotobaaarvit^SSairjRap- Pseudomonas putida F1 Pseudomonas fluoreacens Psaudomonaa aeruginosa PA01

SodatiaakwainMüi« Photorhabdus j Yarsinta moüarei

I LTSfelnla pastis ucfmera aphldlcola Áf*5~ Buchnera aphidicola Sg Blochmannia pennsylvanícus *»•--■-— »nriia florida r»us Buchnara apMdteola Bp

KIM

Erwlnia carotovora airoseptica Salmonella enteric« Typhi Ty2 Salmonella typh ¡murium LT2 Solmonella ontorica Cholera coli CFT073 ftexnen 2a 2457T >ydil Sb2270 ООН 0157H7 Eschenchia coli K12

Shigella dvsenteriae Sd197 fthodopseudomones yaluslne В Rhodopeeudomones palualris CQ Rhodopaoudomonaa palualris Ha

Bradyrhizobwm sp BTAil Bradyrhizobium laponicum

TStiobacter hamburgenate X14 , Nitrobacter winogradskyi

Xanihbbacier autotrophic*« autotroph! cus Agrobacterium lumefaclene C58 Sinorhizotxum meliloti Rhizobium eW CFN 42

THÜorhizobium sp BNC1 Mesorhl2oblum loti MAFF30309»

Brucella suis 1330 Brúcela meHtens>s 16M

Bartonella bacHliformis КСЬвЗ~ Brucella abortus biovar Rickettsia typhi Wilmington Rickettsia prowazekll Madrid E Rickettsia falls URRWXCal2 Rickettsia akari Hartford

Brugia malayi chis Dr mêla rte

TRkkattsia rickettsii

Anaptaama phagocytophilum —С Anaplasma marginal« Maries Wolbachia Dr simulan»

-Г Ehrlichia ruminantium Oardel Г" Ehrlichia ruminantium Welgevon

Thryonomys swindertanus Cavia porceltus

Sciurus vukjons Myorus glis

Oryctofagus cuntcukjs Lapus aumpaaus Ochotor.e coilaris Ocholona pnneeps a

Nannospaiax ahrmnbami MicnXtts kJkvcM Cynocaphalus varktffalus Nycbcnbus coocang Lemur catta

Ratius norvagicus

Mus muscuJus molo s sr nus

Mus músculos domesùcus Mus musculua sbancanus

Trochypithcct CoJobus gua

0.1 us obscuros gueraza

Cercoprthacus aelhiops Rapto hamadryas Macaca mulatta

Macaca sytvanua

Pongo pygmaeus abelii Pongo pygmaeus

Goritia gontta sapiens Yoruba

Pan (rogtoetytes parUacue митохондрии грызунов и зайцеобразных митохондрии приматов

Рис. 5. Филогенетическое дерево анализируемых видов.

Наклонный шрифт - митохондрии млекопитающих; жирный шрифт - облигатные внутриклеточные бактерии (эндосимбионты среди гамма- и паразиты среди альфа-протеобактерий); стандартный шрифт - свободноживущие бактерии. Длина ветвей отражает значения Ка/Кв, полученные в модели 2с (Ка/Кз каждой наружной ветки оценивались независимо для каждого вида, тогда как Ка/Кв внутренних ветвей оценивались независимо для каждого поддерева). Пунктирная линия показывает предположительное происхождение митохондрий от общего предка с Шскей81а1ез.

Мы протестировали несколько эволюционных моделей для анализа величины Ка/Кэ на бактериальном и митохондриальном деревьях: модель 0 - с одним значением Ка/Кэ для всех ветвей дерева; модель 2а - с двумя значениями Кэ/Кб, оцениваемыми отдельно для всех внутренних и всех наружных ветвей дерева; модель 2Ь - с значениями Ка/Кя, оцененными отдельно для группы наружных ветвей, и одним значением Ка/Кв, оцененным для всех внутренних ветвей. В модели 2Ь наружные ветви бактериального дерева были сгруппированы согласно экологии или экологии и таксономии, наружные ветви дерева млекопитающих были сгруппированы только согласно таксономии.

Бактериальное дерево было разделено на три монофилетических поддерева (альфа-, бета- и гамма-протеобактерии), а дерево млекопитающих было разделено на поддеревья грызунов и приматов, и далее каждое поддерево анализировалось отдельно. Для каждого поддерева было применено три модели: модели 0 и 2а (как было описано выше), а также модель 2с, со значениями Ка/Кэ, оцениваемыми для каждой наружной ветви поддерева, и одним значением Ка/Кз для всех внутренних ветвей поддерева. Среди двух любых сравниваемых моделей, модель с большим числом степеней свободы имела наибольшее значение максимального правдоподобия (МЪ) (т.е. Д1пЬ был значительно выше при 5% доверительном интервале для распределения х2 с числом степеней свободы, зависящим от модели), и, таким образом, точнее описывала анализируемы данные. Для полного бактериального дерева и дерева млекопитающих:

МЦмодель 2Ь) > МЦмодель 2а) > МЦмодель 0); для поддеревьев: МЦмодель 2с) > МЦмодель 2а) > МЦмодель 0).

После применения модели 2с на внешних ветвях семи видов не оказалось ни одного несинонимичного замещения (Кп = 0, и, значит, Ка/Кз = 0), поэтому данные виды были исключены из дальнейшего анализа. Таким образом, наша финальная выборка для данной модели состояла из 110 видов, включая 36 альфа-протеобактерий (20 свободноживущих и 16 облигатных внутриклеточных паразитов), 20 свободноживущих бета-протеобактерий, 22 гамма-протеобактерий (22 свободноживущих и 6 облигатных внутриклеточных эндосимбионтов), 13 митохондрий грызунов и 19 митохондрий приматов.

Все результаты, полученные из моделей 2а и 2Ь, полностью согласуются с результатами, полученными из модели 2с (табл. 3 и рис. 6), далее результаты модели 2с будут обсуждаться более подробно.

Табл. 3. Средние и стандартные ошибки значений Ка/Кз, полученных в моделях 2а, 2Ь и 2с.

2а. 2с Млекопитающие 0.070 ± 0.0017,0.073 ± 0.0065 2Ь,2с Грызуны и зайцеобразные 0.043 ± 0.0021,0.049 ± 0.0042 Приматы 0.088 ± 0.0025,0.089 ± 0.0087

Протеобактерии 0.148 ± 0.0026,0.192 ±0.0300 Свободно живущие 0.102 ± 0.0022,0.148 ± 0.0303 Бета 0.081 ± 0.003 8.0.048 ± 0.0095 Альфа 0.121 ± 0.0036,0.243 ± 0.0610 Гамма 0.089 ± 0.0038,0.153 ± 0.0643

Облигатные 0.305 ± 0.0087,0.304 ± 0.0689 Альфа 0.244 ± 0.0088,0.244 ± 0.0503 Гамма 0.455 ± 0.203,0.519 ± 0.2004

Р свободно■ живущие у свободно живущие а свободно живущие

О облигатные внутриклеточные^ у облигатные ^внутриклеточные.

Рис. 6. Различия в силе очищающего отбора (ЬКа/Кв) в изученных организмах, по данным, полученным из модели 2с. Р<0.05 - если овалы расположены раздельно, 0.05<Р<0.08 если овалы соприкасаются, Р>0.08, если овалы перекрываются. Более значимый тренд наблюдался на данных из моделей 2а и 2Ь (см. таб. 3).

Вероятность положительного отбора

Для всех филогенетических групп (все млекопитающие, приматы, грызуны, все протеобактерии, альфа-, бета-, гамма-протеобактерии) модель 7 (согласно которой значения Ка/Кв имеют бета-распределение на интервале (0; 1)) имеет значимо меньшее значение максимального правдоподобия (МЬ), чем модель 8 (в которой предполагается наличие экстра-класса сайтов со значением Ка/Кв > 1). Тем не менее, значения Ка/Кв экстра-класса сайтов в модели 8 были меньше единицы для всех млекопитающих (0.298) и всех протеобактерий (0.384), как и в каждой группе по отдельности: 0.319 в приматах, 0.223 у грызунов, 0.513 в альфа-, 0.239 в бета-, и 0.462 в гамма-протеобактериях. Таким образом, мы не наблюдали положительный отбор в исследуемых генах.

