Биоразнообразие микробного сообщества районов залегания газовых гидратов и бухты Фролиха озера Байкал тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат биологических наук Шубенкова, Ольга Владимировна

• Шубенкова, Ольга Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шубенкова, Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ J

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика озера Байкал

1.2. Геолого-географические характеристики района газовых 9 гидратов озера Байкал

1.3. Распределение метана в воде и донных осадках озера Байкал

1.4. Характеристика химического состава поровых вод донных 17 осадков озера Байкал

1.5. Общая характеристика микроорганизмов донных осадков 19 пресных озер и история их исследования в Байкале

1.6. Идентификация бактерий в донных осадках озера Байкал

1.7. Молекулярно-биологические методы исследования 26 структуры микробных сообществ

1.8. Определение нуклеотидной последовательности рРНК

1.9. Гибридизация рРНК с олигонуклеотидными зондами

ГЛАВА 2.0БЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования и методы отбора проб

2.2. Физико-химическая характеристика районов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Численность метанотрофных бактерий в районах 54 приповерхностного залегания газовых гидратов

3.2. Изучение морфологии бактерий, обитающих в придонной 60 воде подводного грязевого вулкана «К-2» (ст. Кукуйский каньон) методом электронной микроскопии

3.3. Определение видового состава микробного сообщества 64 района приповерхностного залегания газовых гидратов по данным анализа фрагментов гена 16S рРНК

3.4. Анализ аэробного метанотрофного сообщества озера Байкал, 79 методом анализа гена мембрансвязанной метанмонооксигеназы (ртоА)

3.5. Филогенетическое разнообразие архейного компонента 84 кристаллов газовых гидратов и осадков, ассоциированных с ними

3.6. Исследование биоразнообразия микробного сообщества в 92 районе подводного термального источника в бухте Фролиха (Северный Байкал) методом анализа последовательностей гена 16S рРНК

3.7. Определение таксонов некультивируемых бактерий, 100 способных активно развиваться в донных осадках при определенных условиях, методом гибридизации нативной ДНК, меченной 32Р

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биоразнообразие микробного сообщества районов залегания газовых гидратов и бухты Фролиха озера Байкал»

Актуальность проблемы.

Большая часть атмосферного метана, если не весь на Земле -биогенного происхождения, и не смотря на то, что его концентрация на протяжении последних 300 лет стабильно повышалась, количество метана все таки остается на низком уровне. Существует два главных процесса поддержания баланса метана на нашей планете - метаногез и метанотрофия, осуществляемые микроорганизмами. Известные метаногены принадлежат множеству различных филогенетических групп в архейском домене (архебактерии), царстве эуриархеот, большинство видов которых строго анаэробны. Метанотрофия осуществляется двумя разными способами, аэробным и анаэробным и различными группами микроорганизмов, метанотрофными представителями Proteobacteria (Малашенко и др., 1978) и метанотрофными представителями Archaea (Hoehler et al., 1994).

Озеро Байкал - является единственным пресноводным водоемом, в котором обнаружены значительные запасы гидратов метана (Кузьмин, 1998;

Клерке и др. 2003). С помощью геофизических и геохимических методов определено, что они занимают обширные пространства Южной и Средней котловины Байкала, образуя, таким образом, сплошную «подошву» в донных осадках озера. К настоящему времени установлено, что байкальские гидраты

11 состоят из СН4 (99%), а изотопное отношение 8 С = - 60 %о указывает на его биогенное происхождение (Клерке и др., 2003). В Байкале также обнаружены районы, где из донных осадков идет высачивание минерализованных вод, насыщенных метаном (Crane et al., 1991). Источником углерода для развивающихся здесь бентосных сообществ является органическое вещество, образуемое на основе метана биогенного происхождения (Кузнецов и др., 1991; Гебрук и др., 1993).

Цель работы: Изучение биоразнообразия микробного сообщества районов залегания газовых гидратов и б. Фролиха, с использованием молекулярно-биологических методов.

Задачи исследования.

1. Разработать эффективные методы выделения суммарной ДНК из природных образцов донных осадков озера Байкал.

2. Исследовать морфологию микроорганизмов природного образца в районах грязевых вулканов с помощью световой и электронной микроскопии.

3. Определить численность метанотрофных микроорганизмов в районах приповерхностного залегания газовых гидратов и в районе подводного источника б. Фролиха.

4. Изучить разнообразие бактерий исследуемых районов методом анализа гена 16S рРНК и функционального гена ртоА.

5. Разработать методику идентификации некультивируемых бактерий методом гибридизации нативной ДНК, меченной Р in vivo, с байкальскими клонами.

