Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, доктор биологических наук Андрианов, Борис Витальевич

• Андрианов, Борис Витальевич
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Андрианов, Борис Витальевич

Список сокращений:.

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 .Актуальность проблемы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Ретротранспозоны насекомых и связанная с ними изменчивость.

2.1.1. История открытия ретротранспозонов.

2.1.2. Гипотеза о ретровирусной природе МДГ.

2.1.3. Универсальная распространенность ретротранспозонов.

2.1.4. Стратегия экспрессии и основные группы ретротранспозонов.

2.1.5. Индуцированная ретротранспозиция в системах гибридного дисгенеза.

2.1.6 Стрессовая индукция ретротранспозиций.

2.1.7 Ретротранспозиция индуцированная межклеточным переносом ретротранспозонов.

2.2. Клеточные культуры насекомых и анализ генетической нестабильности в клеточных культурах.

2.2.1. Получение клеточных культур насекомых.

2.2.2. Кариологическая изменчивость клеточных культур насекомых.

2.2.3. Экспансия ретротранспозонов в клеточных культурах дрозофилы.

2.3. Митохондриальная изменчивость.

2.3.1. Структура и изменчивость митохондриального генома дрозофилы.

2.3.2. Структура и изменчивость регуляторного А-Т богатого района.

2.3.3. Изменчивость белок-кодирующих генов.

2.3.4. Изменчивость генов транспортных РНК (тРНК).

2.3.5. Изменчивость генов рибосомных РНК (рРНК).

2.3.6. Изменчивость межгенных последовательностей.

2.3.7. Изменчивость мтДНК при старении у дрозофилы.

2.3.8. Механизмы изменчивости мт-генома.

2.3.9. Многоуровневый отбор мт-гаплотипов.

2.3.10. Экспериментальные данные о влиянии храповика Меллера на митохондриальную изменчивость насекомых.

2.3.11. Экспериментальные доказательства селективной значимости митохондриальной изменчивости.

2.3.12. Коадаптация ядерного и митохондриального геномов.

2.3.13. Гетероплазмия у дрозофил.

2.3.14. Применение митохондриальной изменчивости для реконструкций филогенеза.

2.3.15. Теория популяционных систем.

2.3.16. Группа близкородственных видов дрозофил умНв.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Объекты исследования.

3.1.1. Эмбриональные пересеваемые линии клеток дрозофилы.

3.1.2. Линии мух.

3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.2 Выделение вирусоподобных частиц.

3.2.1. Выделение вирусоподобных частиц из культуры клеток.

3.2.2. Упрощенный метод выделения цитоплазматических ВПЧ для количественных сравнений.

3.2.3. Выделение вирусоподобных частиц из мух для изучения инфекционности.

3.3 Очистка вирусоподобных частиц.

3.3.1. Очистка вирусоподобных частиц в градиенте сахарозы.

3.3.2. Фракционирование ВПЧ в агарозных гелях.

3.4. Электронная микроскопия.

3.5. Выделение нуклеиновых кислот.

3.5.1. Выделение плазмидной ДНК.

3.5.2. Выделение геномной ДНК.

3.5.3. Выделение митохондриальной ДНК.

3.5.4. Выделение кольцевой внехромосомной ДНК.

3.5.5. Выделение суммарной клеточной поли(А) РНК.

3.6. ПЦР Амплификация.

3.6.1. Амплификация митохондриального генома О.НПогаНэ в перекрывающихся ПЦР-фрагментах.

3.6.2.ПЦР-амплификация, клонирование и секвенирование.

3.7. Клонирование ДНК.

3.7.1. Клонирование фрагментов ДНК.

3.7.2. Клонирование поли(А) нуклеиновых кислот ВПЧ по гомополимерным поли(ЬА)-поли(с1Т) концам.

3.8. Получение (ЗН) и (32Р) меченых зондов ДНК.

3.9. Обработка ДНК рестрикгазами.

3.10. Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей.

3.11. Трансформация Е coli.

3.12. In situ гибридизация.

3.13. Электрофорез и блот-гибридизация.

3.13.1. Электрофорез и блот-гибридизация ДНК.

3.13.2. Электрофорез и блот-гибридизация РНК.

3.14. Работа с клеточной культурой насекомых.

3.14.1. Получение клеточной линии.

3.14.2. Инфицирование клеточной линии дрозофилы бактерией Wolbachia .111 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Выделение и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов D.virilis - Tvl.

4.1.1. Выделение и клонирование Tv1.

4.1.2. Структурная организация Tv1.

4.1.3. Структура длинных концевых повторов 7W.

4.1.4. Структура консервативных белковых доменов.

4.1.5. Транскрипция 7V7.

4.1.6. Географическое и межвидовое распространение 7V7.

