Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Некрасова, Надежда Александровна

• Некрасова, Надежда Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Некрасова, Надежда Александровна

Список принятых сокращений

Введение

Научная новизна и практическая ценность работы

Основные положения, выносимые на защиту

Публикации и апробация работы

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Вирус иммунодефицита человека первого типа

1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вирус

1.2. Анти-ВИЧ иммунный ответ

1.2.1. Гуморальный иммунитет

1.2.2. Клеточный иммунитет

1.2.3. Мукозальный иммунитет

II. Вакцины против ВИЧ/СПИД

2.1. Вакцины на основе аттенуированных вирусов

2.2. Субъединичные вакцины

2.3. Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ-1 иммуногенов

2.4. ДНК-вакцины

III. Способы доставки вакцинных препаратов

3.1. Микросферы

3.2. Вакцины на основе рекомбианантных вирусных векторов

3.3. Аттенуированные штаммы сальмонелл в качестве системы доставки антигенов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки»

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), стал известен более 20 лет назад. На сегодняшний день СПИД является одним из наиболее серьезных инфекционных заболеваний, занимая четвертое место по количеству смертельных исходов. Главная опасность ВИЧ-инфекции, определяющая ее социальное значение -практически неизбежная гибель инфицированных в среднем через 10 лет после заражения. Начавшаяся в конце 70-ых годов эпидемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным Всемирной Организации Здравоохранения, к настоящему времени унесла жизни 14 млн. жителей Земли. Еще 40,3 млн. человек к концу 2005 года были инфицированы ВИЧ. Важно отметить, что Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования.

Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВИЧ -инфекции - многолетнее малосимптомное носительство вируса. В силу этого обстоятельства ВИЧ инфицированный человек в течение многих лет остается источником распространения инфекции (чаще всего нераспознанным).

Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа как во всем мире, так и в России, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение. В разработке вакцины против ВИЧ-1 в последние годы были использованы различные формы вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный вирус, нативные и генноинженерные белки, синтетические пептиды, а также различные способы представления целевого иммуногена иммунной системе макроорганизма [Spearman Р. 2006, Burgers W.A. et al. 2006, Young K.R. et al. 2006]. Однако проблема создания анти-ВИЧ вакцины до сих пор не решена. Можно выделить несколько факторов, которые сдерживают прогресс в разработке вакцины.

Во-первых, ВИЧ обладает высокой генетической изменчивостью, в результате чего он меняет свою антигенную структуру быстрее, чем исследователи успевают создать вариант вакцины.

Во-вторых, недостаточность наших знаний о биологии вируса. До сих пор идет дискуссия, какое звено иммунного ответа более важно для предотвращения инфекции: индукция антител или цитотоксических Т-лимфоцитов, или же обоих б звеньев вместе. Отсутствуют знания о корелляции уровня иммунного ответа и степенью протекции от заражения.

В-третьих, вирусные белки ВИЧ-1 содержат районы, которые обладают способностью ингибировать протективный иммунитет и индуцировать развитие иммунопатологии.

Наконец, для изучения патогенеза ВИЧ-инфекции фактически отсутствуют экспериментальные модели животных. Только шимпанзе могут быть инфицированы ВИЧ-1, однако, высокая стоимость экспериментов с участием этих животных и различия в патогенезе заболевания затрудняет их широкое использование. Все это, несомненно, тормозит создание эффективного профилактического препарата.

Несмотря на перечисленные проблемы, исследования по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции должны быть продолжены, потому что нет другого пути блокировать, или по крайне мере ослабить быстрое распространение СПИДА. В настоящее время наблюдается растущий оптимизм среди ученых, которые считают, что создание эффективной и безопасной вакцины является вполне осуществимой задачей [McMichael and Hanke Т. 1999, Nelson R. 2003, Matano Т. et al. 2004J. Несомненно, что для решения задачи весьма важным направлением исследований является разработка новых подходов к конструированию ВИЧ иммуногенов и систем их доставки.

Весьма перспективное направление в создании новой генерации эффективных и безопасных вакцин основано на идентификации в вирусных белках Т- и В-клеточных эпитопов и конструирование на их основе синтетических полиэпитопных вакцин. Такие вакцины должны быть свободны от недостатков, которые свойственны вакцинам, создаваемым на основе аттенуированного или инактивированного вирусов или же на основе нативных и рекомбинантных вирусных белков. В частности они не будут содержать нежелательных эпитопов, которые индуцируют иммунопатологию или ингибируют протективный иммунитет.

В ГНЦ ВБ «Вектор» данный подход использовался при конструировании четырех-а-спирального искусственного белка TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen), кандидата молекулярной полиэпитопной вакцины [Eroshkin A.M. et al. 1995]. Белок содержит четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных нейтрализующих эпитопа из белков Env и Gag ВИЧ-1. У мышей, иммунизированных белком TBI, формировался как гуморальный, так и клеточный ответ к ВИЧ-1. Анти7

TBI-антитела обладали ВИЧ-нейтрализующей активностью [Eroshkin A.M. et al. 1995]. Основной недостаток белка TBI заключается в том, что он обладает относительно небольшой молекулярной массой и для индукции эффективного иммунного ответа требует использования адъюванта.

Для стимуляции ВИЧ-специфического цитотоксического ответа был проведен дизайн другого искусственного белка - поли-ЦТЛ-эпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI, Т cell immunogen), состоящего из 392 аминокислотных остатков и содержащего около 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов. В состав TCI были включены эпитопы, которые индуцируют как CD8+ ЦТЛ, так CD4+ Тх и включают последовательности из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef [Bazhan S.I., 2004]. Доставку ЦТЛ-иммуногенов целесообразно проводить с использованием ДНК вакцин, поскольку именно при использовании генной вакцинации происходит эффективная индукция клеточного ответа [Donnelly J.J. 1997] Для этой цели ген TCI был клонирован в составе плазмиды pcDNA 3.1. Известно, что иммунизация голой ДНК вакциной стимулирует очень слабый иммунный ответ, поэтому во всем мире проводятся интенсивные исследования по повышению эффективности ДНК вакцинации. Прежде всего, эти исследования направлены на разработку схем вакцинации и систем доставки вакцины.