Сравнение митохондрий с бактериями

Значения Ка/Кэ митохондриальных генов оказались значимо ниже чем значения Ка/Кз для всех протеобактерий (Р = 0.013), так же, как и значения Ка/Кз для всех облигатных внутриклеточных протеобактерий (Р < 0.001) и облигатных внутриклеточных бактерий из группы альфа-протеобактерий (Р < 0.001), но слабо значимо ниже по сравнению со значениями Ка/Кэ для всех свободноживущих протеобактерий (Р = 0.068 рис. 6). Значения Ка/Кв для митохондрий приматов оказались выше, чем у митохондрий грызунов (Р < 0.001), и ниже, чем у облигатных внутриклеточных альфа-протеобактерий (Р = 0.007).

Бактериальная экология

При анализе всех протеобактерий облигатные внутриклеточные протеобактерии имеют большие значения Ка/Кэ, чем свободноживущие протеобактерии (Р = 0.018, рис. 2). В случае гамма-протеобактерий облигатные внутриклеточные протеобактерии имеют большие значения Ка/Кэ, чем свободноживущие протеобактерии (Р = 0.032), тогда как в случае альфа-протеобактерий значения Ка/Кэ облигатных внутриклеточных и свободноживущих протеобактерий схожи по своим значениям (Р - 0.815, рис. 6).

Значения Ка/Кя облигатных внутриклеточных альфа-протеобактерий (паразиты) почти значимо меньше значений Ка/Кэ облигатных внутриклеточных гамма-протеобактерий (эндосимбионты) (рис. 6) (Р = 0.054). Свободноживущие альфа-протеобактерии имеют более высокие значения Ка/Кэ, чем свободноживущие бета-протеобактерии (Р = 0.003), и схожие значения со свободноживущими гамма-протеобактериями (Р = 0.319, рис. 6). Значения Ка/Кэ свободноживущих гаммапротеобактерий почти значимо выше, чем значения Ka/Ks бета-протеобактерий (Р = 0.08, рис. 6).

Фиксация радикальных аминокислотных замещений

Два из четырех анализированных отношений Кг/Кс (по заряду и по объему) показали значимо более высокие значения для всех протеобактерий по сравнению со всеми митохондриями млекопитающих (Р < 0.001 и Р = 0.049, соответственно). Ни одно из значений Кг/Кс не показало значимых различий между свободноживущими и облигатными внутриклеточными протеобактериями.

Влияние длины ветви

Существует вероятность недостоверной оценки Ka/Ks в связи с насыщением синонимичных сайтов на длинных ветвях дерева или в связи со стохастическими ошибками на коротких ветках дерева. Поскольку одно замещение на кодон (т.е. длина ветки=1) является оптимальным уровнем дивергенции для оценки Ka/Ks (Swanson, Nielsen et al. 2003), мы повторили весь анализ с видами, у которых длина наружной ветви лежит в интервале (0,2; 2). Несмотря на то, что выборка сильно уменьшилась, большинство значимых результатов, наблюденных ранее, остались значимыми. Тем не менее, часть почти значимых результатов исчезла (табл. 4).

Табл. 4. Попарное сравнение значений Ка/Кв (полученных в модели 2с) для всех проанализированных видов (столбец "все ветви") и для видов с оптимальными длинами наружных ветвей (столбец "ветви с оптимальной длиной"). В каждом сравнении группа, упомянутая первой (до наклонной черты) имеет более низкое среднее значение Ка/Кэ по сравнению со второй группой (после наклонной черты). Достоверность различия

Сравниваемые группы Все ветви Ветви с оптимальной длиной

Млекопитающие/ протсобактерии Млекопитающие/ облигатные протеобактерии Млекогоггающие/ облигатные альфа-протеобактерии Млекопитающие/ свободно живущие протеобактерии Грызуны и зайцеобразные/ приматы Р = 0.013 (32/80) Р< 0.001 (32/22) Р <0.001 (32/16) Р = 0.068 (32/56) Р< 0.001 (32/19) Р = 0.032 (32/59) Р< 0.001 (28/15) Р < 0.001 (28/9) Р = 0.171 (28/44) Р< 0.001 (12/16)

Свободно живущие протеобактерии/ облигатные протеобактерии Свободно живущие гамма-протеобактерии/ облигатные гамма-протсобактсрии Свободно живущие альфа-протеобактерии/ облигатные альфа-протеобактерии облигатные альфа-протеобактерии/ облигатные гамма-протеобактерии Р = 0.018 (56/22) Р = 0.032 (16/6) Р = 0.815 (20/16) Р = 0.054 (16/6) Р = 0.002 (44/15) Р = 0.059 (13/6) Р = 0.163 (17/9) Р = 0.165 (9/6)

Плотность мобильных элементов

Значения Ka/Ks отрицательно коррелируют с плотностью мобильных элементов (плотность мобильных элементов - это количество плазмид, профагов и транспозирующих элементов на один миллион пар нуклеотидов генома; Kendall tau = -0.305; Р = 0.0014; N = 46) (рис. 7). После удаления из выборки двух видов с нулевым числом мобильных элементов ([Buchnera aphidicola APS и Buchnera aphidicola Sg) мы построили линейную регрессию 1п(плотность мобильных элементов) от ln(Ka/Ks), которая подтвердила наблюдаемый тренд ln(Ka/Ks) = -1.297 -0.363х1п(плотность мобильных элементов), г2= 0.138, Р = 0.013. Мы также учли зависимость анализируемых данных, используя линейную модель смешанных эффектов, и всё равно наблюдали значимую отрицательную регрессию ln(Ka/Ks) = -0.670 -0.619х1п(плотность мобильных элементов), Р = 0.0012. Плотности плазмид, профагов и транспозирующих элементов по отдельности также демонстрировали значимую ранговую корреляцию с Ka/Ks. Плотность мобильных элементов, определенная как число мобильных генов, деленное на число всех генов в геноме, также демонстрировала отрицательную взаимосвязь с Ka/Ks (Kendall rank корреляция: tau = -0.329, Р < 0.001, N = 46; стандартная линейная регрессия: ln(Ka/Ks) = - 3.891 - 0.396><1п(плотность мобильных элементов), Р = 0.008, N = 44.

Ka/Ks о Ö

О О

V °о о8о ° оГ о <р о о о

53 ИХ) 150 плотность мобильных элементов

Рис.7. Связь Ка/Кв и плотности мобильных элементов для 46 бактериальных геномов. Плотность мобильных элементов была оценена как число мобильных элементов на миллион пар оснований бактериального генома. 31 вид свободноживущих бактерий (белые кружки) и 15 видов облигатных внутриклеточных бактерий (серые кружки).

4.3. Обсуждение полученных результатов

Неожиданным оказалось, что митохондриальные гены, несмотря на низкую эффективную популяционную численность и отсутствие рекомбинации, эффективнее удаляют слабовредные мутации по сравнению с ортологичными генами из облигатных внутриклеточных и даже свободноживущих протеобактерий, имеющих огромные эффективные популяционные численности и ненулевой уровень рекомбинации.

Более того, мы показали, что этот результат не может быть объяснен положительным отбором в бактериях, так как значения Ка/Кэ были меньше 1 во всех моделях (2а, 2Ь и 2с), где значения Ка/Кя оценивались отдельно для ветвей или поддеревьев (но были усреднены по всем сайтам). Кроме того, значения Ка/Кз были меньше 1 для всех классов сайтов, которые были анализированы в сайт-специфичных моделях (7 и 8), подразумевающих, что естественный отбор действует с различной силой на разные сайты (но значения Ка/Кэ были усреднены по всем ветвям дерева). Поскольку адаптивная эволюция может затрагивать всего несколько сайтов в течение нескольких временны'х интервалов, оба подхода усреднения скоростей, по сайтам или по времени (по ветвям), могут не выявить положительный отбор. Однако мы утверждаем, что наш эксперимент был построен таким образом, что анализ консервативных генов на наружных ветках дерева (модель с) позволяет нам игнорировать возможность положительного отбора. И действительно, поскольку мы анализировали только наружные ветки, возможные события положительного отбора на более глубоких ветвях дерева не могли повлиять на наши результаты. С другой стороны маловероятно, что события положительного отбора на наружных ветках (например, в бактериальных видах) могли быть такими многочисленными и универсальными, что могли полностью определить наблюдаемый тренд.

Наши результаты не смещены из-за эффекта насыщения синонимичных сайтов на длинных ветках или стохастических ошибок на слишком коротких ветках, поскольку анализ, проведенный на видах с оптимальной длиной внешней ветки, продемонстрировал схожий тренд в большинстве моделей. Кроме того, анализ Кг/Кс, менее чувствительный к эффекту насыщения, показал схожие тренды.

