Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.01, кандидат биологических наук Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич

• Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Структурно-функциональная характеристика мтДНК.

2. Повреждение мтДНК эндогенными и экзогенными агентами.

3. Репарация повреждений и формирование мутаций мтДНК.

4. Внеклеточная мтДНК-потенциальный маркер оценки радиационного поражения.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Животные.

2.2. Радиационная обработка.

2.3. Основные химические реактивы.

2.4. Выделение ДНК фенольным методом.

2.5. Выделение внеклеточной ДНК из плазмы с использованием магнитных сорбентов.

2.6. Определение содержания ДНК.

2.7. Получение CEL -I эндонуклеазы.

2.8. ПЦР-амплификация участков ДНК.

2.9. Выявление мутаций мтДНК методом гель-электрофореза ДНК при временном градиенте температуры (temporal temperature gradient gel electrophoresis-TTGE).

2.10. Выявление мутаций мтДНК с использованием CEL-I эндонуклеазы.

2.11. Определение количества копий мтДНК методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.12. Статистическая обработка данных.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК.

3.2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей.

3.3. Изменения количества внеклеточных мутантных копий и общего содержания копий мтДНК в плазме крови облученных мышей в пострадиационный период.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мутантные копии митохондриальной ДНК в тканях и плазме крови мышей, подвергнутых радиационному воздействию»

о

Исследование структурно-функциональных нарушений генома в клетках человека и животных, подвергнутых воздействию ионизирующими излучениями (ИИ) остается актуальной проблемой как для определения риска генетических и канцерогенных последствий, так для разработки чувствительных маркеров оценки генотоксического груза и профилактических мер развития патологий, инициируемых радиацией. Многие основополагающие исследования по данной проблеме проводились и проводятся, ориентируясь на важнейшую мишень радиационного поражения — ядерную ДНК (яДНК). Однако, хорошо известно также, что в каждой соматической клетке млекопитающих, кроме ядерного генома, содержатся тысячи копий молекул митохондриальной ДНК (мтДНК). В последнее время, с появлением новых молекулярных методов, активно развиваются исследования- по изучению повреждения, репарации- и мутагенеза мтДНК в* клетках. В? настоящее время можно полагать, что мтДНК является* более уязвимой-мишенью клетки, по сравнению с яДНК, для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов [LeDoux, Wilson, 2005; Wallace etal'., 2010]. МтДНК имеет ряд особенностей, отличных от я ДНК, в структурной* организации- и функционировании^. Так, мтДНК в соматических клетках животных и человека представлена множеством (от нескольких сот до нескольких тысяч) копий ковалентно замкнутых молекул размером* около 16,5 т.п.н., содержащих гены, кодирующие 13 белков системы дыхательной цепи [Shadel and Clayton, 1997;. Falkenberg et al., 2007]. Митохондриальный геном наследуется по материнской линии [Giles et al., 1980]. Для него характерна повышенная мутабельность благодаря повреждениям, индуцируемым активными формами кислорода (АФК), генерируемыми в самих митохондриях и ошибками репликативного синтеза с участием ДНК-полимеразы гамма [Graziewicz et al., 2006; Larsson, 2010]. В тканях (в том числе постмитотических тканях мозга, сердца, скелетных мышц), в популяциях клеток, независимо от их пролиферативной активности, мтДНК, в отличие от яДНК, может реплицироваться независимо от клеточного цикла в течение всей жизни организма [Wallace 2005; Falkenberg et al., 2007]. Результаты многих исследований показывают, что в мтДНК возникают в 3-50 раз больше повреждений (в зависимости от повреждающего агента), чем в соразмерном фрагменте яДНК, при действии на клетки ИИ, химических мутагенов, противоопухолевых и противовирусных препаратов [Marcelino., Thilly, 1999; Газиев, Шайхаев, 2008]. Процессы репарации ДНК в митохондриях клеток функционируют недостаточно эффективно, по сравнению с таковыми в ядрах [Газиев, Подлуцкий, 2003; Stuart., Brown, 2006; Gredilla et al., 2010]. Если репликация поврежденной я ДНК блокируется индуцибельной системой контроля точек хода клеточного цикла (cell' cycle checkpoint) до завершения ее репарации, то» эта система не блокирует репликацию поврежденной мтДНК в митохондриях [Oleaver ,1992; Lallev et al., 1993; Kulawiec et al., 2009]. В отличие от я ДНК, мтДНК Hev ассоциирована с гистонами и не содержит некодируемые последовательности (за исключением участка D-loop), транскрибируется как единый полицистронный блок, и любые нарушения в ней могут быть > патогенетическими. Возможно, что именно по этим причинам-в мтДНК наблюдается накопление мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК [Khrapko, Vijg, 2009] и для митохондрий характерно явление гетероплазмии (одновременное присутствие мутантных и нормальных копий в одной клетке). Когда количество1 мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог (повышенный уровень гетероплазмии), возникает митохондриальная дисфункция, с которой связаны развитие «митохондриальных» болезней, клеточная гибель, нестабильность-, генома [Skulachev, 2006; Wang, Youle, 2009; Norberg et al., 2010].