Была разработана оригинальная система доставки ДНК вакцин с использованием искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ) [Лебедев Л.Р. и др. 2000]. Это могло бы позволить решить проблему сохранения ДНК до того момента, как ВПЧ будет поглощена антигенпрезентирующими клетками и, таким образом, уменьшить эффективную дозу вакцины [Karpenko L.I. et al. 2003].

Другим перспективным способом представления ДНК вакцин иммунокомпетентным клеткам могут быть аттенуированные штаммы сальмонелл [Schoen С. et al. 2004, Du A. et al. 2005, Haga T. et al. 2006]. Преимущество доставки ДНК вакцин с помощью сальмонелл заключается, во-первых, в непарентеральном способе введения, а во-вторых, в том, что помимо системного гуморального и клеточного ответов активируется специфический мукозальный иммунитет, создающий на слизистых барьер для проникновения вируса в организм. Значимость мукозального иммунитета особенно высока для инфекций, передающихся через слизистые оболочки, именно к таким инфекциям и относится СПИД.

Цель работы заключалась в разработке средств доставки полиэпитопных иммуногенов TBI и TCI и исследование их свойств.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

• Получить и исследовать иммуиогеиные свойства искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI.

• На основе аттенуированных штаммов сальмонелл получить рекомбинантные штаммы, продуцирующие белок TBI. Оценить стабильность плазмиды pGEX-TBI в клетках сальмонелл. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных сальмонелл, включая мукозальный ответ.

• Сконструировать ДНК вакцину, обеспечивающую синтез белка TBI в эукариотических клетках. Исследовать ее иммуногенность в составе ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.

• Получить ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл, несущие ДНК вакцину pcDNA-TCI. Изучить иммуногенные свойства полученных конструкций.

Научная новизна и практическая ценность.

В данной работе впервые были получены вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок TBI. Были исследованы иммуногенные свойства полученных частиц (ВПЧ-ТВ1). Было показано, что использование ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа и вызывает адъювантный эффект сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.

Получена ДНК вакцина, содержащая ген TBI под контролем цитомегаловирусного промотора. Сконструированы вирусоподобные частицы, несущие ДНК вакцину, покрытую оболочкой из полиглюкина. Показано, что оболочка из полиглюкина защищает ДНК-вакцину от действия нуклеаз сыворотки крови. Применение частиц в качестве средства доставки ДНК вакцины увеличивает уровень иммунного ответа (как гуморального, так и клеточного) и способствует его пролонгации.

На основе аттенуированных штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella lyphimurium SL 7207 были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI, а также рекомбинантные штаммы, несущие ДНК вакцину pcDNA-TBI. Показано, что рекомбинантные штаммы сальмонелл при ректальной иммунизации, способны стимулировать как системный, так и мукозальный гуморальный иммунный ответ.

ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл были использованы в качестве систем доставки ДНК вакцины, кодирующей полиэпитопный Т-клеточный иммуноген TCI. Было показано, что введение кандидатных вакцинных конструкций вызывает стимуляцию ВИЧ - специфического гуморального и клеточного ответа, причем образующиеся антитела обаладали нейтрализующей активностью в отношении трех штаммов ВИЧ-1 субтипа В.

В результате проделанной работы впервые была показана возможность использования вирусоподобных частиц и аттенуированного штамма сальмонеллы в качестве систем доставки полиэпитопных ВИЧ-1иммуногенов.

Полученные конструкции легли в основу кандидатных вакцин против ВИЧ-1, которые разрабатываются в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Основные положения, выносимые на защиту.

• Вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI, при иммунизации лабораторных животных стимулируют специфический иммунный ответ, который по величине соответствует эффекту, наблюдаемом при использовании полного адъюванта Фрейнда.

• Введение мышам рекомбинантных штаммов сальмонеллы Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих белок GST-TBI, приводило к индукции как системного, так и мукозального иммунитета.

• При ДНК вакцинации плазмидной ДНК pcDNA-TCI регистрировался специфический иммунный ответ. Использование систем доставки ДНК вакцины (ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл) способствовало развитию более выраженного иммунного ответа.

• ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонеллы Salmonella typhimurium SL 7207/ pcDNA-TCI показали эффективность использования для доставки полиэпитопного искусственного белка TCI.

Апробация работы и публикации.

Полученные результаты представлены на двенадцати международных конференциях. По материалам диссертации было опубликовано пять статей, два патента и получено одно пололсительное решение о выдаче авторского свидетельства.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Некрасова, Надежда Александровна

выводы

1. Показано, что иммунизация лабораторных животных искусственными вирусоподобными частицами (ВПЧ), экспонирующими на своей поверхности полиэпитопный белок в8Т-ТВ1, обеспечивает специфический клеточный ответ и образование антител, обладающих вируснейтрализующей активностью. При этом адьювантные свойства конструкции не уступают эффекту адьюванта Фрейнда.

2. Впервые показано, что перректальная иммунизация лабораторных животных рекомбинантными штаммами 5.1урЫтигшт 7207/рСЕХ-ТВ1 и З.еМегШсИя Е23/рОЕХ-ТВ1, продуцирующими белок ТВ1, стимулирует системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ-1.

3. Продемонстрирована способность ТВ1 в формате ДНК вакцины индуцировать специфический гуморальный и клеточный ответы. При этом в сравнении с «голой» ДНК, и ВПЧ, и рекомбинантные штаммы сальмонелл обеспечивают более выраженный уровень иммунного ответа.

4. Сконструированы ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонелл, несущие ДНК вакцину рсВЫА-ТО, кодирующую полиэпитопный ЦТЛ иммуноген. Сравнительный анализ иммуногенности полученных конструкций продемонстрировал, что интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: «голая» ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-рсБМА-ТС1), рекомбинантная сальмонелла Б^рЫтипит 7207/рсБЫА-ТС1.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи:

1 .Л.И.Карпенко, С.И.Бажан, Н.А.Некрасова, О.С.Юдина, Б.П.Ключ, Т.А.Веремейко, П.А.Белавин, С.В.Серегин, Н.К.Данилюк, Л.Р.Лебедев, Т.А.Терещенко, Г.М.Левагина, В.И.Масычева, Т.А.Чеканова, М.Н. Расщепкина, М.С.Воробьева, А.А.Ильичев. Инъекционная и суппозиторная формы кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе полиэпитопных иммуногенов. // Физиология и патология иммунной системы,- 2005,- N8. - С.90-95.

2. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А., Серегин С.С., Данилюк Н.К., Бажан С.И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-ЦТЛ -эпитопный иммуноген // Вестник РАМН. - 2005. - N1. - С. 41-44.

3. Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Сибирский медицинский журнал. - 2004. -Т.19, N2. - С.60-62.

4. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Zaitsev B.N., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Bazhan S.I. Comparative analysis of the immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding HIV-1 polyepitope CTL-immunogen // Vaccine. - 2004,- V. 22, N13-14.-P.1692-1699.

5. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Ильичев A.A. Конструирование и исследование аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих белок TBI // Вопросы вирусологии. - 2002. - N2 - С.25-28.

Патенты:

1. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Терещенко Т.А., Малахова Т.В., Ильичев A.A., Масычева В.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П. Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций. Положительное решение о выдаче патента 26.09.06

2. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данилюк Н.К.,

Серегин C.B., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н.,

108

Воробьев A.A., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2248396. Опубликован в бюллетене по изобретениям №8 от 20.03.05. 3. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., Бойченко М.Н., Воробьев A.A. Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E23/pGEX-2T-TBI как кандидат для конструирования живой вакцины против вируса иммунодефицита человека. Патент РФ №2237089. Опубликован в бюллетене по изобретениям №27 от 27.09.04 г.

Доклады и тезисы конференций:

1. Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Материалы конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунологических и фармацевтических препаратов», посвященная 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион» (16-17 июня 2004, Томск, Россия). -2004. - С.58.

2. Некрасова H.A., Карпенко Л.И., Ключ Б.П., Лебедев Л.Р., Юдина О.С., Чеканова Т.А., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С., Бажан С.И., Ильичев A.A. Конструирование и исследование иммуногенных свойств «КомбиВичВак» -кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД// I международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», (26-28 октября 2004 , Москва, Россия): Сб. тезисов. - 2004. - С.139.

3. Некрасова H.A., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Белавин П.А., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A. Использование аттенуированного штамма сальмонеллы S. typhimurium SL7207 для доставки ДНК вакцины против ВИЧ-1 // Материалы международного мультидисциплинарного конгресса «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (8-19 июня 2003 г., Кара-Даг, Феодосия, Украина). - С. 109.

4. H.A. Некрасова, Л.И. Карпенко, A.A. Ильичев Конструирование и исследование иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов сальмонелл,

109 несущих различные антигены ВИЧ-1 // Материалы международной научно-практической школы-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" -2002.-Т.1, №2, С.162

5. Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Мурашев Б.В., Романович

A.Е., Игнатьев Г.М., Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A. Экспрессия и иммуногенность антигенов ВИЧ-1 и вируса гепатита

B, продуцируемых вакцинными штаммами сальмонелл // Вакцины и иммунизация: Пятый международный форум по глобальной вакцинологии (15-16 сентября 2001 г., Минск, Беларусь): Тез. докл. - Минск.- 2001. - С.36-37.

6. ICarpenko L.I., Ignat'ev G.M., Agafonov А.Р., Murashev B.V., Nekrasova N.A., Veremeiko T.A., Boichenko M.N., Vorob'ev A.A., Klimov N.A., Kozlov A.P., Ilyichev A.A. Delivery of HBV and HIV-1 proteins using attenuated Salmonella strains.// Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.- 2001,- V.5, N1.- P.l 14.

7. Karpenko L.I., Veremeiko T.A., Nekrasova N.A., Chikaev N.A., Ignat'ev G.M., Poryvaeva V.A., Ilyichev A.A. Recombinant attenuated Salmonella for delivery of HIV-1 and HBV antigens // Workshop "Virus-like particles as vaccines" September 26-29, 2001 Berlin, Germany. Abstract book-P.34.

8. Bazhan S.I., Ilyichev A.A., Pokrovsky A.G., Ignayiev G.M., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Shchelkunov S.N., Ryzankin I.V., Nesterov A.E., Nekrasova N.A., Bachinsky A.G., Maksytov A.Z., Eroshkin A.M. The current approaches to development of an effective abd safe vaccine against HIV-1 // IV ISTC scientific advisory committee seminar on basic science in ISTC activities (Akademgorodok, Novosibirsk, 23-27 April, 2001). - P.19.

9. Nekrasova N.A., Murashev B.V., Romanovich A.E., Ignat'ev G.M., Agafonov A.P., Pronyaeva T.R. and Karpenko L.I. Anti-HIV DNA vaccine delivering by attenuated strain Salmonella typhimurium 7207 // Sixth John Humphrey advanced summer programme in immunology. September 15-22, 2002, Pushchino. Abstract book -P.130

10. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. Delivery of artificial HIV-1 multi-epitope proteins and DNA vaccine by attenuated Salmonella strains // XII Intern. Congress of Virology ( Paris, 9-13 August 2002): - Abstr. -V.807.

11. Ilyichev A.A., Nekrasova N.A., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Karpenko L.I. Rectal and oral immunization with recombinant attenuated Salmonella carrying HIVDNA vaccine // DNA vaccines (23-25 October 2002, Edinburgh, Scotland, UK). - P.49.

12. Nekrasova N. A., Ignatyev G. M„ Agafonov A. P., Lebedev L.R., Ilyichev A. A., Karpenko L.I. Different delivery systems for artificial polyepitope HIV-1 antigen // 13th symposium on HIV infection. June 3-5, 2004 Toulon, France. Abstract book - B.14.

Благодарности

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю Карпенко Ларисе Ивановне за организацию работы и помощь в интерпретации полученных результатов.