Научная новизна. Впервые в пресноводном озере с использованием молекулярных методов исследовано сообщество микроорганизмов, ассоциированное с газовыми гидратами. На основе сравнительного анализа фрагментов гена 16S рРНК установлено, что в осадках преобладают некультивируемые формы бактерий, имеющие низкую степень гомологии с известными в мировой базе данных. Выявлено, что байкальские последовательности образуют отдельные кластеры, которые могут свидетельствовать о наличии "эндемичных" бактерий. В районе повышенных концентраций метана обнаружено большое количество морфологически разнообразных форм бактерий, спор и цист. Наличие внутри клеток внутрицитоплазматических мембран (ВЦМ) позволило идентифицировать метанотрофные бактерии. Эти результаты подтверждены данными сравнительного анализа функциональных генов-метанмонооксигеназ, присущих метанотрофным бактериям. Разработана методика детекции некультивируемых бактерий в донных осадках в конкретно-заданных условиях, минуя стадии ПЦР-анализа и клонирования. Впервые исследовано разнообразие архебактерий в донных осдаках озера Байкал, установлено наличие последовательностей, относящихся к царствам Crenarchaeota и Euryarchaeota.

Практическая значимость. Перед мировым сообществом стоит проблема поиска и использования природных источников энергии. Одним из таких источников являются газовые гидраты (ГГ). В Байкале ГГ имеют биогенное происхождение, поэтому изучение групп бактерий, обеспечивающих этот процесс, имеет большую практическую значимость. Данные по распределению различных видов микроорганизмов, в том числе метанотрофных, могут быть использованы в качестве индикаторных показателей мест разгрузки метана и мониторинга деятельности микроорганизмов. Создан банк данных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК и гена ртоА метанотрофных бактерий, 90 из них зарегистрированы в международном EMBL-банке данных и им присвоены следующие номера: AY739914-AY739938, DQ356932-DQ356934, DQ359154-DQ359155, DQ364473-DQ364475, DQ371460-DQ371461, AY839107-AY839135, AY833517-AY833524, DQ178146-DQ17816, DQ338556.

Полученные нуклеотидные последовательности могут служить основой для конструирования зондов для гибридизации, что позволит проводить количественную оценку структуры микробного сообщества донных осадков озера Байкал.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. В донных осадках районов грязевых вулканов и выходов метана в Байкале формируется специализированное микробное сообщество. В поверхностных слоях осадка идет активное окисление метана аэробными метанотрофными бактериями, в глубоких слоях осуществляется анаэробное окисление.

2. В донных отложениях обитают представители различных филогенетических групп, в основном они представлены некультивируемыми формами.

3. В глубоководных осадках озера Байкал обитают архебактерии, принадлежащие двум царствам - Crenarchaeota и Euryarchaeota. Большинство последовательностей байкальских архей относятся к царству Euryarchaeota.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в ВосточноСибирском регионе», Иркутск, 2002; всероссийской конференции «Биоразнообразие и функционирование микробных систем Центральной Азии», Улан-Удэ, 2003; на международном симпозиуме «Газовые гидраты в экосистеме Земли», 2003; международном Байкальском симпозиуме по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», Иркутск, 2003; конференции молодых ученых, посвященная академику М.А.Лаврентьеву, Новосибирск, 2003; международном рабочем совещании «Происхождение и эволюция биосферы», г. Новосибирск, 2005; IV Верещагинской Байкальской конференции, Иркутск, 2005; молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии, Москва 2005, ИНМИ РАН.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 18 научных работ, 2 находятся в печати.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы 120 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 13 рисунков, 15 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Экология», Шубенкова, Ольга Владимировна

выводы

1. В осадках озера Байкал, приуроченных к району залегания газовых гидратов зафиксирована стабильно высокая численность метанотрофных бактерий, которая составила 105- 106кл/ мл.

2. С помощью световой и электронной микроскопии в районе повышенных концентраций метана показано широкое морфологическое разнообразие вегетативных и покоящихся форм клеток. Наличие хорошо выраженных ВЦМ позволило выявить в природном образце метанотрофов первого и второго типа.

3. По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК впервые исследовано микробное сообщество донных осадков, ассоциированных с газовыми гидратами. Обнаружено 260 новых некультивируемых бактерий. Показано, что для полученных последовательностей отсутствуют известные структуры, полностью идентичные байкальским клонам. Процент гомологии байкальских последовательностей с известными в GeneBank составил 8495%. Наиболее высокий процент гомологии отмечен с культивируемыми представителями родов Pseudomonas, Ralstonia, Clostridium.

4. В кристаллах газовых гидратов и осадках, ассоциированных с ними преобладают архей царства Euryarchaeota, относящиеся к порядку Methanosarcinales. Методом FISH установлено наличие в кристаллах газового гидрата бактерий различных филогенетических групп.