Вместе с тем, хотя в радиобиологических исследованиях много внимания уделяется радиационному нарушению энергетического метаболизма, сведения по радиационному мутагенезу мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся воздействию ИИ на уровне целого организма,, в литературе ограничены и противоречивы. Так, в ряде исследовании показано изменения количества копий мтДНК и формирование делеций мтДНК в клетках млекопитающих, подвергнутых радиационному воздействию [Malakhova et al., 2005; Murphy et al., 2005; Nugent et al., 2007; Wang et al., 2007]. Повышенная частота точечных мутаций мтДНК наблюдали в клетках периферической крови людей, проживающих на территории с повышенным радиационным фоном [Forster et al., 2002]. Высокая частота делеций в мтДНК, чем в яДНК, регистрируется у пациентов после сеансов радио-химиотерапии опухолей [Wardell et al., 2003]. Однако не удалось выявить существенного увеличения частоты мутаций мтДНК у полевок, обитающих в зоне аварии Чернобыльской АЭС [Wickliffe et al., 2002]. Не был зарегистрирован повышенный уровень мутаций мтДНК в клетках крови- людей в отдаленные сроки после хронического воздействия на них радиации в условиях ядерного производства [Wilding et al., 2006] и испытаний^ ядерного оружия на- Семипалатинском полигоне [Hamada et ai., 2003].

Стабильность и сохранение митохондриального генома, изменение количества копий мтДНК (дозы генов мтДНК) в клетках играют важную роль в адаптации человека к различным- условиям внешней* среды. С нарушениями мтДНК ассоциируются широкий спектр дегенеративных заболеваний, ослабление функций тканей, нарушения иммунной системы, развитие опухолевых патологий, старения [Schapira, 2006; Jou et al., 2009;. Koene, Smeitink, 2009; Tsutsui et al., 2009; Wallace, Fan,. 2009; Krishnan, Turnbull, 2010; Tuppen et al., 2010; Baines, 2010; Shutt, Shadel, 2010]. Статус митохондрий клетки и мтДНК оказывают влияние на развитие различных клеточных ответов на действие физических и химических агентов.

Поэтому, дальнейшие комплексное исследование возникновения, аккумуляции мутантных копий мтДНК и изменения количественного содержания' копий мтДНК в клетках тканей организма млекопитающих, подвергнутых воздействию ИИ, представляется актуальным и востребованным.

Целью исследования

Цель исследования состояла в определении изменения уровня мутантных копий мтДНК и общего содержания копий мтДНК в тканях и в плазме крови мышей, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения.

В задачи работы входило:

1. Выбор и адаптация чувствительного метода для скрининга радиационно-индуцированных мутаций мтДНК тканей мышей.

2. Исследование уровня мутантных копий мтДНК и общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей в пострадиационный период.

3. Определениел динамики изменения количества внеклеточных мутантных копий- и общего содержания копий» мтДНК, относительно ядерной ДНК, в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Научная новизна работы.