Белавина П.А., Гилеву И.П. и Каргинову Е.А. автор благодарит за предоставленные для изучения плазмидные конструкции.

Бойченко М.Н. и Stocker В.А. автор благодарит за любезно предоставленные аттенуированные штаммы сальмонелл

Лебедева Л.Р. автор благодарит за большой вклад в получение препаратов ВИЧ.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории иммунологической безопасности и лично Георгию Михайловичу Игнатьеву и Александру Петровичу Агафонову за обучение иммунологическим методам и большую помощь в проведении иммунизаций животных.

Плясунову O.A. и Проняеву Т.Р. автор благодарит за постановку реакций вирус-нейтрализации.

Зайцева Б.Н. автор благодарит за проведение микроскопических исследований.

Автор приносит благодарность соавторам, благодаря которым стало возможным опубликование результатов проделанной работы: Бажану С.И., Белавину П.А., Данилюк Н.К., Серегину C.B., Бабкиной И.Н., Юдиной О.С., Нестерову А.Е., Игнатьеву Г.М., Агафонову А.П.

Считаю приятным долгом поблагодарить заведующего отделом иммунотерапевтических препаратов Ильичева Александра Алексеевича за организационные и воспитательные моменты.

Рецензентам, Татьяне Николаевне Ильичевой и Александру Борисовичу Рыжикову, хочу выразить глубокую признательность за внимательное рецензирование диссертационной работы.

Отдельную благодарность за помощь и поддержку выражаю сотрудникам лаборатории разработки средств иммунопрофилактики, в которой была выполнена данная работа.

Заключение

Учитывая продолжающееся распространение эпидемии СПИДа во всем мире, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ вакцин. Один из перспективных подходов связан с созданием синтетических полиэпитопных вакцин [HankeT. et al. 1998, Woodberry Т. et al. 1999, Firat FI. et al. 2001, Bazhan S. et al. 2004, Lorin C. et al. 2005]. Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» были сконструированы два полиэпитопных иммуногена TBI и TCI для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа [Eroshkin A.M. et al. 1995, Bazhan S.I. et al. 2004]. В данной работе были разработаны оригинальные способы доставки этих искусственных антигенов и исследованы их иммуногенные свойства.

В качестве системы доставки белка TBI были использованы вирусоподобные частицы (ВПЧ), экспонирующие на своей поверхности белок GST-TBI. Использование ВПЧ для доставки белка TBI способствовало пролонгации иммунного ответа на целевой иммуноген, при этом было показано, что ВПЧ проявляют адъювантный эффект сравнимым с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда. Эти результаты позволяют рассматривать вирусоподобные частицы как перспективную систему представления вирусных и бактериальных антигенов иммунной системе.

Для экспрессии белка TBI в эукариотической системе клеток была получена экспериментальная ДНК вакцина pcDNA-TBI. Серьезной проблемой ДНК вакцинации является быстрая деградация плазмидной ДНК нуклеазами. Предотвратить разрушение ДНК можно путем ее инкапсулирования в биосовместимые и биодеградируемые полимеры. Нано- и микрочастицы, созданные на основе таких полимеров рассматриваются в настоящее время как один из перспективных способов доставки ДНК вакцин [Z. Cui et. al. 2003, J. Panyam and V. Labhasetwar 2003]. В нашей работе мы использовали вирусоподобные частицы для доставки ДНК вакцины. Мы предполагали, что оболочка из полиглюкина позволит защитить ДНК от быстрой деградации. Иммунизация лабораторных животных конструкцией БПЧ-pcDNA-TBI вызывала более эффективную стимуляцию ИО (как клеточного, так и гуморального звеньев) по сравнению с использованием "голой" ДНК вакцины. Следует отметить, что основным эффектом применения ВПЧ для доставки ДНК вакцины, как и в случае использования ВПЧ для доставки рекомбинантного белка, является пролонгация ИО. Полученный результат является важным показателем эффективности вакцинной конструкции.

При парентеральном введении иммуногенов удается активировать в основном только системный ИО, в то время как местный иммунитет очень важен для предотвращения проникновения вируса через слизистые оболочки. Для создания кандидатной вакцины, способной активировать мукозальный иммунитет были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI. Мы показали, что перректальная иммунизация мышей рекомбинантными сальмонеллами приводила к формированию как системного, так и местного гуморального ответа.

Другой полиэпитопный иммуноген - белок TCI был спроектирован как Т~ клеточный иммуноген. На наш взгляд, применение белка TCI в форме ДНК вакцины является одним из наиболее перспективных путей применения этого иммуногена. ДНК вакцинная конструкция pcDNA-TCI была получена сотрудником ГНЦ ВБ "Вектор" П.А. Белавиным и любезно нам предоставлена для дальнейшего исследования.

С целью повышения иммуногенности ДНК вакцины pcDNA-TCI в качестве систем доставки использовали вирусоподобные частицы и аттенуированный штамм сальмонеллы S.typhimurium SL7207. Наиболее высокий уровень ИО был зарегистрирован в группе животных, иммунизированных клетками сальмонеллы, несущих ДНК вакцину.

В ходе работы были выбраны конструкции, при иммунизации которыми был зафиксирован наиболее высокий уровень иммунного ответа. На основе ВПЧ-TBI и рекомбинантного штамма сальмонеллы, несущей ДНК вакцину pcDNA-TCI, были созданы экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ-1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Некрасова, Надежда Александровна, 2006 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Гос. изд. Медицинской литературы. JI. 1962г.

2. Бойченко M. Н., Воробьев А. А. Использование сальмонелл в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин. // Вестн. РАМН. 1997. - N 3. - С. 43-46.

3. Бойченко M. Н., Елкина С. И. Изучение вирулентности и иммуногенных свойств у мутантов S.typhimurium по цАМФ. // Журнал микробиологии. 1980. -N12.-С. 47-49.

4. Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Тымчук С.Н. Перспектива получения мутантов суа и сгр сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов. // Вестн. РАМН. 1995.- N 10. - С. 37-39.

5. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Игнатьев Г.М., Лебедев Л.Р., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Искусственные анти-ВИЧ иммуногены и методы их доставки. // Вест.Рос. акад. Наук.- 2003. N1. - С. 24-30

6. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. // Молекул, биология.- 2000.- Т. 34, N3.- С. 480485

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984

8. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., "Наука", 1981.

9. Хоробых В.В., Пронин А.В., Киркин А.Ф., Санин А.В. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации. // Иммунология. 1983. - N3. - С.76-79.

10. Amerongen H.M., Weltzin R., Farnet C.M., Michetti P., Haseltine W.A., Neutra M.R. Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission of AIDS. // J Acquir Immune Defic Syndr. -1991- V. 4(8) P. 760-765.

11. Anderson J., Clark R.A., Watts D.H., Till M., Arrastia C., Schuman P. Idiopathic genital ulcers in women infected with human immunodeficiency virus. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. -1996. V. 13(4). - P.343-7.

12. Anderson R.M., May R.M. The population biology of the interaction between HIV-1 and HIV-2: coexistence or competitive exclusion? // AIDS. 1996. - V.10 (14). -P.1663-73.

13. Asakura Y., Mohri H., Okuda K. Perinatal transmission of HIV-1. // JAMA. -1996- V. 23-30,276(16)-P. 1300 1301.

14. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Belyakov I.M. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. //Nat Rev Immunol.- 2001.- V.1.-N3.- P. 209-19.115

15. Bloomfield V. A. DNA condensation. // Curr. Opin. Struct. Biol. -1996.- V.6(3).-P.334-41.

16. Bomsel M. Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier. // Nat Med. -1997- V. 3(1) V. 42-47.

17. Borras-Cuesta F., Petit-Camurdan A., Fedon Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by B and T cells. // Eur J Immunol.-1987-V. 17(8)-P. 1213-1215.

18. Brander C., Walker B.D. T lymphocyte responses in HIV-1 infection: implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol. -1999- V. 11(4) P. 451459.

19. Brandtzaeg P., Farstad I.N., Johansen F.E., Morton H.C., Norderhaug I.N., Yamanaka T. The B-cell system of human mucosae and exocrine glands. // Immunol Rev.-1999- V. 171-P. 45-87.

20. Burton D. R. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94 (19). - P.10018-23.

21. Calarota S., Bratt G., Nordlund S., Hinkula J., Leandersson A.C., Sandstrom E., Wahren B. Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients. // Lancet. -1998- V. 2,351(9112) P. 1320-1325.

22. Cattozzo E.M., Stacker B.A., Radaelly A., De Giuli Morghen C., Tognon M. Expression and immunogenicity of V3 loop epitopes of HIV-1, isolates SC and WMJ2, inserted in Salmonella flagellin. // J Biotechnol. 1997. - Vol. 56.-P. 191-203.

23. Chanh T.C., Kennedy R.C., Alderete B.E., Kanda P., Eichberg J.W., Dreesman G.R. Human immunodeficiency virus gpl20 glycoprotein detected by a monoclonal antibody to a synthetic peptide. // Eur J Immunol. 1986. - V.16.- N11.- P.1465-8.

24. Chatfield S.N, Roberts M, Dougan G, Hormaeche C., Khan C.M. The development of oral vaccines against parasitic diseases utilizing live attenuated Salmonella.// Parasitology.-1995,- 110 Suppl.-P.17-24.

25. Chong C, Bost K.L, Clements J.D. Differential production of interleukin-12 mRNA by murine macrophages in response to viable or killed Salmonella spp. // Infect Immun. 1996. - V. 64(4).- P. 1154-60.

26. Cicala C, Arthos J., Rubbert A., Selig S., Wildt K, Cohen O,J„ Fauci A.S. HIV-1 envelope induces activation of caspase-3 and cleavage of focal adhesion kinase in primary human CD4(+) T cells. // Proc Natl Acad Sci USA. -2000- V. 97 (3) P. 11781183.

27. Clements J.D, El-Morshidy S. Construction of a potential live oral bivalent vaccine for typhoid fever and cholera-Escherichia coli-related diarrheas.// Infect. Immun.- 1984.- V. 46(2).- P.564-9.

28. Cochlovius B., Stassar M.J., Schreurs M.W., Benner A., Adema G.J. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity.// Immunol. Lett. 2002. - V.80 (2).- P.89-96.

29. Cohen H., Levy R.J., Gao J., Fishbein I., Kousaev V., Sosnowski S., Slomkowski S., Golomb G. Sustained delivery and expression of DNA encapsulated in polymeric nanoparticles. // Gene Ther. 2000. - V.7(22).- P. 1896-905.

30. Cohen S., Powell C.J., Dubois D.R., Hartman A., Summers P.L., Eckels K.H. Expression of the envelope antigen of dengue virus in vaccine strains of Salmonella. // Res. Microbiol.-1990. V.141 (7-8). - P.855-8.

31. Collins K.L., Chen B.K, Kalams S.A., Walker B.D., Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. // Nature. -1998- V. 22,391(6665)-P. 397-401.

32. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. -2003- V. 20(2-3) P. 103-137.

33. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2003.-20(2-3). - P.103-37.

34. Curtiss R. 3rd, Goldschmidt R.M., Fletchall N.B., Kelly S.M. Avirulent Salmonella typhimurium delta cya delta crp oral vaccine strains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen.// Vaccine.-1988.- V.6(2).- P.155-60.

35. Curtiss R. 3rd, Kelly S.M. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. // Infect. Immun.-1987. V.55(12).- P.3035-43.

36. Dalla Pozza T., Yan H., Meek D., Guzman C.A., Walker M.J. Construction and characterisation of Salmonella typhimurium aroA simultaneously expressing the five pertussis toxin subunits. //Vaccine. 1998. - V.16 (5). - P.522-9.

37. Daniel M.D., Kirchhoff F., Czajak S.C., Sehgal P.K., Desrosiers R.C. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. // Science. -1992-V. 18,258(5090)-P. 1938-1941.

38. Darji A., Guzman C.A., Gerstel B., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. // Cell. 1997.- V. 12,91(6).- P.765-75.

