Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител: иммуноглобулинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Романенко, Наталья Александровна

• Романенко, Наталья Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романенко, Наталья Александровна

Введение.

Глава 1. Алкилоксибензолы (АОБ) и их биологическая активность в гомо- и гетерологичных системах.

1.1. Многообразие' внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов. Своеобразие АОБ и их влияние в биологических системах.

1.2. Эффекты алкилоксибензолов в отношении макроорганизмов.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Иммуноферментный анализ.

2.2.1. Неконкурентный и конкурентный иммуноферментный анализ.:.

2.2.2. Метод денатурирующего иммуноферментного анализа.

2.3. Определение аффинности антител^ методом «гашения»-* триптофановой флюоресценции.

2.4. Реакция комплементзависимого лизиса эритроцитов.

2.5. Определение функциональной и операционной стабильности иммуноглобулинов.

2.6. Методы статистической обработки результатов.

Глава 3. Влияние АОБ на параметры взаимодействия в системе «антиген-антитело».'.

3.1. Изменение антигенсвязывающей способности антител под влиянием АОБ.

3.2. Частичное изменение специфичности антител под влиянием АОБ.

3.3. Интегральные эффекты АОБ в системе «антиген-антитело».

3.4. Изменение функциональной активности Рс-фрагментов антител

Глава 4. Влияние АОБ на стабильность антител.

4.1. Влияние АОБ на функциональную и операционную стабильность антител при денатурирующих воздействиях.

4.2. Изменение сроков сохранения функциональной активности антител под влиянием АОБ в условиях длительного нахождения в водном растворе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики антител: иммуноглобулинов»

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Алкилоксибензолы (АОБ), в том числе и входящие в эту группу веществ алкилрезорцины (АР), встречаются на разных уровнях организации живой материи (бактерии, грибы, растения) и демонстрируют чрезвычайно широкий спектр биологических активностей, что делает их объектом значительного числа междисциплинарных исследований/1, 2/. В частности, у бактерий родов Azotobacter, Pseudomonas, Micrococcus, Thioalkalivibrio и др. эти вещества выполняют роль внеклеточных ауторегуляторов с функциями адаптогенов, способных индуцировать переход клеток в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/.

В основе биологической активности АОБ лежит их способность к ряду физико-химических взаимодействий (гидрофобных, электростатических, водородных) с липидами клеточных мембран /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, что обуславливает изменение структурной организации и функциональной активности биомакромолекул и надмолекулярных структур. При этом универсальность действия АОБ как «химических шаперонов» /8/ обуславливает развитие сходных эффектов в гетерологичных системах. В частности, в присутствии микромолярных концентраций гомологов АОБ показаны изменения каталитической активности, функциональной и операционной стабильности моно- и полисубъединичных ферментных белков не только микробного и растительного, но и животного происхождения /9-11/, а также снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов/12/.

В связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают в организм человека и животных с пищей, а также синтезируются некоторыми представителями микробиоценоза, их концентрации в биологических жидкостях и тканях могут достигать нано- и микромолярных значений /13, 14/. Это предполагает возможность участия АОБ в регуляции ряда иммунофизиологических и иммунопатологических процессов. Высказанное предположение подтверждает показанная в опытах in vitro способность АОБ изменять розеткообразующую активность Т-лимфоцитов /15/, а также оказывать цитотоксическое действие на мононуклеарные фагоциты /16/. Итоговым результатом реализации такой биологической активности могут являться индуцируемые АОБ аллергические состояния/17, 18/.

Однако до настоящего времени отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител — неферментных иммунных белков человека и животных, включая изменения их основного свойства — антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях.

Цель и задачи исследования

Цель работы — изучить влияние алкилкоксибензолов — химических аналогов бактериальных ауторегуляторов, на функциональную активность и стабильность антител (иммуноглобулинов).

Для достижения данной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Исследовать влияние алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммуноглобулинов в реакциях «антиген-антитело».

2. Изучить действие алкилоксибензолов на стабильность иммуноглобулинов при денатурирующих воздействиях и неоптимальных условиях проведения реакций.

Научная новизна

Впервые установлено, что алкилоксибензолы — химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, способны блокировать специфическое взаимодействие антител (иммуноглобулинов) с соответствующими I антигенами. Выраженность эффектов АОБ зависит от длины алкильного радикала и определяемой этим гидрофобности данных веществ, а концентрационная зависимость их действия варьирует от характеристик реакционной системы. Механизм эффектов АОБ на иммуноглобулины связан с их модифицирующим действием на аффинность, а через него и авидность антител. Эффект распространяется на антитела различной специфичности и классов. В ряде случаев результатом взаимодействия «АОБ : антитела» может стать частичное изменение специфичности иммунных белков.

Обнаружено, что алкилоксибензолы способны дополнительно влиять I на результат реакции в системе «антиген-антитело» через взаимодействие с антигенами. Ранжирование значимости эффектов АОБ в рассматриваемой системе позволило установить, что короткоцепочечные гомологи преимущественно реализуют свою биологическую активность через влияние на свойства антигенов, в то время как длинноцепочечные АОБ оказывают большее действие на свойства антител.

Выявлен модифицирующий эффект длинноцепочечных алкилоксибензолов на функциональную активность Рс-фрагментов антител, проявляющийся в затруднении инициации классического пути активации комплемента в реакции комплементзависимого гемолиза.

Изучение эффектов алкилоксибензолов на функциональную и операционную стабильность антител позволило установить разнокачественность отклика на внешние воздействия: АОБ снижали устойчивость белков к термоденатурации, преимущественно увеличивали их устойчивость к УФ-облучению и неоднозначно изменяли диапазон i активности при низких и высоких значениях рН.

При длительной инкубации модифицированных АОБ антител в водных растворах выявлено развивающееся во времени восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате взаимодействия белков с длинноцепочечными АОБ. На этом фоне значимым эффектом 1,3-диокси-5-метилбензола явилась его способность увеличивать сроки сохранения функциональной активности антител при температуре +37°С.

Практическая значимость

Полученные результаты, свидетельствующие об изменении функциональных характеристик антител при взаимодействии с АОБ, позволяют говорить об алкилоксибензолах как о новой- группе бактериальных ауторегуляторов с иммуномодулирующими свойствами с перспективой разработки на этой основе новых, подходов к регуляции иммунологических реакций-,в системах in vitro и in vivo.

Результаты модификации антител 1,3-диокси-5-метилбензолом положены в основу оригинального подхода к стабилизации этих белковых молекул в условиях длительного нахождения в водных растворах, ориентированного на увеличение сроков хранения диагностических и лечебно-профилактических препаратов иммуноглобулинов без утраты их функциональной активности. Приоритет разработанного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Алкилоксибензолы - химические аналоги бактериальных ауторегуляторов, изменяют функциональные характеристики антител: антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции. Характер влияния алкилоксибензолов зависит от химического строения АОБ и наиболее выражен у их длинноцепочечных гомологов. Изменение параметров связывания в системе «антиген-антитело» дополнительно может быть обусловлено модификацией свойств антигенов в присутствии АОБ.