4.1.7. Хромосомная локализация Tv1.

4.1.8. Копийность Tv1 и амплификация в пересеваемой культуре клеток.

4.19. Внехромосомные кольцевые формы 7V7 в клеточной культуре.

4.2. Идентификация и характеристика вирусоподобных частиц Tvl.

4.2.1. Идентификация ВПЧ Tv1.

4.2.2. Персистенция ВПЧ 7V7 в культуре клеток.

4.2.3.Изучение ВПЧ Tv1 в системе гибридного дисгенеза.

4.2.4. Инфекционность ВПЧ Tv1.

4.3.Сравнительный анализ митохондриальной изменивости у дрозофил группы viri/is.

4.3.1. Определение нуклеотидной последовательности митохондриального генома D.littoralis. Состав генов и геномная организация.

4.3.2. Гены, кодирующие белки.

4.3.3. Гены рибосомных и транспортных РНК.

4.3.4. Некодирующие районы.

4.3.5. Нуклеотидный состав и использование кодонов.

4.3.6. Нуклеотидная изменчивость D.littoralis.

4.3.7. Митохондриальная ДНК в ядре.

4.4. Межвидовая изменчивость мтДНК в группе virilis.

4.4.1. ПДРФ-анализ мтДНК в группе virilis.

4.4.2. Изменчивость З'-концевого фрагмента гена 16S рРНК.

4.4.3. Реконструкция вторичной структуры фрагмента 16S рРНК.176 '

4.4.4. Изменчивость фрагмента гена СОХ1 (цитохром с оксидаза, субъединица 1) в группе virilis.

4.5. Внутривидовой полиморфизм мтДНК в группе virilis.

4.5.1. ПДРФ-анализ мтДНК D.littoralis.

4.5.2. Полиморфизм фрагмента гена СОХ1 D.littoralis.

4.5.3. Парсимониальный нетворк (SNP) мт-гаплотипов D.littoralis.

4.5.4. ПДРФ-анализ мтДНК D.americana.

4.5.5. Внутривидовая изменчивость фрагмента гена СОХ1 D.americana.

4.5.6. Внутривидовой ПДРФ мтДНК D.virilis.

4.5.7. Внутривидовой ПДРФ мтДНК D.montana.

4.5.8. Внутрипопуляционная изменчивость D.littoralis (динамика митохондриального полиморфизма).

4.5.9. Сопряженная изменчивость митохондриальных и ядерных маркеров.

4.6. Получение новой пересеваемой клеточной линии Drosophila melanogaster из линии мух инфицированных внутриклеточной эндосимбиотической бактерией Wolbachia pipientis в природе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы»

1Л .Актуальность проблемы

Автономные генетические элементы выделяют по признаку наличия собственной ДНК, репликация которой частично независима от репликации клеточного генома. Сравнительно небольшие размеры и высокий уровень изменчивости геномов автономных генетических элементов делают их чувствительным маркером микроэволюционных процессов. Все эукариотичсские клетки содержат митохондрии и репликацнонно компетентные семейства транспозонов, а многие виды ещё и внутриклеточные бактерии. Изменчивость ядерного генома, вызываемая автономными генетическими элементами, связана с процессами рекомбинации, ретротранспозиции и горизонтального переноса ДНК. Эти события ведут к увеличению размеров и сложности эукариотических геномов. Другой, не менее важной особенностью изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами, является сё направленность. Как было впервые показано С.М.Гершензоном, наличие ДНК в цитоплазме является мутагенным фактором, вызывающим определённый спектр мутаций, обычно нестабильных и часто ревертирующих к норме. Мутации, вносимые транспозопами, так же носят направленный характер определяемый специфичностью ферментов интеграции. Так как разные виды имеют разные наборы функционально активных транспозонов, а мутации, вносимые ими, многократно и независимо повторяются, то вероятность фиксации этих мутации в популяциях возрастает. Из этих фактов следует, что автономные генетические элементы имеют существенное значение в определении сценария эволюционного преобразования вида.

Транспозоны разделяю!ся на две большие группы: ДНК транспозоны, структурно сходные с бактериальными транспозопами, и ретротранспозоны, амплифицирующиеся в геноме через промежуточную РНК форму. Вероятно, ретротранспозоны присутствуют у всех эукариот.

Парадоксальность ситуации состоит в том, что остаются неизвестными тс, общие для всех эукариот и, следовательно, фундаментальные функции, за которые ответственны ретротранспозоны и благодаря которым они не элиминируются из геномов, по крайней мерс, некоторых видов.