Адаптирован и впервые применен метод, основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей ДНК с неспаренными основаниями, для выявления неизвестных мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ in vivo. Сравнение результатов, получаемых CEL- I эндонуклеазным методом и TTGE-методом (temporal temperature gradient gel electrophoresis -метод) показало, что первый метод более чувствителен, он позволяет анализировать большое количество образцов, дает воспроизводимые результаты и экономичен.

В работе впервые установлено, что. в клетках тканей (головной мозг, селезенка) мышей, подвергнутых воздействию рентгеновского излучения, резко возрастает уровень мутантных копий мтДНК (повышение гетероплазмии мтДНК), с максимумом на 8-й день после облучения и последующим снижением их содержания к 28-у дню пострадиационного времени.

Мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, как и мутагенез ядерных генов, имеет линейную зависимость от дозы рентгеновского излучения (в пределах 1-5 Гр). Результаты сравнительных анализов мутантных копий мтДНК головного мозга (постмитотической ткани) и селезенки (митотически активной ткани) облученных мышей показывают снижение количества мутантных копий мтДНК в пострадиационный период. В ткани селезенки этот процесс происходит более активно, чем в ткани головного мозга.

Вместе с тем, общее количество копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, определяемое относительно гена яДНЕС методом ПНР в реальном времени- (ПЦР-РВ), остается' в течение всего пострадиационного времени (8-28 дней) без изменения, хотя. и. ниже на 25-40% данных контрольной группы (при дозе облучения 5 Гр).

В данном исследовании впервые установлено, что в кровоток облученных мышей в течение длительного пострадиационного времени поступает большое количество циркулирующей вк-мтДНК, существенная часть которой представлена мутантными- копиями. Уровень вк-мтДНК« с мутациями в плазме крови мышей зависит от дозы их облучения. Динамика изменения общего содержания циркулирующей вк-мтДНК и уровня.ее мутантных копий в плазме облученных мышей (в пострадиационный период) отличается от таковой в тканях селезенки и мозга этих же животных. Увеличение содержания мутантных копий вк-мтДНК в плазме облученных мышей совпадает со снижением их уровня в тканях этих же животных. Повышенное содержание мутированных вк-мтДНК в плазме крови облученных мышей свидетельствует об их активной элиминации из клеток тканей в пострадиационный период.

Практическая ценность работы.

Результаты исследования радиационного мутагенеза мтДНК и изменения уровня мутантных копий мтДНК в тканях облученных животных в пострадиационной период существенно дополняют знания о молекулярных механизмах развития лучевой реакции организма. Полученные результаты и использованные в работе методические подходы могут быть применены в дальнейших экспериментальных исследованиях и в клинической практике при радиотерапии опухолей.

Важным результатом, ориентированным на практическое использование, является обнаружение повышенного уровня мутантных копий вк-мтДНК и увеличения содержания общей мтДНК в плазме облученных животных. Поскольку мтДНК является более уязвимой мишенью (чем яДНК) для ИИ" и других генотоксических агентов, то повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями- в плазме крови мышей после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для: оценки радиационного поражения и наличия генотоксического груза.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены^ на школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2007, 2008, 2009, 2010 гг.); на Российской' научной конференции «Медико-биологические проблемы! токсикологии» (Санкт-Петербург, 2008 г.); на конференции «Актуальные вопросы генетики, радиобиологии и радиоэкологии» (Дубна, 2009 г.); на XVI Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2009 г.); на Симпозиуме «Пространственно-временные эффекты в радиационной биологии (Испания, Сант Фелиу де Гишолс, 2009); на 37-ой годичной* конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Прага, 2009); на III Евразийском конгрессе по медицинской физике «Фундаментальные и прикладные аспекты медицинской физики и инженерии» (Москва, 2010); на 38-ой годичной конференции Европейского общества по радиационным исследованиям (Стокгольм, 2010).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах из списка ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах, иллюстрирована 2 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель содержит 221 источников литературы.

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Абдуллаев, Серажутдин Абдуллаевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Итак, можно констатировать, что в мтДНК возникают больше повреждений; чем в соразмерном' фрагменте яДНК, не только в результате действия АФК, генерируемых в самих митохондриях, но и при действии на клетки ИИ,' УФ-света, противоопухолевых и противовирусных препаратов.