2. Алкилоксибензолы различной структуры разнокачественно влияют на стабильность антител при внешних воздействиях: повышают их чувствительность к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и неоднозначно изменяют диапазон активности при различных значениях рН. 1,3-диокси-5-метилбензол увеличивает сроки сохранения функциональной активности антител в условиях их длительного нахождения в водном растворе.

Связь автора с научными программами и собственный вклад автора

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200606125 «Влияние ауторегуляторных ёрфакторов бактерий из группы алкилоксибензолов на структуру и функции биополимеров», а также при поддержке гранта РФФИ 08-04-99078-рофи «Разработка технологии стабилизации иммунных и ферментных белков с использованием химических шаперонов микробного происхождения».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Публикации

Основные результаты представлены в 13 печатных работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на III и V Межрегиональных конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2006, 2010); V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006); Региональной конференции молодых ученых с международным участием . «Современные проблемы экологии, микробиологии и ' иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007); III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь — Н. Новгород, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008); Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 2 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 194 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 21 рисунком.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Романенко, Наталья Александровна

Выводы

1. Алкилоксибензолы способны блокировать специфическое взаимодействие антител с соответствующими антигенами; выраженность подобных эффектов зависит от особенностей химической структуры АОБ и характеристик системы «антиген-антитело».

2. Влияние алкилоксибензолов на параметры специфического связывания антител с соответствующими антигенами обусловлено уменьшением аффинности и авидности иммуноглобулинов.

3. В результате взаимодействия антител с АОБ. может происходить частичное изменение их специфичности с возникновением возможности связываниям гетерологичными антигенами.

4. Алкилоксибензолы способны потенцировать свое действие в системе «антиген-антитело» через изменение поверхностных свойств антигена, что в большей степени характерно для короткоцепочечных АОБ по сравнению с длинноцепочечными.

5. Длинноцепочечные АОБ изменяют функциональную активность Бс-фрагмента антител, затрудняя инициацию классического пути активации комплемента.

6. Алкилоксибензолы увеличивают чувствительность антител к термоденатурации, преимущественно снижают чувствительность к УФ-облучению и разнрнаправленно изменяют диапазон активности при различных значениях рН.

7. При длительном хранении модифицированных АОБ антител в водных растворах происходит восстановление показателей их связывания с соответствующими антигенами, первоначально ингибированного в результате модификации АОБ.

8. 1,3-диокси-5-метилбензол, оказывающий наименьшее влияние на антигенсвязывающую способность антител, существенно увеличивает сроки сохранения, их. функциональной активности в условиях длительного пребывания в водном- растворе.

Заключение

Малые органические молекулы, вероятно, являются одними из наиболее эволюционно древних компонентов живых систем. История их открытия связана с исследованием цвета, запаха и вкуса продуктов растительного и животного происхождения /188/, а распространение подобного поиска в мир микроорганизмов позволило выявить у малых молекул и иные, не менее значимые функции. Так, одним из наиболее ярких открытий в микробиологии конца XX века явилось описание феномена межклеточной коммуникации и определяемого этим коллективного поведения1 бактерий; за которые в качестве химических сигналов отвечают именно малые молекулы /19/. При этом к настоящему времени количество известных малых регуляторных молекул, представленных лактонами гомосерина, циклическими олигопептидами и др. достигло нескольких десятков и продолжает возрастать /25/.

Среди малых молекул с регуляторными свойствами обращает на себя внимание широкий спектр изомеров и гомологов алкилоксибензолов (АОБ), в научной литературе описываемых также как фенольные липиды /54/ или алкилрезорцины /1/. Исследование характера индуцируемых ими эффектов позволило связать биологическую роль АОБ с индукцией перехода микроорганизмов в гипометаболическое и анабиотическое состояние /3, 4/. В свою очередь лежащие в основе- подобной активности молекулярные механизмы оказались связанными со способностью АОБ к взаимодействию с липидными мембранами /5/, протеинами /6/ и нуклеиновыми кислотами /7/, ведущему к изменению структурных особенностей и функциональных характеристик данных биополимеров.

Глубокое биохимическое единство жизни, а также отобранная в процессе эволюции оптимальная структура АОБ определили их присутствие и значимые биологические функции у ряда эукариот - грибов и растений /66, 69/. При этом помимо проявившейся еще в мире прокариот способности АОБ к модификации структуры и функции белковых макромолекул, у растений они дополнительно принимают участие в контроле окислительных процессов, а также реализации антимутагенных и антибактериальных эффектов/189, 190/.

Эндогенное образование алкилоксибензолов в организме животных и I человека в настоящее время не установлено. Однако, в связи с тем, что АОБ в значимых количествах поступают с растительной пищей, а также образуются некоторыми представителями микробиоценоза, они могут выступать и в качестве потенциальных участников ряда'физиологических и патологических процессов данной группы высших эукариот. При этом обоснованность подобного предположения подтверждается обнаружением присутствия АОБ в биологических жидкостях и тканях человека и животных в нано- и микромолярных /13,14/ концентрациях.

Первыми экспериментальными доказательствами регуляторных эффектов АОБ в гетёрологичных системах стали изменение каталитической активности ряда ферментных белков животного происхождения /6, 10/ и обусловленное ими снижение аффинности рецепторов к фибриногену на поверхности тромбоцитов, /12/. В свою очередь доказательствами возможного участия АОБ в регуляции активности иммунной системы стало обусловленное ими изменение розеткообразующей активности Тлимфоцитов, адгезивных свойств и фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов, а также активности белков системы комплемента /16/.

Однако, в научной литературе отсутствуют данные, характеризующие эффекты алкилоксибензолов в отношении антител - неферментных иммунных белков человека и животных, а именно их основного свойства -антигенсвязывающей способности, а также функциональной и операционной стабильности при экстремальных физических и химических воздействиях, что и определило цель настоящего исследования.

В процессе достижения указанной цели на примере ряда гомологов алкилоксибензолов (СгАОБ, С3-АОБ, Сб-АОБ и С12-АОБ), различающихся длиной алкильных радикалов и определяемой этим гидрофобностью молекул, впервые показана зависимость изменения функциональных характеристик и параметров стабильности антител от структуры и действующих концентраций АОБ. При этом установлено, что направленность и выраженность действия АОБ характеризуется выраженной зависимостью от особенностей их химического строения (в первую очередь — длины углеводородного алкильного радикала) и в зависимости от этого проявляется в формировании двух основных групп эффектов:

1) для длинноцепочечных гомологов АОБ впервые показано влияние на ряд функциональных характеристик антител — их антигенсвязывающую способность, специфичность и эффекторные функции, что позволяет охарактеризовать данную группу малых молекул как бактериальные ауторегуляторы с иммуномодулирующими свойствами;

2) впервые охарактеризовано влияние АОБ на чувствительность антител к различным денатурирующим воздействиям, а также стабильность их функциональных' характеристик при длительном нахождении в водном растворе, каковая может быть существенно увеличена в присутствии короткоцепочечного 1,3-диокси-5-метилбензола и позволяет рекомендовать названный гомолог АОБ в качестве стабилизатора препаратов антител.