Мы также использовали модели, которые учитывают возможность разного использования синонимичных кодонов среди анализированных групп видов, но все-таки, мы не исключаем возможности, что эффект смещения по использованию синонимичных кодонов был учтен не полностью. Мы можем предположить, что свободноживущие бактерии с высоким Ne имеют более высокие значения Ka/Ks по сравнению с митохондриями из-за удаления некоторых синонимичных замещений в связи с предпочтением в использовании определенных синонимичных кодонов (другими словами - из-за естественного отбора, действующего на синонимичные замещения). Если такой отбор существует, он будет приводить к недооценке значения Ks, и, соответственно, к завышению значения Ka/Ks. Чтобы проверить эту гипотезу, мы оценили вероятность использования кодонов (codon usage) как расстояние Куллбак-Лейблера (Kullback-Leibler), или относительную энтропию. K(f|| f) = ZfrIn(W), где f - это наблюдаемое вероятностное распределение m кодонов в анализируемом геноме (загружено с Codon Usage Database (Nakamura, Gojobori et al. 2000)) и, f — это частота кодонов при предположении об одинаковом использования кодонов. Если сравниваемые распределения одинаковы, то значение относительной энтропии будет маленьким. У нас получилось, что средняя относительная энтропия максимальна для геномов свободноживущих бактерий (средняя К=257, N=51), средняя для геномов облигатных внутриклеточных бактерий (К=225, N=19) и минимальная для митохондрий (К=191, N=33). Однако сравнение средних не выявило никаких значимых различий между группами (Mann-Whitney U-test), и поэтому мы сделали вывод, что сдвиг по использованию кодонов не может сильно влиять на наши результаты.

Поскольку мы анализировали только одну последовательность из каждого вида, игнорируя полиморфизмы внутри видов, некоторые полиморфные мутации могли внести вклад в значения Ka/Ks, полученные в нашей работе. В случае синонимичных мутаций (если учитывать, что они нейтральны) ожидаемый полиморфизм при мутационно-селективном равновесии пропорционален эффективной численности популяции (Wright 1931). В то же время, полиморфные слабовредные несинонимичные замещения должны сегрегировать с большей частотой в популяциях с низкой Ne по сравнению с популяциями с высокой Ne. Таким образом, оба эффекта должны приводить к недооценке значений Ka/Ks в бактериальных генах и к переоценке значений Ka/Ks в генах митохондрий. Поскольку в нашей работе значения Ka/Ks для бактериальных генов выше, чем для митохондриальных, удаление эффекта полиморфных замещений (что приведет к увеличению значений Ka/Ks у бактерий и уменьшению значений Ka/Ks у митохондрий) только усилит наши результаты.

Таким образом, положительный отбор, неравномерное использование кодонов, стохастические ошибки, эффекты насыщения и влияние полиморфных замещений не объясняют нашего наблюдения, что очищающий отбор более эффективен в митохондриях млекопитающих по сравнению с облигатными внутриклеточными бактериями и, по крайней мере, такой же, как и у свободноживущих бактерий.

Скорее всего, хотя митохондриальные гены выполняют те же функции, что и их бактериальные ортологи, они испытывают более сильные эволюционные ограничения, чему может быть несколько причин. Во-первых, Комплекс I в митохондриях млекопитающих содержит большее число субъединиц (45 в митохондриях против 14 в бактериях (Yagi 1993), что приводит к большему числу белок-белковых взаимодействий, и соответственно, к более медленной белковой эволюции. Во-вторых, раннее высказывалось мнение, что эффективное удаление слабовредных мутаций из мтДНК во время атрезии яйцеклеток у самок млекопитающих достигается за счет апоптоза яйцеклеток с дефектной мтДНК (Krakauer and Mira 1999) (Perez, Trbovich et al. 2000) (Bergstrom and Pritchard 1998). В-третьих, такие дополнительные факторы, как важность белка или уровень экспрессии могут усиливать эволюционные ограничения, действующие на митохондриальные гены (Hirsh and Fraser 2001) (Pal, Papp et al. 2001). Хотя логично предположить, что важность белка и уровень экспрессии должны быть выше в случае митохондриальных генов по сравнению с их бактериальными ортологами, мы не знаем работ, которые подтверждали бы эти предположения. Поэтому дальнейшие исследования помогут в определении причин повышенной эволюционной стабильности митохондриальных белок-кодирующих генов по сравнению с их бактериальными ортологами.

Широко принятая гипотеза о деградации митохондриального генома основана как на теоретических (Hoekstra 2000), так и на эмпирических данных (Lynch 1996; Lynch 1997; Lynch and Blanchard 1998). Поскольку митохондрии характеризуются низкой эффективной численностью и отсутствием рекомбинации, молекулярная эволюция митохондриальных генов должна быть связана с высокой скоростью накопления слабовредных мутаций. Существует ряд работ, сравнивающих митохондриальные гены тРНК с ядерными генами тРНК и подтверждающих эти предположения (Lynch 1996; Lynch 1997; Lynch and Blanchard 1998). Но данный подход не совсем адекватен, так как ядерные и митохондриальные гены тРНК не ортологичны, и поэтому изначально имеют разные функциональные и структурные ограничения. В нашей работе мы провели сравнение ортологичных генов из митохондрий и протеобактерий, и не наблюдали никакой повышенной деградации митохондриального генома. Поэтому мы можем предположить, что существуют дополнительные факторы (например, те, о которых было сказано выше), которые поддерживают эффективность очищающего отбора в митохондриях на высоком уровне, несмотря на их низкую эффективную численность и отсутствие рекомбинации.

Хотя наша работа полностью не опровергает гипотезу о необратимом накоплении слабовредных мутаций в нерекомбинирующих генах митохондрий, мы настаиваем, что скорость храповика Мёллера в современных митохондриальных генах, по крайней мере, медленнее, чем в их экологических эквивалентах, облигатных внутриклеточных эндосимбионтах. Скорость храповика Мёллера зависит от числа оптимальных индивидуумов по, с наименьшим числом слабовредных мутаций. Если по низкое, то существует большой шанс случайного вымирания таких особей без возможности оставить потомство, и тогда храповик совершит один щелчок: новый класс По индивидуумов будет уже немного хуже, чем предыдущий, поскольку будет содержать большее число слабовредных мутаций. Хейг показал, что при аддитивном взаимодействии слабовредных мутаций количество индивидуумов в оптимальном классе можно описать уравнением: -К т -U/s

По - Ne где Ne — эффективная численность популяции, U - скорость появления новых слабовредных мутаций на геном на поколение, s - коэффициент отбора против слабовредных мутаций (Haigh 1978).

Мы считаем, что по в митохондриях значительно выше, чем в облигатных внутриклеточных эндосимбионтах, благодаря более высокому s (поскольку более низкие значения Ka/Ks наблюдались в митохондриях) и более низкому или такому же U (из-за меньшего размера митохондриального генома (-16500 пар оснований)), но более высокой скорости мутирования на нуклеотид на поколение. Таким образом, при всех прочих равных (Ne и скорость мутирования на нуклеотид на поколение) скорость храповика Мёллера должна быть меньше в митохондриях.

Хотя два из четырех значений Кг/Кс показали более эффективный очищающий отбор в митохондриях по сравнению с бактериями, нам кажется, что Кг/Кс менее чувствителен к различиям в силе очищающего отбора между видами.

Более высокие значения Ka/Ks у облигатных внутриклеточных бактерий по сравнению со свободноживущими согласуются с теоретическими данными. Эти результаты объясняются низкой эффективной численностью и отсутствием рекомбинации у облигатных внутриклеточных протеобактерий.

Мы наблюдали более высокую эффективность очищающего отбора в облигатных внутриклеточных альфа-протеобактериальных паразитах по сравнению с облигатными внутриклеточными гамма-протеобактериальными симбионтами. Поскольку обе группы проходят через так называемое бутылочное горлышко в связи с внутриклеточным облигатным образом жизни, разница в эффективности очищающего отбора вряд ли связана с разной эффективной численностью популяций. Ранее предполагалось, что поскольку облигатные паразитические бактерии чаще меняют своих хозяев, чем облигатные эндосимбионты, наследуемые строго вертикально в линии хозяина, то после горизонтального переноса паразитические колонии могут рекомбинировать (Bordenstein and Reznikoff 2005). Таким образом, наиболее правдоподобным объяснением наблюденной разницы в эффективности очищающего отбора может служить наличие более высокого уровня рекомбинации у облигатных внутриклеточных паразитических альфа-протеобактерий.