Этот повышенный уровень повреждений ■ в>мтДНК, по сравнению с яДНК, облученных клеток, можно полагать, обусловлен сочетанным действием АФК, генерируемых митохондриях и индуцируемых ИИ. Было^ показано, что радиационное нарушение ЦПЭ в митохондриях может привести к. увеличению АФК и усилению окислительного * стресса [УовЫск е! а1., 2000]. Что-касается высокой частоты повреждений; мтДНК, по сравнению' с яДНК, в клетках обработанных различными, химическими агентами, то это является, скорее всего, результатом более активного проникновения' этих соединений« из цитоплазмы в митохондрии.

Таким образом, мтДНК в отличие от яДНК, является более уязвимой мишенью для эндогенных АФК и экзогенных повреждающих агентов.

С другой стороны анализ многих данных, посвященных исследованию репарации мтДНК, позволяет заключить, что в митохондриях клеток млекопитающих полностью функционируют только те репарационные системы, которые имеют ограниченный набор ферментов [Газиев, Подлуцкий, 2003; Stuart, Brown, 2006, Gredilla et al., 2010]. Так, доказано, что механизмы ЭРН не функционируют в митохондриях [Clayton, et al., 1974]. Однако показано, что в митохондриях клеток млекопитающих реализуется система ЭРО с короткими заплатками [Bohr, 2002]. Кроме ЭРО в митохондриях млекопитающих выявлены и другие системы антимутагенной репарации ДНК [Gredilla et al., 2010]. Вместе с тем, как признано многими исследователями, в целом, процессы репарации мтДНК в митохондриях клеток млекопитающих функционируют недостаточно эффективно.

О низкой эффективности функционирования систем репарации в митохондриях млекопитающих свидетельствует множество данных, указывающих на накопление нерепарированных повреждений и на повышение частоты спонтанных мутаций в мтДНК, по сравнению с яДНК, с возрастом организма. И один из современных постулатов1 о механизмах старения связан с накоплением структурных изменений в мтДНК клеток тканей с возрастом [Wallace et al., 2010; Baines, 2010; Krishnan, Turnbull, 2010; Larsson, 2010].

В тканях (головного мозга, сердца, скелетных мышц), в. популяциях клеток, независимо от их пролиферативной активности и клеточного цикла, мтДНК, в отличие от яДНК, может реплицироваться в течение всей жизни [Clayton, 2003; Falkenberg et al., 2007]. Более того, если репликация поврежденной яДНК блокируется индуцибельной системой контроля хода клеточного цикла (cell cycle checkpoint)'до завершения ее репарации, то, как указывает ряд данных, в митохондриях не происходит блокировки репликации мтДНК, поврежденной ИИ [Cleaver, 1992; Lallev et al., 1993; Chung et al., 2001].

При этом, можно полагать, что репликативный синтез может протекать не только на неповрежденных копиях мтДНК-матриц, но и на мутированных или поврежденных матрицах. Очевидно, спонтанные и индуцированные (не репарированные или ошибочно репарированные) повреждения мтДНК в последующих кругах репликации будут реализовываться в мутации и делеции митохондриального генома.

Скорее всего, именно по этим причинам в мтДНК тканей организма, возможно, возникновение мутаций с более высокой частотой, чем в яДНК, после радиационного воздействия. Согласно данным разных авторов, частота спонтанных и индуцированных мутаций в генах мтДНК в 10-100 раз выше, чем в я ДНК [Beckman, Ames, 1998; Marcelino, Thilly, 1999; Khrapko, Vijg 2009; Singh, Kulawiec, 2009; Milone, Massie, 2010].

Увеличение частоты повреждений и мутаций в мтДНК тканей мозга, сердца и скелетных мышц, отражается на функциях этих тканей, а также играет значительную роль в развитии дегенеративных процессов и различных патологий [Wallace, 2005; Wallace et al., 2010; Baines, 2010; Krishnan, Turnbull, 2010; Larsson, 2010]. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный порог, (повышенный уровень гетероплазмии),. возникает митохондриальная дисфункция, с которой ассоциируется развитие множества патологий.