Обобщая и обсуждая полученные при проведении работы указанные фундаментальные и прикладные результаты, еще раз обратим внимание на следующие детализирующие их основные моменты, а также определим возможные направления дальнейшего научного поиска.

Первая группа научных результатов работы связана с выявлением I способности АОБ к' блокированию специфического связывания антител с соответствующими (гомологичными) антигенами. С использованием различных вариантов иммуноферментного анализа, включающего классический «сендвич-метод» и конкурентный ИФА показано, что присутствие в реакционной системе возрастающих концентраций АОБ приводит к достоверному снижению показателей связывания антител I различной специфичности и классов. Данная способность существенно зависела от химического строения использованных гомологов алкилоксибензолов, будучи наиболее выраженной у длинноцепочечных Сб- и С12-АОБ в сравнении с короткоцепочечными С г и Сз-АОБ.

В подобном контексте малый размер, а также особенности молекулярной организации АОБ позволяют уподобить их гаптенам, активность которых также связана с блокированием антигенсвязывающей способности антител /166/. Однако, в отличи от истинных гаптенов, представляющих собой фрагменты детерминантных групп антигенов и в этой связи блокирующих взаимодействие только в определенных парах «антиген-антитело», эффект АОБ распространялся на антитела самой разной специфичности. Сказанное позволило рассматривать исследованные малые молекулы как некие «супергаптены», обладающие расширенным спектром биологической активности.

Обнаружение подобной уникальной способности АОБ ставит вопрос о механизмах, лежащих в основе вызываемого ими блокирования антител. При этом вероятные возможности определяются взаимодействием длинноцепочечных гомологов АОБ с остатками гидрофобных аминокислот непосредственно в активных центрах антител, а также обуславливаемым ими изменением характера укладки полипептидных цепей, нарушающего точную организацию макромолекулы в области активного центра, как это было ранее показано для ряда ферментных белков /51, 108-110/.

Окончательное решение данного вопроса требует продолжения исследований в обозначенном направлении, в том числе с использованием методов исследования третичной структуры белков (рентгеноструктурный анализ, двух- и многомерная ЯМР-спектроскопия). Полученные же при проведении настоящего исследования экспериментальные результаты позволили детализировать выявленные эффекты АОБ через влияние на аффинитет и авидность антител, характеризующие качество и количество силы их связывания с соответствующими антигенами.

Так изменение аффинитета антител под действием АОБ было зафиксировано с использованием метода гашения триптофановой флюоресценции при добавлении нитроароматического лиганда динитрофенола. При этом выявленное подавление гашения флюоресценции антител, предварительно инкубированных с С6-АОБ, по сравнению с интактными иммуноглобулинами позволило говорить о снижении их аффинности в присутствии названных малых молекул. В свою очередь методом денатурирующего иммуноферментного анализа был показан более выраженный прямой блокирующих эффект АОБ по отношению к низкоавидным антителам по сравнению с высокоавидными, а также снижение самого показателя авидности последних в присутствии Сб-АОБ.

На этом фоне вторым значимым научным результатом представляется I экспериментально обнаруженная способность АОБ не только блокировать взаимодействие антител с гомологичными антигенами, но и обуславливать возможность их неспецифического взаимодействия с рядом гетерологичных антигенов. Так в опытах с антителами шести специфичностей к стероидным и нестероидным гормонам человека продемонстрировано повышение показателей их взаимодействия с гетерологичными антигенами под действием С6-АОБ, а особенно С12-АОБ. Сказанное позволило констатировать, что подобная способность вновь была характерна именно для длинноцепочечных АОБ, тем самым заставляя рассматривать два описанных выше феномена (блокирование специфического взаимодействия и возникновение возможности неспецифического взаимодействия в системе «антиген-антитело») как проявление одного и того же механизма биологической активности гидрофобных гомологов алкилоксибензолов, определяемого изменением структуры активных (антигенсвязывающих) центров антител.

Обсуждая полученный результат, представляется целесообразным сопоставить его с недавно полученными данными о влиянии АОБ на внутримолекулярную динамику белка, рассмотренную на примере ферментного белка — лизоцима /191/. При этом обращает на себя внимание повышение внутримолекулярной подвижности модифицированной- АОБ белковой глобулы, в том числе проявляющейся в увеличении флуктуаций в области активного центра. Результатом же происходящих процессов оказывается снижение характеризуемой константой Михаэлиса субстратной специфичности ферментных белков, одновременно* сопровождающееся-парадоксальным расширением спектра их субстратной специфичности. Так в варианте модификации лизоцима, наряду с изменением его активности к типичному субстрату — бактериальному пептидогликану, отмечена выраженная стимуляция гидролитической активности фермента в отношении коллоидного хитина /10/.

В подобном контексте представляется вероятным предположение о том, что изменение специфичности белков как результат их модификации АОБ, по-видимому, является универсальным эффектом этих малых молекул, распространяющимся как на иммунные, так и на ферментные белки (в частности — лизоцим /10/, оксигеназы /11/ и др.). Применительно же именно к антителам возможность частичного изменения их специфичности при взаимодействии с АОБ может иметь дополнительные медико-биологические аспекты. В частности, модификация антител АОБ микробного происхождения представляется одним из молекулярных механизмов «уклонения» инфекционных агентов от эффекторов иммунной системы. В свою очередь механизмы индуцируемых АОБ растительного происхождения иммунопатологических состояний /17, 18/ также могут быть опосредованы именно этой особенностью биологической активности названных малых молекул.

Дополнительным вопросом, требующим своего решения при описании взаимодействияАОБ с белковыми макромолекулами, являлся избирательный или неизбирательный характер их контакта именно с активными (антигенсвязывающими) центрами антител. Проведенное с этой целью экспериментальное исследование влияния АОБ на активность еще одного функционального участка — Бс-фрагмента антител, позволило констатировать, что эффект алкилоксибензолов проявляется и в изменении его активности, тем самым свидетельствуя о делокализованности данных малых молекул по всей глобуле белка. При этом действие алкилоксибензолов на эффекторные функции иммуноглобулинов в реакции комплементзависимого лизиса эритроцитов проявлялось через увеличение кинетического параметра 150%, характеризующего скорость инициации классического пути активации комплемента. В совокупности же с известными данными о влиянии АОБ на собственную активность белков системы комплемента /16/, их действие на эффекторные функции антител может рассматриваться в качестве еще одного механизма «уклонения» микроорганизмов от контакта с бактерицидными факторами организма-хозяина.

