Ювенильный артрит с увеитом: педиатрические аспекты прогнозирования развития, профилактики, раннего распознавания и терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.08, кандидат наук Гайдар Екатерина Владимировна

• Гайдар Екатерина Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Гайдар Екатерина Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Патофизиологические и эпидемиологические аспекты увеита ассоциированного с ювенильным артритом

1.1.1 Ювенильный артрит с увеитом: основы патогенеза и классификация

1.1.2 Распространенность ювенильного артрита с увеитом в популяции

1.2 Обзор основных направлений терапии увеитов: достоинства и недостатки

1.2.1 Терапия глюкокортикостероидами

1.2.2 Метотрексат в терапии увеитов

1.2.3 Генно-инженерная биологическая терапии увеитов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая характеристика пациентов

2.2 Общая характеристика выполненных исследований

2.3 Инструментальные методы

2.4 Лабораторные маркеры активности воспалительного иммунопатологического процесса

2.5 Протеомный анализ слезы

2.6 Статистический анализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Способность метотрексата предотвращать развитие увеита у пациентов с ювенильным идиопатическим артритом

3.2 Оценка риска возникновения увеита у детей с ювенильным артритом, получающих терапию этанерцептом

3.3 Оценка роли увеита как маркера прогнозирования тяжести ЮИА

3.4 Оценка эффективности терапии адалимумабом увеита, ассоциированного с ювенильным артритом

3.5 Протеомный профиль слезы в диагностике увеита, ассоциированного с ювенильным артритом

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ювенильный артрит с увеитом: педиатрические аспекты прогнозирования развития, профилактики, раннего распознавания и терапии»

Актуальность темы исследования

Особенностью течения увеита при ювенильном идиопатическом артрите (ЮИА) является слабо выраженная офтальмологическая симптоматика либо полное ее отсутствие на ранних этапах течения и отсроченное, иногда на несколько лет, вовлечение суставов [28]. Поздняя диагностика приводит к несвоевременному началу лечения и применению неадекватных схем терапии. В результате чего возникает необходимость в проведении сложной хирургической коррекции зрения в более позднем возрасте, а в 30 - 40% случаев является причиной необратимой потери зрения [30, 59, 98, 107, 129, 159]. Своевременное назначение схем терапии, используемых в настоящее время для лечения ЮИА, позволило бы значительно улучшить исходы увеита [65, 84, 128, 146].

Для лечения ЮИА с увеитом в настоящее время применяется ступенчатая терапия, первой ступенью которой - использование местной терапии глюкокортикостероидами в виде инстилляций и инъекций. При неэффективности первой линии терапии переходят на базисную цитостатическую терапию метотрексатом [57]. При сочетании артрита с увеитом терапия метотрексатом способна вызвать ремиссию увеита в среднем в 50-73% случаев [41, 56, 123, 131].

Остается открытым вопрос, изменяет ли метотрексат частоту увеита у детей с ЮИА. Решение этого вопроса имеет важное значение, так как доказательство способности метотрексата предотвращать развитие увеита может расширить показания к его применению у пациентов с олигоартритом, имеющих высокие риски развития увеита, но, как правило, не всегда являющихся кандидатами для терапии метотрексатом, по крайней мере, в начале заболевания [18]. Зачастую, артрит с увеитом требует более агрессивной терапии по причине глазного поражения, а вот насколько наличие увеита влияет на особенности течения суставного синдрома недостаточно изучено.

При неэффективности терапии метотрексатом к нему могут быть добавлены другие небиологические (циклоспорин А, азатиоприн, мофетила микофенолат или микофеноловая кислота) и биологические (адалимумаб, инфликсимаб, абатацепт) болезнь модифицирующие базисные противоревматические препараты [154]. Однако, в большинстве случаев опыт применения тех или иных препаратов ограничивается сериями из нескольких десятков наблюдений с разными результатами, которые не всегда могут быть одинаково воспроизведены в реальной клинической практике. Вопросы назначения генно-инженерных биологических препаратов у пациентов с увеитами находятся в стадии постоянного изучения.

Актуальным является вопрос диагностики хронического увеита на этапе до развития отчетливого суставного синдрома. Изолированный хронический аутоиммунный увеит может быть, как самостоятельным заболеванием, так и напоминать по своим клиническим проявлениям увеит при ЮИА. При отсутствии суставного поражения пациенты с хроническими увеитами лечатся у офтальмологов с применением топических стероидов и, как правило, не направляются к ревматологу. Такие пациенты не получают вовремя адекватную иммуномодулирующую терапию, которая может существенно улучшить исход увеита и сохранить зрительные функции на должном уровне. Лабораторные тесты, позволяющие диагностировать иммунопатологический характер изолированного увеита, ограничены неспецифическим тестом - определением антинуклеарного фактора; при этом не менее 30-40 % пациентов с хроническим увеитом могут быть серонегативными по антинуклеарному фактору, соответственно эти пациенты не имеют маркеров иммунопатологического процесса. Для диагностики иммунопатологического характера увеита может использоваться определение протеомного профиля слезы - исследование, позволяющее выявлять различные белки в ультрамалых концентрациях, которые могут быть как диагностическими маркерами, так и маркерами активности заболевания. Применение анализа протеомного профиля слезы аналогично изучению протеомного профиля синовиальной жидкости, использовавшегося

ранее для попытки классификации ювенильного ревматоидного артрита по спектру белков, выделяемых из синовиальной жидкости [115].

В пользу наличия ассоциации состава внутриглазной жидкости и слезы/крови свидетельствует:

1) известная системность патологического процесса при ЮИА, предположительно изменяющая и состав слезы/крови;

2) наличие дефектов гематоретинального барьера, возникающих вследствие воспаления и являющихся, по современным представлениям, одним из важных звеньев патогенеза увеита.

В связи с вышеизложенным, наиболее вероятными маркерами увеита, ассоциированного с ЮИА, должны быть высокомолекулярные соединения, являющиеся, по сути, информационными молекулами появления циркулирующих нетолеризованных к элементам внутренней структуры глаза Т-лимфоцитов, и/или запускающими активацию и клональную экспансию Т-лимфоцитов и/или мобилизацию лимфоцитов, макрофагов и полиморфноядерных клеток из кровяного русла, и/или тормозящими генерацию антигенспецифических Т-регуляторных лимфоцитов в селезенке, стремящихся остановить воспаление и ограничить патологический процесс.

Инструментом такого поиска может быть прецизионная масс-спектрометрия, а средой, в которой надо искать информационные молекулы -слеза, поскольку очень большое количество разных по молекулярной массе соединений, содержащихся в крови, чрезвычайно затруднит как предварительную подготовку к проведению анализа, так и сам анализ.

Цель исследования

Изучить педиатрические аспекты прогнозирования развития, профилактики, раннего распознавания и терапии ювенильного артрита с увеитом с целью создания оптимальных алгоритмов ранней диагностики и своевременного лечения.

Задачи исследования

1. Оценить риски возникновения увеита de novo у детей с ЮИА, получающих разные виды терапии на основании клинико-лабораторных данных.

2. Изучить роль увеита как маркера прогнозирования тяжести ЮИА.

3. Изучить эффективность и безопасность терапии адалимумабом у пациентов с ювенильным артритом с увеитом в зависимости от наличия факторов риска развития увеита.

4. Выполнить сравнительное исследование протеомного профиля слезной жидкости у различных групп детей и пациентов с увеитом, ассоциированным с ЮИА, установить ассоциации характеристик профиля с ювенильным артритом.

Научная новизна исследования

Впервые на основе многофакторного анализа установлена зависимость частоты развития увеита de novo у пациентов с ЮИА от проводимой терапии. Доказана способность метотрексата снижать риски развития увеита у пациентов с ювенильным идиопатическим артритом независимо от наличия факторов риска. Установлено, что риски развития увеита de-novo у пациентов, получающих этанерцепт, сопоставимы с пациентами, получающими метотрексат. Выявлено, что основными факторами риска увеита de-novo являются особенности течения ЮИА, а не проводимая терапия. Показано, что наличие сопутствующего увеита является независимым предиктором тяжести ювенильного идиопатического артрита и снижает эффективность проводимой терапии. Установлено, что терапия адалимумабом одинаково эффективна у детей с ЮИА-ассоциированным увеитом независимо от наличия факторов риска увеита и особенности течения заболевания.

Впервые изучен протеомный профиль слезы у пациентов с ювенильным артритом в зависимости от наличия увеита. Определена роль белковых маркеров

слезы в диагностике ЮИА-ассоциированного увеита с использованием прецизионной масс-спектрометрии, а также иерархического кластерного анализа.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выявленные факторы риска увеита, а также разработанный алгоритм диагностики и ведения пациентов с ЮИА, имеющих факторы риска увеита de novo, включающий оценку клинико-лабораторных данных, проводимой терапии и данных протеомного анализа слезы, позволяют уменьшить риски развития увеита у пациентов с ЮИА. Применение данного алгоритма может улучшить прогноз, исходы, качество жизни и уменьшить степень инвалидизации пациентов с ЮИА в случае развития увеита. Использование анализа протеомного профиля слезы у пациентов с ЮИА позволит выявлять не только группы риска по развитию увеита, а также может служить диагностическим тестом для пациентов, развивших увеит до суставного синдрома. Данные диссертационного исследования позволяют разработать подходы к профилактике увеита, его раннему распознаванию и выбору наиболее эффективных схем терапии.

Результаты диссертации используются в работе педиатрического отделения №3, офтальмологического отделения, кафедры госпитальной педиатрии и кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Терапия MTX способна снижать риск развития увеита de novo у пациентов с ЮИА независимо от наличия факторов риска увеита.

2. Адалимумаб способствует достижению быстрой и длительной ремиссии увеита, ассоциированного с ЮИА, независимо от наличия факторов риска увеита.

3. Протеомный анализ слезы дает возможность диагностики ЮИА-ассоциированного увеита в стадии доклинического проявления артрита.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертационного исследования доложены на семинаре «Увеит при ювенильных артритах: современные проблемы диагностики и терапии» (г. Санкт-Петербург, 2013), Европейском ревматологическом конгрессе (European League Against Rheumatism Congress, Rome, Italy, 2015), XV Юбилейной северозападной научно-практической конференции «Дни ревматологии в Санкт-Петербурге - 2015», Ежегодном конгрессе американского колледжа ревматологов (Annual American College of Rheumatology Congress, San-Diego, USA, 2015), Европейском ревматологическом конгрессе (European League Against Rheumatism Congress, London, 2016), Конгрессе с международным участием «Дни ревматологии в Санкт-Петербурге - 2016», XXIII Европейском педиатрическом

тЛ

ревматологическом конгрессе (23 European Pediatric Rheumatology Congress, Genoa, Italy, 2016), Конгрессе с международным участием «Здоровые дети -будущее страны» (г. Санкт-Петербург, 2017), Конгрессе с международным участием «Дни ревматологии в Санкт-Петербурге - 2017», Конгрессе с международным участием «Здоровые дети - будущее страны» (г.Санкт-Петербург, 2018), XXIV Европейском педиатрическом ревматологическом конгрессе (24th European Pediatric Rheumatology Congress, Lisbon, Portugal, 2018), Ежегодном конгрессе американского колледжа ревматологов (Annual American College of Rheumatology Congress, Chicago, USA, 2018).