39. Deck R.R., DeWitt C.M., Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Characterization of humoral immune responses induced by an influenza hemagglutinin DNA vaccine. // Vaccine.-1997-V. 15(1)-P. 71-78.

40. Desrosiers R.C. Prospects for an AIDS vaccine. // Nat Med. -2004- V. 10(3) P. 221-223.

41. Dhiman N., Dutta M., Khuller G.K. Poly (DL-lactide-co-glycolide) based delivery systems for vaccines and drugs. // Indian J Exp Biol. -2000-V. 38(8) P. 746752.

42. Dietrich G., Gentschev I., Hess J., Ulmer J.B., Kaufmann S.H., Goebel W. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria. // Immunol. Today. -1999.-V.20 (6).- P.251-3.

43. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines. Am // J Respir Crit Care Med. -2000- V. 162, N 2. P. 190-193.

44. Donnelly J.J., Martinez D., Jansen K.U., Ellis R.W., Montgomery D.L., Liu M.A. Protection against papillomavirus with a polynucleotide vaccine. // J Infect Dis. -1996-V. 173(2)-P. 314-320.

45. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W., Liu M.A. DNA vaccines. // Annu. Rev. Immunol.-1997.- V.15.- P.617-48.

46. Donnelly J.J., Wahren B., Liu M.A. DNA vaccines: progress and challenges. // J. Immunol.- 2005.- V.175(2).- P.633-9.

47. Du A., Wang S. Efficacy of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Eimeria tenella infection in chickens. //Int. J. Parasitol. 2005.-V.35.-N7.- P. 777-85.

48. Dunn D.T., Newell M.L., Ades A.E., Peckham C.S. Risk of human immunodeficiency virus type 1 transmission through breastfeeding. // Lancet. -1992- V. 5,340(8819)-P. 585-588.

49. Dunstan S.J., Simmons C.P., Strugnell R.A. Comparison of the abilities of different attenuated Salmonella typhimurium strains to elicit humoral immune responses against a heterologous antigen.// Infect. Immun.-1998. V.66(2).- P.732-40.

50. Eroshkin A.M., ICarginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Eng. 1995. - V. 8(2). - P. 167-173.

51. Eroshkin A.M., Zhilkin P.A, Shamin V.V., Korolev S, Fedorov B.B. Artificial protein vaccines with predetermined tertiary structure: application to anti-HIV-1 vaccine design. // Protein Eng. -1993- V. 6(8) P. 997-1001.

52. Fairweather N.F., Chatfield S.N., Charles I.G., Roberts M., Lipscombe M., Li L.J., Strugnell D., Comerford S., Tite J., Dougan G. Use of live attenuated bacteria to stimulate immunity. //Res. Microbiol.-1990. V.141 (7-8). - P.769-73.

53. Forthal D.N., Landucci G., Keenan B. Relationship between antibody-dependent cellular cytotoxicity, plasma HIV type 1 RNA, and CD4+ lymphocyte count.// AIDS Res Hum Retroviruses.-2001.-V. 10 (6).-P. 553-561.

54. Fouts T.R, Lewis G.K, Hone D.M. Construction and characterization of a Salmonella typhi-based human immunodeficiency virus type 1 vector vaccine.// Vaccine. 1995. - V.13 (6).- P. 561-9.

55. Fowler M.G. Update: transmission of HIV-1 from mother to child. // Curr Opin Obstet Gynecol. -1997- V. 9(6) P. 343-348.

56. Frankel A.D., Bredt D.S., Pabo C.O. Tat protein from human immunodeficiency virus forms a metal-linked dimer.// Science. 1988. - V.240 (4848). - P. 70-73.

57. Gilman R.H., Hornick R.B, Woodard W.E, DuPont H.L, Snyder M.J, Levine M.M, Libonati J.P. Evaluation of a UDP-glucose-4-epimeraseless mutant of Salmonella typhi as a liver oral vaccine.// J. Infect. Dis. 1977. - V. 136(6).- P.717-23.

58. Goebel F.D., Mannhalter J.W, Belshe R.B, Eibl M.M, Grob P.J, de Gruttola V, Griffiths P.D., Erfle V, Kunschak M, Engl W. Recombinant gpl60 as a therapeutic vaccine for HIV-infection: results of a large randomized, controlled trial. European

59. Multinational IMMUNO AIDS Vaccine Study Group. // AIDS. -1999- V.13(12) P. 1461-1468.

60. Gonzalo R.M., Rodriguez D., Garcia-Sastre A., Rodriguez J.R., Palese P., Esteban M. Enhanced CD8+ T cell response to HIV-1 env by combined immunization with influenza and vaccinia virus recombinants. // Vaccine. 1999.- V.17(7-8).- P.887-92.

61. Goulder P.J., Rowland-Jones S.L., McMichael A.J., Walker B.D. Anti-HIV cellular immunity: recent advances towards vaccine design. // AIDS. -1999- V. 13 P. 121-136.

62. Grillot-Courvalin C., Goussard S., Huetz F., Ojcius D.M., Courvalin P. Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells. // Nat. Biotechnol. 1998.- V.16(9).- P.862-6.

63. Gulig P.A., Curtiss R. 3rd. Plasmid-associated virulence of Salmonella typhimurium.//Infect. Immun. 1987,- V.55(12).- P.2891-901.

64. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. // Annu Rev Immunol. -2000- V. 18 P. 927-974.

65. Hackett J. Use of Salmonella for heterologous gene expression and vaccine delivery systems.// Curr Opin Biotechnol. 1993. - V.4(5).- P.611-5.

66. Hanke T, Schneider J, Gilbert SC, Hill AV, McMichael A. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice. // Vaccine. 1998. - V.16 (4).- P. 426-35.

67. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. // J Immunol Methods. -1999- V. 29,229(1-2) P. 1-22.

68. Ho D.D. HIV-1 dynamics in vivo. // J Biol Regul Homeost Agents. -1995- V. 9(3) -P. 76-77.

69. Hoiseth S.K., Stocker B.A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.// Nature. 1981. - V. 291(5812).- P.238-9.