Наконец еще одним экспериментально выявленным эффектом АОБ в системе «антиген-антитело», усиливающим направленность и выраженность происходящих процессов, явилась способность данных малых молекул, наряду с изменением функциональных характеристик антител, модифицировать и значимые для взаимодействия с ними поверхностные свойства антигенов. При этом подобная способность в наибольшей степени была выражена уже не у длинноцепочечных, но у короткоцепочечных гомологов АОБ, что вероятно определялось их влиянием на гидратную оболочку антигенов. В свою очередь результаты проведенного двухфакторного дисперсионного анализа свидетельствовали о преобладании у длинноцепочечных АОБ способности к модификации антигенсвязывающей способности антител, развернутая характеристика которой была дана нами выше.

Таким образом, результатом выполнения первой части работы явились выявление и характеристика изменения функциональной активности антител (иммуноглобулинов) как результата их взаимодействия с химическими аналогами низкомолекулярных регуляторных факторов бактериального и растительного происхождения, что позволяет по-новому оценить роль I последних при их поступлении или образовании в организме человека и животных. В целом полученные результаты позволили с новых позиций оценить эволюционно древние химически консервативные малые молекулы из группы алкилоксибензолов как иммуномодуляторы особого типа, формирующие «информационный шум», дезорганизирующий и дискоординирующий иммунный ответ и потенциально ведущий к развитию иммунодефицитных и аутоиммунных состояний.

В подобном контексте полученные результаты хорошо согласуются с формирующимся в мировой науке представлениям о наличии у некоторых I бактериальных ауторегуляторов способности к воздействию на; функционирование иммунной системы млекопитающих /192/. Однако^ в отличие от известных фактов стимуляции продукции цитокинов при воздействии на клетки иммунной системы образуемого Chromobacterium violaceum ауторегулятора N-додеканоил-гомосеринлактона /193/ или показанного у образуемого Pseudomonas aeruginosa автоиндуктора N-оксододеканоил-гомосеринлактона способности к индукции апоптоза макрофагов и нейтрофилов /194/, оригинальность полученных результатов заключается в выявлении воздействия бактериальных ауторегуляторов не на клеточное, но на гуморальное звено иммунитета.

Второй блок полученных экспериментальных результатов включает оценку эффектов алкилоксибензолов на функциональные характеристики иммунных белков при денатурирующих воздействиях (функциональная стабильность) или неоптимальных условиях проведения реакций (операционная стабильность). При этом основанием для подобной постановки вопроса явились представления об АОБ как своеобразных химических шаперонах», предотвращающих денатурацию белковых молекул при экстремальных внешних воздействиях /8, 9/. Однако, экспериментально зафиксированные эффекты АОБ в отношении стабильности антител при воздействии высоких температур, ультрафиолетового облучения и неоптимальных значениях рН оказывались достаточно разнонаправленными.

Так короткоцепочечный гомолог СгАОБ в низких концентрациях повышал, а в высоких понижал значения характеризующего процесс термоденатурации параметра ЕТ20, не оказывая достоверного влияния на параметр ЕТ50. В свою очередь проведение модификации с использованием Сб-АОБ и последующая термообработка образующихся комплексов вели не только к значимому изменению величин ЕТ20, но и к снижению ЕТ50 существенно ниже такового у немодифицированных антител. При этом полученный результат, свидетельствующий о происходящем снижении терморезистентности комплексов «антитело+АОБ», согласуется с приведенными выше данными о повышении внутримолекулярной подвижности белковой глобулы при ее модификации алкилоксибензолами /191/, одновременно еще раз подтверждая факт связывания АОБ в области активных центров антител.

Еще одним, воспроизводящим ранее полученный на примере ферментных белков эффект /9/, стало протективное действие АОБ на функциональную стабильность антител при УФ-облучении, в основе которого может лежать близость спектральных максимумов (277 нм у Ср АОБ и 280 нм у Сб-АОБ) с таковыми у входящих в структуру белков остатков ароматических аминокислот — тирозина и триптофана (около 280 нм). Соответственно, в результате частичного перекрывания данных спектров в УФ-диапазоне возникает возможность формирования своеобразного «оптического экрана» из молекул АОБ, поглощающих кванты света на пути к белку. В то же время подобное предположение не способно полностью объяснить связь выраженности УФ-протекторного эффекта с особенностями химического строения АОБ, а также формирующиеся при этом нелинейные концентрационные зависимости, вновь заставляя признать роль в этих процессах прямого взаимодействия в системе «антитело+АОБ».

Наконец эффекты на операционную стабильность антител при неоптимальных значениях рН также оказывались достаточно неоднозначными. При этом наиболее общей зависимостью стало то, что при низких (кислых) значения рН АОБ проявляли себя как дестабилизаторы антител, а единичные- факты расширения их операционной стабильности продемонстрированы при высоких (щелочных) значениях рН.

На фоне столь неоднозначного эффекта АОБ на функциональную и операционную стабильность антител важной задачей представлялось исследование эффектов данной группы малых молекул на стабильность их характеристик в водных растворах, потенциально определяемых особыми амфифильными свойствами АОБ. При этом предпосылки для подобного исследования дополнительно определялись собственными результатами компьютерного моделирования взаимодействия молекул воды с различными гомологами АОБ, позволившими методом функционала плотности БРТ/ КОШ7/ ВЗ ЬУР/ в базисе 6-310 провести расчет межмолекулярных потенциалов и определить возможность создания устойчивых по энергии комплексов. Выполнение соответствующих расчетов позволило констатировать особенность свойств коротокоцепочечных гомологов АОБ и, особенно, С1-АОБ, формирующего устойчивые связи с молекулами воды и, тем самым, способного существенно модифицировать гидратную оболочку биополимеров.

Экспериментальное исследование влияния СрАОБ на антитела, изначально не вызывающего значимых изменений функциональных характеристик данных белков (см. выше), сопровождалось достоверным увеличением сроков сохранения их антигенсвязывающей способности. В частности, использование названного гомолога к концу периода хранения при +37°С почти двукратно увеличивало время, за которое происходила потеря 20% функциональной активности антител и обуславливала превышение показателя их антигенсвязывающей способности на 79.0% по сравнению с интактными антителами. В свою очередь использование длинноцепочечных гомологов АОБ в динамике хранения хотя и вело к частичному восстановлению показателей связывания модифицированных ими антител с соответствующими антигенами, не сопровождалось значимым увеличением сроков сохранения подобной функциональной активности.

Полученные результаты определили перспективу инновационного подхода к стабилизации иммунных белков как результата их взаимодействия с АОБ, включающего определение химической структуры стабилизатора (Сг АОБ) и его оптимальной концентрации (10"4М), не оказывающих негативного эффекта на антигенсвязывающую способность и другие значимые характеристики антител, но позволяющих достичь увеличения сроков сохранения их функциональной активности при длительном нахождении в водных растворах. Приоритет подобного подхода закреплен «Способом стабилизации антител в водных растворах» (положительное решение ФИПС по заявке на изобретение № 2010136488 от 30.08.2010 г.).