ДО

5. Разработана методика гибридизации нативной ДНК меченной Р in vivo, с байкальскими последовательностями, позволяющая детектировать последовательности микроорганизмов в донном осадке, минуя стадию клонирования и секвенирования.

БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает сердечную благодарность научному руководителю к.б.н. Т.И. Земской за всестороннюю помощь в работе, зав. лаб. к.б.н. В.В. Парфеновой, О.М. Хлыстову, д.б.н. С.И. Беликову, к.б.н. Н.Н. Деникиной, Р. Аделыиину, д.б.н. Б.Б. Намсараеву, Т.Я. Косторновой, С.М. Черницыной, Т. Волгиной, С.Ю. Максименко и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии ЛИН СО РАН за оказанную помощь при выполнении работ и обсуждении результатов. Выражаю искреннюю благодарность Е.И. Рябчиковой из научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», г. Новосибирск. Автор также признателен экипажу НИС «Г.Ю. Верещагин» за отбор проб воды и донных осадков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для функционирования экосистемы Байкала очень важной компонентой является цикл метана. По данным Егорова А.В. (Егоров, 2003), его концентрации в придонных слоях воды и поверхностных слоях осадка гораздо выше, чем в водном теле.

В районах залегания газовых гидратов и выхода гидротермального источника б. Фролиха в воде и осадках были зарегистрированы максимальные значения концентраций метана для Байкала, что обусловлено наличием большого количества природного газа биогенного происхождения в первом случае и подтоком метана с гидротермальными флюидами во втором.

Анализ кривых распределения метана на границе вода-донные осадки (Егоров, 2003) свидетельствует о его активной деструкции в данной зоне. Это было также подтверждено нашими исследованиями при оценке численности метанотрофных бактерий, она оказалась высокой на протяжении всего периода исследований (105-106 кл/мл) и сопоставима с численностью данной группы бактерий в морских экосистемах (Пименов, 2004), где отмечено наличие грязевых вулканов и холодных метановых сипов.

Наши исследования по оценке скорости окисления метана в воде и придонном слое данных районов (Дагурова и др., 2004) радиоизотопным методом показали высокие скорости этого процесса. Скорость окисления метана до СО2 достигала 372 мкл СН4/(л сут) в придонной воде, а в иловых отложениях была гораздо выше и составляла 7,0—4700,0 мкл СН4/(л сут).

Проведенный анализ метанотрофного сообщества донных осадков приповерхностного залегания газовых гидратов (ст. Маленький) методом исследования функционального гена мембрансвязанной метанмонооксигеназы (ртоА) показал присутствие этого гена лишь в поверхностных горизонтах осадка (0-5 см), что совпадает с зоной, где происходят активные процессы аэробного окисления метана. Результат сравнительного анализа полученных байкальских метанотрофных бактерий показал их родство (92 %) с метанотрофами первого типа пресноводного озера Вашингтон.

Исследования морфологии бактерий, обитающих в придонной воде грязевого вулкана «К-2», показал широкий спектр различных по морфологии клеток. Ультратонкие срезы этих бактерий позволили идентифицировать внутрицитоплазматические мембраны. Характерное расположение этих мембран в клетке дали основание отнести эти бактерии к метанотрофам первого и второго типа. В природном образце были также обнаружены клетки с различными типами мембранных образований (везикулы, трубчатые выросты), что свидетельствует о более широком спектре видов, чем удалось нам идентифицировать. В пробе также детектировалось наличие различных покоящихся форм бактерий: цисты и экзоспоры. Поэтому в будущем исследования в этом направлении необходимо продолжить и с применением других методов исследования.

Методом анализа гена 16S рРНК показано широкое разнообразие видов бактерий, обитающих в донных осадках озера Байкал. Подавляющее большинство исследованных байкальских бактерий проявляют низкую степень гомологии с некультивируемыми бактериями, выделенными из природных образцов воды и осадков морских и пресноводных экосистем. Процент гомологии байкальских последовательностей с известными в GeneBank составил 84-95%. Наиболее высокий процент гомологии отмечен с культивируемыми представителями родов Pseudomonas, Ralstonia, Clostridium.

Некоторые байкальские последовательности, полученные из осадков, ассоциированных с газовыми гидратами, проявили сходство с некультивируемыми бактериями, изолированными из кристаллов газовых гидратов морских экосистем (Lanoil et al., 2001).