Единственным семейством ретротранспозонов, функция которого доказана, является семейство НеТ-А D.melanogastcr. Эгн ретротранспозоны образуют тандемные повторы на концах хромосом, которые защищают их от концевой недорепликации. Такой механизм, однако, уникален для D.melanogaster и не может служить причиной универсальности распространения ретротранспозонов. Хотя основная эволюционная функция ретротранспозонов неизвестна, число открытых генетических явлений, за которые ответственна активность ретротранспозонов, существенно возросло с момента их обнаружения и продолжает расти. К нестабильным мутациям добавилась ретроамплификация репликациошю компетентных транспозонов и ретропозонов, инсерции в геном псевдогенов, внедрение в гены новых сайтов сплайсинга, промоторов и терминаторов, возникновение новых регуляторных механизмов экспрессии генов. Изучение инактивации экспрессии ретротранспозонов по механизму косупрессии позволило развить новые представления о регуляции активности генов и о противовирусной защите клеток.

Все это позволяет с полным основанием заключить, что изучение структурной pi функциональной изменчивости, вносимой в геном ретротранспозонами, остается актуальной проблемой современной генетики.

Выделение функционально-активного семейства регротранспозонов из генома любого вида организмов существенно расширяет возможности дальнейшего изучения генетики этого вида и его возможного биотехнологического применения. Задача эта, однако, не проста, так как большинство копий рефотранспозонов в геноме дефектны и либо вовсе не способны к перемещению, либо могут перемещаться только в присутствии ретротранспозона-помощника. В данной работе представлено выделение, клонирование и характеристика нового функционально-активного семейства ретротранспозонов Tvl из генома D.virilis. Применённый метод может быть использован для выделения и характеристики функционально-активных семейшв ретротранспозонов из других видов эукариот. Tvl относится к близкородственной группе ретротранспозонов насекомых из суперсемейства gypsy. Особенностью регротранспозонов данной группы является наличие env гена, который кодирует белок наружной оболочки вирусной частицы. Для ряда представителей этого семейства инфекционная передача показана экспериментально, что позволило отнести их к новой группе вирусов названной — эррантивирусы. Вместе с тем, основной путь наследования этих вирусов состоит в вертикальной передаче в ряду поколений и они присутствуют в геноме всех представителей вида, что делает старое название - ретротранспозоны более адекватным.

В работе представлена молекулярно-генетическая характеристика экспрессии Tvl и применение гипервариабельных последовательностей Tvl в качестве селективно нейтральных маркёров для характеристики популяционной структуры природных популяций дрозофил группы vi lilis и в качестве маркёров сайтов инсерций митохондриальных псевдогенов.

Определена нуклеотидная последовательноегь митохондриального генома D.littoralis и на этой основе проведено изучение межвидовой и в н утр и п о пул я ш i о н н о й изменчивости митохондриального генома природных популяций дрозофил. Исследования были проведены на близкородственной группе дрозофил, объединяемой в группу virilis. Группа virilis состоит из одиннадцати широко распространённых видов дрозофил, обитающих в Евразии и Северной Америке. Филогения группы сводятся к разделению на две фи лады: virilis ('D.virilis, D.americana americana, D.americana texaua, D.novamexicana, D.lummei) и montana (D.montana, D.ladeóla, D.borealis, D.jlavomontana, D.kanekoi, D.ezoana и D.littoralis). Предполагаемое время дивергенции предковых форм D.virilis и D.melanogaster оценивается в 40 миллионов лет. В настоящее время данная группа интенсивно исследуется с точки зрения эволюции и видообразования. Внимание к этой группе, в первую очередь, связано с тем, что виды группы virilis представляют собой модель эволюции на ранних этапах дивергенции. Активно исследуются полиморфные генетические признаки и их связь с мобильными элементами. Большое внимание уделяется генетическому контролю поведенческих и морфологических признаков, связанных с формированием репродуктивной изоляции, а также признаков, связанных с адаптациями к новым условиям среды, таких как устойчивость к стрессу и диапауза.

Дрозофилы группы virilis - удобный модельный объект для сравнительного исследования внутрипопуляционной структуры природных и синантропных видов.

Видам, образующим природные популяции, свойственна генетическая гетерогенность. Это свойство определяет экологическую лабильность вида и его жизнеспособность в непостоянных условиях среды. Популяции синантропных видов, напротив, отличаются генетической мономорфностыо, очень нестабильны и подвержены резким колебаниям численности вплоть до полного локального вымирания. Быстрое возрастание генетического груза, проявляющееся в потере жизнеспособности популяции, как ответ на интенсивный отбор, хорошо известно почти для всех видов сельскохозяйственных и домашних животных. Вместе с тем, природные популяции, несмотря на отбор и большие флуктуации численности, регулярно проводящие популяцию через "бутылочное горлышко", вырождаются лишь изредка. Следовательно, различия в популяционной структуре имеют существенное значение для поддержания жизнеспособности популяций. В настоящее время все больше видов вовлекается во взаимодействие с человеком, возникают синантропные расы, изменяется генетическая структура популяций. Изучение закономерностей в ответе на эти изменения со стороны наиболее лабильной части генома, представленной ретротранспозонами и другими автономными генетическими элементами, представляет несомненный интерес.