Таким образом, проведенное исследование, свидетельствующее о взаимодействии малых регуляторных молекул из группы алкилоксибензолов с антителами, изменяющем их функциональные характеристики и параметры стабильности, приобретает оригинальные медико-биологические и биотехнологические приложения. С одной стороны, полученные результаты позволяют раскрыть' новые механизмы взаимодействия «микроорганизм-макроорганизм», определяемые бифункциональностью длинноцепочечных гомологов АОБ в подобной системе и потенциально ведущие к созданию на данной основе новой группы иммуномодуляторов. С другой стороны, в ряде случаев полученные результаты могут быть биотехнологически полезными, что заключается в возможности длительного сохранения функциональных характеристик антител при их модификации короткоцепочечными АОБ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романенко, Наталья Александровна, 2011 год

1. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chemical Reviews. 1999. V. 99. No. l.P. 1-31.

2. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин A.JI., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 446-456.

3. Вострокнутова Г.Н., Капрельянц А.С., Светличный В.А.,I

4. Эль-Регистан Г.И., 'Шевцов В.В., Островский Д.Н. Мембраноактивные свойства препарата из культуральной жидкости бактерий, обладающего ауторегуляторным действием // Прикладная биохимия и микробиология. 1983. Т. 19. №4. С. 21-25.

5. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Эль-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами микробных аутоиндукторов анабиоза // Микробиология. 2005. Т. 74. № 5. С. 616-625.

6. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов1 // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 708-715.

7. Kozubek A., Wroblewski Z. Cereal grain long chain amphiphiiicresorcinolic lipids inhibit significantly binding, of fibrinogen by platelets whereas short chain resorcinolic lipids and fatty acids do not // Studia biophysica. 1990. No. 139. P. 177-181.

8. Landberg R., Linko A-M., Kamal-Eldin A., Vessby В., Adlercreutz H., Aman Pi Human plasma kinetics and relative bioavailability of- alkylresorcinols after intake of ryebran // The Journal of Nutrition. 2006. Y. 136: P. 2760-2765.

9. Ross A.B., Redeuil.K., Vigo M., Rezzi S., Nagy K. Quantification of alkylresorcinols in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2010: V. 24. No. 5. P. 554-560.

10. Казацкая Ж.А., Николаева Н.В., Липова В.В., Шушпанова О.Н. Влияние алкилоксибензолов на некоторые иммунологические реакции in vitro // Паллиативная медицина и реабилитация. 2005. № 1. С. 68.

11. Шушпанова О.Н. Оценка иммунотропной активности алкилоксибензолов // Материалы XV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». 2008. С. 46.

12. Ока К., Saitp F., Yasuhara Т., Sugimoto A. A study of cross-reactions between mango contact allergens and urushiol // Contact Dermatitis. 2004. V. 51. P. 292-296.

13. Hershko K., Weinberg I., Ingber A. Exploring the mango poison ivy connection: the riddle of discriminative plant dermatitis // Contact Dermatitis. 2005. V. 52. P. 3-5.

14. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. M.: Наука, 1988.-270 с.

15. Stephens К. Pheromones among the procaryotes // CRC Critical Reviews in Microbiology. 1986. No. 13. P. 309-334.

16. Whittaker R.H., Feeny P.P. Allelochemics: chemical interactions between species // Science. 1971. V. 171. P. 757-770.

17. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria // Annual Review of Microbiology. 2001. V. 55. P. 165-199.

18. Waters C., Bassler B.L. Quorum sensing: Cell-to-cell communication in bacteria // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2005. V. 21. P. 319-346.

19. Lal A. Quorum Sensing. How bacteria talk to each other // Resonance. 2009. P. 866-871.

20. Bassler B.L.,, Wright M., Showalter R.E., Silverman M.R. Intercellular signaling in Vibrio harveyh sequence and function of genes regulating expression of luminescence//Molecular Microbiology. 1993. V. 9. P. 773-786.

21. Dworkin M., Gibson S.M. A system for studying microbial morphogenesis: rapid formation of microcysts in Myxococcus xanthus II Science. 1964. No. 146. P. 243-244.

22. Piper K.R., Beck von Bodman S., Farrand S.K. Conjugation factor of Agrobacterium tumefaciens regulates Ti plasmid transfer by autoinduction // Nature. 1993. V. 362. P. 448-450.

23. Bainton N.J., Stead P., Chhabra S.R., Bycroft B.W., Salmond G.P.C., Steward G.S.A.B., Williams P. N-(3-Oxohexanoyl)-L-homoserine lactone regulates carbapenem antibiotic production in Erwinia carotovora И Biochemical Journal. 1992. V. 288. P. 997-1004.

24. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым возействиям // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 1. С. 5-24.

25. Мулюкин A.JL, Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н., Дужа JVLB., Митюшина JI.A., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов//Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 42-49.

26. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.

27. Kozubek A., Zarnowski R., Stasiuk М., Gubernator J. Natural amphiphilic phenols as bioactive compounds // Cellular and Molecular Biology Letters. 2001. V. 6. No. 2A. P. 351-355.

28. Kozubek A., Pietr S., Czerwonka A. Alkylresorcinols are abundant lipid components in different strains of Azotobacter chroococcum and Pseudomonas spp. II Journal of Bacteriology. 1996. V. 178. No. 14. P. 4027-4030.

29. Zarnowski R., Suzuki Y., Zarnowska E.D., Esumi Y., Kozukek A., Pietr S.J. 5-n-Alkylresorcinols from the nitrogen-fixing soil bacterium Azotobacter chroococcum Azl2 // Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. V. 59c. P. 318-320.

30. Rejman J., Kozubek A. The effect of alkylresorcinol on lipid metabolism in Azotobacter chroococcum II Zeitschrift fur Naturforschung. 2004. V. 59c. P. 393-398.

31. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996. Т. 65. № 1.С. 20-25.

32. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембраннотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий // Успехи химии. 1991. Т. 60. № 11. С. 2362-2372.

33. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. — 367с.

34. Reusch R.N., Sadoff H.L. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelandii: isolation and characterization // Journal of Bacteriology. 1979. V. 139. P. 448-453.

35. Reusch R.N., Sadoff H.L. Novel lipid components of the Azotobacter ■vinelandii cyst membranen // Nature. 1983. V. 302. P. 268-270.

36. Su C.-J., Reusch R.N., Sadoff H.L. Isolation and characterization of several unique lipids from Azotobacter vinelandii cyst // Journal of Bacteriology. 1981. V. 147. P. 80-90.

37. Tsuge N., Mizokami М., Imai S., Shimazu A., Seto H. Adipostatins A and B, new inhibitors of glycerol-3phospate dehydrogenase // Journal of Antibiotics. 1992. V. 45. P. 886-891.

38. Запрометов M.H. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 272 с.

39. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность. М.: Наука, 1988. — 247 с.

40. Stasiuk М., Kozubek A. Biological activity of phenolic lipids // Cellular and Molecular Life Sciences. 2010. V. 67. P. 841-860.

41. Zarnowska E.D;, Zarnowski R., Kozubek A. Alkylresorcinols in fruit pulp and leaves of Ginkgo biloba L II Zeitschrift fur Naturforschung. 2000. V. 55. P. 881-885.