Для скрининга спонтанных и индуцированных ИИ точечных мутаций, в последовательностях ДНК или отдельных генах млекопитающих на уровне целого организма первостепенное значение- приобретает выбор чувствительного и экономичного-метода. На основании* анализа-литературы мы выбрали два наиболее адекватных метода для возможного их использования при определении мутаций в большом количестве образцов ДНК, получаемых из тканей мышей, подвергнутых радиационному воздействию. Эти были - «CEL-I эндонуклеазный метод», основанный на использовании CEL-I эндонуклеазы, специфически расщепляющей участки ДНК с неспаренными основаниями, и метод гель электрофореза при временном градиенте температуры (temporal temperature gradient gel electrophoresis - TTGE). Сравнение результатов, получаемых обоими методами, позволило заключить, что CEL- I эндонуклеазный метод дает более качественные результаты, чем TTGE-метод.

Более того, GEL-1 эндонуклеазный метод более чувствителен, по сравнению с TTGE-методом. GEL-I эндонуклеазный метод позволяет одновременно проводить анализ большого количества образцов ДНК, получать воспроизводимые результаты, не требует сложного оборудования и экономичен. Важнейшим этапом при выявлении мутаций, индуцируемых ИИ, методом CEL-I эндонуклеазы является получение: гетеродуплексов путем гибридизации ПЦР-ампликонов участков мтДНК облученных и контрольных животных. Эта процедура дает существенное преимущество для более четкого воспроизводства результатов в; параллельных анализах и является необходимым при выявлении мутаций ДНК. CEL-I эндонуклеазный метод является достаточно чувствительным инструментом для выявления мутации в последовательностях ДНК, индуцируемых ИИ. С помощьк»этого метода может быть выявлена, одна, мутантная; молекула; среди; 30-35 нормальных (диких) молекул размером около; 500т 1000; п.н. [Bannwarth et al., 2008; Tsuji, Niida, 2008]. Для. анализа мутаций; мтДНК, индуцируемых; ИИ в дозах 1-5 Fp, этим методом мы, использовали? гетеродуплексы; ИЦР-ампликоновштДНК- размером 437-1092: п.н: Что касается; определения, мутаций мтДНК, возникающих при малых дозах облучения, животных, то для. этого требуется: получение гетеродуплексов!ЩР-ампликонов,участков ДНК большего размера (2000-5000 п.н.):. Таким?: образом; метод определения« мутаций; с использованием, GEL-I эндонуклеазы, позволяет достичь необходимой чувствительности.

Прежде, чем начать основные эксперименты;, с использованием этого метода, мы определяли расщепление «эталонного» гетеродуплекса, полученного из ПЦР-ампликонов, заранее подобранных фрагментов дикого и мутантного типов гена р53, GEL-эндоиуклеазой. Результаты наших экспериментов i показали; что4 метод может, быть , использован для выявления неизвестных мутаций в тканях млекопитающих, индуцируемых ионизирующей радиацией. Полученные нами результаты по определению мутаций мтДНК в тканях и в составе, циркулирующей ДНК облученных мышей, с использованием CEL-I эндонуклеазы, не позволяют представить расчетные величины по реальной частоте мутаций мтДНК, индуцируемых ИИ. Однако эти данные позволяют характеризовать степень гетероплазмии (одновременное присутствие мутантных и диких копий) мтДНК в тканях и в плазме животных, подвергнутых радиационному воздействию.

Доля мутантных копий мтДНК (или гетероплазмия) в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, увеличивается- в зависимости от дозы рентгеновского излучения. Здесь мы наблюдаем, подобную линейную зависимость, которая была выявлена при определении частоты мутаций в составе яДНК тканей головного мозга И' селезенки мышей, облученных разными дозами» рентгеновского излучения [Nakamura. et al., 2000; Ono et al., 2003]. Результаты-наших- экспериментов показали, что уровень гетероплазмии мтДНК в клетках тканей организма, после радиационного воздействия, существенно- повышается, и это- может оказывать, влияние, на- многие молекулярные и клеточные процессы, связанные: с развитием лучевойфеакции организма.