Недавно при межгеномном сравнении облигатных внутриклеточных паразитов и эндосимбионтов было показано, что в паразитических геномах содержится намного больше мобильных элементов (Bordenstein and Reznikoff 2005). Отрицательная зависимость между плотностью мобильных элементов и Ka/Ks служит хорошим эмпирическим доказательством того, что более высокий уровень рекомбинации приводит к более эффективному удалению слабовредных мутаций. Однако причинно-следственная связь между силой очищающего отбора и различными типами мобильных элементов может быть разной, (i) Так, отрицательная зависимость плотности транспозонов и Ka/Ks, скорее всего, объясняется влиянием уровня рекомбинации на оба параметра. Рекомбинация увеличивает как плотность транспозонов, так и эффективность очищающего отбора (то есть 1 -Ka/Ks). Это может означать, что между плотностью транспозонов и силой очищающего отбора нет прямой причинно-следственной связи, (и) Но всё же, другие мобильные элементы, плазмиды и умеренные фаги, определяют число событий рекомбинации, и поэтому с увеличением их числа происходит усиление эффективности очищающего отбора. Поэтому мобильные элементы, индуцируя рекомбинацию в бактериальных геномах, выполняют адаптивную роль, увеличивая эффективность очищающего отбора, благотворно влияя на эволюцию хозяйской ДНК (Kidwell and Lisch 2000).

Данное исследование наглядно демонстрирует, что, сравнивая характер молекулярной эволюции экологически различных групп, можно выявить генетические последствия различного образа жизни. При сравнении силы очищающего отбора в различных протеобактериях, характеризующихся разным образом жизни, мы получили теоретически ожидаемые результаты. Низкие значения эффективной численности популяции и уровня рекомбинации в облигатных внутриклеточных протеобактериях приводят к менее эффективному удалению слабовредных мутаций по сравнению со свободноживущими родственными видами. Редкие горизонтальные переносы, т.е. эффективно нулевой уровень рекомбинации в симбиотических облигатных внутриклеточных протеобактериях, приводит к менее эффективному очищающему отбору, чем в паразитических облигатных внутриклеточных протеобактериях, где высокая частота рекомбинации, связанная с высокой плотностью мобильных элементов, приводит к более эффективному удалению слабовредных мутаций. В то же время, более эффективный очищающий отбор, который мы наблюдали в относительно маленьких популяциях бесполых митохондрий по сравнению с огромными популяциями свободноживущих протеобактерий, был неожиданным, поскольку противоречит общепринятой теории. По-видимому, существуют дополнительные причины, такие как большое число белок-белковых взаимодействий или атрезия яйцеклеток у самок, поддерживающие эффективный очищающий отбор в митохондриях.

5. ОБСУЖДЕНИЕ В данной работе мы получили два, на первый взгляд, противоречащих друг другу результата: (i) более быстрое накопление слабовредных мутаций в митохондриальном геноме крупных млекопитающих (Popadin, Polishchuk et al. 2007) и (ii) более эффективный (или, по крайней мере, не менее эффективный) отбор в митохондриальных генах млекопитающих по сравнению с отбором в генах ортологах протеобактерий (Mamirova, Popadin et al. 2007). Если первый результат говорит о более быстрой деградации митохондриальных геномов крупных млекопитающих по сравнению с мелкими млекопитающими, то второй результат показывает нам, что вся эта деградация происходит с такой же или даже меньшей скоростью, чем накопление мутаций у протеобактерий. Поскольку протеобактерии имеют огромные рекомбинирующие популяции и не показывают никаких признаков деградации и потенциального вымирания, то совокупность этих результатов парадоксальна с точки зрения популяционной генетики. Необходимо привлечь какие-то дополнительные факторы, которые влияют на силу очищающего отбора в митохондриях или бактериях и которые нарушают предположение о всех прочих равных, принятое в начале работы. Например, гены дыхательного комплекса бактерий могут быть менее ограничены эволюционно из-за меньшего уровня экспрессии этих генов, а также в связи с наличием нескольких альтернативных путей синтеза АТФ. В этом случае повышенная скорость накопления аминокислотных замен у бактерий может быть следствием меньших эволюционных ограничений, накладываемых на гены дыхательной цепи бактерий.

Таким образом, получается, что отбор у крупных млекопитающих достаточно эффективен (по сравнению с бактериями), и немного повышенные скорости фиксации слабовредных мутаций (по сравнению с мелкими млекопитающими) являются лишь отражением более низкой эффективной численности крупных млекопитающих.

Может ли повышенная скорость накопления вредных мутаций у крупных млекопитающих представлять собой процесс, потенциально грозящий вымиранием крупных млекопитающих? Попытаемся ответить или, по крайней мере, найти подходы к ответу на данный вопрос.

Влияние компенсаторных мутаций Если бы в эволюции существовали только слабовредные мутации, то единственным эволюционным трендом всех видов была бы непрерывная (пусть даже очень медленная) деградация, ведущая к вымиранию. Очевидно, что большую роль должны играть и слабополезные мутации, восстанавливающие приспособленность и компенсирующие накопленные ранее слабовредные мутации. Недавно было показано, например, что перемещение видов с острова на материк, сопровождаемое увеличением эффективной численности популяции, приводит к краткосрочному ускорению темпа эволюции за счёт фиксации большого количества слабополезных мутаций, компенсирующих накопленные ранее (при жизни на острове) слабовредные (Charlesworth and Eyre-Walker 2007). Таким образом, теоретически наши результаты могут объясняться быстрым накоплением как слабовредных, так и слабополезных мутаций у крупных видов, и в этом случае быстрая аминокислотная скорость эволюции крупных видов может быть не связана с понижением их приспособленности. Действительно, эти два класса мутаций (слабовредные и слабополезные) сложно отличить нашими методами, поскольку слабополезные мутации также могут быть несинонимичными и радикальными, как и слабовредные. Для ответа на вопрос о том, какие же мутации вносят вклад в обнаруженные нами зависимости, мы реконструировали аминокислотную последовательность всех митохондриально кодируемых белков на каждом узле дерева и сравнили физико-химическую дистанцию между белком последнего предка и современным видом (Глава 3). Если слабополезные мутации полностью компенсируют эффект слабовредных, мы обнаружим, что физико-химическая дистанция между предковым белком и современным в среднем одинакова и не зависит от массы тела. Однако мы обнаружили, что физико-химическая дистанция между предковым белком и современным больше для крупных млекопитающих, чем для мелких (Popadin, Polishchuk et al. 2007). Таким образом, класс слабополезных мутаций, по крайней мере, не компенсирует полностью эффект слабовредных мутаций, и приспособленность крупных млекопитающих плавно уменьшается с накоплением всё большего и большего числа слабовредных мутаций. Однако, вполне возможно, что у крупных млекопитающих доля компенсаторных мутаций может быть выше. При этом физико-химическая дистанция может увеличиваться, а приспособленность организма (активность фермента) восстанавливаться. Косвенно это предположение о большей частоте компенсаторных мутаций подтверждается повышенными значениями отношения частот транзиций к трансверсиям у крупных млекопитающих, полученными в нашей работе (данные не приведены). Однако более точно оценить долю компенсаторных мутаций у крупных и мелких млекопитающих нужно в отдельной работе, в которой помимо анализа белков удобно воспользоваться молекулами транспортных РНК (Kern and Kondrashov 2004).

Скорость накопления слабовредных мутаций и число слабовредных мутаций в геноме

Следует помнить, что в этой работе мы оценивали лишь скорости накопления слабовредных мутаций относительно скоростей накопления нейтральных и никак не оценивали качество генома самого по себе. Мы поняли, что скорость накопления слабовредных мутаций относительно нейтральных у крупных млекопитающих выше, чем у мелких, однако мы также знаем, что темп мутирования на геном на единицу времени, и, соответственно, скорость нейтральной эволюции, выше у мелких млекопитающих в связи с большим числом поколений, и, следовательно, раундов репликации ДНК клеток половой линии на единицу времени (generation-time hypothesis (Nikolaev, Montoya-Burgos et al. 2007; Nabholz, Glemin et ai. 2008)). Однако остаётся открытым вопрос об общем числе вредных мутаций в геноме, и, соответственно, о приспособленности разных организмов (Kondrashov 1995). Каков будет общий результат? Какой геном будет хуже - тот, в котором образуется много мутаций в единицу времени, из которых фиксируется небольшая доля (мелкие млекопитающие), или тот, в котором образуется мало мутаций в единицу времени, но фиксируется большая доля от них (крупные млекопитающие)? Или в результате скорость аминокислотной эволюции окажется примерно одинаковой? Единственная мера, не нормированная на нейтральную скорость эволюции в наших методах — это расстояние Грантама, однако даже в этой мере косвенно присутствует нормировка на уровень дивергенции, поскольку расстояние Грантама усреднялась только по различающимся аминокислотным позициям, а число это, естественно, зависит от уровня дивергенции.