Этическая экспертиза

Включение пациентов в исследование осуществлялось при наличии информированного добровольного согласия пациента или законного представителя. Методы исследования и лечения одобрены этическим комитетом ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России, протокол №3/11 от 04 декабря 2012г.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Все пациенты, включенные в исследование, были осмотрены автором лично, у 52% пациентов с увеитом автор был лечащим врачом. Самостоятельно проведен анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме, составлен план исследования, изучены и проанализированы анамнестические данные, собраны данные из первичной медицинской документации; проведено клиническое обследование, также самостоятельно выполнена обработка полученных результатов. Самостоятельно произведен забор материала для изучения протеомного профиля, выполнена подготовка материала для проведения анализа в проточном масс-спектрометре. Анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций выполнены автором лично.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 7 статей в рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией Министерства образования РФ рецензируемых научных журналах. Среди печатных работ 12 опубликовано на английском языке, из них 10 тезисов и 2 статьи.

Объем и структура диссертации

Основной текст диссертации изложен на 124 страницах машинописного текста на русском языке и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные исследования, обсуждение, заключение, выводы и практические рекомендации. Диссертация иллюстрирована 35 таблицами и 20 рисунками. Список цитируемой литературы включает 165 источников, из них 5 публикаций в отечественной литературе и 160 публикаций в иностранной литературе.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Патофизиологические и эпидемиологические аспекты увеита ассоциированного с ювенильным артритом

1.1.1 Ювенильный артрит с увеитом: основы патогенеза и классификация

Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) - хроническое воспалительное заболевание суставов неизвестной этиологии продолжительностью не менее 6 месяцев, начинающееся в возрасте до 16 лет [109]. ЮИА является наиболее частой причиной хронического переднего увеита в детском возрасте, увеит в свою очередь является наиболее частым внесуставным проявлением ювенильного артрита [120]. Частота развития увеита составляет около 15% от общего числа пациентов с ЮИА и развивается преимущественно в первые два года от дебюта суставного синдрома [149]. Начало хронического переднего увеита часто протекает бессимптомно, могут поражаться один или оба глаза [114]. Считается, что более короткий интервал между началом артрита и развитием увеита является прогностическим признаком тяжелого течения увеита [161]. В серии исследований установлены основные факторы риска развития увеита: олигоартикулярный субтип артрита, ранний возраст дебюта, серопозитивность по антинуклеарному фактору (АНФ), высокий уровень С-реактивного белка (СРБ) в дебюте [10]. Диагностика и лечение увеита у детей с ЮИА, представляют большую проблему, поскольку течение заболевания часто маломанифестно [18, 100], дети, как правило, не жалуются на ухудшение зрения и настроены негативно по отношению к активному офтальмологическому осмотру. В результате до 30-40% детей, страдающих увеитом, в значительной степени теряют зрение [9, 164]. Слепота, по крайней мере, односторонняя, наступает у 1735 % детей, а ухудшение зрения у 17-41 % детей [39, 114].

Причины увеита у детей, как и у взрослых, чрезвычайно разнообразны, причем неинфекционные увеиты являются наиболее частой формой, а в 60 %

случаев причина заболевания вообще остается нераспознанной [18, 38, 81, 100, 114, 145]. Общепринятым является мнение о том, что ЮИА является заболеванием, которое связано с нарушением Т-клеточного звена иммунитета. Дисрегуляция цитокинов, в первую очередь фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-а), лежит в основе как олиго-, так и полиартикулярного артрита, а также увеита при возможном сочетании генетических [69, 155] и внешнесредовых факторов [87]. Современные представления о его патогенезе схематически представлены на Рисунке 1.1 [27]. Традиционно предполагается, что неинфекционные увеиты по своей природе являются аутоиммунными заболеваниями, возникающими вследствие потери иммунной толерантности к аутоантигенам и последующей активации аутореактивных Т-лимфоцитов [27, 82, 85, 96, 110, 148]. Большую роль в основе патогенеза неинфекционного увеита отводят вовлечению в патологический процесс Т-клеточного звена иммунитета с участием CD4+ Т-хелперных клеток 1-ого и 17-ого типов, продуцирующих соответственно интерферон-гамма и интерлейкин-17 [27, 84, 97], которые контролируются CD4+CD25+FoxP3+T-лимфоцитами. Патогенетическая роль, как Т-хелперных клеток 1 -го и 17-го типа, так и регуляторных Т-клеток, при неинфекционном увеите установлена в ходе экспериментальных и клинических исследований, проведенных на экспериментальных моделях аутоиммунного увеита, ассоциированного с энцефалитом, а также увеита, вызванного введением эндотоксина, меланина [86]. Однако детальные механизмы участия каждого из этих звеньев в формировании заболевания неизвестны [7, 73, 102, 116]. Неполная элиминация в тимусе предшественников эффекторных Т-клеток, ответственных за распознавание ретинальных антигенов, приводит к появлению циркулирующих нетолеризованных Т-клеток. Эти клетки активируются антигенами или кроссреактивными антигенами сетчатки при наличии эндо- или экзогенных воспалительных стимулов и дифференцируются в аутоагрессивные ТЫ- или ТЫ7-клетки. Хотя естественные Т^-клетки, происходящие из тимуса, тормозят активацию и клональную экспансию клеток-предшественников, часть из них все же достигают внутренней среды глаза. Взаимодействие аутореактивных

лимфоцитов с антигенами глаза приводит к возникновению воспалительного каскада, результатом которого являются прорыв гематоретинального барьера, миграция лейкоцитов и формирование увеита. Одновременно антигены сетчатки, высвобожденные из поврежденных тканей, запускают генерацию антигенспецифических Treg-клеток в селезенке, стремящихся остановить воспаление и ограничить патологический процесс в глазу. [27, 76, 84, 97, 102, 142].

Рисунок 1.1 - Клеточные механизмы увеита: АРС-антиген-презентирующая

клетка, ОС-дендритная клетка, ЬРБ-липополисахарид, РМЫЪ-полиморфноядерный лимфоцит, ТН - Т-хелпер, Тге§ - Т-регуляторная клетка, СрО-ЭКА - цитозин-регуляторная клетка, в том числе и некоторые активированные эффекторные Т-клетки [27]

Анатомо-физиологические основы образования слезы и ее состав

Как известно, слой слезы, покрывающей роговицу и конъюнктиву, имеет сложную структуру (Рисунок 1.2) [47], а в ее формировании участвует несколько типов желез (Рисунок 1.3) [68]. Железы Krause (около 40 на верхнем веке, 6-8 на нижнем веке) и Wolfring/Ciaccio (около 2-5 на верхнем веке) по структуре и функции подобны основной слезной железе. Крипты Henle, железы Manz и бокаловидные клетки секретируют муцин. Мейбомиевы железы (около 50 на

верхних веках и около 25 на нижних) секретируют сложный субстрат с высоким содержанием липидов. Железы Zeis и Moll секретируют липиды. Жидкость, продуцируемая основной и дополнительными слезными железами, содержит также электролиты. Количество и качество слезы регулируется по парасимпатическим (медиаторы: ацетилхолин и вазоактивный интестинальный пептид) и симпатическим (медиатор: норадреналин) каналам.

Сигналы передаются при участии субстанции P и кальцитонин-генерируемого пептида. Основная слезная железа, иннервируемая в основном парасимпатическими волокнами, функционирует рефлекторно в ответ на стимуляцию, а дополнительные железы обеспечивают нерефлекторную базальную секрецию слезы [6]. Слеза изотонична, электролиты представлены в основном ионами Na+, K+, Cl-, HCO3- и в значительно меньшей степени - Mg2+ и Ca2+. Слеза содержит в незначительных количествах малые молекулы (глюкоза, лактат, мочевина и др.). Муцин (MUC5AC) формирует конъюнктивальный гель. Еще как минимум два типа молекул этого гликопротеина - MUC1 и MUC4 -связываются с поверхностью роговицы и образуют гликокаликс.

площадь поверхности ~ 2 кв см

_4 сп .о.

•Ч-►

слой липидов

наружный

неполяриэованный

слой

внутренний

поляризованный

слой

. поверхность глаза

ВОДНАЯ ФАЗА белки, соли. ■ формирующие гель муцины (MUC5AC)

СЛОЙ ГЛИКОКАЛИКСА

трансмембранные ' гликопротеины. муцины MUC1, MUC4. MUC16

белки

Рисунок 1.2 - Структура слезной пленки [48]

Рисунок 1.3 - Секреторный аппарат, формирующий слезу [68]

Особый интерес представляют белки, содержащиеся в слезе. Основу протеомного профиля слезы составляют четыре белка, находящихся в ней в большом количестве: лизоцим, лактоферрин, липокалин и секреторный иммуноглобулин А [43]. Эти белки секретируются слезными железами и

клетками эпителия их протоков, а также плазматическими клетками, причем концентрация белковых компонентов в слезе очень зависит от того, каков ее объем: стимулированная слеза содержит меньшие концентрации белков (3-7 и 20 мг/л соответственно) при изменении их соотношения (таблица 1.1) [6].

Таблица 1.1 - Относительное содержание белковых фракций в слезе [6]

Фракции В нестимулированной слезе, % В стимулированной слезе, %

Альбумин 58,2 20,2

Глобулин 23,9 56,9

Лизоцим 17,9 22,9

С возрастом количество белка в слезе уменьшается пропорционально уменьшению объема слезы, что приводит к сохранению или даже увеличению концентрации в слезе, например, альбумина и церулоплазмина [52, 90, 124], а во время сна секреция жидкости и основных белков, кроме sIgA, прекращается [141]. Эта вариабельность концентрации компонентов слезы является одним из факторов, требующих стандартизации отбора слезы для ее исследования [90]. В последние годы исследование протеомного профиля слезы вызывает все больший интерес [86, 99, 150, 151].

Все больше научных данных указывают на то, что анализ белкового состава слезы является перспективным направлением исследований его применения для раннего распознавания офтальмологической патологии. Количество белков, выявляемых в слезе, определяется методом, который при этом используется. Первые исследования белкового состава слезы проводили с использованием электрофореза в полиакриламидном геле [8, 34, 93], в дальнейшем все более широкое распространение стали получать различные подходы с использованием метода масс-спектрометрии [48, 86, 140]. В настоящее время построение протеомного профиля слезы наиболее широко используют для поиска биомаркеров синдрома сухого глаза [51, 67, 144, 150, 163]. С использованием все более совершенных методов исследования количество идентифицируемых в слезе белков увеличилось от 17 до 491 [140]. В настоящее время все белковые компоненты могут быть разделены на две группы [6].

Группа А. Белки, сходные с белками плазмы; их количество составляет <15 % всех белков слезы. Некоторые из этих белков всегда присутствуют в слезе (альбумин, иммуноглобулин G (1^0), а-Ь-антитрипсин, трансферрин, а-Ь-антихимотрипсин, р- 2-микроглобулин), другие - обнаруживаются транзиторно (церулоплазмин, гаптоглобин, цинк-а- 2-гликопротеин).

Группа В. Специфические белки, синтезируемые только слезной железой, например, белок RMP , и поступающие из прочих мест (лизоцим, лактоферрин, сывороточный 1§Л).

Классификация увеита при ЮИА

Увеит классифицируют в соответствие со стандартами, определенными номенклатурой SUN (Standardization of Uveitis Nomenclature) [38, 66], предполагающей учет времени длительности патологического процесса и вовлеченных в него структур глаза (Рисунок 1.4) [57].

Рисунок 1.4 - Схематическое изображение глаза с указанием структур, поражаемых при переднем, среднем и заднем увеите. В скобках приведены

патологические изменения

Харктеристики увеита, согласно протоколу SUN, представлены в таблице 1.2 [66].