42. Deszcz L., Kozubek A. Higher cardol homologs (5-alkylresorcinols) in rye seedlings // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. V. 1483. P. 241-250.

43. Landberg R'., Kamal-Eldin A., Salmenkalio-Marttila M., Rouau X., Eman P. Localization of alkylresorcinols in wheat, rye and barley kernels // Journal of Cereal Science. 2007. Accepted Manuscript. 19 p.

44. Ross A.B. Alkylresorcinols in cereal grains: occurrence, absorption, and possible use as biomarkers of whole grain wheat and rye intake. Doctoral thesis. Swedish University of Agricultural Sciences. Uppsala, 2003. — 20 p.

45. Magnucka E.G., Suzuki Y., Pietr S.J., Kozubek A., Zarnowski R. Effect of norflurazon on resorcinolic lipid metabolism in rye seedlings // Zeitschrift fur Naturforschung C. 2007. V. 62. P. 239-245.

46. Ji X., Jetter R. Very long chain alkylresorcinols accumulate in the intracuticular wax of'rye (Secale cereale L.) leaves near the tissue surface // Phytochemistry. 2008. V. 69. No. 5. P. 1197-1207.

47. Zarnowski R., Kozubek A. Alkylresorcinol homologs in Pisum sativum L. varieties // Zeitschrift fur Naturforschung. 1999. V. 54. P. 44-48.

48. Zarnowski R., Suzuki Y., Yamaguchi I., Pietr S.J. Alkylresorcinols in barley (Hordeum vulgare L. distichon) grains // Zeitschrift fur Naturforschung. 2002. V. 57. P. 57-62.

49. Zarnowski R., Suzuki Y. 5-n-Alkyresorcinols from grains of winter barley (.Hordeum vulgare L.) II Zeitschrift fur Naturforschung С. 2004. V. 59. P. 315-317.

50. Zarnowski R., Zarnowska E.D., Kozubek A. Alkylresorcinols in the family Fabaceae II Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 2001. V. 70. No. 1. P. 25-29.

51. Jin W., Zjawiony J.K. 5-alkylresorcinols from Merulius incarnates // Journal of Natural Products. 2006. V. 69. No. 4. P. 704-706.

52. Zarnowski R., Suzuki Y., Esumi Y., Pietr S.J. 5-n-Alkyresorcinols from the green microalga Apatococcus constipates // Phytochemistry. 2000. V. 55. No. 8. P. 975-977.

53. Barrow R.A., Capon R.J. Alkyl and alkenyl resorcinols from an Australian marine sponge, Haliclona sp. (Haplosclerida: Haliclonidae) // Australian Journal of Chemistry. 1991. No. 44. P. 1393-1405.

54. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова A.K., Дуда В.И. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus II Микробиология. 1983. T. 52. № l.C. 33-38.

55. Мулюкин A.JI., Демкина Е.В., Козлова А.Н., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующихбактерий как механизм регуляции их активности в почве и осадочных породах//Микробиология. 2001. Т.70. № 5. С. 620-628.

56. Мулюкин А.Л., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся клеток бактерий рода Pseudomonas // Микробиология. 2008. Т. 77. № 4. С. 512-523.

57. Маргулис А.Б., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Муфер К. Индукция гипометаболических форм у неспорообразующих грамположительных бактерий // Ученые Записки Казанского Государственного Университета. Естественные науки. 2005. Т. 147. Кн. 2. С. 108-114.

58. Горшков В.Ю., Петрова O.E., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.В., Мулюкин А.Л., Гоголев Ю.В. Образование «некультивируемых» покоящихся форм фитопатогенной энтеробактерии Envina carotovora II Микробиология. 2009. Т. 78. № 5. С. 647-655.

59. Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti Р221 под влиянием алкилоксибензола // Известия ТСХА. 2009. № 1. С. 149-154.

60. Николаев Ю:А., Мулюкин А.Л., Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 489-496.

61. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Лойко Н.Г., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующее действие микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. V. 44. № 5. Р. 571-575.

62. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Разработка способов защиты пивоваренных дрожжей от осмотического стресса // Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 3. С. 40-41.

63. Miche L., Belkin S., Rozen R., Balandreau J. Rice seedling whole exudates and extracted alkylresorcinols induce stress-response in Escherichia coli biosensors // Environmental Microbiology. 2003. V. 5. No. 5. P. 403-411.

64. Ильинская O.H., Колпаков А.И., Шмидт M.A., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия //Микробиология. 2002. Т. 71. № 1. С. 23-29.

65. Маргулис А.Б., Ильинская О.И., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г.И. Индукция SOS-ответа клетки под действием ауторегуляторных факторов микроорганизмов // Генетика. 2003. Т. 39. № 9. С. 1180-1184.

66. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Шабурова Л.Н., Кирдяшкин В.В., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Стабилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae И Хранение и переработка сельхозсырья. 2007. № 8. С. 44-46.

67. Конаныхина И.А., Шаненко Е.Ф., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Регулирующие действия микробных алкилоксибензолов различной структуры на стрессовый ответ дрожжей // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 5. С. 571-575.

68. Funabashi М., Fuña N., Horinouchi S. Phenolic lipids synthesized by type III polyketide synthase confer penicillin resistance on Streptomyces griseus II Journal of Biological Chemistry. 2008. V. 283. No. 20. P. 13983-13991.

69. Халатур П.Г. Самоорганизация полимеров // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 4. С. 36-43.

70. Kozubek A. Determination of octanol/water partition coefficients for long-chain homologsof orcinol from cereal grains // Acta Biochimica Polonica. 1995. V. 42. No: 2. P. 247-251.

71. Siwko М.Е., de Vries А.Н., Mark A.E., Kozubek A., Marrink S.J. Disturb or stabilize? A molecular dynamics study of the effects of resorcinolic lipids on phospholipid bilayers // Biophysical Journal. 2009. V. 96. P. 3140-3153.

72. Kozubek A., Demel R.A. Permeability changes of erythrocytes and liposomes by 5-(n-alk(en)yl)resorcinols from rye //Biochimica et Biophysica Acta. 1980. V. 603. P. 220-227.

73. Kozubek A. The effect of 5-(n-alk(en)yl)resorcinols on membranes. I. Characterization of the permeability increase induced by 5-(n-heptadecenyl)resorcinol // Acta Biochimica Polonica. 1987. V. 34. P. 357-367. . .!

74. Stasiuk M., Kozubek A. Modulation of hemolytic properties of resorcinolic lipids by divalent cations // Cellular and Molecular Biology Letters. 1996. V. l.P. 189-198.

75. Stasiuk M., Kozubek A. Modulation of hemolytic properties of resorcinolic lipids by divalent cations. Dependence of the effect of cations on alkylresorcinol structure // Cellular and Molecular Biology Letters. 199.7. V. 2. P. 77-87.