Чтобы перейти от усреднённой вредности каждой аминокислотной замены к тотальной, мы повторили анализ с расстоянием Грантама на 110 видах млекопитающих, проведённый в главе 3, однако на этот раз мы не усредняли расстояние Грантама по всем аминокислотным заменам, а складывали её, получая тотальную меру физико-химического различия между белками современного млекопитающего и его последним реконструированным предком. Оказалось, что общее физико-химическое различие на внешних ветвях филогенетического древа оказалось значимо больше для мелких по сравнению с крупными млекопитающими (суммарное расстояние Грантама = 17411.0 -743.5*Ьп\У, Р < 0.001, Я2=0.146). суммарное расстояне Грантама в зависимости от массы тела масса тела (1гМ/)

Рисунок 8. Зависимость суммарного расстояния Грантама, оцененного между современным видом и его последним реконструированным предком, от массы тела вида, соответствующего данной ветви филогенетического древа.

Итак, суммировав физико-химические расстояния всех аминокислотных замещений, мы получили картину, противоположную рисунку 4Р, в котором мы использовали усреднённую дистанцию. Как можно объяснить оба рисунка - 4Р и 8?

Скорее всего, мелкие млекопитающие накапливают много мутаций со слабым эффектом, тогда как крупные накапливают мало мутаций, но с более сильным эффектом (более далёкие по физико-химическим свойствам аминокислотные замещения). В этом случае ожидается, что число аминокислотных замещений на внешних ветвях мелких млекопитающих будет значимо больше по сравнению с крупными, а тотальная мера физико-химического расстояния пропорциональна числу аминокислотных замещений. Действительно, оба эти предположения оказались верными: Количество аминокислотных замещений на внешней ветви филогенетического древа млекопитающих оказалось значимо большим для ветвей, соответствующих мелким млекопитающим (число аминокислотных замещений = 317.940 - 14.267х1лМ, Р < 0.001, Я2=0.18). число аминокислотных замещений в зависимости от массы тела масса тале (1п\Л/)

Рисунок 9. Зависимость числа аминокислотных замещений на внешней ветви от массы тела соответствующего данной ветви современного вида млекопитающего.

1) суммарное расстояние Грантама оказалось прямо пропорционально числу аминокислотных замещений на внешних ветвях филогенетического древа (суммарное расстояние Грантама = -6.638 + 56.667*(число аминокислотных замещений), Р < 0.001, Я2=0.99). Когда мы построили линии регрессии отдельно для крупных и мелких млекопитающих (относительно медианы - 8400 грамм), мы получили две почти параллельные линии: суммарное расстояние Грантама = -494.7887+57.7550х(число аминокислотных замещений), Р < 0.001, Я2=0.99 для мелких млекопитающих и суммарное расстояние Грантама = 166.1356+ 56.9787х(число аминокислотных замещений), Р < 0.001, Я2=0.99 для крупных млекопитающих. Две почти параллельные линии отличаются на 660 единиц по матрице Грантама, что соответствует трём - четырём далёким аминокислотным заменам. число аммюкислотных имеирнт

Рисунок 10. Зависимость суммарного расстояния Грантама от длины внешней ветви, выраженной в числе аминокислотных замещений между современным видом и его последним реконструированным предком. Серые точки и серая линия соответствуют крупным млекопитающим, черные точки и черная линия — мелким млекопитающим.

Итак, получается, что два фактора влияют на расстояние Грантама — размер тела и длина внешней ветви, выраженной в числе аминокислотных замещений. Однако, когда мы сделали множественную линейную регрессию (среднее расстояние Грантама = 52.0853 + 0.4977хЬп\\г + 0.4488х(число аминокислотных замещений)) оказалось, что эффект массы тела является доминирующим (р < 0.001) а значимость длины ветви пропадает (р = 0.64).

Итак, получается, что мелкие млекопитающие имеют высокий темп мутирования и, соответственно, к ним ведут длинные ветви филогенетического древа. Важно отметить, что для мелких млекопитающих ветки дерева являются более длинными в обоих смыслах - как в смысле количества нейтральных мутаций, так и в смысле общего количества аминокислотных замещений. Однако параллельно с этим они имеют высокую эффективную численность популяций, и сильный очищающий отбор элиминирует все наиболее вредные мутации. Крупные же млекопитающие имеют низкий темп мутирования на геном на единицу времени и, соответственно, к ним ведут короткие ветви древа. Однако в силу низкой численности своих популяций они подвержены накоплению слабовредных мутаций в результате генетического дрейфа. В итоге, как показали наши исследования (рисунок 8) мелкие млекопитающие быстрее удаляются в физико-химическом пространстве от своего последнего предка. То есть высокий темп мутирования на единицу времени, сопряжённый с эффективным очищающим отбором, у мелких млекопитающих в результате всё же приводит к их более быстрой эволюции на аминокислотном уровне (более быстрое накопление аминокислотных замещений и увеличение общего расстояния Грантама). Эти результаты являются аргументом против гипотезы мутационного плавления крупных млекопитающих, однако всё же они не опровергают эту гипотезу полностью. Предположим, что приспособленность организма зависит лишь от нескольких важных аминокислотных позиций и от того, какие аминокислоты находятся в них, зависит вероятность вымирания. В этом случае общая статистика аминокислотных замен даст нам мало информации, а вот вредность мутаций в некоторых ключевых аминокислотных позициях будет определять приспособленность. Другими словами, небольшое число более вредных аминокислотных замен в крупных млекопитающих может оказаться принципиальным и определять пониженную приспособленность популяции и, соответственно, повышенную вероятность вымирания. Более того, большое число аминокислотных замещений, зафиксированных на внешних ветвях, ведущих к мелким млекопитающим, должны обладать очень слабыми (близким к нулю) коэффициентами отбора, поскольку все вредные мутации эффективно элиминируются из популяций мелких млекопитающих. В то же время, небольшое число мутаций, зафиксированных в геномах крупных млекопитающих, может обладать достаточно большим отрицательным коэффициентом отбора.

Планы на будущее

Получается, что пока мы не можем ответить на вопрос — чей митохондриальный геном хуже? Интересно было бы оценить абсолютную приспособленность каждого митохондриального генома, аппроксимируя её числом вредных мутаций по сравнению с идеальным митохондриальным геномом. Для сравнения абсолютной приспособленности митохондриальных геномов млекопитающих, нам необходимо вернуться к платоновской и аристотелевской концепции "идеала", когда реально существующие объекты являются лишь несовершенными приближениями к этому идеалу (рисунок 11).

Рисунок 11. Заражённость генома представляет собой число слабовредных мутаций в геноме. При строгом мутационно-селективном равновесии эта заражённость остаётся постоянной во времени, однако накопление эффективно-нейтральных мутаций приводит к постоянному сползанию этого равновесия в сторону большей заражённости генома вредными мутациями. В случае мутационного плавления скорость накопления слабовредных мутаций увеличивается дополнительно за счёт уменьшения популяционной численности. Например, популяция слонов находится ближе к порогу мутационного плавления, чем популяция мышей по двум независимым причинам - (1) низкая и, следовательно, большое число фиксирующихся слабовредных мутаций и (и) низкая скорость размножения по сравнению с мелкими млекопитающими, в результате чего достичь порога мутационного плавления (< 2 потомков, доживших до половой зрелости, от каждой пары организмов) для крупных млекопитающих намного проще.

Как восстановить метафизическую сущность митохондриального генома и как реконструировать биоинформатически такой идеальный геном? По видимому, реконструированный митохондриальный геном предка всех млекопитающих может играть роль идеального генома по двум причинам - во-первых, мы знаем, что данный организм привёл к появлению всех ныне существующих видов млекопитающих и, следовательно, по определению, его приспособленность должна быть высокой; во-вторых, известно, что первые млекопитающие были мелкими животными, которые должны были иметь достаточно высокую численность, и, соответственно, эффективный очищающий отбор.