Таблица 1.2 - Классификация степеней увеита и критерии обострения согласно протоколу SUN_

Степени увеита по количеству клеток в передней камере (для поля зрения щелевой лампы 1 мм2)

Степень Количество клеток в поле зрения

0 < 1

0,5+ 1 - 5

1+ 6 - 15

2+ 16 - 25

3+ 26 - 50

4+ 50+

Критерии обострения увеита по визуально наблюдаемому накоплению плазменных белков

Степень Описание

0 нет обострения

1+ Легкое

2+ умеренное (радужка/хрусталик чисты)

3+ выраженное (радужка/хрусталик замутнены)

4+ сильное (коагуляция фибрино/серозно-пластическая)

Наиболее частой формой увеита, ассоциированного с ЮИА, является хронический передний увеит, который может быть односторонним (30%) или двусторонним (70 %). Частота переднего увеита достигает 83 %, остальные формы увеита у пациентов с ЮИА встречаются реже: средний увеит - 9%, задний увеит - 1%, панувеит - 7% [57]. По характеру течения увеиты подразделяются на острые, хронические и рецидивирующие. В 68 % всех случаев течение увеита носит хронический характер, в 16 % случаев - острый и в 12 % случаев -рецидивирующий [118]. Увеит, начавшийся у детей в раннем возрасте, может иметь двухфазное течение: снижение активности в возрасте около 9 лет с

последующей активацией патологического процесса в пубертатном возрасте [58]. Острый передний увеит у больных ювенильным артритом встречается обычно при энтезит-ассоциированном артрите или ювенильном спондилоартрите -заболеваниях, ассоциированных с носительством антигена НЬА В27.

Из-за особенностей течения увеита ребенок часто поступает на первый осмотр окулиста уже со снижением остроты зрения. Основными причинами снижения остроты зрения являются такие осложнения увеита, как катаракта (3552 %), отек зрительного нерва (17-29 %), рубцы макулы (27 %), вторичная глаукома (15-33 %), неврит зрительного нерва (8 %), отслойка сетчатки (8 %) [9, 18, 61, 81, 114, 164]. Основной причиной поздней диагностики осложнений увеита является факт позднего направления/обращения к офтальмологу пациентов с ювенильным артритом, несмотря на хорошо известную взаимосвязь ювенильного артрита и увеита [30]. Профилактика осложнений увеита, ассоциированного с ЮИА, напрямую зависит от своевременной диагностики и адекватного лечения заболевания. Так Американская академия педиатрии, Международная лига ревматологических ассоциаций (ILAR) и Американская коллегия ревматологов (АСЯ) рекомендуют пациентам с ЮИА диспансерный осмотр окулистом с выполнением биомикроскопии каждые 3-6 или 12 месяцев в зависимости от возраста и субтипа заболевания [29]. Однако в последнее время появляются рекомендации по проведению биомикроскопии чаще - каждые 3 месяца, а у пациентов с высоким риском даже каждые 6-8 недель в первые полгода-год [57]. Известно, что вероятность возникновения осложнений увеита составляет до 34 % в течение первых 5-6 лет после постановки диагноза [22]. Длительное мониторирование за пациентами с увеитом в семидесятые-восьмидесятые годы прошлого века, до введения метотрексата в протокол лечения ЮИА, позволило установить, что через 7 лет у 42 % детей с ювенильным артритом формировалась катаракта, у 5 % - глаукома [122, 158]. К взрослому возрасту у половины пациентов, заболевших ювенильным артритом, формируется катаракта, у 22 % -глаукома и около 50 % имеют признаки активного увеита или получают

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гайдар Екатерина Владимировна, 2018 год

_ - -

20 40 60 80 100 120

Time, months

140 160 180 200

— No MTX -----MTX

— ETA

Рисунок 3.5 - Кумулятивная доля пациентов с возрастом дебюта ЮИА младше 5 лет, не развивших увеит, в зависимости от трех видов терапии (LogRank test)

3.3 Оценка роли увеита как маркера прогнозирования тяжести ЮИА.

На третьем этапе исследования проводилась оценка роли увеита, как маркера тяжести ювенильного идиопатического артрита. Для этого была отобрана группа из 175 пациентов, которым впервые был назначен генно-инженерный биологический препарат. Создание группы детей, которым потребовалось

назначение ГИБП, было связано с необходимостью отобрать пациентов, степень тяжести заболевания которых трактовалась как средняя или выше. В эту группу вошли 124 ребенка из первых двух частей исследования и дополнительно включен еще 51 ребенок, получавший другие ГИБП по поводу ЮИА без поражения органа зрения.

Критерии включения в эту часть исследования: 1) пациенты с ЮИА, у которых впервые был назначен генно-инженерный биологический препарат; 2) пациенты, получающие метотрексат либо пациенты у которых терапия метотрексатом могла быть отменена по причине ремиссии, непереносимости или побочных явлений после назначения ГИБП.

Критерии исключения: терапия текущими системными глюкокортикостероидами, а также терапия ритуксимабом, инфликсимабом, терапия ГИБП до включения в исследование.

Конечной точкой исследования считалось определение доли пациентов, с развившимся или неразвившимся значимым суставным поражением, которое требовало коррекции терапии в виде назначения небиологического базисного противоревматического препарата (при его отсутствии), либо смены текущей терапии ГИБП. В результате отбора была сформирована искомая группа из 175 пациентов.

Целью данной части исследования было определить, влияет ли сопутствующий увеит на риски значимого суставного обострения у пациентов, получавших первый ГИБП в зависимости от проводимой терапии метотрексатом.

Для исключения возможных рисков обострения, связанных с выработкой противолекарственных антител в данную часть, не включались пациенты, получавшие ранее какой-либо ГИБП, а также инфликсимаб, к которому часто происходит выработка противолекарственных антител в виду его химерной структуры. Дизайн исследования представлен на рисунке 3.6.

-1 то т-т2т ОМАНЕ I

го

МТХ+ГИБП

Отмена МТХ

Обострение > ♦ 1 1 *

А

МТХ+ГИБП

Ремиссия

i ГИБП

Рисунок 3.6 - Дизайн исследования у пациентов, получивших первый ГИБП

Группа пациентов, отобранных в результате применения критериев включения и исключения, была представлена группами с увеитом (п=32; 18,3%) и без него (п=143; 81,7%). Пациенты с увеитом характеризовались меньшим возрастом дебюта, чаще встречались серопозитивность по АНФ, а также олигоартикулярный характер поражения, пациенты с увеитом имели меньшее число активных суставов. Пациенты с увеитом характеризовались меньшей продолжительностью ремиссии, а также меньшим временем до развития первого значимого обострения. Пациенты с увеитом имели риски развития первого значимого суставного поражения в 2,6 раза чаще по сравнению с пациентами, у которых не было увеита. Пациенты с увеитом чаще получали терапию моноклональными антителами к ФНОа, тогда как пациенты без увеита достоверно чаще получали растворимые рецепторы к ФНОа, а не моноклональные антитела. Пациенты с увеитом нуждались в смене ГИБП чаще, чем пациенты без увеита, что имеет клиническое значение, однако данные статистически не достоверны. Данные представлены в таблице 3.24.

Таблица 3.24 - Характеристики пациентов с ЮИА, получивших первый генно-инженерный биологический препарат_

Параметр Вся группа, Увеит (+) Увеит (-) Р

n=175 n=32 n=143

Возраст дебюта, г. 6,3 (2,3; 10,2) 3,9 (2,1; 6,2) 5,5 (2,5; 10,5) 0,033

Пол, женский 59 (33,7) 21 (65,6) 95 (66,4) 0,930

АНА позитивность, n (%) 40/92 (40,8) 15/26 (57,7) 26/72 (36,1) 0,056

СОЭ, мм/ч 11,0 (4,0; 20,0) 12,5 (7,0; 19,0) 10,0 (4,0; 20,0) 0,406

СРБ, мг/л 1,5 (0,4; 7,6) 2,2 (0,5; 6,2) 1,5 (0,4; 7,7) 0,593

ЧАС 3,0 (1,0; 6,0) 1,0 (1,0; 2,0) 4,0 (2,0; 8,0) 0,000005

Олигоартрит, n (%) 112 (64,0) 28 (87,5) 84 (58,7) 0,002

ГИБП, название:

Этанерцепт 95 (54,3) 3 (9,3) 92 (64,3) 0,0000001

Адалимумаб 46 (26,3) 23 (71,9) 23 (16,1)

Тоцилизумаб 10 (7,0) 0 (0,0) 10 (7,0)

Абатацепт 23 (13,1) 6 (18,8) 17 (11,9)

Голимумаб 1 (0,6) 0 (0,0) 1 (0,7)

Комбинация с МТХ, n (%) 129 (73,7) 26 (81,3) 103 (72,0) 0,284

Время до первого ГИБП, г. 2,2 (1,1; 5,3) 2,9 (1,5; 5,3) 2,2 (1,0; 5,2) 0,343

Время до МТХ, мес 10,5 (3,3; 37,1) 10,4 (3,3; 36,8) 10,5 (3,3; 38,2) 0,980

Ремиссия, n (%) 124 (70,9) 23 (71,9) 101 (70,6) 0,889

Длительность ремиссии, 12,7 (5,8; 27,4) 6,5 (2,4; 6,9) 13,1 (6,5; 28,0) 0,078

мес

Обострения, n (%) 38/174 (21,8) 14 (43,8) 24/142 (16,9) 0,0009

Время до первого 48,9 (24,7; 65,1) 33,0 (16,7; 48,6 (26,4; 0,023

значимого обострения, 61,5) 65,7)

мес.

Смена первого ГИБП, n (%) 25/174 (14,4) 7(21,9) 18/142 (12,7) 0,18

Время до смены первого 50,3 (32,4; 65,4) 49,0 (24,5; 52,3 (35,0; 0,186

ГИБП, мес. 62,1) 66,2)

Наличие у пациента увеита повышало вероятность развития первого значимого обострения ОШ = 3,82 (95% ДИ:1,68; 8,73). Применение регрессионных моделей Сох показало, что увеит является независимым предиктором обострения ЮИА. При введении поправки на применение метотрексата выявлено примерно полуторакратное снижение относительного риска, что указывает на протективную роль метотрексата. Данные применения регрессионных моделей Сох представлены на рисунке 3.7.

В подгруппах пациентов, получавших ингибиторы ФНОа в сочетании с метотрексатом и в группе пациентов, получавших терапию адалимумабом с метотрексатом и без него, выявлены аналогичные изменения. Пациенты, с увеитом, получавшие терапию адалимумабом имели больше рисков значимого суставного обострения, по сравнению с пациентами, без увеита, получавшими терапию этанерцептом (таблица 3.25).

Рисунок 3.7 - Кумулятивная доля пациентов, не развивших первое значимое обострение в зависимости от наличия или отсутствия увеита (Log-Rank test)

Таблица 3.25 - Увеит, как фактор риска первого значимого обострения у пациентов, получавших лечение первым ГИБП (данные регрессионных моделей Cox): анализ в подгруппах_

Фактор риска первого значимого обострения ЮИА ОР (95% ДИ) Р

Увеит, для всех групп препаратов С поправкой на метотрексат 4,5 (1,7; 12,1) 3,1 (1,6; 6,0) 0,003 0,0008

Анализ в подгруппах: - Этанерцепт+МТХ, Адалимумаб+Метотрексат - Адалимумаб vs. адалимумаб+Метотрексат 7,23 (1,8; 28,6) 6,48 (1,4; 31,1) 0,005 0,02

3.4 Оценка эффективности терапии адалимумабом увеита, ассоциированного с ювенильным артритом

Следующим этапом анализа было проведение оценки эффективности терапии адалимумабом пациентов с ЮИА-ассоциированным увеитом, резистентных к терапии топическими стероидами и метотрексатом. В исследовании проанализированы результаты лечения 36 детей (25 девочек -69,4%). Медиана возраста начала заболевания составила 2,9 (2,0-6,0) года. Возраст дебюта увеита - 5,0 (3,2-7,7) лет. Среди детей с ЮИА-ассоциированным увеитом преобладали пациенты с олигоартритом. В большинстве случаев ЮИА-ассоциированного увеита (74,6%) артрит развился до дебюта увеита, тогда как у остальных детей увеит предшествовал развитию суставного синдрома. Положительный АНФ был обнаружен у 57,6% детей. По анатомической локализации воспаления в глазу были выявлены 3 типа увеита: передний (76,9%), периферический (5,9%) и панувеит (18,0%). У 3/36 (8,3%) пациентов увеит развился на фоне терапии ГИБП - этанерцептом. Доля пациентов с активным увеитом на момент инициации терапии адалимумабом составила 30/36 (83,3%). Медиана числа глаз с увеитом составила 2,0 глаза (1,0-2,0). Подробная демографическая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в таблице 3.26.

