Ультраструктурные основы трансэпителиальной проницаемости: Транцеллюлярный и парацеллюлярный транспорт веществ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук в форме науч. докл. Снигиревская, Екатерина Сергеевна

• Снигиревская, Екатерина Сергеевна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1997

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Снигиревская, Екатерина Сергеевна

1.1 Актуальность проблемы

Эпителии представляют собой наиболее ярко выраженный тип тканей, сформированных полярными клетками. Выстилая полости всех внутренних органов и механически защищая их, эпителии регулируют гомеостаз ионов, неэлектролитов и воды в разных компартментах организма и участвуют в продукции экстрацеллюлярных компонентов тканей. Проблема трансэпителиальной проницаемости является одной из центральных фундаментальных проблем клеточной биологии. Несмотря на то что процессы транспорта веществ через различные эпителии исследуются уже со второй половины XIX столетия, до сих пор в этой проблеме остается много спорных вопросов, решение которых важно не только для фундаментальной науки, но и для ряда медицинских проблем. Для объяснения механизмов транспорта питательных веществ, воды и ионов в желудочно-кишечном тракте и в осморегулирующих органах млекопитающих предлагались альтернативные точки зрения (трансцеллюлярный пли парацеллюлярный путь транспорта), поочередно доминирующие в литературе в зависимости от получения новых фактов.

Большой прогресс в понимании путей и механизмов трансэпителиального транспорта был сделан за последние 30 лет. Сочетание современнных физиологических и морфологических подходов позволило до некоторой степени приблизиться к разрешению ряда вопросов. Так, были открыты явления рецептор-опосредованного эндоцитоза для поглощения макромолекулярных питательных веществ (Goldstein et al., 1985); примембранного пищеварения в тонкой кишке млекопитающих (Уголев, 1962); расшифрованы на биохимическом уровне механизмы регуляции вазопрессином транспорта воды в плотных эпителиях (см. Иванова, Наточин, 1987); открыто явление межклеточной коммуникации (Loevvenstein, Kanno, 1964); обнаружены белки водных каналов - аквапорины (Agre et al., 1993) и каналов, осуществляющих межклеточный обмен ионами и метаболитами - коннексины (Goodenough, Musil, 1993). Однако, многие вопросы о морфологических путях транспорта веществ через эпителии еще ждут своего разрешения.

Экспериментальная стимуляция транспорта веществ через различные кани дает возможность изучать процессы, связанные с поглощением и переносом веществ через клетку, такие, как рецепция лиганда, проведение •.•-папа через плазматическую мембрану и через клетку, ответ клетки на i физиологические воздействия. Эксперименты, позволяющие дозировать i нагрузку и количественно регистрировать всасывание и транспорт расследуемых веществ, обеспечивает проведение структурных исследований |в строго определенных физиологических условиях.

В настоящее время в мире существует всего несколько исследовательских групп, занимающихся структурно-функциональным анализом транспортирующих эпителиев ( группа проф. Бурге во Франции, группы проф. Хепса, проф. Венда и проф. Панпенгеймера в Америке). Каждая из этих групп занимается изучением одного типа эпителия с применением одного-двух методов элекгронной микроскопии. В связи с этим представляется актуальным комплексный подход к изучению проблемы проницаемости эпителиев с использованием разных объектов исследования и широкого спектра многообразных структурных методов.

1.2. Цель и задачи исследовании

Целью настоящей работы было выявление путей транспорта различных веществ (мало- и крупномолекулярных питательных веществ, изотонической жидкости, воды) через разные типы эпителиев (проницаемые и плотные), клеточные культуры , ооциты насекомых, клетки простейших.

Для решения проблемы трапеэпителнальной проницаемости был поставлен ряд задач:

1) изучить роль апикальной мембраны полярных эпителиальных клеток и плазматической мембраны одиночных клеток - ооцитов при стимуляции транспортных процессов;

2) оценить вклад межклеточных контактов в транспорт веществ между соседними клет ками и через эпителиальные слои;

3) исследовать участие внутриклеточных органелл - элементов цитоскелета и вакуолярной системы клеток в трансцеллюлярном транспорте веществ;

4) проследить судьбу комплекса лиганд-рецептор в процессе вителлогенеза ооцита комара.