Мы провели пилотный анализ, в котором, воспользовавшись реконструированным предком всех млекопитающих, полученном алгоритмом максимального правдоподобия (Yang 1997), мы оценили три параметра для каждого современного вида - число аминокислотных замещений, среднее расстояние Грантама и суммарное расстояние Грантама от предка всех млекопитающих. Далее, мы построили регрессии между исследуемыми тремя параметрами и массой тела современных видов. Ни один из анализов не показал значимой регрессии, отличной от нулевой. То есть, как крупные, так и мелкие млекопитающие оказались равно удалёнными от общего предка с точки зрения общего числа аминокислотных замен, усреднённого расстояния Грантама и суммарного расстояния Грантама. Почему? Ведь мы ожидали, что, по крайней мере, общее число аминокислотных замен, в соответствии с повышенным темпом мутирования мелких млекопитающих, должно быть выше у мелких млекопитающих. Но мы такого не увидели. Возможно, неадекватно реконструирован предок? Возможно и другое. До сих пор все анализы мы проводили на внешних ветвях дерева, и сравнивали аминокислотные последовательности на коротких эволюционных временах - между последним реконструированным предком и современным видом. При таком подходе мы могли игнорировать положительный отбор, который навряд ли мог быть столь мощным, чтобы независимо влиять на особенности молекулярной эволюции каждого изучаемого вида млекопитающего. Однако в нашем последнем анализе мы перешли на большие временные рамки и стали сравнивать последовательности, отстоящие друг от друга более чем на сотню миллионов лет. Теперь, этапы положительного отбора, которые моглы быть в глубокой филогении млекопитающих, будут заметны и смогут сильно исказить результаты наших анализов, отодвигая млекопитающих, в истории которых был положительный отбор в каком либо гене дыхательной цепи, в физико-химическом пространстве от их общего предка. Таким образом, необходимо удалить все события потенциального положительного отбора из дерева млекопитающих прежде чем оценивать физико-химическое расстояние между предком и современными видами.

Альтернативным направлением для проверки связи между накоплением слабовредных мутаций и приспособленностью можно считать сравнение митохондриальных геномов вымерших и не вымерших млекопитающих, а также краснокнижных и не краснокнижных видов. В этом случае мы будем сравнивать выборки организмов, для которых заранее известно различие в их приспособленности -вымершие виды должны обладать меньшей приспособленностью, чем не вымершие виды; краснокнижные виды, находящиеся под угрозой исчезновения, скорее всего, обладают приспособленностью меньшей, чем не краснокнижные виды. К настоящему моменту полный митохондриальный геном отсеквенирован лишь для шести вымерших видов млекопитающих (американский мастодонт Mammut americanum, мамонт Mammuthus primigenius, неандерталец Homo sapiens neanderthalensis, пещерный медведь Arctodus simus, шерстистый носорог Coelodonta antiquitatis, тасманский волк Thylacinus cynocephalus), однако уже этих данных достаточно для первых анализов. Количество краснокнижных видов млекопитающих доходит до ста. Таким образом, в будущем необходимо провести адекватный биоинформатический и статистический анализы на данных выборках для выявления генетической компоненты приспособленности.

5.ВЫВОДЫ

1. Сравнение параметров молекулярной эволюции крупных и мелких млекопитающих, а также облигатных внутриклеточных и свободно-живущих протеобактерий показало повышенную скорость накопления слабовредных мутаций в малочисленных популяциях.

2. Сравнение параметров молекулярной эволюции эндосимбиотических и паразитических бактерий, а также плотности мобильных элементов у всех протеобактерий показало повышенную эффективность очищающего отбора в геномах с более высоким уровнем рекомбинации.

3. Сравнение эволюционно далеких митохондриальных и протеобактериальных геномов, показало более эффективный или, по крайней мере, не менее эффективный отбор в малочисленных и нерекомбинирующих митохондриальных геномах по сравнению с более многочисленными и рекомбинирующими геномами протеобактерий. Это ставит под сомнение существующие теории о постоянной и необратимой деградации митохондриального генома млекопитающих, приводящей к мутационному плавлению видов.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

Alroy, J. (1998). "Cope's rule and the dynamics of body mass evolution in North American fossil mammals." Science 280(5364): 731-4.

Arkhipova, I. and M. Meselson (2000). "Transposable elements in sexual and ancient asexual taxa." Proc Natl Acad Sei U S A 97(26): 14473-7.

Au, H. K., S. H. Lin, et al. (2005). "Deleted mitochondrial DNA in human luteinized granulosa cells." Ann N Y Acad Sei 1042: 136-41.

Avise, J. С. (1986). "Mitochondrial DNA and the evolutionary genetics of higher animals." Philos Trans R Soc Lond В Biol Sei 312(1154): 325-42.

Bachtrog, D. (2005). "Sex chromosome evolution: molecular aspects of Y-chromosome degeneration in Drosophila." Genome Res 15(10): 1393-401.

Barraclough, T. G., D. Fontaneto, et al. (2007). "Evidence for inefficient selection against deleterious mutations in cytochrome oxidase I of asexual bdelloid rotifers." Mol Biol Evol 24(9): 1952-62.

Barritt, J. A., C. A. Brenner, et al. (1999). "Mitochondrial DNA rearrangements in human oocytes and embryos." Mol Hum Reprod 5(10): 927-33.

Barritt, J. A., C. A. Brenner, et al. (2000). "Spontaneous and artificial changes in human ooplasmic mitochondria." Hum Reprod 15 Suppl 2: 207-17.

Bazin, E., S. Giemin, et al. (2006). "Population size does not influence mitochondrial genetic diversity in animals." Science 312(5773): 570-2.

Bergstrom, С. Т. and J. Pritchard (1998). "Germline bottlenecks and the evolutionary maintenance of mitochondrial genomes." Genetics 149(4): 2135-46.

Birky, C. W., Jr. (1995). "Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes: mechanisms and evolution." Proc Natl Acad Sei U S A 92(25): 11331-8.

Blackburn, Т. M. and R. P. Duncan (2001). "Determinants of establishment success in introduced birds." Nature 414(6860): 195-7.

Bordenstein, S. R. and W. S. Reznikoff (2005). "Mobile DNA in obligate intracellular bacteria." Nat Rev Microbiol 3(9): 688-99.

Brook, B. W., L. W. Traill, et al. (2006). "Minimum viable population sizes and global extinction risk are unrelated." Ecol Lett 9(4): 375-82.

Brown, W. M., M. George, Jr., et al. (1979). "Rapid evolution of animal mitochondrial DNA." Proc Natl Acad Sei U S A 76(4): 1967-71.

Cardillo, M., G. M. Mace, et al. (2005). "Multiple causes of high extinction risk in large mammal species." Science 309Г5738): 1239-41.

Charlesworth, В. (2007). "Mutation-selection balance and the evolutionary advantage of sex and recombination." Genet Res 89(5-6): 451-73.

Charlesworth, J. and A. Eyre-Walker (2007). "The other side of the nearly neutral theory, evidence of slightly advantageous back-mutations." Proc Natl Acad Sei U S A 104(43): 16992-7.

Chen, X., R. Prosser, et al. (1995). "Rearranged mitochondrial genomes are present in human oocytes." Am J Hum Genet 57(2): 239-47.

Cortopassi, G. A. (2002). "Fixation of deleterious alleles, evolution and human aging." Mech Ageing Dev 123(8): 851-5.

Cortopassi, G. A. and N. Arnheim (1990). "Detection of a specific mitochondrial DNA deletion in tissues of older humans." Nucleic Acids Res 18(23): 6927-33.

Crow, J. F. (1993). "How much do we know about spontaneous human mutation rates?" Environ Mol Mutagen 21(2): 122-9.

Cummins, J. M. (2001). "Mitochondria: potential roles in embiyogenesis and nucleocytoplasmic transfer." Hum Reprod Update 7(2): 217-28.

Damuth, J. (1993). "Cope's rule, the island rule and the scaling of mammalian population density." Nature 365(6448): 748-50.

Denver, D. R., K. Morris, et al. (2000). "High direct estimate of the mutation rate in the mitochondrial genome of Caenorhabditis elegans." Science 289(5488): 2342-4.

Diaz-Uriarte, R. and T. Garland, Jr. (1998). "Effects of branch length errors on the performance of phylogenetically independent contrasts." Syst Biol 47(4): 654-72.

Elliott, H. R., D. C. Samuels, et al. (2008). "Pathogenic mitochondrial DNA mutations are common in the general population." Am J Hum Genet 83(2): 254-60.

Eyre-Walker, A. and P. D. Keightley (2007). "The distribution of fitness effects of new mutations." Nat Rev Genet 8(81: 610-8.

Eyre-Walker, A., P. D. Keightley, et al. (2002). "Quantifying the slightly deleterious mutation model of molecular evolution." Mol Biol Evol 19(12): 2142-9.

Eyre-Walker, A., M. Woolfit, et al. (2006). "The distribution of fitness effects of new deleterious amino acid mutations in humans." Genetics 173(2): 891-900.

Faith, J. J. and D. D. Pollock (2003). "Likelihood analysis of asymmetrical mutation bias gradients in vertebrate mitochondrial genomes." Genetics 165(2): 735-45.

Felsenstein, J. (1974). "The evolutionary advantage of recombination." Genetics 78(2): 73756.

Fisher, D. O. and I. P. Owens (2004). "The comparative method in conservation biology." Trends Ecol Evol 19(7): 391-8.