Таблица 3.26 - Демографическая характеристика пациентов, включенных в исследование эффективности и безопасности терапии адалимумабом

Показатель Результат (n=36)

Пол, девочки, n (%) 25 (69,4)

Субтип артрита:

- олигоартрит 23 (63,9)

- полиартрит 9 (25,0)

- энтезит-ассоциированный артрит 4 (11,1)

Типы увеита, n (%):

- передний 30 (76,9%)

- периферический 2 (5,9%)

- панувеит 7 (18,0%)

АНФ, n (%) 19/33 (57,6)

HLA-B27, n (%) 3/19 (15,8)

Возраст дебюта артрита, г., Me (25%-75%) 2,9 (2,0; 6,0)

Возраст дебюта увеита, г., Me (25%-75%) 5,0 (3,2; 7,7)

Число глаз с увеитом, Me (25%-75%) 2,0 (1,0; 2,0)

Среднее число обострений увеита в год в пересчете на 4,0 (1,0-9,0)

1 пациента за 1 год, предшествующий терапии АДА

Увеит de-novo на фоне ЬМ1Ш, n (%) 14 (35,9)

Для этого этапа исследования были проанализированы истории болезни пациентов с ЮИА-ассоциированным увеитом с 2009 по 2016 гг. Диагноз ЮИА был установлен в соответствии с критериями Международной лиги ревматологических ассоциаций (ILAR) [104]. Основанием для назначения адалимумаба было прогрессирующее и/или рецидивирующее течение увеита либо артрита, резистентного к терапии метотрексатом. Все пациенты получали стартовую терапию адалимумабом в дозе 20 мг п/к (при весе <30 кг) либо 40 мг (при весе >30 кг) каждые 2 недели, все пациенты получали терапию

метотрексатом парентерально в дозе 15-20 мг/м в неделю, часть пациентов получали комбинацию метотрексата с циклоспорином-А в дозе 4-5 мг/кг.

Для каждого пациента анализировали, как минимум, двухлетний период наблюдения, не менее чем за год до и не менее чем один год после инициации терапии адалимумабом.

У пациентов с активным увеитом ремиссия была достигнута у 29/30 пациентов (96,7 %) через 2,0 (2,0-12,0) недели, и только 1 пациент по-прежнему оставался активен. На фоне терапии адалимумабом отмечено существенное снижение частоты обострений с 4,0 (1,0-9,0) обострений на одного пациента за год, предшествующий терапии адалимумабом (р=0,000004) до 0,0 (0,0-1,0) обострений увеита на одного пациента за первый год терапии адалимумабом (Рисунок 3.8).

14

12

| 10

з-

го с

сС о

X

й> а.

I—

о о ю о

го но

о го 1Г

р=0,000004

-□-

ДоАДА

п МесПап I—I 25%-75% Мт-Мах

На фоне АДА

Рисунок 3.8 - Динамика частоты обострений увеита в пересчете на одного пациента за год до терапии адалимумабом и год на фоне терапии

На фоне терапии адалимумабом в 8,5 раз уменьшилось число пациентов, получавших топические глюкокортикостероиды к концу первого года терапии адалимумабом до 7,1 %, (р = 0,00001). За первый год терапии адалимумабом обострения отмечались у 11 (28,2 %) пациентов. Среди детей, с развившимся обострением, у 2/11 пациентов увеит был в неактивной фазе перед началом терапии адалимумабом. У пациентов, с развившимся обострением, при недостаточной эффективности топических ГКС, назначенных в момент обострения, либо наличие стероидозависимости, проводилось изменение режима дозирования: у 4 пациентов была увеличена доза адалимумаба с 20 мг до 40 мг, у 1 пациента, получавшего 40 мг каждые 2 недели, был сокращен интервал между инъекциями до 1 недели. Данные представлены в таблице 3.27.

Таблица 3.27 - Динамика воспалительной увеальной активности на фоне

терапии адалимумабом

Показатель Результат

Достижение ремиссии, п (%) 29/30 (96,7)

Время до достижения ремиссии увеита, недели 2,0 (2,0; 12,0)

Среднее число обострений увеита в год в пересчете на 1 пациента за первый год терапии АДА, Me (25%-75%) 0,0 (0,0-1,0)

Время до развития обострения, недели 28 (12,9-68,6)

Мы не нашли различий в сроках и способности достижения ремиссии, а также различий в сроках и вероятности обострения в зависимости от пола, двустороннего или одностороннего поражения глаз в дебюте, серопозитивности по AНФ, типа увеита, характера суставного поражения. Данные представлены в таблице 3.28.

Таблица 3.28 - Динамика сроков достижения ремиссии и вероятности обострения увеита в зависимости от изучаемых показателей_

Параметр Достижение ремиссии Развитие обострения

ОР Р ОР Р

Тип увеита 0,76 0,73 0,5 0,17

Мужской пол 1,6 0,49 0,68 0,63

Одно/двустороннее поражение 0,63 0,5 1,0 0,99

АНФ 0,62 0,5 0,48 0,29

Артрит до увеита 2,3 0,39 0,5 0,23

Субтип артрита 1,9 0,1 1,1 0,84

За время наблюдения не было выявлено серьезных нежелательных явлений, приведших к отмене препарата.

3.5 Протеомный профиль слезы в диагностике увеита, ассоциированного с

ювенильным артритом

Одним из ключевых элементов дифференциальной диагностики неинфекционных увеитов является необходимость наиболее раннего распознавания увеита, ассоциированного с ЮИА, поскольку в лечении этой формы патологии в последние годы произошли революционные изменения в связи с успешным использованием генно-инженерных (биологических) препаратов. По причине высокой стоимости этих препаратов их назначению предшествует декретированная процедура установки диагноза. Эта процедура неукоснительно соблюдается при наличии суставного синдрома, когда диагноз ЮИА-ассоциированного увеита не вызывает сомнений, но в случаях, когда поражение суставов еще отстутствует, а увеит уже регистрируют, биологическую терапию не назначают, поскольку идентифицировать форму увеита не представляется возможным, и его квалифицируют как идиопатический, что не

является показанием для назначения этого вида терапии. Решением проблемы было бы выявление маркеров ЮИА-ассоциированного увеита при общеизвестном отсутствии надежных маркеров самого ЮИА в случае отсутствия суставного синдрома. Инструментом такого поиска может быть прецизионная масс-спектрометрия, а средой, в которой следует искать информационные молекулы — слеза.

Образцы слез были получены у пациентов, включая детей с увеитом ассоциированным с ЮИА (п=17). Распределение детей в зависимости от нозологической принадлежности представлено в таблице 3.29.

Таблица 3.29 - Распределение обследованных детей по диагнозам

Диагноз Количество обследованных (М:Д) Средний возраст, лет (диапазон) Длительность заболевания, месяцев

ЮИА, хронический передний увеит 2+-3+ 17 (9:8) 13 (2-16) 6-120

ЮИА без увеита 4 (4:0) 14-17 18 - 33

Системный васкулит 3 (2:1) 10-17 3 - 36

Идиопатический 4 (2:2) 5-9 0 - 1

увеит

Здоровые дети 3 (3:0) 9 - 11

При проведении масс-спектрометрии в слезе было обнаружено около 3000 протеинов, из которых в результате последующего анализа были выбраны около 300 наиболее вероятных кандидатов на роль маркеров ЮИА-ассоциированного увеита.

При сравнении протеомного профиля слезы здоровых и больных ЮИА-ассоциированным увеитом детей были выделены белки, концентрация которых существенно различалась (порог 2,5 раза, р <0,05): концентрация 45 белков в опытной группе была выше, а концентрация 1 белка - ниже (таблицы 3.30, 3.31). Все белки имели внеклеточную локализацию.

Таблица 3.30 - Список белков-кандидатов на роль маркеров ЮИА-ассоциированного увеита_

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Ламинин альфа 2 54,516 4,57Б-02 LAMA2 неизвестна

Коагуляционный фактор IX 32,964 8,33E-04 F9 пептидаза

Примаза и полимераза 30,827 1,63E-02 PRIMPOL фермент

Ламинин альфа 4 30,236 5^-05 LAMA4 Фермент

Субъединица 27,043 2,7Ш-02 MED12L Неизвестна

медиаторного комплекса 12

Цистатин SA 26,125 3,57Б-02 CST2 Неизвестна

Пролактин- 24,952 1,^-06 PIP Пептидаза

индуцирующий протеин

Цистатин SN 23,691 3^-03 CST1 Неизвестна

Версикан 19,297 2^-03 VCAN Неизвестна

Альфа-Ь-2 фукозидаза 19,185 3,^-02 FUCA2 Фермент

плазмы

Хемицентин 2 18,659 1^-02 HMCN2 Неизвестна

EF- кальций связывающий 17,314 4,63E-02 EFCAB7 Неизвестна

домен 7

Карбокси ! эстер липаза 16,106 2^-02 CEL Фермент

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Убиквитинлигаза E3B 15,049 4,83E-02 UBE3B Фермент

Липокалин 1 14,899 2,80E-11 LCN1 белок-транспортер

Белок суперсемейства комплемента C1q несущего фактор некроза опухоли 1 14,484 3,91E-02 C1QTNF1 Неизвестна

SPARC связанный с модульным кальциевым соединением 2 13,987 1,96E-02 SMOC2 Неизвестна

Лактотрансферрин 13,493 6,71E-07 LTF Пептидаза

WAP четыре-дисульфид домен 1 13,262 5,19E-03 WFDC1 Неизвестна

Цистатин S 11,353 4,05E-04 CST4 Неизвестна

Нейротрофин 3 11,047 1,02E-02 NTF3 ростовой фактор

Ламинин альфа 3 10,152 1,85E-02 LAMA3 Неизвестна

Ламинин альфа 5 10,152 1,85E-02 LAMA5 Неизвестна

Член семейства арилсульфатазы K 9,697 6,76E-03 ARSK Фермент

Контактин ассоциированный протеин 3 9,407 2,38E-02 CNTNAP3 Неизвестна

Коллаген, тип XXI, альфа 1 9,35 2,34E-02 COL21A1 Неизвестна

Динеин, аксонемал, тяжелая цепь 3 8,95 9,82E-05 DNAH3 Фермент

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Фактор роста фибробластов 3 8,567 1,65E-03 FGF3 ростовой фактор