Цель работы:

Изучить структуру и популяционную динамику изменчивости, связанную с полуавтономными генетическими элементами у дрозофил.

Задачи исследования:

1. Разработать метод выделения функционально-активных семейств ретротранспозонов и выделить функционально-активные семейства ретротранспозонов ОМНШ.

2. Определить нуклеотидную последовательность митохондриального генома одного из видов группы утНх фЛШогаШ).

3. Охарактеризовать межвидовую изменчивость митохондриальной ДНК у дрозофил группы утШ по трем признакам: ПДРФ тотальной мтДНК, изменчивость фрагмента гена 168 рРНК, изменчивость фрагмента гена СОХ1.

4. Изучить особенности внутривидового полиморфизма мтДНК в группе лчгШх у четырех видов дрозофил: и.1ШогаШ, О.атегчсапа, О. у/г/У/.у, и 0.топ(апа.

5. Исследовать внутрипопуляционную структуру и динамику митохондриальной изменчивости в локальной, чётко ограниченной, природной популяции ВЛШогаИ.у (пос. Рыбинский, Ростовская обл.) на протяжении нескольких лет. Для этого провести анализ сопряженности митохондриальных гаплотипов с полиморфным ядерным ДНК-маркером для выявления расовой структуры популяции.

6. Получить новую пересеваемую клеточную линию дрозофилы, инфицированную внугриклеточными бактериями Wolbachia для изучения горизонтального переноса ДНК между клеткой дрозофилы ti бактерией.

Научная новизна работы Разработан метод выделения функционально-акгивных ретротранспозонов и этим методом впервые выделено и охарактеризовано функционально-активное семейство ретротранспозонов D.virilis - Tvl.

Предложен простой метод электронно-микроскопической идентификации вирусоподобных частиц ретротранспозонов.

Впервые показана трансактивация сишеза вирусоподобных частиц Tvl в клеточной культуре.

Впервые определена нуклеотидная последовательность полного митохондриального генома D.littoralis.

Впервые проведен многолетний анализ динамики митохондриальных маркеров в локальной ирнродной популяции D.littoralis. Обнаружено устойчивое соотношение мт-гаплотипов. Анализ сопряженности несцепленных ядерных и митохондриальных маркеров в выборке из природной популяции D.littoralis позволил выявить скрытую расовую : структуру, способствующую поддержанию генетической гетерогенности и стабильности популяциониого генофонда.

На основе анализа изменчивости митохондриальнои ДНК в группе virilis получен ряд новых данных, позволивших уточнить филогенетическую структуру группы virilis. В частности, показано единство митохондриального генофонда двух подвидов D.americana) а также получено подтверждение разделения вида D.littoralis на два подвида: D.littoralis littoralis и D.littoralis imeretensis.

Теоретическая и практическая значимость работы Разработанный метод выделения функционально-активных ретротранспозонов может быть применён для других видов животных. Наиболее актуально это для видов, геном которых не секвенирован. Другое применение метода - оценка геномной стабильности различных клеточных культур по наличию/отсутствию и количеству вирусоподобных частиц эндогенных ретротранспозонов.

Описание и анализ полного митохондриального генома йЛШогаШ даёт новые данные для изучения эволюции митохондриального генома дрозофилы.

Полученные результаты вносят вклад в фундаментальные исследования по генетике популяций, разрабатываемые на дроюфиле как модельном объекте; и закладывают основы для дальнейшего изучения динамики митохондриальных генофондов насекомых. Полученные результаты важны для исследований в области охраны и мониторинга популяций редких и исчезающих видов, а гакже рационального использования эксплуатируемых популяции. Результаты работы могут быть применены в исследованиях, проводимых в учреждениях системы РАН и РАСХН, таких как Институт Общей генетики РАН, Институт Молекулярной биологии РАН, Институт Биологии развития РАИ, Институт Биологии гена РАН, Институт комплексного освоения природных ресурсов РАН, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН, Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяпс1ва и звероводства РАСХН.

Положения выносимые на защиту

1. Клетки пересеваемых клеточных культур дрозофил содержат вирусоподобные частицы одного или нескольких семейств эндогенных ретровирусов и/или ретротранспозонов. Клонирование нуклеиновых кислот из клеточной фракции вирусоподобных частиц позволяет клонировать функционально-активные семейства ретротранспозонов данного вида.

2. Суперинфекция вирусоподобными чаешцами клеток пересеваемой культуры может приводить к временной индукции сишеза вирусоподобных частиц ретротранспозонов клетки.

3. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома ИАШогаШ и выявлены области, изменчивость которых специфична для группы утНз.

4. В условиях клеточной пересеваемой культуры ускоряется перенос митохондриальной ДНК в ядро с образованием новых митохондриальных псевдогенов. Процесс переноса митохондриальной ДНК в ядро может быть обнаружен по инсерциям функционально-активных ретротранспозонов в последовательности митохондриальных псевдогенов.

Инсерции ретротранспозонов маркируют митохондриальные псевдогены и делают возможным их выделение.

5. Структура митохондриальной изменчивости природных и синантропных видов насекомых существенно различается. Локальные популяции синантропных видов мономорфны, тогда как у видов, образующих природные популяции, митохондриальная изменчивость образована совокупностью нескольких митохондриальных гаплотипов, находящихся в равновесии.

6. Анализ сопряжённости несцеиленных митохондриальных и ядерных ДНК маркёров в локальных, частично изолированных популяциях позволяет выявить криптические расы, обитающие симпатричсски.

7. В пересеваемых клеточных линиях дрозофилы возможна персистенция внутриклеточных бактерий Wolbachia pipientis.

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

IV съезда ВОГнС. Москва 21-22 нюня. 2009;

Международная научно-пракшчсская конференция Актуальные проблемы биоэкологи. 21-24 октября 2008;

XX International Congress of Genetics Berlin, Germany, 2008;

48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, Pennsylvania, USA, 2007;

47th Annual Drosophila Research Conference, Houston, Texas, 2006;

19th European Drosophila Research Conference, Eger, Hungary, 2005;

46th Annual Drosophila Research Conference, San Diego, USA, 2005;

III съезда ВОГиС, 2004;

45th Annual Drosophila Research Conference, Washington, USA, 2004.

На заседании объединенного семинара генетических лабораторий Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 23.04 2010 г и на заседании семинара отдела генетики животных Института общей генетики им. H.H. Вавилова РАН, 21.04 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 257 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, заключения, выводов, списка литературы по теме диссертации, списка цитируемой литературы, в который входит 515 ссылок. Работа проиллюстрирована J4 таблицами и 67 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Андрианов, Борис Витальевич

Заключение

В представленной работе изучены особенности изменчивости, связанной с автономными генетическими элементами: ретротранспозонами, митохондриями и симбиотическими бактериями. Объектом исследований была выбрана близкородственная группа дрозофил, объединяемая в группу virilis. Начиная с классических исследований (Patterson & Stone, 1952), данная группа активно изучается как модельный объект микроэволюции и видообразования. Изучение дрозофил группы virilis в России имеет давнюю историю. Первые исследования систематики и экологии D.lummei и D.littoralis проведены Н.Н.Соколовым. (Соколов, 1948). Интерес к исследованию популяционно-генетических и микроэволюционных процессов в группе virilis сохраняется и в настоящее время. Одно из перспективных направлений в этой области - связь микроэволюционных процессов с активностью ретротранспозонов.

Выделение и характеристика функционально-активного семейства ретротранспозонов группы virilis - Tvl.

Идея метода выделения функционально-активных ретротранспозонов основана на гипотезе об универсальности распространения ретротранспозонов в геномах всех организмов. Следствием данной гипотезы является предсказание наличия в любых клетках вирусоподобных частиц, содержащих активность обратной транскриптазы и внехромосомную ДНК ретротранспозонов. Очевидно, что такие вирусоподобные частицы потенциально мутагенны и могут иметь значение для контроля апоптоза, клеточного старения и иммортализации пересеваемых клеточных культур, а также иметь отношение к амплификации ДНК в клетке. Кроме того, ДНК ретротранспозона, содержащуюся в частицах, можно клонировать и таким образом выделять функционально активные семейства ретротранспозонов из любого вида, не имея предварительных данных о последовательностях ретротранспозонов данного вида. Эта идея была проверена на клеточной пересеваемой культуре D.virilis. ВПЧ ретротранспозонов могут быть выделены методами дифференциальной седиментации из клеточных лизатов по протоколам, разработанным для выделения ВПЧ ретротранспозонов D.melanogaster (Schiba & Saigo, 1883; Gorelova et all., 1989). Этими методами из клеток D.virilis была выделена фракция ВПЧ, и ДНК из этой фракции была клонирована. В результате было выделено и охарактеризовано новое семейство транспозонов Tvl, относящееся к группе gypsy, что вполне подтвердило первоначальную идею.