Ранее было- показано, что ИИ вызывает in1 vivo больше повреждений в мтДНК, чем в соразмерном фрагменте яДНК. Также было установлено, что ИИ индуцирует синтез мтДНК и.биогенез, митохондрий в клетках тканей животных в, течение 2-5 часов, после их облучения мышей, [Malakhova. et al., 2005; Патрушев и-др., 2006; Евдокимовский и др., 2007; Nugent'et al., 2007; Zhang et al., 2007]. Хотя, механизмы усиления;биогенеза митохондрий и синтеза мтДНК после* действия ИИ' не достаточно ясны, индукция! этих процессов ассоциируется с развитием компенсаторной реакции в клетках в; связи с повреждением мтДНК и снижением'энергообеспечения клеток [Lee, Wei, 2005; Газиев, Шайхаев, 2008]. Можно полагать,.что значительное количество вновь синтезируемых копий мтДНК на- поврежденных матрицах будут содержать мутации. Это может привести к возникновению повышенной гетероплазмии в клетках тканей облученных животных в пострадиационный период. В течение от 8 до 28 дней пострадиационного периода, мы обнаружили снижение уровня общего количества копий мтДНК в тканях головного мозга и селезенки мышей, облученных в дозе 3-5 Гр. Увеличение мутантных копий и снижение общего содержания копий мтДНК в тканях мышей в течение длительного пострадиационного периода свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма и возникновении дисфункции митохондрий в тканях облученного организма. Такая ситуация в свою очередь может приводить к усилению продукции АФК в митохондриях и последующему увеличению повреждений, с которыми, в определенной мере, связана последующая нестабильность генома облученных клеток [Miller et al., 2008;,Wallace et al., 2010]. Как установлено в настоящее время, клетки разных тканей, для их нормального функционирования, требуют определенный-уровень содержания копий. мтДНК [Clay et al., 2009; Krishnan et al., 2010].

Результаты наших экспериментов показывают, что высокий уровень гетероплазмии (мутантных. копий мтДНК) в тканях мышей, наблюдаемый, на 8 день,после их облучения, постепенно снижается ^ 28 дню пострадиационного, периода. С другой стороны, содержание общего количества мтДНК (из. расчета на яДНК) в тканях мышей фактически, остается на одинаковом уровне во все сроки исследования после облучения в дозах 1-5 Гр. Заметим, что снижение доли мутантных молекул мтДНК происходит быстрее в селезенке, клетки которой более активно подвержены- радиационной гибели, чем клетки головного мозга. Такая- динамика снижения» мутаций не характерна для яДНК. Как показывают ранее полученные данные Оно и соавторов [Ono et al., 2003], уровень частоты соматических мутаций; выявляемых в составе яДНК тканей головного мозга и. селезенки мышей, подвергнутых воздействию рентгеновским излучением, сохраняется без изменения в течение четырех месяцев.

Одновременно со снижением мутантных копий мтДНК в тканях, мы регистрируем резкое увеличение их доли, со сдвигом максимума на 14 день после облучения, в составе циркулирующей вк-ДНК плазмы этих же мышей. Известно, что соматические клетки с нерепарированными или летальными повреждениями я ДНК могут подвергаться гибели разными путями. В нормальных физиологических условиях в плазме крови животных и человека всегда содержится определенное количество циркулирующей вк-ДНК. При массовой гибели клеток в тканях организма в результате радиационного поражения или при иной патологии, возможно, выявление, значительного повышения уровня вк-ДНК в плазме (сыворотке) крови и других N биологических жидкостях [Umansky, Tomei, 2006; Tsang; Lo, 2007; Тамкович и др. 2008; Holdenrieder, Stieber, 2009]. Усиление гибели клеток, при проведении радиотерапии опухолей, сопровождается увеличением содержания вк-ДНК в плазме и в, других биологических жидкостях у пациентов, [Cheng et al., 2009]. Увеличение содержания- общей циркулирующей ДНК в» плазме- крыс, подвергнутых радиационному воздействию, было показано в, работе Владимирова с сотрудниками [Vladimirov et al., 1992]. Результаты наших анализов показывают, что в плазме мышей доля мутантных» копий вк-мтДНК на 14 день после облученияувеличиваетсяв, 15 раз (при;дозе 5 Гр) по сравнению с контролем, тогда как общее содержание вк-мтДНК увеличивается в 4 раза (рис. 21, 22).