Белок щелевых контактов гомолог 3 (Дрозофила) 8,567 1,65E-03 SLIT3 Неизвестна

BMP-связывающий эндотелиальный регулятор 7,951 2,74E-03 BMPER Неизвестна

Реснички и жгутики ассоциированный протеин 58 7,628 2,05E-02 CFAP58 Неизвестна

Белок содержащий цинковый палец, C3H1-rara 6,58 3,82E-02 ZFC3H1 Неизвестна

Лизоцим 5,845 3,40E-03 LYZ Фермент

Тироглобулин 5,467 4,73E-02 TG Неизвестна

ADAM- децизин1 5,072 1,74E-02 ADAMDEC1 Пептидаза

Хемокин (C-X3-C motif) лиганд1 5,008 2,74E-02 CX3CL1 Цитокин

Секретоглобулин, 1 член семейства 1D 3,933 4,24E-02 SCGB1D1 Неизвестна

Релаксин 2 3,839 3,50E-02 RLN2 Неизвестна

Секретоглобин , 1 член семейства 2A 3,814 5,39E-03 SCGB2A1 неизвестна

Трансферрин 3,775 2,57E-02 TF белок-транспортер

Фактор Виллибранта 3,479 4,52E-02 VWF Неизвестна

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Пролин обогощенный 4 (слезный) 3,272 2,20Б-02 PRR4 Неизвестна

Интегральный мембранный белок с обогощенным аспартатным хвостом 1 3,182 1,84Б-02 SMDT1 неизвестна

Фактор роста фибробластов 9 2,899 2,4Ш-02 GDF9 ростовой фактор

Иммуноглобулин стабилизирующий гамма 1 ( G1m маркер ) 2,616 1,7Ш-03 IGHG1 неизвестна

Альбумин 1 1,17^02 ALB белок-транспортер

Фактор роста фибробластов 8 (андроген-индуцированного) -4,679 2,87E-02 FGF8 ростовой фактор

Таблица 3.31 - Белки-маркеры увеита, ассоциированного с ювенильным

идиопатическим арт итом

Название белка Кратное Доверительная Краткое Функция

изменение вероятность обозначение

Липокалин 1 14.899 2^-11 LCN1 белок-транспортер

Лактотрансферрин 13.493 6.71E-07 LTF Пептидаза

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Пролактин-индуцирую щий протеин 24.952 1.19E-06 PIP Пептидаза

Ламинин альфа 4 30.236 5.48E-05 LAMA4 Фермент

Динеин, аксонемал, тяжелая цепь 3 8.950 9.82E-05 DNAH3 Фермент

Цистатин S 11.353 4.05E-04 CST4 неизвестна

Коагуляционный фактор IX 32.964 8.33E-04 F9 Пептидаза

Фактор роста фибробластов 3 8.567 1.65E-03 FGF3 ростовой фактор

Белок щелевых контактов гомолог 3 (Дрозофила) 8.567 1.65E-03 SLIT3 неизвестна

Иммуноглобулин стаби-лизирующий гамма 1 ( G1m маркер ) 2.616 1.71E-03 IGHG1 неизвестна

Версикан 19.297 2.26E-03 VCAN неизвестна

BMP-связывающий эндотелиальный регулятор 7.951 2.74E-03 BMPER неизвестна

Цистатин SN 23.691 3.39E-03 CST1 неизвестна

Лизоцим 5.845 3.40E-03 LYZ Фермент

WAP четыре-дисульфид домен 1 13.262 5.19E-03 WFDC1 неизвестна

Секретоглобин , 1 член семейства 2A 3.814 5.39E-03 SCGB2A1 неизвестна

Название белка Кратное изменение Доверительная вероятность Краткое обозначение Функция

Член семейства арилсульфатазы K 9.697 6.76E-03 ARSK Фермент

Нейротрофин 3 11.047 1.02E-02 NTF3 ростовой фактор

Хемицентин 2 18.659 1.08E-02 HMCN2 неизвестна

Альбумин 1.000 1.17E-02 ALB белок-транспортер

С учетом кратности различия и уровня доверительной вероятности в группу маркеров вошли липокалин-1 (LCNi), лактотрансферрин (LTF), пролактин-индуцированный протеин (PIP) и ламинин-а-4 (LAMA4) (табл. 35-36). IPA-анализ позволил сформировать группу воспалительных кластеров, состоящих из протеинов с наилучшим Z-критерием, и описать этот кластер в терминах известных биологических феноменов (Рисунок 3.9).

Рисунок 3.9 - Фрагмент результатов поиска известных биологических феноменов, описываемых совокупностью белковых кластеров, выявленных в слезе больных ЮИА-ассоциированным увеитом. площадь элемента пропорциональна доверительной вероятности p, серый цвет-динамике Z-критерия: белый цвет - не определено, neg-область отрицательных значений Z-критерия в

диапазоне от 0 до -2,437, интенсивность оттенка серого отражает динамику положительного значения Z-критерия от 0 до +2,618 (Ingenuity Pathway Analysis)

Один из таких кластеров представлен на рисунке 3.10, выявленные связи с биологическими феноменами на рисунке. 3.9. Как видно, в кластеры включены ранее не ассоциированные с увеитом белки, в частности IL-23A. Выявленные из слезы больных ЮИА-ассоциированным увеитом белковые кластеры в наибольшей степени могут быть описаны в терминах: «развитие ткани», «межклеточная передача сигнала», «сердечно-сосудистая система», «миграция клеток», «гематология», «воспалительный ответ», «трансформация иммунных клеток», что в целом соответствует современным представлениям о патогенезе ЮИА-ассоциированного увеита.

Рисунок 3.10 - Кластер белков, сформированный программой Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Серый цвет кодирует большее содержания белка в слезе

больных ЮИА-ассоциированным увеитом, чем у здоровых. Оттенок серого кодирует уровень экспрессии. Белый цвет кодирует белки, содержание которых в слезе больных ЮИА-ассоциированным увеитом меньше, чем у здоровых

Один из сформированных программой IPA кластеров белков, включающих в себя, в частности, лактотрансферрин, группировался вокруг цитокина IL-1 (Рисунок 3.11), что дало основание для более детального исследования связи ЮИА-ассоциированного увеита с системным васкулитом. Воспалительный ответ обеспечивается активацией продукции LTF и еще 13 белков. В отличие от увеита

увеличения экспрессии лактотрансферрина при системном васкулите не зарегистрировано, а экспрессия липокалина даже снизилась.

Рисунок 3.11 - Белковый кластер, сформированный вокруг интерлейкина-1 (IL-1), альбумина (ALB), человеческого гомолога вирусного онкогена (Akt), липопротеинов низкой плотности (LDL) и гормона роста (Growth hormone) при

участии лактотрансферрина (LTF)

Выявленные в слезе больных системным васкулитом белковые кластеры также могут быть описаны преимущественно в терминах: «эволюция ткани», «межклеточная передача сигнала», «миграция клеток», «гематология», «воспалительный ответ», «трансформация иммунных клеток», что в целом соответствует современным представлениям о патогенезе системного васкулита (Рисунок 3.12). Однако, при системном васкулите в отличие от ЮИА-ассоциированного увеита существенно большее значение имеет низкая экспрессия многих белков, входящих в кластер. Это фактически и является основой различий патогенетических механизмов этих состояний.

Рисунок 3.12 - Фрагмент результатов поиска известных биологических феноменов, описываемых совокупностью белковых кластеров, выявленных в слезе детей, больных системным васкулитом. Площадь элемента пропорциональна доверительной вероятности p, серый цвет - Z-критерию: белый цвет - не определено, оттенки серого до черного - динамика значений Z-критерия

в области отрицательных значений от 0 до -1,660, количество крестиков -динамика положительного значения Z- критерия от 0 до +2,219 (Ingenuity Pathway

Analysis)

На Рисунке 3.13 представлены фрагменты более детального описания карт, представленных на Рисунках 3.9 и 3.12. Как видно, по количеству включенных в соответствующий кластер белковых молекул, при ЮИА-ассоциированном увеите лидируют феномены: «миграция клеток» (41 молекула), «количество клеток» (34), «активация клеток» (28), «миграция лейкоцитов» (22), «количество клеток крови» (20), «воспалительный ответ» (16), в то время как при системном васкулите -«эволюция сердечно-сосудистой системы» (30), «артрит» (23), «васкулогенез»

(19).

г • г* t л д£»Г4 - Дс£7УДЪОЛ ■ l/nl Л * Mfrrtult".

о Ocqovutvli h Stream 171Ы& hcmu a an si ai >ALB, AMY it, *Ci*. COUAJ, CSTJ. F9. ; - 'I UMU, LAMCJ. N.. л 1 13

□ Des^pi-nefiC: ccnqeiMU jnorrulm Ы к do МО) 1ПСГНН 4 ?000 tin f HAS1 If-JMCi. LAMC1. ИРМРЗ. PCSXS. V.H)

□ Witfiojs •lictewi hiwtnye 13ti4i 1999 OIK sum.-ifwe. мне), is«, ickaiw, шам 4Tt, *tuu in, -миг , н u

sm-o* US) OiM FRASI. 'CKC LAW 1 PCSK5 ■ SLJTI ;

EiltWOiiiC De tomwoeor гж-о* LMO 01 art BSN. -UN. FMOT. IfNfi fire Pi 'LAM A J LAMAS HTFJ РАРРД. N

□ yatoflxyrtH* _ ust-or LJI6 • '.. bmpfr. <ql4AJ -CST3, cxiai. ::. [IK. rets CRN. »

Cowti« t»i LM«17 Lit; Ait. 'Mil. Albil ecu ton«, axui. С1ГЗ FXOO. CBN. 1 i

и 1Л1 <u L6» ■АРОД1. BMPER, (LiДFGF5. GHN. 1FNG. 1GHG1. 5ЕИР1НАЗ. "... 10

□ C#IM*r Oewei diifwifflwren Ы bene «Hi №l ИМ ВСЧ (ЫКЛ CilJ. ItttC lt.HH. I0H01. 4tf. If. и CM. - «AN а 10

□ CdnjlCF^CUJ scalifcjban Ы rndtthrlia!« 1ХИ1 «я •АРОДЛ. BMPLR. (Own;. НИ. 6ЯН. 1FH6 ISH61. KBPIKA) . ' I...

а CsrdiovjiwJj dcveiooniefll at сапЬстло! 1.132 1« ANGPUt.-APOA1. S1-' 4 COUA?. CST5 OiKLi LOIL3. ELW. . »

□ СеЛОл&лпс се.11 йглт D1 ЛгхЬЛ! nennfi iffifciil. ШЗ ALB. IFNG. ICUtCil. NTF1 SLAPIMAj IF. .ICS Г

Рисунок 3.13 - Белковые кластеры слезы детей с ЮИА-ассоциированным увеитом (а) и системным васкулитом (б) в терминах известных биологических

феноменов (Ingenuity Pathway Analysis)

Проведенное исследование показало возможность идентификации увеита, ассоциированного с ЮИА, по протеомному профилю слезы. Одним из ключевых протеинов, обеспечивающих эту идентификацию, является лактотрансферрин.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В нашем исследовании показано, что назначение метотрексата уменьшает риск развития увеита. Примечательно, что в сравнении с исследованием, выполненном в Италии, увеличение пропорции пациентов, получающих метотрексат, в два раза привело к снижению риска увеита более чем в четыре раза. Нами выявлены основные предикторы развития увеита, хорошо известные по результатам целого ряда предыдущих исследований [11, 25, 56], а также нами были выявлены половые различия в факторах риска увеита и было доказано, что женский пол не является универсальным фактором риска увеита. Патофизиологические основы эффективного предотвращения риска развития увеита показаны в экспериментальных исследованиях, отражающих способность метотрексата проникать в ткани глаза и создавать там более высокие концентрации, чем в плазме крови [105, 134]. Понимание факта развития увеита на фоне терапии метотрексатом имеет принципиальное значение, объясняющее развитие увеита механизмами самого заболевания. В эру широкого применения генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП) часто обсуждается вопрос о роли самих препаратов в развитии «новых» случаев увеита. Опыт широкого применения метотрексата свидетельствует в пользу того, что главенствующую роль в патогенезе увеита следует отдать механизмам срыва иммунологической толерантности у пациентов с ЮИА. Данные немецкого регистра Biker наглядно свидетельствуют о том, что комбинированная терапия метотрексатом и ГИБП также приводит к снижению риска увеитов "de novo" в сравнении с применением монотерапии ГИБП [41]. Складывается ощущение, что основная роль в профилактике увеита у пациентов с ЮИА принадлежит метотрексату, как в случаях его комбинации с ГИБП, так и случаях применения монотерапии метотрексатом. В нашем исследовании показано, что наличие факторов риска увеита модулировало способность метотрексата предотвращать развитие увеита у пациентов с ЮИА. Возможно, данные подобных исследований позволят в

будущем пересмотреть показания к более раннему назначению метотрексата в группах с высоким риском развития увеита, а также избегать ранней отмены метотрексата в случаях комбинированной терапии с ГИБП у пациентов с высоким риском развития увеита.