Установлено, что в кристаллах газовых гидратов и осадках, ассоциированных с ними преобладают археи царства Euryarchaeota, относящиеся к порядку Methanosarcinales . Преобладание архей этой группы бактерий было также отмечено в Черном море (Гальченко, 2001) в районе высачивания метана. Проведенные исследования анаэробного метанотрофного сообщества зон метановых сипов Тихого океана у побережья Калифорнии, с помощью биомаркеров (специфических липидов) и посредством филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, показали, что, потребление метана, возможно, осуществляют архей, входящие в порядок Methanosarcinales (Hinrichs et al., 1999). В дальнейшем это было доказано с помощью олигонуклеотидных флуоресцентных зондов, которые подтвердили, что эти архей, вместе с сульфатредукторами, составляют микроконсорциумы, осуществляющие анаэробное окисление метана в морских осадках (Boetius et al., 2000).

Методом гибридизации in situ (FISH и CARD-FISH) подтверждено наличие в кристаллах газового гидрата озера Байкал бактерий различных филогенетических групп, в том числе, участвующих в анаэробном окислении метана в морских осадках (группа ANME-1). Вместе с тем, следует отметить, что метод прямого секвенирования не показал наличия последовательностей в байкальских осадках и газовых гидратов, полностью идентичных для бактерий, обеспечивающих этот процесс в морских экосистемах. Не отмечено нами в исследуемых образцах и структур сульфатредуцирующих бактерий, столь характерных для морских условий. В единичных случаях с помощью флуоресцентно-окрашенных зондов нами отмечено присутствие бактериальных агрегатов, содержащих сульфатредуцирующие бактерии, но их редкое обнаружение в пробах не дает основания считать их ключевыми бактериями, обеспечивающими анаэробное окисление метана в озере Байкал.

32

Разработанный нами метод гибридизации нативной ДНК меченной Р in vivo позволяет идентифицировать наличие в различных природных образцах донных осадков интересующие последовательности бактерий без процедуры клонирования и секвенирования. Таким образом, в ближайшем будущем предполагается с использованием данного метода получить более полную картину спектра видов для различных природных образцов, в том числе и для газовых гидратов.

Ill

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шубенкова, Ольга Владимировна, 2006 год

1. Атлас Байкала / под ред. Галазия Г.И. М.: ФСГК. 1993. - 160с.

2. Беликов С.И., Земская Т.И., Парфенова В.В. Первичная характеристика бактерий керна BDP-93 из озера Байкал. // Байкал природная лаборатория для исследования изменений окружающей среды и климата: Тез. докл. - 1994. - Т. 5. - С. 14.

3. Белькова Н.Л., Парфенова В.В., Косторнова Т.Я., Денисова Л.Я., Зайчиков Е.Ф. Характеристика биоразнообразия микробного сообщества водной толщи озера Байкал // Микробиология. 2003. - Т. 72. № 2. - С. 239-249.

4. Белькова Н.Л., Чунг Х.М., Ан Т.С. Применение метода гибридизации IN SITU для выявления цианобактериальных клеток. // Микробиология. 2002. -Т. 71, №3, С. :381-386.

5. Верещагин Г.Ю. Байкал. Иркутск, ОГИЗ. 1947. С. - 170.

6. Верещагин Г.Ю. Газы, выделяющиеся со дна Байкала // Природные газы СССР. Вып. 27. Л., 1933. С. 21-40.

7. Вернадский В.И. Живое вещество / В.И. Вернадский. М.: Наука, 1978.-358 с.

8. Верхозина В.А. Микробиальные процессы круговорота азота в Байкале. // Микроорганизмы в экосистемах озер и водохранилищ. 1985. - С. :33-42.

9. Вотинцев К.К. Гидрохимия озера Байкал. Труды Байкал, лимнол. ст. АН СССР.-М.: Изд. АН СССР, 1961. 311 с.

10. Вотинцев К.К., Мещерякова А.И., Поповская Г.И. О значении ультрананнопланктонных водорослей в создании первичной продукции

11. Байкала в летний период. // Гидробиол. Журнал. 1972. - Т. 8 ,№3, С. 2127.

12. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии М.: ГЕОС, 2001. - 500с.

13. Гальченко В.Ф., Шишкина В.Н., Сузина Н.Е., Троценко Ю.А. Выделение и свойства новых штаммов облигатных метанотрофов. // Микробиология. -1977. Т. 46. - С. 890-897.

14. Гебрук А.В., Кузнецов А.Н., Намсараев Б.Б., Миллер Ю.М. Роль бактериальной органики в питании глубоководных донных животных в бухте Фролиха (оз. Байкал) в усовиях повышенного теплового потока. // Изв. РАН. Сер. биол. 1993. - Т. 6. С. 903-908.

15. Гинсбург Г.Д., Соловьев В.А. Субмаринные газовые гидраты. Санкт-Петербург, ВНИИОкеанология, 1994,200 с.

16. Голубев В.А. Геотермия Байкала. Новосибирск: Наука, 1982, 150 с.

17. Голубев В.А. Докл. РАН. 1997. - Т. 352, № 5 - С. 652-655.