1.3. Научная новизна работы

Впервые проведено сравнительное исследование апикальных мембран двух типов эпителия: проницаемого - тонкой кишки крыс и плотного - мочевого пузыря лягушки и установлены существенные различия в их струкгурной организации.

Получены абсолютно новые данные о возможности стимуляции водных потоков в плотном эпителии мочевого пузыря лягушки не только антидиуретическим гормоном, но и отмывкой из эпителия физиологически активных веществ липидной природы, аутакоидов, способствующих сохранению низкого уровня водной проницаемости мочевого пузыря в норме. При стимуляции водного транспорта обоими способами обнаружены одни и те же изменения апикальной мембраны, свидетельствующие о встраивании в неё доменов с высокой водной проницаемостью.

Получена новая информация о перераспределении мембранных белков апикальной мембраны полярных клеток проницаемого и плотного эпителиев при стимуляции транспортных процессов через эпителии.

Впервые на электронномикроскопическом уровне полностью прослежена судьба комплекса лиганд-рецепгор при поглощении питательных веществ развивающимися ооштгами комара, в частности, продемонстрированы процессы диссоциации рецептора и лиганда и возвращение рецептора в плазматическую мембрану ооцита.

Параллельные морфологические и физиологические исследования явления межклеточной коммуникации позволили обнаружить увеличение количества щелевых контактов при индукции межклеточной связи в клеточных культурах и наличие их в смешанном сенсомоторном синапсе лягушки.

Впервые на объекте, обладающем лишь одним типом специализированных межклеточных контактов, сизигии грегарин, показано, что септировапный контакт не участвует в межклеточной связи, а играет адгезионную роль.

1.4. Научно-практическое значение работы

Полученные в настоящей работе данные по структуре клеточных мембран, специализированных межклеточных контактов и внутриклеточных органелл в условиях всасывания и транспорта различных веществ разными типами клеток вносят существенный вклад в решение фундаментальной проблемы клеточной биологии - трансэлителиальной проницаемости. Обнаруженные изменения ультраструктуры исследуемых клеток дают новый уникальный материал для вскрытия механизмов трансмембранной, трансцеллюлярной и межклеточной проницаемости.

Наряду с общебиологическим значением представленные результаты могут быть использованы в учебных целях и в медицине при исследовании функциональных нарушений проницаемости пищеварительных и осморегулирующих органов. Известно, что в основе многих патологических изменений функций органов лежат нарушения в клеточном ответе на регуляторные факторы, выражающиеся в изменениях ул ьт ра стру к I-)' р ы к л сто к.

Изучение особенностей развития ооцитов комара открывает новые возможности для разработки биологических методов борьбы с комарами, являющимися переносчиками ряда заболеваний, на ранних стадиях их развития.

1.5. Положения, выносимые на защит}'

1) Проведенный в работе сравнительный анализ изменений ультраструюуры основных барьеров проницаемости эпителиев: апикальной мембраны и плотных контактов позволил высказать предположение о том, что основной путь транспорта веществ через проницаемые и плотные эпителии - трансцеллюлярный, а вклад парацеллюлярного пути очень мал.

2) В работе высказано предположение об участии аппарата Гольджи в регуляции клеточного объема при транспорте изотонической жидкости и воды через проницаемые и плотные эпителии.

3) Постулируется участие специфических гранул эпителиальных клеток, формирующихся в аппарате Гольджи во встраивании белков водных каналов в апикальную мембрану.

4) Отмечается существенная роль микрофиламентов и микротрубочек в ответе клеток плотного эпителия на гидроосмотическое действие гормона.

5) В работе оценивается участие межклеточного пространства в транспорте изотонической жидкости и воды в проницаемых и плотных эпителиях - минимальная проницаемость зоны плотных контактов и проведение потоков жидкости в кровь по латеральным межклеточным щелям;

6) Анализируются особенности рецептор-опосредованного эндоцитоза в ооцитах комаров: иитернализация комплексов лиганд-рецептор через окаймленные ямки, диссоциация комплексов при переходе ранних эндосом и поздние, возвращение рецептора в плазматическую мембрану, накопление лиганда в желточных телах.