Среди генно-инженерных иммунобиологических препаратов, применяемых в терапии увеита, ассоциированного с ювенильным артритом, наиболее часто используются ингибиторы ФНО-а. Так по данным систематического анализа и метанализа показано, что наиболее эффективными оказались препараты, имеющие структуру в виде моноклональных антител -адалимумаб (87% ответчиков) и инфликсимаб (72% ответчиков) в сравнении с этанерцептом, относящимся к классу растворимых рецепторов (33% ответчиков) [131]. Различия в эффективности могут быть связаны с особенностями строения молекулы, так моноклональные антитела, помимо связывания растворимой молекулы ФНО-а, также обладают способностью к комплемент-зависимому и антитело-зависимому цитолизу клеток, рецепторы которых уже связали с ФНО-а, что не способен делать этанерцепт. Инфликсимаб в отличие от адалимумаба и этанерцепта обладает еще способностью индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и макрофагов, что усиливает его противовоспалительные свойства [121]. Также возможно имеет значение способность конкретных препаратов проникать через гемато-офтальмологический барьер.

Наиболее изученным представителем лекарственных препаратов из группы ингибиторов ФНО-а, используемых в терапии увеитов, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями является адалимумаб. Так, например, в одном из первых исследовании участвовало 18 пациентов, страдавших увеитом, ассоциированным с ювенильным ревматоидным артритом. Больные получали глюкокортикостероидную терапию в комплексе с адалимумабом. У 17 пациентов в период от 2 до 16 недель после начала лечения был получен положительный ответ на терапию. В дальнейшем 16 пациентов смогли отказаться от применения топических глюкокортикостероидов, у 1 появилась возможность снизить дозу топических глюкокортикостероидов, и только у 1 пациента не отмечено

существенной динамики. Эффективность препарата по данным этого исследования составила 88% [20]. В исследовании Kotaniemi адалимумаб получали 94 пациента с увеитом, ассоциированным с ювенильным артритом, в связи с активным артритом и/или увеитом. Из включенных в исследование исходно 94 пациентов, только 54 пациента смогли завершить исследование. Среди них у 36/54 имел место хороший ответ на адалимумаб (31% - смогли полностью отменить топические глюкокортикостероиды, а 35% снизить дозу топических глюкокортикостероидов до 1-2 капли/глаз/день). В соответствии с критериями SUN у 28% детей отмечено двукратное уменьшение активности увеита, у 16 пациентов - умеренный ответ, у 16 пациентов не отмечено существенной динамики увеита и у 13 пациентов отмечено ухудшение, которое выражалось в виде двукратного увеличения активности увеита. Также за время наблюдения 22% пациента с увеитом смогли полностью отменить системную глюкокортикостероидную терапию. У 18/94 (19,1%) пациентов терапия адалимумабом была отменена вскоре после инициации из-за неэффективности и/или побочных эффектов [77].

По данным итальянского национального регистра, среди пациентов, получавших инфликсимаб или адалимумаб у 55,3% пациентов зафиксировано достижение ремиссии, у 32,9% увеит носил рецидивирующий характер, у 11,8% детей имело место хроническое течение увеита. На фоне терапии ГИБП отмечено уменьшение числа осложнений увеита в пересчете на одного пациента с 0,47 до 0,32 [161].

Вторым по частоте применения препаратом, использующимся в терапии увеита, ассоциированного с ювенильным артритом, является инфликсимаб. Применение инфликсимаба, сопряжено с целым рядом трудностей, связанных с тем, что препарат не имеет официальных показаний к применению у пациентов с ЮИА в детском возрасте, переводя тем самым его назначение в режим - off-label. Также наличие химерной структуры молекулы инфликсимаба повышает риски выработки противолекарственных антител (ПЛА), что может приводить к развитию инфузионных реакций и снижению эффективности (т.н. «ускользание

эффекта»), что требует изменения режима дозирования в виде увеличения дозировки препарата и сокращения интервала между инфузиями, что приводит к существенному удорожанию терапии [108]. При сопоставлении эффективности адалимумаба и инфликсимаба по данным итальянского национального регистра показано, что адалимумаб оказался эффективнее инфликсимаба (67,4% уб 42,8%; р=0,025), и безопаснее. Так, число нежелательных явлений было почти в четыре раза выше у пациентов, получавших инфликсимаб по сравнению с пациентами, получавшими адалимумаб [161]. В исследовании Simonini G. et а1. проводилась сравнительная эффективность адалимумаба в качестве ГИБП первой и второй (после инфликсимаба) линии терапии. В этом исследовании показано, что применение адалимумаба, как препарата первой линии более эффективно, нежели, когда адалимумаб назначается после инфликсимаба [132]. Аналогичные данные получены для взрослых с ревматоидным артритом, у которых применение адалимумаба в качестве ГИБП препарата первой линии было более эффективным нежели применение после инфликсимаба. Особенно это было очевидно в случаях, когда у пациентов перед назначением адалимумаба уже были выявлены противолекарственные антитела к инфликсимабу [16]. Это может быть объяснено возможностью выработки ПЛА при применении второго блокатора ФНО-а после первого, являющего химерным, особенно если на него произошла выработка ПЛА [16, 157]. Совместное назначение метотрексата, а также применение адалимумаба препаратом первой линии (до инфликсимаба) позволяет снизить риски выработки ПЛА и тем самым сохранить эффективность препарата и увеличить продолжительность его использования [79]. В проведенном нами исследовании на фоне терапии адалимумабом у 96,7% отмечено достижение ремиссии увеита. У пациентов с увеитом, получающих терапию адалимумабом отмечено существенное снижение частоты обострений увеита, уменьшение дозы топических стероидов. Полученные данные подтвердили актуальность проведения дальнейших исследований оценки длительной терапии адалимумабом с учетом его высокой эффективности во всех исследуемых группах.

При изучении протеомного профиля слезы следует отметить наиболее важную часть исследования, которая заключается в обнаружении и описании характерного воспалительного процесса, протекающего интраокулярно, а также в способности к неинвазивной экстраокулярной диагностике. Убедительно показано, что повышенная экспрессия целого ансамбля белков обусловлена именно наличием увеита, поскольку патология, близкая по иммуновоспалительным свойствам и сопровождающаяся значительно более обширным системным воспалением без вовлечения интраокулярных структур, характеризовалась совершенно другим профилем экспрессии белков. Наличие специфических для увеита изменений в экстраокулярных средах (слеза) указывает на факт нарушения гематоретинального барьера при ЮИА-ассоциированном увеите. В исследовании установлено, что ключевым протеином, необходимым для диагностики и дифференциальной диагностики увеита в выявленном белковом ансамбле, был лактотрансферрин.

Как известно, лактотрансферрин (лактоферрин) входит в семейство трансферринов. Это белок, обладающий наибольшей железосвязывающей способностью из всех членов семейства, относится к гликопротеинам с молекулярным весом 78 кДа и состоит из остатков 690 аминокислот [15]. У человека он является одним из основных белков в составе секретов экзокринных желез, включая грудное молоко, слюну, слезу, семенную и вагинальную жидкость, жидкости желудочно-кишечного тракта, слизистую носовых ходов и бронхов [33, 47, 112, 147]. Будучи важным звеном в механизмах врожденного иммунитета [152], он обладает антибактериальным, противогрибковым, противовирусным, антипаразитарным, противовоспалительными и антиаллергенными свойствами, а также антиоксидантным и даже, как считают многие исследователи, обладает антиканцерогенными свойствами [64, 75, 103, 162]. Суммируя основные свойства лактотрансферрина, можно утверждать, что это классический противовоспалительный протеин. Повышенная секреция лактотрансферрина со слезой является попыткой организма купировать иммунопатологический воспалительный процесс в глазном яблоке, как путем

непосредственного воздействия на компоненты воспалительного процесса, так и опосредованно через его участие в межклеточных сетях обмена информацией. Известно, что лактоферрин является сигнальной молекулой в нескольких межклеточных информационных сетях, управляющих циклом развития клетки и запускающих торможение развития клетки, истинный митохондриальный апоптоз и разрушение клеточной мембраны. Все эти эффекты реализуются через торможение активности Akt (протеинкиназы В), активацию p21, p27, p38 и JNK (c-Jun N-terminal kinase), вызывающих выброс каспазы-8 и каспазы-3, а также цитохрома С, что приводит к стимулированию апоптоза [75, 162].

Показано, что лактоферрин реализует свой эффект через сигнальную цепочку, управляемую ядерным фактором каппа-бета (NF-Kß) и MAP-киназу. Лактоферрин на клеточном уровне модулирует дифференцировку, созревание, активацию, миграцию и пролиферацию иммунных клеток [44].

В экспериментах in vitro лактоферрин активировал иммунный ответ локально, мобилизуя нейтрофилы, обеспечивающие межклеточное взаимодействие, и активируя фагоцитоз полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами. В результате концентрация провоспалительных цитокинов уменьшалась, а активность естественных клеток-киллеров увеличивалась [36, 37]. По всей видимости, повышенная продукция лактоферрина при увеите направлена на уменьшение локальной интраокулярной продукции провоспалительных цитокинов, запускаемой активированными Т-лимфоцитами в результате срыва процессов аутотолерантности. Известно, что концентрация лактоферрина в месте воспаления многократно увеличивается с 0,4-2,0 до 200 мг/мл, что обеспечивает его противовоспалительный эффект через механизм обратной связи воспалительного ответа [39].

Лактоферрин, регулируя соответствующие звенья воспаления, управляет как клеточными, так и гуморальными реакциями, ответственными за его формирование [17, 83, 106, 127, 165], включая продукцию цитокинов, в частности IL-1, IL-6, TNF-a, которые задействованы в патогенезе иммунного воспаления [34, 88, 139]. Интересно, что в кластеры воспалительного ответа ЮИА-

ассоциированного увеита закономерно включались ГЬ-1, 1Ь-6, ТОБ-а, значение которых в формировании воспалительного процесса общеизвестно. Спектр интерлейкинов, принимающих участие в формировании неинфекционного увеита, достаточно широк [72, 92], но большинство исследователей не включают в этот спектр ГЬ-23, вошедший в кластер воспалительного ответа в нашем исследовании. Этому интерлейкину, как одному из факторов формирования аутоиммунного увеита [27], отводят роль инициатора синтеза 1Ь-22 дифференцированными клетками ТЫ7 [153] в условиях взаимного антагонизма между ТЫ7 и ТЫ-клетками, возникающего вследствие индукции реципрокных путей развития Т-клеток интерлейкинами ]Ь-23 и ]Ь-17 [153].

Вероятнее всего, роль лактотрансферрина сводится к мобилизации лимфоцитов, макрофагов и полиморфноядерных лимфоцитов из кровяного русла, блокировке иммунных стимулов и/или торможению активации и клональной экспансии Т-хелперов 1 и 17 типов, регулированием формирования индуцированных Т^-клеток посредством модуляции функции антигенпрезентирующих клеток (см. Рисунок 4.1), а противовоспалительными механизмами, описанными выше.