Как известно, гибель клеток тканей, облученных животных может происходить различными путями в течение длительного времени и зависит от дозы облучения. При этом, максимум активной гибели различных клеток приходится на 6-10 часы после облучения животных сублетальными дозами радиации [Maruyama, Feola, 1987; Nomura et al., 1992]° Полученные нами данные, указывающие на увеличение содержания внеклеточной мтДНК с мутациями В' плазме крови мышей в- течение 28 дней после их облучения, нельзя связывать с максимумом активной фазы апоптоза клеток тканей этих животных. Скорее всего, повышенный уровень мтДНК с мутациями в плазме облученных мышей, можно предполагать, связан с отсроченной гибелью клеток и селективной элиминацией поврежденных и мутантных копий мтДНК из клеток.

Известно, что в отдаленные сроки пострадиационного времени количество гибнущих клеток существенно снижается, но гибель клеток связанная с индуцированной нестабильностью генома, может продолжаться. Одним из характерных признаков индуцированной нестабильности генома является отсроченная гибель клеток в течение длительного пострадиационного времени [Morgan et al., 1996; Zhivotovsky, Kroemer, 2004]. Возможно, увеличение количества мутантных копий мтДНК приводит к усилению продукции АФК и последующему увеличению- повреждений митохондриального генома и митохондриальной:дисфункции, которые оказывают влияние на радиационную индукцию нестабильности генома в облученных клетках [Kulkarni et al., 2009; Park et al., 2009; Anoopkumar-Dukie et al., 2009; Bianchi, 2010]. Следовательно; развитие каскада этих взаимосвязанных процессов; может, приводить к продолжению отстроченной» клеточной гибели [Morgan: et al., 1996; Zhivotovsky, Kroemer, 2004] и, соответственно, к; выбросу большого количества вк-ДНК в кровоток облученных животных. Можно предполагать, что повышенный уровень вк-мгДНК с мутациями в- плазме крови облученных мышей в отдаленные пострадиационные сроки (8-28 дни) * обусловлен, также, и селективной элиминацией копий. мтДНК с. мутациями из клеток тканей [Alexeyev et al., 2008]. Элиминация 'мтДНК с мутациями из; клеток может происходить, в результате митофагии митохондрий, несущих поврежденные и мутантные копий ДНК [Не, Klionsky, 2009]. Очевидно, пусковым; механизмом митофагии является повреждение макромолекул в митохондриях атаками-АФК [Tolkovsky,.2009]. Высвобождаемые в результате митофагии фрагменты мтДНК могут поступать в цитозоль [Patrushev et al., 2006] и затем в кровоток. Митофагия и постоянный; синтез мтДНК способствует обеспечению митохондриального гомеостаза, необходимого для выживания клеток [Не, КИопэку, 2009; ТоИсоувку, 2009].

Таким образом, результаты нашего исследования позволяют полагать, что мутагенез мтДНК в тканях головного мозга и селезенки облученных мышей, так же как, и мутагенез ядерных генов, имеет линейную зависимость от дозы ИИ. В отличие от мутантных ядерных генов, большая часть мутантных копий мтДНК элиминируется из тканей мозга и селезенки, при сохранении в них на одинаковом уровне общего содержания мтДНЕС, в течение 28 дневного пострадиационного периода. Результаты показывают, что в течение указанного пострадиационного времени в плазме облученных мышей сохраняется высокий уровень вк-мтДНК с мутациями, с максимумом на 14 день, в составе циркулирующей ДНК. Одновременно мы регистрируем существенное повышение содержания общей вк-мтДНК в плазме облученных мышей. Повышенное содержание вк-мтДНК с мутациями в плазме крови после радиационного воздействия можно рассматривать как потенциальный биомаркер для оценки радиационного поражения организма животных и человека, а также действия других генотоксических агентов. Однако для этого требуется продолжение исследований в условиях клиники.