Определение нуклеотидной последовательности Tvl показало наличие генов gag, pol и env с ожидаемой структурой доменов, что свидетельствует в пользу функциональной активности выделенного семейства и его принадлежность к группе gypsy. Интересно, что близкородственный ретротранспозон gypsy D.melanogaster идентифицирован в геноме D.virilis, но оказался неактивным (Mizrokhi & Mazo, 1990). Возможно, близкородственные ретротранспозоны находятся в геноме в конкурентных взаимоотношениях и исключают друг друга.

ВПЧ Tvl, сходные с частицами ретровирусов, были идентифицированы в клетках пересеваемой культуры и в некоторых линиях мух D.virilis. Очищенные ВПЧ способны переносить последовательность Tvl в клетки D.melanogaster, где ее раньше не было, и активировать образование эндогенных ВПЧ Tvl в пересеваемых клетках D.virilis. Последний феномен, названный трансактивацией в клетках дрозофилы, обнаружен впервые (Андрианов и др., 2005). Трансактивация сходна с явлением «гетерологичной индукции» дрожжевого ретротранспозона Ту1 под влиянием экспрессии экзогенного ретротранспозона, в том числе ретрогранспозона gypsy дрозофилы (Резник и др., 1995а). Предполагаемой причиной индукции экспрессии дрожжевого Ту1 служит обратная транскриптаза, так как индукция наблюдалась не только после трансформации дрожжевой клетки целым транспозоном, но и в случае экспрессии в дрожжах гена обратной транскриптазы вируса HIV человека (Резник и др., 1995а). Трансактивация синтеза ВПЧ Tvl в клетках дрозофилы может иметь ту же причину. ■ Источником обратной транскриптазы в этом случае являются вирусоподобные частицы, добавляемые в клеточную культуру. Ферментативная природа трансактивирующего агента весьма вероятна, так как термоинактивированные ВПЧ теряют индукционные свойства.

Анализ копий Tvl из генома D.virilis показывает, что экспансия данного семейства ретротранспозонов происходит в настоящее время. Так как 5' и 3' ДКП новой копии ретротранспозона сразу после интеграции в хромосому идентичны, возраст инссрции можно определить по степени наблюдаемой дивергенции двух ДКП. В случае Tvl большинство копий фланкированы идентичными ДКП. Такая ситуация довольно типична для ретротранспозонов дрозофилы. Сравнение выявленных в геноме D.melanogaster полных копий ретротранспозонов оценивает их возраст в среднем в 137 тыс. лет с умеренным разбросом около среднего значения -fc 89 тыс. лет [Bowen, McDonald, 2001]. Столь незначительный эволюционный возраст указывает на быструю смену копий, притом, что состав семейств весьма консервативен. Гомологичная рекомбинация между ДКП играет у D.melanogaster незначительную роль в удалении ретротранспозонов из генома. В геноме D.melanogaster выявлено 682 копии ретротранспозонов, содержащих ДКП, и только 58 единичных ДКП [Kaminker et al., 2002]. У D.virilis ситуация несколько отличается. 211 копий Tvl в геноме D.virilis разделяются примерно пополам на полноразмерные элементы и единичные ДКП. Это отличие вероятно связано с более высокой активностью ферментов гомологичной рекомбинации у D.virilis. Причиной быстрого удаления инсерций из генома D.melanogaster являются делеции менее 400 н.п., случайным образом распределенные по-геному, частота которых у дрозофилы в 75 раз выше, чем у млекопитающих [Petrov, Hartl, 1997]. Большая скорость потери ДНК обнаружена не только у D.melanogaster, но и D.virilis, что является причиной компактности геномов дрозофил [Petrov, Hartl, 1998]. Потери ретротранспозонов компенсируются их быстрым распространением. Менее чем за 100 лет в популяциях D.melanogaster распространился /-элемент [Bucheton et al., 1992]. Ретротранспозон Penelope распросграняется в настоящее время в природных популяциях D.virilis [Lyozin et al., 2001]. Интересно, что в геноме D.virilis найдены "ископаемые" формы Penelope [Lyozin et al., 2001], что вместе с данными о небольшом возрасте имеющихся копий ре гротранспозонов в геноме указывает на неоднократность заселения генома вида одними и теми же семействами ретротранспозонов.

Взаимодействие ретротранспозонов и митохондрий.

Полученные данные по митохондриальной изменчивости у дрозофил группы virilis позволяют предложить гипотезу о взаимодействии ретротранспозонов и митохондрий у насекомых. В настоящее время эта тема малоизученна, тем не менее, известно довольно много косвенных данных, указывающих как на возможность такого взаимодействия, так и на важность его для биологии насекомых.

Недавно было показано (Koulintchenko et al., 2003, 2006), что митохондрии растений и млекопитающих способны поглощать цитоплазматическую ДНК. Оптимальной формой I поглощаемой ДНК является двунитевая линейная молекула, нуклеогидная последовательность которой несущественна. Импорт осуществляют только функционально-активные митохондрии, имеющие разность потенциалов на внутренней мембране. В этом процессе участвуют митохондриальный белок-транспортер адениловых нуклеотидов и митохондриальный комплекс РТРС. Оба этих белка являются ключевыми компонентами системы транслокации в митохондриях всех животных, поэтому процесс импорта ДНК, вероятно, универсален.