18. Голубев В.А. Тепловой поток через впадину оз. Байкал. // Докл.АН СССР. -1979. Т. 245, №6. - С. 1333-1336.

19. Гольмшток А.Я., Дучков А.Д., Хатчинсон Д.Р., Ханукаев С.Б., Ельников А.И. Оценки теплового потока на озере Байкал по сейсмическим данным о нижней границе слоя газовых гидратов // Геология и геофизика. 1997. -№ 10.-С. 1677-1691.

20. Гоман Г.А. Бактериальное восстановление сульфатов и окисление сульфидов в грунтах Байкала. // Гидробиол. Журнал. 1975. - Т. 11, №5. - С. 18-22.

21. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнецов С.И. Экология водных микроорганизмов. -М.: Наука, 1977. -288 с.

22. Гранин Н.Г., Гранина JI.3. Газовые гидраты и выходы газов на Байкале. // Геология и Геофизика. 2002. - Т. 43. - С.629-637.

23. Гранина JI.3., Каллендер Е., Ломоносов И.С., Мац В.Д., Голобокова Л.П. Granina L.Z.; Callender Е.; Lomonosov I.S.; Mats V.D.; Golobokova L.P.

24. Аномалии состава поровых вод донных осадков Байкала. Anomalies in the composition of Baikal pore waters. // Геология и геофизика. 2001. - Т. 42, №1-2, С. 362-372.

25. Грачев М.А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал. 2002. 156 с.

26. Гайнутдинова Е.А., Б.Ц. Ешинимаев, И.С. Цыренжапова, О.П. Дагурова, Н.Е. Сузина, В.Н. Хмеланина, Б.Б. Намсараев, Ю.А. Троценко Аэробные метанотрофные сообщества донных осадков озера Байкал // Микробиология. 2005. - Т. 74, № 4. - С. 562-571.

27. Дагурова О.П., Намсараев Б.Б., Козырева Л.П., Земская Т.И., Дулов Л.Е. Бактериальные процессы цикла метана в донных осадках озера Байкал. // Микробиология. 2004. - Т.74, №2. - С. 248-257.

28. Денисова Л.Я., Белькова Н.Л., Тулохонов И.И., Зайчиков Е.Ф. Биоразнообразие бактерий на различных глубинах южной котловины озера Байкал, выявленное по последовательностям 16S рРНК. // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 4. - С. 547-556.

29. Драбкова В.Т. Зональное изменение интенсивности микробиологических процессов в озерах. Л.: Наука. Ленингр. Отд-ние, 1981. - 212 с.

30. Дучков А.Д., Лысак С.В., Голубев В.А., Дорофеева Р.П., Соколова Л.С. Геология и геофизика. 1999. - Т. 40, № 3. - с. 287-303.

31. Егоров А.В. Исследование распределения метана в воде и осадках северовосточной части Черного моря 1999-2002 гг. // Тез. докл. XV Международной школы морской геологии. М. 2003. - Т. II . С. 167 — 168.

32. Исаев В.П., Коновалова Н.Г., Михеев П.В. Природные газы Байкала. // Геология и Геофизика. 2002. - Т. 43. - С. 638 - 643.

33. Истомин В.А, Якушев B.C. Газовые гидраты в природных условиях. М.: Недра, 1992,236 с.

34. Кожов М.М. Биология озера Байкал. М.: АН СССР, 1962. - 316с.

35. Кузнецов А.П., Стрижов В.П., Кузин B.C., Фиалков В.А., Ястребов B.C. Новое в природе Байкала: сообщество, основанное на бактериальном хемосинтезе // Изв. АН. СССР. Сер. биол. 1991. - №5. - С. 766-772.

36. Кузнецов С.И. Микрофлора озер и ее геохимическая деятельность. Л.: Наука, 1970.-440 с.

37. Кузнецов С.И., Саралов А.И., Назина Т.Н. Микробиологические процессы круговорота углерода и азота в озерах. М.: Наука, 1985. - 213 с.

38. Кузьмин М.И., Калмычков Г.В., Гелетий В.Ф. и др. Первая находка газогидратов в осадочной толще озера Байкал. // Доклады АН. 1998. - Т. 362 №4.- С. 541-543.

39. Лаптева Н.А., Афанасьев В.А. Микрофлора озера Байкал (электронно-микроскопические исследования). // Биология внутренних вод. -1988. Т. 80.-С. 5-13.

40. Ленглер. И., Древе Г., Шлегель Г. Современная микробиология прокариоты т. 2. С. 486. М.: Мир. 2005.

41. Макагон Ю.Ф. «International Conference on Natural Gas Hydrates» 20-24 June 1993, N.-York, USA, p. 119-145.

42. Макагон Ю.Ф. Гидраты природных газов. М.: Недра, 1974. 208 с.