76. Kozubek A. Detergent-like effect of phenolic lipids on biological membranes // Acta Universitatis Wratislaviensis. 1989. V. 868. P: 27-32.

77. Kozubek A. The effect of some nonisoprenoid phenolic lipids upon biological membranes//Acta Universitatis Wratislaviensis. 1986. V. 886. P. 122.

78. Комолова Г.С., Горская И.А., Каверинская T.B., Шевелева И.Д. Влияние алкилрезорцина на дыхание, синтез нуклеиновых кислот и белка в изолированных тимоцитах И Биохимия. 1989. Т. 54. № 11. С. 1847-1851.

79. Ненашев В.А., Придачина Н.Н., Проневич JI.A., Батраков С.Г. 5-алкил(С19-С25)резорцины регуляторы окисления митохондриями сукцината и NAD-зависимых субстратов // Биохимия. 1989. V. 54. № 5. С. 784-787.

80. Ненашев Е.А., Придачина Н.Н., Эль-Регистан Г.И., Золотарева И.Н., Батраков С.Г. Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крыс // Биохимия. 1994. Т. 59. № 1. С. 1511-1515.

81. Sikorski A.F., Michalak К., Bobrowska M., Kozubek A. Interaction of spectrin with some amphipatic compounds // Studia biophysica. 1987. V. 121. P. 183-191.

82. Kieleczawa J., Szalewicz A., Kozubek A., Kulig E. Effect of resorcinols on electron transport in pea chloroplasts // Progress in Photosynthetic Research. 1987. V. 2. P. 585-587.

83. Kozubek A. Interaction of alkylresorcinols with proteins // Acta Biochimica Polonica. 1995. V. 42. P. 241-246.

84. Kozubek A., Nietubyc M., Sikorski A.F. Modulation of the activities of membrane enzymes by cereal grain resorcinolic lipids // Zeitschrift fur Naturforschung. 1992. V. 47. P. 41-46.

85. Rejman J., Kozubek A. Long-chain orcinol homologs from cereal bran are effective inhibitors of glycerophosphate dehydrogenase // Cellular and Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 411-419:

86. Rejman J., Kozubek A. Inhibitory effect of natural phenolic lipids upon NAD-dependent dehydrogenases and- on triglyceride accumulation in 3T3-L1 cells in culture // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. V. 52. P. 246-250.

87. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль-Регистан Г.И. Активация ферментного комплекса LaminexBG GlucanaseComplex в производстве пива//Пиво и напитки. 2010. № 1. С. 12-14.

88. Лысюк В.М., Шаненко Е.Ф., Гернет М.В., Эль-Регистан Г.И. Практические аспекты применения активации ферментных препаратов при получении пивного сусла // Пиво и напитки. 2010. № 2. С. 14-15.

89. Липова В.В., Шушпанова О.Н., Казацкая Ж.А., Эль-Регистан Г.И., Новиков В.В. Стабилизирующее действие алкилоксибензолов на антитела против HBs-антигена // Иммунология. 2007. № 1.С. 22-23.

90. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // EMBO Journal. 1996. V. 15. No. 23. P. 6363-6373.

91. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Влияние химических аналогов микробных ауторегуляторов на чувствительность ДНК к УФ-облучению // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 654-661.

92. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных ауторегуляторов // Микробиология. 2006. Т. 75. № 5. С. 662-669.

93. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Исследование влияния химических аналогов ауторегуляторных с1гфакторов микроорганизмов на структурные переходы ДНК методом ИК-спектроскопии //Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 306-312.

94. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 194-199.

95. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Свойства фенотипических диссоциантов бактерий Pseudomonas aurantiaca и Pseudomonas fluorescens II Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 766-776.

96. Маргулис А.Б., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Сравнительное действие гомосеринлактона и гексилрезорцина в индукции фенотипической диссоциации бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 468-471.

97. Fate G.D., Lynn D.G. Xenognosin methylation is critical in defining the chemical potential gradient that regulates the spatial distribution in Striga pathogenesis // Journal of the American Chemical Society. 1996. V. 118. P. 11369-11376.

98. Hladyszowski J., Zubik L., Kozubek A. Quantum mechanical and experimental oxidation studies of pentadecyl-resorcinol olovetol, orcinol and resorcinol // Free Radical Research. 1998. V. 28. P. 359-368.

99. Musialik M., Litwinienko G. DSC study of linolenic acid autoxidation inhibited by BHT, dehydrozingerone and olivetol // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2007. V. 88. P. 781-785.

100. Struski D.G.J., Kozubek A. Cereal grain alk(en)ylresorcinols protect lipids against ferrous ions-induced peroxidation // Zeitschrift fur Naturforschung. 1992. V. 47. P. 47-50.

101. Kozubek A., Nienartowicz B. Cereal grain resorcinolic lipids inhibit H202-induced peroxidation of biological membranes // Acta Biochimica Polonica.1995. V. 42. P. 309-316.i

102. Deszcz L., Kozubek A. Inhibition of soybean lipoxygenases by resorcinolic lipids from cereal bran // Cellular and Molecular Biology Letters. 1997. V. 2. P. 213-222.

103. Kubo I., Masuoka N., Ha T.J., Tsujimoto K. Antioxidant activity of anacardic acids //Food Chemistry. 2006. V. 99. P: 555-562.

104. Hengtrakul P., Mathias M., Lorenz K. Effects of cereal alkylresorcinols on human platelets thromboxane production // The Journal of Nutritional Biochemistry. 1991. V. 2. P. 20-24".

105. Kulawinek M., Kozubek A. 5-n-alkylresorcinols of whole graincereals and whole grain cereal products as biomarkers of healthy food // Postepy Biochemii. 2007. V. 53. No. 3. P. 287-296.

106. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Aman P. Dietary alkylresorcinols: absorption, bioactivities, and possible use as biomarkers of whole-grain wheat- and rye-rich foods //Nutrition-Reviews. 2004. V. 62. No. 3. P. 81-95.

107. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Lundin E.A., Zhang J.-X., Hallmans G., Aman P. Cereal alkylresorcinols are absorbed by humans // The Journal of Nutrition. 2003. V. 133. P. 2222-2224.

108. Chen Y., Ross A.B., Aman P., Kamal-Eldin A. Alkylresorcinols asimarkers of whole grain wheat and rye in cereal products // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. V. 52. P. 8242-8246.

109. Montonen J., Landberg R., Kamal-Eldin A., Aman P., Knueppel S., Boeing H., Pischon T. Reliability of fasting plasma alkylresorcinol concentrations measured 4 months apart // European Journal of Clinical Nutrition. 2010. V. 64. No. 7. P. 698-703.

110. Landberg R., Kamal-Eldin A., Aman P., Christensen J., Overvad K., Tjonneland A., Olsen A. Determinants of plasmaalkylresorcinol concentration in Danish post-menopausal women // European Journal of Clinical Nutrition. 2011. V. 65. No. l.P. 94-101.

111. Linko A.M., Parikka K., Wahala K., Adlercreutz H. Gasichromatographic mass spectrometric method for the determination of alkylresorcinols in human plasma // Analytical Biochemistry. 2002. V. 308. No. 2. P. 307-313.