также

Рисунок 4.1 - Клеточные механизмы увеита: APC — антиген-презентирующая клетка, DC — дендритная клетка, LPS — липополисахарид, PMNL — полиморфноядерный лимфоцит, TH — т-хелпер, Treg — т-регуляторная клетка, CpG-DNA — цитозин-регуляторная клетка, в том числе и некоторые

активированные эффекторные Т-клетки

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Увеит, ассоциированный с ЮИА в настоящее время является одной из наиболее малоизученных и актуальных проблем современной ревматологии в связи с тяжелыми последствиями его течения, зачастую приводящими к сложным хирургическим вмешательствам и высоким риском инвалидизации вплоть до полной утраты зрения (слепота наступает у 17-35% детей) [39, 165].

Сложность своевременной постановки диагноза заключается в отсроченном появлении суставного синдрома. Пациенты при отсутствии или стертости симптомов поражения глаз [29] обращаются за специализированной помощью с уже значительным снижением остроты зрения. В связи с отсутствием общеизвестного неспецифического маркера иммуноптологического процесса -антинуклеарного фактора у 30-40% пациентов с хроническим изолированным увеитом длительно применяют лечение местными глюкокортикостероидами, что приводит к развитию осложнений, наиболее частыми из которых являются катаракта (риск развития соответствует формуле, расчитанной Т^те: 0,04/глаза х год) и глаукома.

Прогнозирование развития увеита у пациентов с ювенильным артритом является не менее актуальной проблемой: наличие факторов риска не всегда является определяющим фактором для назначения своевременных и адекватных схем терапии, влияющих на дальнейшее течение заболевания.

Изучение современных методов диагностики ювенильного артрита с увеитом, для раннего распознавания офтальмологической патологии, может обеспечить своевременное назначение схем терапии, используемых в настоящее время для лечения ювенильного ревматоидного артрита и позволит значительно улучшить результаты лечения офтальмологической патологии [128].

С целью изучения педиатрических аспектов прогнозирования развития, профилактики, раннего распознавания и терапии ювенильного артрита с увеитом для создания оптимальных алгоритмов ранней диагностики и своевременного

лечения на базе СПбГПМУ было проведено исследование, в которое вошли 478 детей в возрасте от 2 до 17 лет.

Пациенты, включенные в настоящее исследование, подвергались селективному скринигу для формирования групп в зависимости от целей каждого этапа исследования.

Для оценки суставного статуса проводился подсчет числа активных суставов. Для диагностики увеита все пациенты проходили офтальмологическое обследование с использованием биомикроскопии каждые 3-4 месяца, которое выполнялось офтальмологами отделения микрохирургии глаза клиники ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России. У пациентов с непрерывно-рецидивирующим увеитом число обострений в год приравнивалось к 12. У всех пациентов оценивали сроки достижения ремиссии, динамику частоты обострений увеита, изменение текущей терапии топическими ГКС на фоне терапии биологическим препаратами у пациентов в зависимости от пола, АНФ-статуса, типа увеита, количества глаз в дебюте, степени суставного поражения (олигоартрит, полиартрит), сопутствующей цитостатической терапии, предшествующей терапии. Диагностика хронического увеита основывалась на критериях SUN [39, 68].

Среди лабораторных тестов оценивались рутинные тесты, такие как уровни СОЭ, СРБ.

Иммунологическое обследование включало в себя определение антинуклеарного фактора (АНФ) и антигена HLA B27. Определение АНФ проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции на клеточной линии HeP2 с определением типа свечения. Позитивность по АНФ определялась при титре >1/160. Определение наличия антигена HLA-B27 осуществлялось методом полимеразной цепной реакции.

В заключительной части нашей работы проводилось исследование протеомного профиля слезы.

В первую часть исследования был включен 281 ребенок, медиана (Ме) продолжительности ЮИА составила 3,8 года. Частота увеита была ниже в группе детей, получавших метотрексат - 11,5% по сравнению с 46,7% в группе детей без метотрексата (ОШ=6,7 (95%ДИ:3,7-12,3), p = 0,0000001). Также среди детей, с развившимся увеитом доля метотрексата была практически в два раза меньше (35,9%) по сравнению с детьми, не имевшими увеит (77,5%). Пациенты, получавшие терапию метотрексатом, имели большее число активных суставов, реже встречался олигоартикулярный вариант течения, чаще поражался лучезапястный сустав и мелкие суставы кистей и стоп. Следующим этапом было проведение аналогичного раздельного анализа уже в подгруппах в зависимости от наличия или отсутствия фактора риска развития увеита. При проведении сопоставительного анализа отдельно в группе мальчиков (МТХ (+), n=59, МТХ (-), n= 26) и группе девочек (МТХ (+), n= 132, МТХ (-), n= 64). Частота увеита в целом была меньше в группе мальчиков (Р=0,001, ОШ= 7,3 (95%ДИ:2,0-26,6), сенситивность: 69%, специфичность: 76%) по сравнению с девочками (Р=0,000001, ОШ= 5,9 (3,0-11,9), сенситивность: 63%, специфичность: 78%), независимо от терапии метотрексатом. Способность метотрексата предотвращать развитие увеита была выше в группе мальчиков. При проведении анализа отдельно в группе пациентов с олигартикулярным (МТХ (+), n=125, МТХ (-), n=81) и полиартикулярным течением ЮИА (МТХ (+), n=66, МТХ (-), n=9) способность метотрексата предотвращать развитие увеита была несколько выше в группе пациентов с полиартикулярным вариантом ЮИА (Р= 0,007, ОШ= 6,7 (95%ДИ:1,5-31,2), сенситивность: 36 %, специфичность: 92 %). При проведении анализа отдельно в группе пациентов с ЮИА серопозитивных по АНФ (МТХ (+), n=61, МТХ (-), n=29) и серонегативных по АНФ (МТХ (+), n=90, МТХ (-), n=43) способность метотрексата предотвращать развитие увеита было более чем в 2 раза выше для пациентов, позитивных по АНФ (Р= 0,000002, OR= 10,1 (95%ДИ:3,6-28,1), сенситивность: 65%, специфичность: 85%). При проведении анализа раздельно в группах пациентов с ЮИА, имевших возраст дебюта менее 5 лет (МТХ (+), n=111, МТХ (-), n=57) и более 5 лет (МТХ (+), n=90, МТХ (-), n=47)

выявлены различия в виде значительно меньшей частоты развития увеита в группе пациентов, получавших метотрексат и имевших возраст дебюта ЮИА более 5 лет. Соответственно способность метотрексата предотвращать развитие увеита была практически в 6 раз выше в группе пациентов с возрастом дебюта ЮИА старше 5 лет. При проведении сопоставительного анализа установлено, что пациенты, развившие увеит, имели младший возраст, у них чаще встречался олигоартрит, отмечалось меньшее число активных суставов, более высокое СОЭ, чаще имела место серопозитивность по АНФ. Следующим этапом работы было изучение особенностей течения ЮИА в зависимости от наличия или отсутствия увеита раздельно в группах детей, имеющих, либо не имеющих факторы риска развития увеита. При раздельном изучении характеристик ЮИА в группе мальчиков и группе девочек установлено, что именно женский пол у детей с сопутствующим увеитом был достоверно ассоциирован с основными факторами риска увеита, таким как олигоартикулярный вариант дебюта, серопозитивность по АНФ и высокая воспалительная активность. В группе мальчиков достоверных различий в изучаемых параметрах, связанных с наличием или отсутствием увеита, выявлено не было. Выявлено, что олигоартикулярный вариант ЮИА у детей с увеитом был достоверно ассоциирован с такими факторами риска увеита, как женский пол, серопозитивность по АНФ, ранний возраст дебюта, тогда как полиартикулярный вариант у детей с ЮИА и сопутствующим увеитом был ассоциирован с ранним возрастом дебюта. Серопозитивность по АНФ у детей с сопутствующим увеитом была ассоциирована с меньшим возрастом ЮИА, тогда как серонегативные пациенты с увеитом имели достоверно меньшее число активных суставов. Возраст дебюта менее 5 лет у детей с ЮИА и сопутствующим увеитом был ассоциирован с серопозитивностью по АНФ и высокой воспалительной активностью, тогда как у детей старше 5 лет не было выявлено достоверных различий в параметрах, ассоциированных с развитием увеита. При изучении подгрупп пациентов, выявлено что у 128 детей (45,7%) увеит развивался в достаточно поздние сроки - более 5 лет от дебюта ЮИА. При раздельном изучении роли факторов риска увеита, установлено, что только у детей с ранним

(до 5 лет от дебюта ЮИА) развитием увеита играют роль основные, ранее изученные, факторы риска, такие как ранний возраст дебюта, серопозитивность по АНФ и высокая воспалительная активность. У детей с поздним развитием увеита (более 5 лет от дебюта ЮИА) единственным фактором риска был ранний возраст дебюта ЮИА. Применение анализа выживаемости Каплана-Мейера показало, что пациенты, получавшие метотрексат, имели меньшую кумулятивную вероятность развития увеита (HR=4,35, p=0,000001). К обобщенным данным по риску развития увеита относятся женский пол, олигоартикулярный вариант течения ЮИА, высокая воспалительная активность, серопозитивность по АНФ, дебют артрита младше 5 лет, отсутствие терапии метотрексатом. При проведении анализа в подгруппах оценивалась способность метотрексата предотвращать развитие увеита в зависимости от наличия факторов риска. Установлено, что метотрексат оказывал сдерживающее влияние на развитие увеита, однако, при наличии фактора риска, сдерживающая способность метотрексата была ниже, чем у детей, не имеющих факторов риска увеита.

Вторым этапом исследования была оценка риска возникновения увеита на фоне проводимого лечения с использованием этанерцепта, как с метотрексатом, так и без. Для этого к двум вышеописанным группам пациентов была добавлена третья группа детей с ЮИА, получавших терапию этанерцептом ЮИА (n = 413). Пациенты, получавшие этанерцепт, в целом имели меньшее число основных факторов риска. При сравнении кривых вероятности развития увеита de-novo были получены достоверные различия между группами «Метотрексат» и пациентами, получавшими НПВП и ВСГКС ОР = 3,6 (2,1; 6,0), p = 0,000002, а также между группами «Этанерцепт» и пациентами, получавшими НПВП и ВСГКС ОР = 2,0 (1,2; 3,3), p = 0,006. Частота развития увеита de-novo была самой низкой в группе детей, получавших этанерцепт, затем в группе детей, получавших метотрексат и самая высокая в группе детей, получавших терапию НПВП и ВСГКС.

На третьем этапе исследования проводилась оценка роли увеита как маркера тяжести ювенильного идиопатического артрита. Для этого была отобрана

группа из 175 пациентов, которым впервые был назначен генно-инженерный биологический препарат, так как степень тяжести этих пациентов трактовалась как средняя или выше. В эту группу вошли 124 ребенка из первых двух частей исследования и дополнительно включен еще 51 ребенок, получавший другие ГИБП по поводу ЮИА без поражения органа зрения. Группа пациентов, отобранных в результате применения критериев включения и исключения, была представлена группами с увеитом (п=32; 18,3%) и без (п=143; 81,7%). Наличие у пациента увеита повышало вероятность развития первого значимого обострения ОШ = 3,82 (95% ДИ:1,68; 8,73). Применение регрессионных моделей Сох показало, что увеит является независимым предиктором обострения ЮИА. При введении поправки на применение метотрексата выявлено примерно полуторакратное снижение относительного риска, что указывает на протективную роль метотрексата.