Поглощаемая ДНК транскрибируется и, возможно, транслируется митохондриальной системой экспрессии. Образуемые продукты, очевидно, влияют на жизнеспособность митохондрий и могут вызывать ее апоптоз. Транспорт ДНК отличается от диффузии макромолекул через митохондриальную макропору, открывающуюся в процессе апоптоза.

Обычно цитоплазматическая ДНК в клетке отсутствует. Она появляется только при вирусной инфекции или индуцированной экспрессии ретротранспозонов. В этом случае митохондрии могут ее поглощать. Действительно, обнаружены случаи транспорта в митохондрии нуклеиновых кислот вируса HIV (Somasundaran et al., 1994). Проникновение нуклеиновых кислот вируса HIV в митохондрии вызывает апоптоз. В инфицированных клетках обнаружены вирусные частицы, локализованные в местах лизиса и вакуолизации митохондрий (Radovanovic et al., 1999). В вирусных частицах, помимо нуклеиновой кислоты вируса, находится tRNA(Lysl выполняющая роль праймера для синтеза (-)-цепи ДНК вируса, а также белок Lys tRNA синтаза. Этот белок экспрессируется с ядерного гена и образует две формы, цитоплазматическую и митохондриальную, за счет альтернативного сплайсинга. Но в составе частиц выявляется преимущественно митохондриальная форма белка (Kaminska et al., 2007). Предполагается что митохондриальная форма белка попадает в цитоплазму, к месту сборки вирусных частиц, через митохондриальную макропору индуцированную в митохондриальной мембране под действием вирусного белка Vpr (Jacotot et al., 2000). Но не исключено, что частицы HIV собираются внутри митохондрии, используя митохондриальную систему для экспрессии своего генома.

Сходную картину локализации вирусоподобных частиц можно наблюдать и в клетках пересеваемой культуры D.virilis, активно экспрессирующей ретротранспозон Tvl (рисунок 31). В случае проникновения ДНК Tvl в митохондрию и ее экспрессии с образованием ВПЧ, можно ожидать интеграции Tvl в митохондриальную ДНК. Учитывая что интеграция Tvl сайт-специфична (рисунок 22) и происходит в микросателлитные повторы

TA)n, то в митохондриальном геноме группы virilis существуют три потенциальных сайта интеграции Tvl, что следует из сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных геномов D.virilis и D.littoralis (см. раздел 4.3.4). Определение нуклеотидной последовательности одного из таких сайтов между генами atpó и сохЗ у девяти видов дрозофилы группы virilis выявило значительную изменчивость длины микросателлита (ТА)П, чего и следует ожидать при многократных и не вполне точных инсерциях/эксцизиях ретротранспозона с дупликацией сайта интеграции. Как показано в разделе 4.3.7., в Y-хромосоме D.virilis выявлены псевдогены atpó и сохЗ. Между этими псевдогенами обнаружены инсерции Tvl в микросателлитный сайт (ТА)П.

Процесс образования псевдогенов ускоряется в клеточной культуре, как следует из анализа их нуклеотидных последовательностей (см. раздел 4.3.7.). В этой же клеточной культуре происходит десятикраiная амплификация копий Tvl. Взятые вместе, эти факты позволяют предположить проникновение цитоплазматической ДНК Tvl в митохондрии, экспрессию в митохондриях этой ДНК с образованием ВПЧ и интеграцию Tvl в подходящие для него сайты митохондриального генома. Фрагменты митохондриальной ДНК с инсерциями Tvl могут попадать в цитоплазму при лизисе митохондрий и интегрироваться в геном как псевдогены.

Биологический смысл взаимодействия ретротранспозонов и митохондрий можно объяснить в свете открытий противовирусной системы клетки, включающей сложный комплекс белков, в том числе белки цитидинтрансаминазы семейства АРОВЕС (Mangeât, Trono, 2005). Эти белки упаковываются в вирусные частицы вместе с белками вирусного капсида gag и приводят к формированию неинфекционных частиц. Один из известных механизмов противовирусного действия белков АРОВЕС состоит в дезаминировании вирусного цитозина. Сложные ретровирусы типа HIV кодируют дополнительные малые белки, исключающие упаковку АРОВЕС в состав вирусных частиц, что обеспечивает их инфекционность. Но ретротранспозоны таких белков не имеют, поэтому их инфекционные ВПЧ могут формироваться только в клеточных компартментах, лишенных АРОВЕС, например, в митохондриях. (Эта гипотеза объясняет факт существования как инфекционных, так и неинфекционных частиц Tvl (Андрианов и др., 2005)).