43. Максимова Э.А., Сергеева И.А., Максимов В.Н. Микробоценозы доннных отложений Байкала. 1991. -С. 160.

44. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование / Лабораторное руководство. Москва: Мир., 1984. 480 с.

45. Мизандронцев И.Б. Химический состав грунтовых растворов Байкала. // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах / АН СССР.СО. Лимнол.ин-т; 1975. С. 250-253.

46. Младова Т.А. Микробиологическая характеристика донных отложений Байкала. // Круговорот вещества и энергии в озерных водоемах. 1975. -С. 246-250.

47. Малашенко Ю.Р., Романовская В.А., Троценко Ю.А. Метаноокисляющие микроорганизмы М.: Наука. 1978. 198 с.

48. Намсараев Б.Б., Дулов Л.Е., Дубинина Г.А., Земская Т.Н., Гранина Л.З., Карабанов Е.Б. Участие бактерий в процессах синтеза и деструкции органического вещества в микробных матах озера Байкал. // Микробиология. 1994. -Т. 63, №2. - С. 345-351.

49. Намсараев Б.Б., Земская Т.Н. Микробиологияческие процессы круговорота углерода в донных осадках озера Байкал. Новосибирск.: Изд-во СО РАН, 2000.

50. Намсараев Б.Б., Земская Т.Н., Дагурова О.П., Гранина Л.З.,Голобокова Л.П.,

51. Ситникова Т.Я.(В. В. Namsaraev, Т. I. Zemskaya, О. P. Dagurova, L. Z. Granina,

52. P. Golobokova, and T. Ya. Sitnikova) Бактериальные сообщества донныхосадков в районе гидротермального источника бухты Фролиха. (BACTERIAL

53. COMMUNITIES OF THE BOTTOM SEDIMENTS

54. NEAR A HYDROTHERMAL SOURCE IN FROLIKHA BAY (Northern Baikal)). // Геология и геофизика. 2002. - Т. 43, №7. - С. 644-647.

55. Наумова Н.Б. Археи в неэкстремальных экосистемах // Успехи современной биологии. -2003. Т. 123, № 1. - С. 16-23.

56. Нечаева Н.Б., Салимовская-Родина А.Г. Микробиологический анализ донных отложений Байкала // Тр. Байкал. Лимнол. Ст. 1935. - Т 6. — С. 5-14.

57. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир, 1997. - 432 с.

58. Палас П.С. Путешесвие по разным провинциям Российского государства. Ч. II. СПб, 1788, 624 с.

59. Пампура В.Д., Кузьмин М.И., Гвоздков А.Н., Антипин B.C., Ломоносов И.С., Хаустов А.П. Геохимия современной седиментации оз. Байкал. // Геология и геофизика. 1993. - Т. 34, №10-11. - С. 52-67.

60. Пименов Д.В. Индивидуальная изменчивость морфологических признаков Rosa aciculams Zindl в Забайкалье. // Ботанические исследования в Сибири. -1994. С. 92-99.

61. Романенко В.И., Кузнецов С.И. Экология микроорганизмов пресных водоемов: лабораторное руководство. Л.: Наука, 1974. - 194 с.

62. Романенко В.И., Младова Т.А. Шарообразные стеклянные баллоны для стерильного отбора проб воды и грунта с больших глубин. // Информ. бюл. / АН СССР. Ин-т биологии внутренних вод; 1969; 4: Биология внутренних вод. С. 72-75.

63. Русанов И.И., Леин А.Ю., Пименов Н.В., Юсупов С.К., Иванов М.В. Биогеохимический цикл метана на Северо-Западном шельфе Черного моря // Микробиология. 2002. Т. 71. № 4. С. 558-566.

64. Сокольников В.М. Причины, обуславливающие образование пропарин (ключей) в ледяном покрове Байкала // Тр. Байкальской лимнологической станции. Т. 15. М.; Л., 1957, с. 65-94.

65. Сузина Н.Е., Дмитриев В.В., Фихте Б.А. Влияние условий культивирования на организацию на организацию мембранного аппарата и поверхностных трубчатых структур клеток Methylocystis echinoides. // Микробиология. -1982.-Т. 51.-С. 806-808.

66. Сузина Н.Е., Дмитриев В.В., Четина В.Е., Фихте Б.А. Цитобиохимические особенности метанотрофных бактерий. // Микробиология. 1984. - V. 53. - С. 257-260.

67. Турова Т.П., Колганова Т.В., узнецов Б.Б. Пименов Н.В. Филогенетическое разнообразие архейного компонента бактериальных обрастаний на кораловидных постройках в зонах выхода метана в Черном море // Микробиология. 2002 . Т.71. № 2. С. 230-236.

