Взаимодействие уникального домена высокомолекулярной киназы легких цепей миозина с белками-мишенями и его регуляция фосфорилированием тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Вилиткевич, Елена Леонидовна

• Вилиткевич, Елена Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Вилиткевич, Елена Леонидовна

Список используемых сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Подвижность немышечных клеток.

Миозины II типа.

Киназы легких цепей миозина.

Гены КЛЦМ.

Экспрессия КЛЦМ210 в тканях организма.

Строение и функциональные свойства КЛЦМ210.

Аминотерминальный домен.

Каталитический домен.

Регуляторный сегмент.

КНР домен и связывание с миозином.

Связывание с актином.

Фосфорилирование КЛЦМ210.

Участие КЛЦМ210 в регуляции клеточной подвижности.

Обоснование задачи.

Материалы и методы.

Материалы.

Методы.

Молекулярно-биологические методы.

Генетическое конструирование фрагментов уникального домена

КЛЦМ210 для бактериальной экспрессии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Введение точечных аминокислотных замен.

Получение мутантов N27-15 7(8140Б;8149Б).

Трансформация клеток Е. coli.

Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

Биохимические и физико-химические методы.

Очистка рекомбинантных белков.

Выделение белков из тканей.

Определение концентрации белков.

Электрофорез и денситометрия.

Иммуноблоттинг.

Дифференциальное ультрацентрифугирование.

Измерение светорассеяния суспензии микротрубочек и агрегатов тубулина.

Электронная микроскопия белков. Исследование влияния уникального домена КЛЦМ210 на микротрубочки.

Фосфорилирование фрагментов КЛЦМ.

Определение участков фосфорилирования в уникальном домене

КЛЦМ210 методом масс-спектрометрии.

Клеточно-биологические методы.

Экстракции.

Результаты.

Создание генетических конструкций уникального домена КЛЦМ

Фрагмент N1-452 колокализуется с актином и микротрубочками в немышечных клетках.

Фрагменты N1-201 и N27-157 колокализуются с актином в немышечных клетках.

Сравнение защитного действия КЛЦМ210 и N1-452 на микрофиламенты в культивируемых клетках.

Связывание фрагмента N1-452 с актином и тубулином.

Взаимодействие фрагментов N1-201 и N27-157 с Ф-актином in vitro

Влияние N1-452 на сборку и взаимодействие микротрубочек.

Влияние фосфорилирования уникального домена КЛЦМ210 протеинкиназой А на его связывание с актином и микротрубочками in vitro.

Фосфорилирование фрагмента N1-452 протеинкиназой А.

Фосфорилирование N1-452 протеинкиназой А практически не влияет на его связывание с микротрубочками.

Фосфорилирование фрагмента N27-157 протеинкиназой А.

Фосфорилирование N27-157 протеинкиназой А ослабляет его связывание с актином.

Идентификация участков фосфорилирования протеинкиназой А в уникальном домене КЛЦМ210.

Взаимодействие фосфоимитирующих мутантов N27-157 с цитоскелетом.

Активация протеинкиназы А в клетках HeLa сопровождается уменьшением связывания N27-157 с цитоскелетом.

Обсуждение.

Новые участки связывания с компонентами цитоскелета в структуре уникального домена КЛЦМ210.

Функциональное значение фосфорилирования уникального домена

КЛЦМ210.

КЛЦМ210 как интегратор цитоскелета и организатор клеточной подвижности.

Выводы.

Благодарности.