Клетки способны подавлять экспрессию вирусов многими путями, главным из которых является формирование РНК-белковых комплексов образуемых специфичными малыми РНК и белками, типа Dicer, Piwi, Argonaute pi Aub, выявленными в клетках дрозофилы (Siomia et al., 2008; Vagin et al., 2006). Эти антивирусные системы блокируют экспрессию ретротранспозонов на этапах транскрипции, процессинга и трансляции, поэтому формирование цитоплазматической ДНК ретротранспозонов как финального этапа их жизненного цикла возможно только в случае несостоятельности противовирусной системы клетки.

Это обстоятельство может быть использовано насекомыми и другими высшими животными для отбраковки организмов с дефектной противовирусной системой. Отбор происходит на стадии зародышевых клеток, что сопровождается« минимальными энергетическими потерями для вида. Известно, что зародышевые клетки отличаются повышенным уровнем экспрессии ретротранспозонов самых разных семейств. В клетках с некомпетентной противовирусной защитой должен происходить синтез ДНК ретротранспозонов и ее проникновение в митохондрии. Если это проникновение носит массовый характер, клетка погибает Гибель зародышевых клеток в системе гибридного дисгенеза в результате экспрессии ретротранспозонов показана у D.virilis (Losovskaya et al., 1990).

Таким образом, биологический смысл существования активных форм ретротранспозонов можно объяснить их ролью в эмбриональной селекции по снижению-генетического груза популяции по генам системы противовирусной защиты клетки. Если это предположение верно, популяции с активными формами ретротранспозонов будут более устойчивы к вирусным инфекциям, чем популяции с неактивными транспозонами. Этот позитивный эффект ретротранспозонов может уравновесить негативное влияние перемещения ретротранспозонов на стабильность генома.

Изучение митохондриальной изменчивости в группе virilis

В данном исследовании впервые изучена митохондриальная изменчивость всех видов группы virilis. Изучена она была по трем признакам. Hinfl-ПДРФ полиморфизм позволяет с низким разрешением охарактеризовать весь митохондриальный геном. Для увеличения разрешающей способности метода были проанализированы фрагменты нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и СОХ1. Филогения группы, построенная по результатам анализа межвидовой митохондриальной изменчивости, соответствует общепринятой классификации Трокморюна (Throckmorton, 1982).

Далее был проведен анализ внутривидовой митохондриальной изменчивости для четырех видов группы: D.virilis, D.montana, D.americana и D.littoralis. Анализ обнаружил характерные отличия синатропного вида D virilis от остальных трех видов, образующих природные популяции. Внд D.virilis мономорфен на всем ареале, в то время как виды, образующие природные популяции, представлены совокупностью митохондриальных гаплотипов.

Для объяснения наблюдаемых отличий была предложена гипотеза, согласно которой высокая изменчивость видов, образующих природные популяции, объясняется наличием i скрытой внутрипопуляционной структуры, образованной несколькими симпатрическими расами. Для проверки этой гипотезы была подробно проанализирована внутрипопуляционная изменчивость у D.americana и D.littoralis.

Анализ внутрипопуляционной изменчивости D.littoralis проводили в течение 10 лет в локальной популяции. Столь длительные исследования динамики изменчивости генетических параметров популяционной системы во времени для дрозофил ранее были проведены только Ф. Добжанским (Dobzhansky et al., 1964) на калифорнийском виде D.pseudoobscura. Для выявления внутрипопуляционной структуры были проанализированы два несцепленных генетических маркера: митохондриальные гагоютипы и ядерная полиморфная минисателлитная последовательность в составе ДКП Tvl. Выбор; ядерных и митохондриальных маркеров заведомо исключает возможность их физического сцепления. Вторым условием, необходимым для выявления расовой структуры популяции, является частично изолированный островной характер анализируемой популяции, в которой возможна быстрая генетическая сегрегация маркеров, проявляющая расовую структуру, которая в иных условиях может остаться незамеченной или быть интерпретированной ошибочно.

На рисунке 67 показан выбранный экспериментальный подход, а также истинная и ошибочная интерпретация одних и тех же данных, в зависимости от схемы организации исследования. Представленная на рисунке ситуация соответствует наличию двух симпатрических рас, в которых сегрегация генетических маркёров завершена. В соседних локальных популяциях сегрегация происходила в разных направлениях и привела к фиксации двух альтернативных состояний, возможных для анализируемых маркеров. Из рисунка следует, что при неправильной организации сбора материала реально существующая расовая структура не будет обнаружена. Ситуация будет выглядеть, как географическая клинальная изменчивость.

Исследование 1