7) Обсуждается корреляция между количеством щелевых контактов и степенью связанности клеток.

8) Функция септированного контакта ограничивается участием в адгезии клеток.

1.6. Апробация работы

Материалы работы доложены или представлены на VIII- XVI Всесоюзных (Российских) конференциях по Электронной Микроскопии (1971, 1976,1982, 1988, 1992, 1996), съездах АГЭ (1972, 1981) ; на ХШ Междунар. Копф. по Электронной Микроскопии (Париж, 1994); на VI и VIII конф. по "Водно-солевому обмену и функции почек" (1981, 1990); на Всесоюзных съездах протозоологов (1976), физиологов (1983); на Междунар. Конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (1988); Междунар. Симп. "Межклеточная коммуникация» (1994); на научных семинарах в Сиенском Университете (Италия, 1991), Бернском Университете (Швейцария, 1991), на 4-х семинарах в Мичиганском Университете (США, 1994,1996); доклады на семинарах Института цитологии.

1.7. Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 46 статей, в том числе 2 обзора,

глава в монографии Комиссарчика Я.10. и Миронова А.А. «Электронная микроскопия клеток и тканей: замораживание-скалывание-травление», 1992,

глава в атласе «Microscopic Anatomy of Invertebrates» и около 30 тезисов.

2. Материал и методы

В настоящей работе представлен анализ изменений ультраструктуры клеток двух типов эпителиев при различных физиологических воздействиях: проницаемого эпителия тонкой кишки крысы и плотного эпителия мочевого пузыря лягушки. Морфологические особенности поглощения макромолекулярных питательных веществ исследовались на ооцптах комара, межклеточной коммуникации на клеточных культурах (L и FBT), сенсомоторном синапсе спинного мозга лягушки и двухклеточной стадии жизненного цикла простейших грегарин - сизигии.

Наряду со стандартными методами электронной микроскопии в настоящей работе были использованы следующие методы ультраструктурного анализа: замораживание-скалывание, замораживание-замещение, замораживание-высушивание, низко-температурная заливка в акриловые смолы, иммунная электронная микроскопия на срезах материала, залитого в различные смолы (postembedding) и на ультратонких замороженных срезах, рентгеноспектральный анализ.

Ультратонкие срезы и реплики, полученные методом замораживания-скалывания просматривались в просвечивающих электронных микроскопах JEM-7, JEM-100U, JEM-100C; JEM-100CX, Pliilips-CMIO; поверхность клеток изучалась в сканирующем микроскопе JSM-35; для рентгеновского микроанализа использовался сканирующий электронный микроскоп JSM-U3.

Описание использованных физиологических методов приводится а разделах соотвествующих глав "Постановка экспериментов". 2.(.Стандартные методы элсктроппомнкросгсопнческого исследования применялись для изучения особенностей морфологии клеток и тканей. Они включали в себя фиксацию материала 2,5% раствором глютар-альдегида, постфиксацию 1% раствором OsO^, дегидратацию в спиртах повышающейся концентрации и заливку в эпоксидные смолы.

В настоящей работе для приготовления фиксаторов использовались веронал-ацетатный, какодилатный и фосфатный буферы с рН - 7,2-7,4 и тоничностыо, соответствующей осмоляльности интерстициальной жидкости исследуемых объектов. Фиксация быстро вырезанного кусочка ткани анестезированного животного производилась при комнатной температуре (К Г), сначала глютар-альдегидом и течение 40 мин-1 ч, потом OsO.1 - в течение 1 ч. После продолжительной дегидратации (1,5-2 ч) и пропитки в заливочной среде материал заливался в Аралдит, Эпон, смесь Аралдита с Эпопом или LR-White. Полимеризация эпоксидных и акриловых смол осуществлялась в термостате при + 58-60°С в течение 2-х суток. Ультрагонкие срезы материала, залитого в смолы, приготавливались на ультрамикротомах LKB 8800 и Reihert-Jimg стеклянными и алмазными ножами. Срезы из эпоксидных смол окрашивались сначала спиртовым раствором уранил-ацетата (¡0 мин), затем цитратом свинца по Рейнолдсу (5 мин). Срезы материала, залитого в акриловые смолы, окрашивались водным раствором уранил-ацетата (5 мин) и цитратом свинца (1-2 мин).