70. Jang J.-H. and Shea L.D. Intramuscular delivery of DNA releasing microspheres: microsphere properties and transgene expression. // J. Control. Release. -2006. V.l 12(1).- P.120-8.

71. Katare Y.K., Muthukumaran T., Panda A.K. Influence of particle size, antigen load, dose and additional adjuvant on the immune response from antigen loaded PLA microparticles. // Int. J. Pharm. 2005. - V. 301(1-2).- P.149-60.

72. Kaufmann S.H. and Hess J. Immune response against Mycobacterium tuberculosis: implications for vaccine development. // J. Biotechnol. 2000. - V. 83(1-2).- P.13-7.

73. Kozlowski PA, Neutra MR. The role of mucosal immunity in prevention of HIV transmission. // Curr Mol Med. 2003. - V. 3(3).-P.217-28.

74. Kushibiki T, Tomoshige R, Fukunaka Y, Kakemi M, Tabata Y. In vivo release and gene expression of plasmid DNA by hydrogels of gelatin with different cationization extents. // J. Control Release. 2003,- V.90(2).- P.207-16.

75. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - v.227. - N 5259. - P. 680-685.

76. Lehner T, Bergmeier L.A, Wang Y, Tao L, Sing M, Spallek R, van der Zee R. Heat shock proteins generate beta-chemokines which function as innate adjuvants enhancing adaptive immunity. // Eur J Immunol. -2000- V. 30(2) P. 594-603.

77. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine.// Science. 1998. -V. 19;280(5371). -P.1875-1880.

78. Letvin N.L. What immunity can protect against HIV infection. // J Clin Invest. -1998- V. 1,102(9)-P. 1643-1644.

79. Levine M.M, Kaper J.B, Black R.E, Clements M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development.// Microbiol Rev.- 1983,- Dec;47(4).- P.510-50.

80. Lohman B.L., Miller C.J., McChesney M.B. Antiviral cytotoxic T lymphocytes in vaginal mucosa of simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques. // J Immunol.-1995- V. 155(12)-P. 5855-5860.

81. Lunsford L., McKeever U., Eckstein V., Hedley M.L. Tissue distribution and persistence in mice of plasmid DNA encapsulated in a PLGA-based microsphere delivery vehicle. // J Drug Target. -2000- V. 8(1) P. 39-50.

82. Lutsiak C.M., Sosnowski D.L., Wishart D.S., Kwon G.S., Samuel J. Use of a liposome antigen delivery system to alter immune responses in vivo, // J Pharm Sei. -1998- V. 87(11)-V. 1428-1432.

83. Mazanec M.B., Kaetzel C.S., Lamm M.E., Fletcher D., Nedrud J.G. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies. // Proc Natl Acad Sci US A,-1992- V. 89(15)-P. 6901-6905.

84. McMichael A.J., Hanke T. Is an HIV vaccine possible? // Nat Med. 1999. - V. 5(6).-P. 612-616.

85. McMichael A.J., Phillips R.E. Escape of human immunodeficiency virus from immune control. // Annu Rev Immunol. -1997- V. 15 P. 271-296.

86. Medina E., Guzman C.A. Modulation of immune responses following antigen administration by mucosal route.// FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 2000. V. 27(4).-P.305-11.

87. Meyer H., Sutter G., Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. // J Gen Virol. -1991-V. 72, N5-P. 1031-1038.

88. Montgomery D.L., Ulmer J.B., Donnelly J.J., Liu M.A. DNA vaccines. // Pharmacol Ther. -1997- V. 74(2) P. 195-205.

89. Mor G., Singla M„ Steinberg A.D., Hoffman S.L., Okuda K., Klinman D.M. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? // Hum Gene Ther. -1997- V. 10;8(3)-P. 293-300.

90. Moss D.J., Schmidt C., Elliott S., Suhrbier A., Burrows S., Khanna R. Strategies involved in developing an effective vaccine for EBV-associated diseases. // Adv Cancer Res.-1996- V. 69-P. 213-245.

91. Nathanson N., Mathieson B.J. Biological considerations in the development of a human immunodeficiency virus vaccine. // J Infect Dis. -2000-V. 182(2) P. 579-589. Epub 2000 Jul 28.

92. Nelson R. New HIV vaccine shows promising results in preclinical studies. //Lancet. 2003,- V. 10;361(9369).- P. 1627.

93. Neutra M.R., Frey A., Kraehenbuhl J.P. Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization. // Cell. -1996- V. 86(3) P. 345-348.

94. Newton S.M., Jacob C.O., Stacker B.A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. // Science. -1989- V. 7, 244(4900) P. 70-72.

95. O'Hagan D.T., Ugozzoli M., Barackman J., Singh M., Kazzaz J., Higgins K., Vancott T.C., Ott G. Microparticles in MF59, a potent adjuvant combination for a recombinant protein vaccine against FIIV-1. // Vaccine. -2000- V. 18(17) P. 17931801.

96. Pantaleo G, Fauci A.S. Tracking HIV during disease progression. // Curr Opin Immunol. -1994- V. 6(4) P. 600-604.

97. Panyam J. and Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003,- V. 55(3).- P.329-47.

98. Pascual D.W, Powell R.J, Lewis G.K, Hone D.M. Oral bacterial vaccine vectors for the delivery of subunit and nucleic acid vaccines to the organized lymphoid tissue of the intestine. // Behring. Inst. Mitt.-1997. V.98. - P. 143-52.

99. Rizzuto C, Sodroski J. Fine definition of a conserved CCR5-binding region on the human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120. // AIDS Res Hum Retroviruses. 2000. - V. 16(8). - P. 741-750.

100. Roberts M, Chatfield S.N, Dougan G. Salmonella as carries of heterologous antigens. P.27-58 In D.T. O Hagan (ed.), Novel delivery system for oral vaccines. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla

101. Robinson H.L. DNA vaccines for immunodeficiency viruses. // AIDS. -1997- V. 11 Suppl A P. 109-119.

102. Rollman E., Hinkula J., Arteaga J., Zuber B., Kjerrstrom A., Liu M., Wahren B., Ljungberg K. Multi-subtype gpl60 DNA immunization induces broadly neutralizing anti-HIV antibodies. // Gene Ther. -2004- V. 11(14) P. 1146-1154.