68. Хатчинсон Д.Р., Гольмшток А.Я., Зоненшайн Л.П., Мур Т.К., Шольц К.А., Клитгорд К.Д. Особенности строения осадочной толщи оз. Байкал по результатам многоканальной сейсмической съемки (1989г.). // Геология и геофизика. 1993. -Т. 34, № 10-11. - С. 25-36.

69. Хлыстов О.М., Клерке Ж., Де Батист М. Донные осадки, содержащие приповерхностные газовые гидраты в оз. Байкал. // Третья Верещагинская Байкальская конференция: Тез. докл.; 2000. С. 258.

70. Яснитский В.А., Бланков Б.Н., Гортиков В.И. Отчет о работе Байкальской лимнологической станции. Изв. Биол.-геогр. Ин-та при ИГУ. - 1927. -Т.З. - Вып.З. - С.47-54.

71. Amann R., Methodological aspects of fluorenscence in situ hybridization // Biosci. Microflora. 2000 -V. 19. - № 2. - P. 85-91.

72. Appenzeller "New Item", J.Incl.Phenom. 1991. - V.l 1. - P. 91-101.

73. Casamayor E.O., Calderon-Paz J.I., Mas J., Pedros-Alio C. Identification of phototroflc sulfur bacteria through the analysis of LmwRNA band patterns // Arch. Microbiol. 1998. - V. 170. - P. 269-278.

74. Chandler D.L., Stults J.R., Cebula S. Et al. Affinity purification of DNA and RNA from environmental samples with peptide nucleic acid clamps // Appl. Env. Microbiol. 2000. - V. 66. - № 8. - P. 3438-3445.

75. Crane К., Hecker В., Golubev V. Hydrothermal vents in Lake Baikal. // Nature. -1991. -№.350-P. 281.

76. Cases I., de Lorenzo V. The grammar of microbiological diversity // Environ. Microbiol. 2002. - 4.- № 11. - P. 623-627.

77. Connon S.A., Giovannoni S.J. High throughput methods for culturing microorganisms in very - low - nutrient media yield diverse new marine isolates // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - 68. - P. 3878-3885.

78. Falkner K.K., Measures C.I., Herbelin S.E., Edmond J.M., Weiss R.F. The major and minor element geochemistry of Lake Baikal. // Limnology and Oceanography. 1991. - V. 36. - №3. - P. 413-423.

79. Fricker C.R. From media to molecules: new approaches to the detection of microorganisms in water // Water, Air and Soil Pollution. -2000. 123. - P. 35-41.

80. Galchenko V.F., Lein A.Yu., Ivanov M.V., Biological sinks of methane // Exchange of trace gases between terrestrial ecosystems and the atmosphere. -Dahlem konferenzen. 1989. - P. 59-71.

81. Georgi J. G. Bemerkungen einer Reise im Rissishen Reichim Jahre, 1772, Bd. 2. SPb, 1775.

82. Glockner F.O. An In Situ Hybridization Protocol for Detection and Identification of Planctonic Bacteria // Microbiol. 1996. - V. 19. P. 403-406.

83. Glockner F.-O., Fuchs B.M., Amann R. Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridisation // Appl. Environ. Microbiol. 1999. 65. № 8. - P. 3721-3726.

84. Gray M.W., Sancoff D., Cedergen R.J. On the evolutionary descent of organisms and organelles: a global phylogeny based on highly conserved structural core in small suunit ribosomal RNA // Nucleic. Acids Res. 1984. - 12.- № 14. P. 5837-5852.

85. Head I.M., Saungers J.R., Pickup R.W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms //Microb. Ecol. 1998. - V. 35. - № 1. - P. 1-21.

86. Hoehler T.M., Alperin M.J., Albert .B. Field and laboratory studies of methane oxidation in an anoxic marine sediments: evidence for a methanogen-sulfate reducer consorcium // Global Biochem. Cycles. 1994. - V.8. - №4. - P. 451463.

87. Hofle M.G. Bacterioplankton community structure and dynamics after largescale release of nonindigenous bacteria as reveald by low-molecular-weight-RNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - № 10. - P. 3387-3394.

88. Hoehler T.M., Alperin M.J., Albert .B. Field and laboratory studies of methane oxidation in an anoxic marine sediments: evidence for a methanogen-sulfate reducer consorcium // Global Biochem. Cycles. 1994. - V.8. - №4. - P. 451463.

89. Hofle M.G. Bacterioplankton community structure and dynamics after largescale release of nonindigenous bacteria as reveald by low-molecular-weight-RNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - № 10. - P. 3387-3394.

90. Hofle M.G. Taxonomic diversity and metabolic activity of microbial communities in the water column of the central Baltic Sea // Limnol. Oceanogr. 1995. - 40. -№5.-P. 868-874.