Gerber, A. S., R. Loggins, et al. (2001). "Does nonneutral evolution shape observed patterns of DNA variation in animal mitochondrial genomes?" Annu Rev Genet 35: 539-66.

Goldman, N. and Z. Yang (1994). "A codon-based model of nucleotide substitution for protein-coding DNA sequences." Mol Biol Evol 11(5): 725-36.

Grantham, R. (1974). "Amino acid difference formula to help explain protein evolution." Science 185(4154): 862-4.

Guindon, S. and O. Gascuel (2003). "A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood." Syst Biol 52(5): 696-704.

Guindon, S., F. Lethiec, et al. (2005). "PHYML Online-a web server for fast maximum likelihood-based phylogenetic inference." Nucleic Acids Res 33(Web Server issue): W557-9.

Haigh, J. (1978). "The accumulation of deleterious genes in a population—Muller's Ratchet." TheorPopul Biol 14(2): 251-67.

Hasegawa, M., Y. Cao, et al. (1998). "Preponderance of slightly deleterious polymorphism in mitochondrial DNA: nonsynonymous/synonymous rate ratio is much higher within species than between species." Mol Biol Evol 15(11): 1499-505.

Hickey, D. A. (1982). "Selfish DNA: a sexually-transmitted nuclear parasite." Genetics 101(3-4): 519-31.

Hirsh, A. E. and H. B. Fraser (2001). "Protein dispensability and rate of evolution." Nature 411(6841): 1046-9.

Ho, S. Y., M. J. Phillips, et al. (2005). "Time dependency of molecular rate estimates and systematic overestimation of recent divergence times." Mol Biol Evol 22(7): 1561-8.

Hoekstra, R. F. (2000). "Evolutionary origin and consequences of uniparental mitochondrial inheritance." Hum Reprod 15 Suppl 2: 102-11.

Howell, N., I. Kubacka, et al. (1996). "How rapidly does the human mitochondrial genome evolve?" Am J Hum Genet 59(31: 501-9.

Howell, N., C. B. Smejkal, et al. (2003). "The pedigree rate of sequence divergence in the human mitochondrial genome: there is a difference between phylogenetic and pedigree rates." Am J Hum Genet 72(3): 659-70.

Hsieh, R. H., N. M. Tsai, et al. (2002). "Multiple rearrangements of mitochondrial DNA in unfertilized human oocytes." Fertil Steril 77(5): 1012-7.

Hughes, A. L., T. Ota, et al. (1990). "Positive Darwinian selection promotes charge profile diversity in the antigen-binding cleft of class I major-histocompatibility-complex molecules." Mol Biol Evol 7(6): 515-24.

Ingman, M., H. Kaessmann, et al. (2000). "Mitochondrial genome variation and the origin of modern humans." Nature 408(6813): 708-13.

Ives, A. R. and J. Zhu (2006). "Statistics for correlated data: phylogenies, space, and time." Ecol Appl 16(1): 20-32.

Jansen, R. P. and G. J. Burton (2004). "Mitochondrial dysfunction in reproduction." Mitochondrion 4(5-6): 577-600.

Jansen, R. P. and K. de Boer (1998). "The bottleneck: mitochondrial imperatives in oogenesis and ovarian follicular fate." Mol Cell Endocrinol 145(1-2): 81-8.

Katoh, K., K. Kuma, et al. (2005). "MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment." Nucleic Acids Res 33(2): 511-8.

Katoh, K., K. Misawa, et al. (2002). "MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform." Nucleic Acids Res 30(14): 3059-66.

Keefe, D. L., T. Niven-Fairchild, et al. (1995). "Mitochondrial deoxyribonucleic acid deletions in oocytes and reproductive aging in women." Fertil Steril 64(3): 577-83.

Keightley, P. D. and A. Caballero (1997). "Genomic mutation rates for lifetime reproductive output and lifespan in Caenorhabditis elegans." Proc Natl Acad Sci U S A 94(8): 38237.

Keightley, P. D. and A. Eyre-Walker (2000). "Deleterious mutations and the evolution of sex." Science 290(5490): 331-3.

Kern, A. D. and F. A. Kondrashov (2004). "Mechanisms and convergence of compensatory evolution in mammalian mitochondrial tRNAs." Nat Genet 36(11): 1207-12.

Khrapko, K. and J. Vijg (2009). "Mitochondrial DNA mutations and aging: devils in the details?" Trends Genet 25(2): 91-8.

Kidwell, M. G. and D. R. Lisch (2000). "Transposable elements and host genome evolution." Trends Ecol Evol 15(3): 95-99.

Kimura, M. (1962). "On the probability of fixation of mutant genes in a population." Genetics 47: 713-9.

Kimura, M. (1979). "The neutral theory of molecular evolution." Sci Am 241(5): 98-100, 102, 108 passim.

Kimura, M. (1980). "A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences." J Mol Evol 16(2): 111-20.

Kimura, M. and T. Maruyama (1966). "The Mutational Load with Epistatic Gene Interactions in Fitness." Genetics 54(6): 1337-1351.

Kondrashov, A. S. (1982). "Selection against harmful mutations in large sexual and asexual populations." Genet Res 40(3): 325-32.

Kondrashov, A. S. (1988). "Deleterious mutations and the evolution of sexual reproduction." Nature 336(6198): 435-40.

Kondrashov, A. S. (1995). "Contamination of the genome by very slightly deleterious mutations: why have we not died 100 times over?" J Theor Biol 175(4): 583-94.

Kondrashov, A. S. (2001). "Sex and U." Trends Genet 17(2): 75-7.

Krakauer, D. C. and A. Mira (1999). "Mitochondria and germ-cell death." Nature 400(6740): 125-6.

Krishnan, N. M., H. Seligmann, et al. (2004). "Detecting gradients of asymmetry in site-specific substitutions in mitochondrial genomes." DNA Cell Biol 23(10): 707-14.

Li, W. H., M. Tanimura, et al. (1987). "An evaluation of the molecular clock hypothesis using mammalian DNA sequences." J Mol Evol 25(4): 330-42.

Lynch, M. (1996). "Mutation accumulation in transfer RNAs: molecular evidence for Muller's ratchet in mitochondrial genomes." Mol Biol Evol 13(1): 209-20.

Lynch, M. (1997). "Mutation accumulation in nuclear, organelle, and prokaryotic transfer RNA genes." Mol Biol Evol 14(9): 914-25.

Lynch, M. and J. L. Blanchard (1998). "Deleterious mutation accumulation in organelle genomes." Genetica 102-103(1-6): 29-39.

Lynch, M., R. Burger, et al. (1993). "The mutational meltdown in asexual populations." J Hered 84(5): 339-44.

Lynch, M., B. Koskella, et al. (2006). "Mutation pressure and the evolution of organelle genomic architecture." Science 311(5768): 1727-30.

Mamirova, L., K. Popadin, et al. (2007). "Purifying selection in mitochondria, free-living and obligate intracellular proteobacteria." BMC Evol Biol 7: 17.

McDonald, J. H. and M. Kreitman (1991). "Adaptive protein evolution at the Adh locus in Drosophila." Nature 351(6328): 652-4.

Meiklejohn, C. D., K. L. Montooth, et al. (2007). "Positive and negative selection on the mitochondrial genome." Trends Genet 23(6): 259-63.

Muller, H. J. (1964). "The Relation of Recombination to Mutational Advance." Mutat Res 106: 2-9.

Murphy, W. J., E. Eizirik, et al. (2001). "Molecular phylogenetics and the origins of placental mammals." Nature 409(6820): 614-8.

Nabholz, B., S. Glemin, et al. (2008). "Strong variations of mitochondrial mutation rate across mammals—the longevity hypothesis." Mol Biol Evol 25(1): 120-30.

Nachman, M. W. (1998). "Deleterious mutations in animal mitochondrial DNA." Genetica 102-103(1-6): 61-9.

Nakamura, Y., T. Gojobori, et al. (2000). "Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000." Nucleic Acids Res 28(1): 292.

Nekhaeva, E., N. D. Bodyak, et al. (2002). "Clonally expanded mtDNA point mutations are abundant in individual cells of human tissues." Proc Natl Acad Sci U S A 99(8): 55216.

Nielsen, R. and D. M. Weinreich (1999). "The age of nonsynonymous and synonymous mutations in animal mtDNA and implications for the mildly deleterious theory." Genetics 153(1): 497-506.

Nielsen, R. and Z. Yang (2003). "Estimating the distribution of selection coefficients from phylogenetic data with applications to mitochondrial and viral DNA." Mol Biol Evol 20(8): 1231-9.