103. Rowland-Jones S., Tan R. Control of HIV co-receptor expression: implications for pathogenesis and treatment.// Trends Microbiol. 1997. - V. 5(8). - P. 300-302.

104. Rowland-Jones S.L., McMichael A. Immune responses in HIV-exposed seronegatives: have they repelled the virus? // Curr Opin Immunol. -1995- V. 7(4) P. 448-455.

105. Ruprecht R.M. Live attenuated AIDS viruses as vaccines: promise or peril? // Immunol. Rev.-1999. -N170.-P. 135-49.

106. Sandstrom E., Wahren B. Therapeutic immunisation with recombinant gpl60 in HIV-1 infection: a randomised double-blind placebo-controlled trial. Nordic VAC-04 Study Group. // Lancet. -1999- V. 353(9166) P. 1735-1742.

107. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. Biotechniques. -1997.-V. 23(3).-P. 424-7.

108. Schoen C., Stritzker J., Goebel W., Pilgrim S. Bacteria as DNA vaccine carriers for genetic immunization. // Int. J. Med. Microbiol.- 2004.- V. 294,- N5.- P. 319-35.

109. Schwartz O., Marechal V., Le Gall S., Lemonnier F., Heard J.M. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. // Nat Med. -1996- V. 2(3) P. 338-342.

110. Shata M.T, Reitz M.S. Jr, DeVico A.L, Lewis G.K, Hone D.M. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. // Vaccine. 2001. - V.20(3-4).- P.623-9.

111. Sidney J, Grey H. M, Kubo R.T. Practical, biochemical and evolutionary implications of the discovery of HLA class I supermotifs. // Immunol. Today. 1996. -V. 17.-P. 261-266

112. Singh M, Kazzaz J, Ugozzoli M, Malyala P, Chesko J, O'Hagan D.T. Polylactide-co-glycolide microparticles with surface adsorbed antigens as vaccine delivery systems. // Curr. Drug. Deliv. 2006. - V.3(l).- P.l 15-20.

113. Spearman P. Current progress in the development of HIV vaccines. // Curr Pharm Des. -2006.-V. 12. N9,- P. 1147-67.

114. Staats HF, Jackson RJ, Marinaro M, Takahashi I, Kiyono H, McGhee JR. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol. 1994. - V.6(4).-P. 572-83.

115. Stocker B.A. Aromatic-dependent salmonella as anti-bacterial vaccines and as presenters of heterologous antigens or of DNA encoding them. // J. Biotechnol. 2000. -V. 83(1-2).-P.45-50.

116. Stocker BA. Auxotrophic Salmonella typhi as live vaccine.//Vaccine.- 1988. V. 6(2).- P.141-5.

117. Sturesson C, Degling Wikingsson L. Comparison of poly(acryl starch) and poly(lactide-co-glycolide) microspheres as drug delivery system for a rotavirus vaccine. // J Control Release. -2000- V.3, 68(3) P. 441-450.

118. Tavegp T. Cellular and humoral immune responses to a canarypox vaccine containing human immunodeficiency virus type 1 Env, Gag, and Pro in combination with RGP120. // J Infect Dis. 2001-V.18 - P.563-570

119. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. // J. Immunol. Meth. - 1984. - V. 12.- p. 313-340.

120. Townsend A., Bodmer H. Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes. Annu Rev Immunol. -1989- V. 7 P. 601-624.

121. Truong-Le V.L., August J.T., Leong K.W. Controlled gene delivery by DNA-gelatin nanospheres. // Hum. Gene Ther. 1998.- V. 9(12).- P.1709-17.

122. Van Heyningen WE, Van Heyningen S, King CA. The nature and action of cholera toxin. // Ciba Found Symp.-1976. V.42.-P. 73-88.

123. Velin D., Hopkins S., Kraehenbuhl J.P. 1998. Delivery systems and adjuvants for vaccination against HIV. // Pathobiology. V.66, N3-4. - P. 170-175.

124. Walker C.M., Moody D.J., Stites D.P., Levy J.A. CD8+ lymphocytes can control HIV infection in vitro by suppressing virus replication.// Science. -1986- V. 234(4783)-P. 1563-6.

125. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little M.C., Nadeau J.G., Malinowski D.P. Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique.//Nucleic Acids Res. 1992.- V.ll;20.-P.1691-6.132

126. Walter E, Merkle H.P. Microparticle-mediated transfection of non-phagocytic cells in vitro. // J Drug Target. -2002- V. 10(1) P. 11-21.

127. Wange R.L, Samelson L.E. Complex complexes: signaling at the TCR.// Immunity. -1996- V. 5(3) P. 197-205.

128. Weber J. The pathogenesis of HIV-1 infection. // Br Med Bull. 2001. - V.58. -P. 61-72.

129. Weintraub H, Cheng P.F, Conrad K. Expression of transfected DNA depends on DNA topology. // Cell.-1986. V. 46(1). - P.l 15-22.

130. Weiss A, Littman D.R. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors.// Cell. -1994- V. 76(2) P. 263-74.

131. Whatmore A.M., Cook N, Hall G.A, Sharpe S, Rud E.W, Cranage M.P. Repair and evolution of nef in vivo modulates simian immunodeficiency virus virulence. // J Virol.-1995-V. 69(8)-P. 5117-5123.

132. Wyatt R, Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. // Science.-1998. V. 280(5371). - P. 1884-8.

133. Yahi N, Fantini J, Mabrouk K, Tamalet C, de Micco P, van Rietschoten J, Rochat H, Sabatier J.M. Multibranched V3 peptides inhibit human immunodeficiency virus infection in human lymphocytes and macrophages. //J Virol.- 1994.- V.68.-N9.-P. 5714-20.

134. Young K.R., McBurney S.P., Karkhanis L.U., Ross T.M. Virus-like particles: Designing an effective AIDS vaccine. //Methods.- 2006- V. 40.-N1.- P. 98-117