91. Karl D.M., Tilbrook B.D. Production and transport of methane in oceanic particulate organic-matter. //Nature. 1994. - V. 368. - P. 732-734.

92. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. //J. Mol. Biol. 1961. - V. 3. - P. 208-218.

93. Moll G., Ahrens R. Ein neuer Fimbrientyp. // Arch. Microbiol. 1970. - V. 70. - P. 361-368.

94. Murrell J.C., McDonald I.R., Bourne D.G. Molecular methods for the study of methanotroph ecology // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - V. 27. - P. 103-114.

95. Mutray A.F., Mohn W.W. Quantitaition of the population size and metabolic activity of a resin acid degrading bacterium in activated sludge using slot-blot hybridization to measure ther RNA: rDNA ratio // Microb. Ecol. 2000. - V. 38. -P. 348-357.

96. Nistrom T. Not quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death //Arch. Microbiol.-2001.- 176.-P. 159-164.

97. Qiu X., Wu L., Huang H., McDonel P.E., Palumbo A.V., Tiedje J.M., Zhou J. Evaluation of PCR-generated, mutations, and heteroduplexes with 16S rRNA gene-based cloning // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - 67. - № 2. -P. 880887.

98. Rochelle P.A., Fry J.C., Parkes R.J., Weightman A.J. DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities. // FEMS Microbiol. Letters. 1992. - V.100. - P.59-66.

99. Sambrook J., Frisch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. -1989. V. 2. - P. 53-72.

100. Schmidt T.M., DeLong E.F., Pace N.R. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing // J.Bacteriol. — 1991. — 173.-P. 4371-4378.

101. Schmidt T.M., DeLong E.F., Pace N.R. Analysis of a marine picoplankton community by 16S rRNA gene cloning and sequencing // J.Bacteriol. — 1991. — 173.-P. 4371-4378.

102. Schulz M., Faber E., Hollerbach A., Schroder H.G., Gude H. The methane cycle in the epilimnion of Lake Constance. // Archiv fur Hydrobiol. 2001. -V. 151. - P. 157-176.

103. Seifert R., Amann R., Delling N., Richnow H-H., Kempe S., Hefter J., Michaelis W. Ethylene and methane in the upper water column of the subtropical Atlantic // J. Biogeochem. 1999. - V. 44. - P. 73-91.

104. Sekar R. An improved protokol for quantification of freshwater Actinobacteria by fluorescence in situ hybridization. // // Appl. Env. Microbiol. 2003. - V.69. -№ 5. - P. 2928-2935.

105. Sheu D.-S., Wang Y.-T., Lee C.-Y. Rapid detection of polyhydroxyalkanoate-accumulating bacteria isolated from the environment by colony PCR // Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 2019-2025.

106. Sloan E.D. Clathrate Hydrates of Natural Gases. N.Y.: Basel, 1990. P. 641.

107. Spanggaard В., Huber I., Nielsen J., Nielsen Т., Appel K. F., Gram L. The microflora of rainbow trout intestine: a comparison of trditional and molecular identification // Aquaculture. 2000. 182. - P. 1-15.

108. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S rRNA sequences // Appl. Environ. Microbiol. -1985.-49.-P. 1379-1384.

109. Staley J.T. Prosthecomicrobium and Anacalolomicrobium: new freshwater prosthecate bacteria J. Bacterid. 1968. - V. 95. - P. 1921-1942.

110. Suzuki Т., Yamasato K. Phylogeny of spore-forming lastic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequences // FEMS Microbiol. Letts. 1994. - V. 115, № 1. -P. 13-17.

111. Takeya S., Uchida Т., Nagao J. et al. International Workshop on Gas Hydrate Studies and Related Topics. 1-2 March 2003. Kitami: Kitami Inst.f Technol. 2003.-P.10.

112. Thompson J.R., Marcelino L.A., Polz M.F. Heteroduplexes in mixed-template amplifications: formation, consequence and elimination by "reconditioning PCR" // Nucleic Acids Res. 2002. - 30. - № 9. - P. 2083-2088.

113. Tsai Y.-L., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial DNA from humic substances in sediments for polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - 58. - № 7. P. 2292-2295.

114. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community // Nature (London). 1990. -V. 345.-P. 63-65.

115. Weller R., Glockner F.-O., Amann R. 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes for in situ detection of members of the phylum Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides // System. Appl. Microbiolol. 2000. - 23. - P. 107-114.

116. Whittenburry R., Davies S.L., Davey J.F. Exospores and cycts formed by methane-utilizing bacteria. // J. Gen. Microbiol. 1970. - V. 61. - P. 219-226.

117. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - 63. - 10. - P. 3741-3751.

118. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Towards natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eukarya // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 4576-4579.