Следующим этапом анализа было проведение оценки эффективности терапии адалимумабом пациентов с ЮИА-ассоциированным увеитом, резистентных к терапии топическими стероидами и метотрексатом. В исследовании проанализированы результаты лечения 36 детей (25 девочки -69,4%). У пациентов с активным увеитом ремиссия была достигнута у 29/30 пациентов (96,7 %) через 2,0 (2,0-12,0) недели, и только 1 пациент по-прежнему оставался активен. На фоне терапии адалимумабом отмечено существенное снижение частоты обострений с 4,0 (1,0-9,0) обострений на одного пациента за год, предшествующий терапии адалимумабом (р=0,000004) до 0,0 (0,0-1,0) обострений увеита на одного пациента за первый год терапии адалимумабом. На фоне терапии адалимумабом в 8,5 раз уменьшилось число пациентов, получавших топические к концу первого года терапии адалимумабом до 7,1 %, (р = 0,00001).

Заключительным этапом настоящего исследование стало выявление маркеров ЮИА-ассоциированного увеита, что является актуальным при общеизвестном отсутствии надежных маркеров самого ЮИА в случае отсутствия суставного синдрома. Выполнено исследование слезной жидкости методом прецизионной масс-спектрометрии у детей (п=31), включая пациентов с увеитом

ассоциированным с ЮИА (п=17). При сравнении протеомного профиля слезы здоровых и больных ЮИА-ассоциированным увеитом детей были выделены белки, концентрация которых существенно различалась (порог 2,5 раза, р <0,05): концентрация 45 белков в опытной группе была выше, а концентрация 1 белка -ниже. С учетом кратности различия и уровня доверительной вероятности в группу маркеров вошли лактотрансферрин (доверительная вероятность 6,71Е-07), липокалин 1(доверительная вероятность 2,80Е-11), пролактин-индуцированный протеин (доверительная вероятность 1,19Е-06) и ламинин-а-4 (доверительная вероятность 5,48Е-05). IPA-анализ позволил сформировать группу воспалительных кластеров, состоящих из протеинов с наилучшим 2-критерием и описать этот кластер в терминах известных биологических феноменов. Проведенное исследование показало возможность идентификации увеита, ассоциированного с ЮИА, по протеомному профилю слезы. Одним из ключевых протеинов, обеспечивающих эту идентификацию, является лактотрансферрин.

По результатам проведенного исследования был разработан научно-обоснованный алгоритм по раннему выявлению увеита у детей на доклинической стадии артрита, который включает учет клинических и лабораторных факторов риска и проведение тандемной масс-спектрометрии слезной жидкости; доказана необходимость расширить показания для назначения терапии метотрексатом в том числе для профилактики развития увеита у детей с ЮИА и при комбинации терапии с этанерцептом; в качестве препарата выбора более эффективного генно-инженерного препарата доказано, что следует отдавать предпочтение монотерапии моноклональными антителами.

ВЫВОДЫ

1. Установлена распространенность увеита у детей, получающих разные схемы терапии. У детей, получавших терапию НПВП и внутрисуставными глюкокортикостероидами, частота увеита de novo составила 46,7%, в группе детей, получавших терапию метотрексатом 11,5% в группе детей, получавших терапию этанерцептом - 3,7%. У детей, получавших комбинированную терапию этанерцептом и метотрексатом, частота увеита составила 2,4%. Показано, что основной причиной развития увеита у детей с ЮИА являются патогенетические механизмы, лежащие в основе заболевания, а не проводимая терапия. Выявлены половые различия в факторах риска увеита. Установлено, что основные факторы риска увеита, такие как: ранний возраст дебюта, серопозитивность по АНФ, высокая воспалительная активность ассоциированы с женским полом, и носят дублирующий характер, тогда, как отсутствие терапии метотрексатом имело наибольшее прогностически неблагоприятное значение и не зависело от пола ребенка. Женский пол не является универсальным фактором риска увеита. Доказана способность метотрексата эффективно снижать риски развития увеита de-novo у пациентов с ЮИА. Наличие факторов риска увеита модулировало способность метотрексата предупреждать развитие увеита у пациентов с ЮИА.

2. Наличие у пациента увеита повышало вероятность развития первого значимого обострения ОШ = 3,82 (95% ДИ:1,68; 8,73). Доказано, что увеит является независимым предиктором обострения ЮИА.

3. На фоне терапии адалимумабом у 96,7% отмечено достижение ремиссии увеита. У пациентов с увеитом, получающих терапию адалимумабом отмечено существенное снижение частоты обострений увеита, уменьшение дозы топических стероидов. Эффекты адалимумаба не зависели от наличия или отсутствия факторов риска увеита.

4. Установлено, что пациенты с ЮИА обладают уникальным протеомным профилем слезы, что может быть использовано в диагностических целях.

Определение лактоферрина у пациентов с ЮИА в слезе следует рассматривать, как биомаркер высокого риска развития увеита, а также диагностировать иммунный характер увеита до появления клинических симптомов поражения суставов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем пациентам с ЮИА необходимо тщательно мониторировать клинические и лабораторные факторы риска увеита, такие как АНФ, СОЭ, СРБ, определение лактоферрина слезы, что позволит выявлять пациентов с высоким риском развития увеита еще на доклинической стадии, либо в случаях развития хронического увеита до появления суставного синдрома. Идентификация таких пациентов позволит своевременно направлять их к ревматологу для назначения иммуносупрессивной терапии.

2. Для уменьшения риска возникновения увеита у пациентов с ЮИА необходимо:

а) расширить показания для назначения метотрексата в группе детей с ЮИА с повышенным риском развития увеита,

б) отдавать предпочтение комбинированной терапии этанерцепта с метотрексатом, нежели монотерапии этанерцептом для уменьшения риска развития увеита, особенно при наличии факторов риска увеита.

в) в случаях невозможности проведения терапии метотрексатом у пациентов с факторами риска увеита, особенно при повышении уровня лактоферрина слезы отдавать предпочтение монотерапии моноклональными антителами против ФНОа, нежели растворимому рецептору.

3. При развитии увеита у пациента с ЮИА необходимо усиливать противоревматическую терапию, поскольку увеит является независимым предиктором тяжести течения артрита. При наличии увеита отдавать предпочтение комбинированным схемам терапии: ГИБП с метотрексатом у пациентов с ЮИА, даже если увеит находится в стадии ремиссии.

4. Пациентам с ЮИА-ассоциированным увеитом, устойчивым к цитостатической терапии своевременно назначать иммуномодулирующую

терапию адалимумабом для достижения быстрой и устойчивой ремиссии увеита у пациентов с ЮИА.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АДА Адалимумаб

АНФ Антинуклеарный фактор

БМШ1 Болезнь-модифицирующий противовоспалительный препарат

ВНЧС Височно-нижнечелюстной сустав

ВСГК Внутрисуставной глюкокортикостероид

ГИБП Генно-инженерные биологические препараты

ГСС Голеностопный сустав

ЖКТ Желудочно-кишечный тракт

КПС Крестцово-подвздошное сочленение

КС Кортикостероиды

ЛЗС Лучезапястный сустав

Ме Медиана

МТХ Метотрексат

НПВС Нестероидный потивовоспалительный препарат

ОА Олигоартикулярный

ОШ Отношение шансов

ПЛА Противолекарственные антитела

РФ Ревматоидный фактор

СОЭ Скорость оседания эритроцитов

СРБ С-реактивнй белок

ТБС Тазобедренный сустав

ФНО-а Фактор некроза опухолей а

ШОП Шейный отдел позвоночника

ЭАА Энтезит-ассоциированный артрит

ЮАУ Увеит ассоциированный с ювенильным артритом

ЮИА Ювенильный идиопатический артрит

Akt Человеческий гомолог вирусного онкогена

ALB Альбумин

ANA Антинуклеарные антитела

APS Антиген-презентирующая клетка

AUC Area under the curve - Площадь под кривой

CpG-DNA Цитозин-регуляторная клетка

De-novo Вновь

DC Дендритная клетка

Eta Этанерцепт

HeP2 Клетки эпителиальной карциномы гортани человека

HLA-B27 Human Leukocyte Antigens-B27 - Антигены лейкоцитов человека - В27

HPLC Высокопроизводительный жидкостной хроматограф

HR Hazard ratio - Оценка отношения интенсивностей (показателей, уровней, функции) риска в экспериментальной и контрольной группах, рассчитанные для любого момента времени наблюдения

JNK c-Jun N-terminal kinase - c-Jun N-концевая киназа

IgG Иммуноглобулин G

IL-1 Интерлейкин 1

IL-6 Интерлейкин 6

IL-22 Интерлейкин 22

IL-23A Интерлейкин 23 А

ILAR International League Against Rheumatism - Международная лига ревматологических ассоциаций

IPA Программа Ingenuity Pathway Analysis

IPI International Protein Index - Международный протеиновый индекс

LAMA4 Ламинин альфа 4

LCN1 Липокалин 1

LDL Липопротеины низкой плотности

LPS Липополисахарид

LTF Лактотрансферрин

MAPK Mitogen-activated protein kinase - Митоген-активируемая протеинкиназа

Ме Медиана

MS Масс-спектрометрия

NF-KB Нуклеарный фактор каппа-В

NSL Наноспрей-ионизация

Р Показатель достоверности различий

PIP Пролактин-индуцированный протеин

PMNL Полиморфноядерный лимфоцит

PMNs Полиморфноядерный лейкоцит

ROC-анализ Receiver operating characteristic - рабочая характеристика приёмника - анализ классификаций с применением ROC-кривых

RMP Rapid migration protein - быстрорастворимый белок

sIgA Секреторный иммуноглобулин А

SUN Standartisation of Uveitis Nomenclature - Стандартизированная номенклатура увеитов

TH Т-хелпер

Th 1 Т-хелперы 1

Th 17 Т-хелперы 17

Th 27 Т-хелперы 27

Treg-клетки T-регуляторные клетки

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Базарова, Т.М. Ингибиторы фактора некроза опухоли альфа в лечении ювенильного идиопатического артрита: дисс. докт. мед. наук: 14.01.08 / Т. М. Базарова Татьяна Маратовна.- М. - 2015.- С. 467.

2. Баранов, А.А. Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с ювенильным артритом / А. А. Баранов.- М. - 2013. -С. 33.

3. Катаргина, Л.А. Эндогенные увеиты у детей и подростков/Л. А. Катаргина, Хватова, А.В. // М.: Медицина. - 2000. - С. 320.

4. Катаргина, Л.А. Диагностика и лечение увеитов, ассоциированных с ювенильным идиопатическим артритом/ Л.А. Катаргина, В.В. Бржеский, М.Р. Гусева, и др. // Федеральные клинические рекомендации по офтальмологии -2015. - С. 102 -111.

5. Насонов, Е.Л. Рекомендации EULAR по лечению ревматоидного артрита -2013: общая характеристика и дискуссионные проблемы / Е.Л. Насонов, Д.Е. Каратеев, Н.В. Чичасова // Научно-практическая ревматология / - 2013. - № 6. - С. 609-22.

6. Agarwal, S., Agarwal, A.,Apple, D.J. et al.(2002). Textbook of Ophthalmology . New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd,657 .

7. Amadi-Obi, A., Е Yu CR, Liu X, Mahdi RM, Clarke GL, Nussenblatt RB, et al. (2007). TH17 cells contribute to uveitis and scleritis and are expanded by IL 2 and inhibited by IL 27/STAT1. Nat Med, 13,711-718.

8. Ananthi, S., Santhosh, R.S., Nila, M.V. et al.(2011). Comparative proteomics of human male and female tears by two-dimensional electrophoresis .Exp Eye Res, 92, 454-63.