Nikolaev, S. I., J. I. Montoya-Burgos, et al. (2007). "Life-history traits drive the evolutionary rates of mammalian coding and noncoding genomic elements." Proc Natl Acad Sei U S A 104(51): 20443-8.

Ohta, T. (1995). "Synonymous and nonsynonymous substitutions in mammalian genes and the nearly neutral theory." J Mol Evol 40(1): 56-63.

Ohta, T. (1998). "Evolution by nearly-neutral mutations." Genetica 102-103(1-6): 83-90.

Ohta, T. (2003). "Origin of the neutral and nearly neutral theories of evolution." J Biosci 28(4): 371-7.

Ohta, T. and J. H. Gillespie (1996). "Development of Neutral and Nearly Neutral Theories." Theor Popul Biol 49(2): 128-42.

Pakendorf, B. and M. Stoneking (2005). "Mitochondrial DNA and human evolution." Annu Rev Genomics Hum Genet 6: 165-83.

Pal, C., B. Papp, et al. (2001). "Highly expressed genes in yeast evolve slowly." Genetics 158(2): 927-31.

Paland, S. and M. Lynch (2006). "Transitions to asexuality result in excess amino acid substitutions." Science 311(5763): 990-2.

Parsons, T. J., D. S. Muniec, et al. (1997). "A high observed substitution rate in the human mitochondrial DNA control region." Nat Genet 15(4): 363-8.

Perez, G. I., A. M. Trbovich, et al. (2000). "Mitochondria and the death of oocytes." Nature 403(6769): 500-1.

Peterson, J. D., L. A. Umayam, et al. (2001). "The Comprehensive Microbial Resource." Nucleic Acids Res 29d): 123-5.

Petrov, D. A. (2001). "Evolution of genome size: new approaches to an old problem." Trends Genet 17(1): 23-8.

Polishchuk, L. V. (2002). "Ecology. Conservation priorities for Russian mammals." Science 297(5584): 1123.

Popadin, K., L. V. Polishchuk, et al. (2007). "Accumulation of slightly deleterious mutations in mitochondrial protein-coding genes of large versus small mammals." Proc Natl Acad Sei U S A 104(33): 13390-5.

Purvis, A., J. L. Gittleman, et al. (2000). "Predicting extinction risk in declining species." Proc Biol Sei 267(1456): 1947-52.

Raina, S. Z., J. J. Faith, et al. (2005). "Evolution of base-substitution gradients in primate mitochondrial genomes." Genome Res 15(5): 665-73.

Rand, D. M. and L. M. Kann (1998). "Mutation and selection at silent and replacement sites in the evolution of animal mitochondrial DNA." Genetica 102-103(1-6): 393-407.

Reynier, P., M. F. Chretien, et al. (1998). "Long PCR analysis of human gamete mtDNA suggests defective mitochondrial maintenance in spermatozoa and supports the bottleneck theory for oocytes." Biochem Biophys Res Commun 252(2): 373-7.

Santos, C., R. Montiel, et al. (2005). "Understanding differences between phylogenetic and pedigree-derived mtDNA mutation rate: a model using families from the Azores Islands (PortugaD." Mol Biol Evol 22(6): 1490-505.

Schon, E. A., S. H. Kim, et al. (2000). "Chromosomal non-disjunction in human oocytes: is there a mitochondrial connection?" Hum Reprod 15 Suppl 2: 160-72.

Schon, 1.1, and K. Martens (2000). "Transposable elements and asexual reproduction." Trends Ecol Evol 15(7): 287-288.

Smith , L. S., Ernest SKM, Jones KE, Kauffman DM, Dayan T, Marquet PA, Brown JH, Haskell JP (2003). "BODY MASS OF LATE QUATERNARY MAMMALS." Ecological Archives E084-094.

Stewart, J. B., C. Freyer, et al. (2008). "Purifying selection of mtDNA and its implications for understanding evolution and mitochondrial disease." Nat Rev Genet.

Stewart, J. B., C. Freyer, et al. (2008). "Strong purifying selection in transmission of mammalian mitochondrial DNA." PLoS Biol 6(1): elO.

Sullender, B. W. and T. J. Crease (2001). "The behavior of a Daphnia pulex transposable element in cyclically and obligately parthenogenetic populations." J Mol Evol 53(1): 63-9.

Swanson, W. J., R. Nielsen, et al. (2003). "Pervasive adaptive evolution in mammalian fertilization proteins." Mol Biol Evol 20(1): 18-20.

Taylor, R. W. and D. M. Turnbull (2005). "Mitochondrial DNA mutations in human disease." Nat Rev Genet 6(5): 389-402.

Taylor, W. R. (1986). "The classification of amino acid conservation." J Theor Biol 119(2): 205-18.

Thomas, C. M. and K. M. Nielsen (2005). "Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria." Nat Rev Microbiol 3(9): 711-21.

Thompson, J. D., T. J. Gibson, et al. (1997). "The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools." Nucleic Acids Res 25(24): 4876-82.

Trifunovic, A., A. Hansson, et al. (2005). "Somatic mtDNA mutations cause aging phenotypes without affecting reactive oxygen species production." Proc Natl Acad Sci U S A 102(50): 17993-8.

Trifunovic, A., A. Wredenberg, et al. (2004). "Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase." Nature 429(6990): 417-23.

Van Valkenburgh, B., X. Wang, et al. (2004). "Cope's rule, hypercarnivory, and extinction in North American canids." Science 306(5693): 101-4.

Wallace, D. C. (2005). "A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine." Annu Rev Genet 39: 359-407.

Wallace, D. C. (2007). "Why do we still have a maternally inherited mitochondrial DNA? Insights from evolutionary medicine." Annu Rev Biochem 76: 781-821.

Wernegreen, J. J. (2002). "Genome evolution in bacterial endosymbionts of insects." Nat Rev Genet 3(11): 850-61.

Wernegreen, J. J. and N. A. Moran (1999). "Evidence for genetic drift in endosymbionts (Buchnera): analyses of protein-coding genes." Mol Biol Evol 16(1): 83-97.

Woolfit, M. and L. Bromham (2003). "Increased rates of sequence evolution in endosymbiotic bacteria and fungi with small effective population sizes." Mol Biol Evol 20(9): 154555.

Woolfit, M. and L. Bromham (2005). "Population size and molecular evolution on islands." Proc Biol Sci 272(1578): 2277-82.

Wright, S. (1931). "Evolution in Mendelian Populations." Genetics 16(2): 97-159.

Yagi, T. (1993). "The bacterial energy-transducing NADH-quinone oxidoreductases." Biochim Biophvs Acta 1141(1): 1-17.

Yampolsky, L. Y., F. A. Kondrashov, et al. (2005). "Distribution of the strength of selection against amino acid replacements in human proteins." Hum Mol Genet 14(21): 3191201.

Yang, Z. (1997). "PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood." Comput Appl Biosci 13(5): 555-6.

Yang, Z. and R. Nielsen (1998). "Synonymous and nonsynonymous rate variation in nuclear genes of mammals." J Mol Evol 46(4): 409-18.

Yang, Z., R. Nielsen, et al. (2000). "Codon-substitution models for heterogeneous selection pressure at amino acid sites." Genetics 155(1): 431-49.

Yang, Z. and W. J. Swanson (2002). "Codon-substitution models to detect adaptive evolution that account for heterogeneous selective pressures among site classes." Mol Biol Evol 19(1): 49-57.

Zhang, J. (2000). "Rates of conservative and radical nonsynonymous nucleotide substitutions in mammalian nuclear genes." J Mol Evol 50(1): 56-68.

Кимура (1985). "Молекулярная эволюция: теория нейтральности."

Заключение диссертации по теме «Биоинформатика», Мамирова, Лейла Абдумажетовна

1. Сравнение параметров молекулярной эволюции крупных и мелких млекопитающих, а также облигатных внутриклеточных и свободно-живущих протеобактерий показало повышенную скорость накопления слабовредных мутаций в малочисленных популяциях.2. Сравнение параметров молекулярной эволюции эндосимбиотических и паразитических бактерий, а также плотности мобильных элементов у всех протеобактерий показало повышенную эффективность очищающего отбора в геномах с более высоким уровнем рекомбинации.3. Сравнение эволюционно далеких митохондриальных и протеобактериальных геномов, показало более эффективный или, по крайней мере, не менее эффективный отбор в малочисленных и нерекомбинирующих митохондриальных геномах по сравнению с более многочисленными и рекомбинирующими геномами протеобактерий. Это ставит под сомнение существующие теории о постоянной и необратимой деградации митохондриального генома млекопитающих, приводящей к мутационному плавлению видов.