112. Ross A.B., Eman P., Andersson R., Kamal-Eldin A. Chromatographic analysis of alkylresorcinols and their metabolites // Journal of Chromatography A. 2004. V. 1054. P. 157-164.

113. Linko A.M., Ross A.B., Kamal-Eldin A., Serena A., Bjornbak Kjaer A.K., Jorgensen H., Penalvo J.L., Adlercreutz H., Eman P, Knudsen K.E.B.

114. Kinetics of the appearance of cereal alkylresorcinols in pig plasma // British Journal of Nutrition. 2006. V. 95. P. 282-287.

115. Koskela A., Linko-Parvinen A.-M., Hiisivuori P., Samaletdin A., Kamal-Eldin A., Tikkanen M.J., Adlercreutz H. Quantification of alkylresorcinol metabolites in urine by HPLC with coulometric electrode array detection // Clinical

116. Chemistry. 2007. V. 53. No. 7. P. 1380-1383.i

117. Ross A.B., Eman P., Kamal-Eldin A. Identification of cereal alkylresorcinol metabolites in human urine — potential biomarkers of wholegrain wheat and rye intake // Journal of Chromatography B. 2004. V. 809. P. 125-130.

118. Jansson E., Landberg R:, Kamal-Eldin A., Wolk A., Vessby B., Aman P. Presence of alkylresorcinols, potential whole-grain biomarkers, in human adipose tissue // British Journal of Nutrition. 2010. V. 104. No. 5. P. 633-636.

119. Arisawa M., Ohmura K., Kobayashi A., Morita N. A cytotoxic constituent of Lysimachia japónica Thrunb. (Primulaceae) and the structure-activity relationships of related compounds // Chemical and Pharmaceutical

120. Bulletin. 1989. V. 37. P. 2431.

121. Filip P., Anke T., Sterner O. 5-(20-oxoheptadecyl)-resorcinols and 5-(20-oxononadecyl)-resorcinol, cytotoxic metabolites from a wood-inhabiting Basidiomycete II Zeitschrift fur Naturforschung. 2002. V. 57. P. 1004-1008.

122. Tamai H., Yamane T., Tasaka K. Anticancer agents containing 4-alkylresorcinols. Patent Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P.02.292.213, 1990.

123. Gosteli J. Antimicrobial resorcinols. Ger. Offen. 2.359.410, 1974.

124. Katsuta T. Oral bactericidial compositions containing phenols. Patent Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P. 02.255.609, 1990.

125. Uchida H. 2-Alkylresorcinols. Jpn. Kokai Tokkyo Koho J.P. 60.139.637, 1985.

126. Kozubek A., Gubernator J., Przeworska E., Stasiuk M. Liposomal drug delivery, a novel approach: PLARosomes // Acta Biochica Polonica. 2000. V. 47. No. 3.P 639-649.

127. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies with crystalline papain // Biochemical Journal. 1959. V. 73. P. 119-126.

128. Wasserman R.L., Capra J.D. Immunoglobulins. In: The Glycoconjugates, edited by M.I. Horowitz and W. Pigman. Academic Press, New York. 1977. P. 323-348.

129. Hilschmann N., Craig L.C. Amino acid sequence studies with Bence Jones proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1965. V. 53. P. 1403-1409.

130. Edmundson A.B., Ely K.R., Abola E.E., Schiffer M., Panagiotopoulos N. Rotational allomerism and divergent evolution of domains in immunoglobulin light chains // Biochemistry. 1975. V. 14. P. 3953-3961.

131. Capra J.D., Kehoe J.M. Hypervariable regions, idiotypy and the antibody combining site // Advances in Immunology. 1975. V. 20. P. 1-40.

132. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / Под ред. члена-кореспондента РАН, проф. Е.С. Северина, проф. А.Я. Николаева. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. 448 с.

133. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. / М.: Мир, 2000.-592 с.

134. Иммунология: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987-1989. 360 с.

135. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер с англ. / Под ред. Д. Кэтти. М.:.Мир, 1991.- 287 с.

136. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998.-479 с.

137. Method of stabilizing antibody and stabilized solution-type antibody preparation. US 0020255, 2007.

138. Stabilized aqueous composition containing antibodies. US 5237054,1993.

139. Stabilization of antibodies. US 4902500, 1990.

140. Monoclonal antibody stabilization. US 4650772, 1987.

141. Process for modifying the stability of antibodies. US 6262238, 2001.

142. Самуилов В.Д. Иммуноферментный анализ // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 12. С. 9-15.

143. Rezus Y.L.A., Bakker H.J. Effect of urea on the structural adynamics of water // PNAS. 2006. V. 103 . No. 49. P. 18417-18420.

144. Wetlaufer D.B., Malik S.K., Stoller L., Coffin R.L. Nonpolar group participation in the derlaturation of proteins by urea and guanidinium salts. Model compound studies // Journal of the American Chemical Society. 1964. V. 86. P. 508-514.

145. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. Пер. с англ. Тарасов А.П. М.: Медицина, 1987. 472 с.

146. Кэбот Е., Мейер М. Экспериментальная иммунохимия. М.: Мир, 1968.-684 с.

147. Бриттон Г. Биохимия природных пигментов: Пер. с англ. М.: Мир, 1986.-422 с.

148. Брудастов Ю.А. Определение антикомплементарной активности бактерий по кинетике иммунного гемолиза // Вестник ОГУ. 2005. № 12. С. 51-54.

149. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. ВУЗов. М.: Высшая школа, 1990. — 352 с.I

150. Linko A.M., Adlercreutz Н. Whole-grain rye and wheat alkylresorcinols are incorporated into human erythrocyte membranes // British Journal of Nutrition. 2005. V. 93. № 1. P. 10-13.

151. Vagel A., Roo E. Alkylresorcinols — rare chemicals available in bulk // Innovations in Pharmaceutical Technology. 2004. P. 94-95.

152. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. М.: Медицина, 1998. 7041 с.

153. Stabilization of immunoglobulins at low pH. United States Patent 7220409, 2001.

154. Литвинов M. Малые молекулы организмов // Химия и жизнь 21 век. С. 23-26.

155. Zarnowski R., Kozubek A., Pietr S.J. Effect of rye5.n-alkylresorcinols on in vitro growth of phytopathogenic Fusarium andi

156. Rhizoctonia fungi // Bulletin of the Polish. Academy of Sciences. Biological Sciences. 1999. V. 47. No. 2-4. P. 231-235.

157. Gasiorowski K., Szyba K., Brokos В., Kozubek A. Antimutagenic activity of alkylresorcinols from cereal grains // Cancer Letter. 1996. V. 106. P. 109-115.

158. Hooi D.S.W., Bycroft B.W., Chhabra S.R., Williams P., Pritchard D.I. Differential immune modulatory activity of Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing signal molecules // Infection and Immunity. 2004. V. 72. No. 11. P. 6463-6470.