2.2. Криометоды. В связи со сходством ряда процедур все использованные в работе низкотемпературные методы объединены в группу криометодов.

2.2.1. Замороженные ультра топкие срезы использовались для целей иммуно-локализашш клеточных белков. Перед криофиксацией делалась предварительная префиксация материала 2% раствором формальдегида с добавлением 0,05% глготар-альдегида в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Для предотвращения образования кристаллов льда в клетках объекты пропитывались растворами сахарозы повышающейся концентрации (0,5, 1,5, 2,3 M сахарозы) при +4°С на мешалке в течение суток. Криофиксация осуществлялась самым простым способом -быстрым погружением кусочков материала, закрепленных на держателях, в пропан, охлажденный до температуры -190°С жидким азотом. Образцы могут храниться в жидком азоте в течение нескольких месяцев. Замороженные срезы приготавливались сухими стеклянными ножами при -90°С по методу Tokuyasu, 1986. Оптимальный угол наклона ножа 6°, оптимальная скорость резки 2 мм/сек. Перед резкой замороженный объект с держателем затачивался в камере микротома охлажденным металлическим стержнем. Срезы с сухой поверхности ножа снимались тонкой металлической петлей (диаметр - 2мм), содержащей каплю 2,ЗМ сахарозы, и монтировались на покрытую пленкой никелевую сеточку. Сетки со срезами помещались на поверхность 2% желатины, залитой в чашку Петри, и хранлись в холодильнике. Перед проведением иммуноцитохимической реакции сахароза отмывалась инкубацией срезов в ФБ при КТ. Контрастирование замороженных срезов отличается от такового срезов смолы. Их окрашивание производилось в два этапа: 1) 1 ч в нейтральном 2% растворе уранил-ацетата, содержащем 0,15 M оксалата калия (рН 7,2 доводится 10% аммиаком), 2) срезы промывались водой и переносятся в 2% кислый уранил-ацетат (рН 5,8), содержащий 1,8% метил-целлюлозу.

2.2.2. Метол замораживания-замещения, сочетающий криофиксациго материала и его заливку в смолы, способствует хорошей сохранности как ультраструктуры клеток, так и антигенных свойств его химических компонентов. В качестве криофиксации в настоящей работе была использована методика быстрого замораживания объекта на охлажденном металлическом блоке (зеркале). Объекты могут храниться в жидком азоте длительное время. При таком способе замораживания 5-10 мкм поверхности ткани, контактирующей с зеркалом, практически не содержат видимых в электронном микроскопе кристаллов льда. После криофиксации производилось замещение верифицированной воды раствором ацетона, содержащем OsOA при -95°С в течение 3-х дней. Затем ткань медленно согревали до комнатной температуры (КТ) и заливали в одну из смол.

2.2.3. Метод замораживания-скалывания. Для предотвращения образования в ткани кристаллов льда мы использовали предварительную химическую фиксацию объекта пногар-альдегидом и его пропитку 25% глицерином. Объект замораживался в золотом держателе, после чего помещался в установку с высоким вакуумом, где раскалывался при температуре -150°С и напылялся углем и платиной. Все эти процедуры проводятся в высоком вакууме при температуре жидкого азота. После растворения ткани гипохлоридом калия реплики исследовались в просвечивающем электронном микроскопе. Для обозначения поверхностей скола использовалась номенклатура, предложенная Брайтоном (Branton, 1978).

2.2.4. Для сканирующего электронного микроскопа объекты замораживались одним из упомянутых методов и затем высушивались методом замораживания-высушивания, который по нашим и литературным данным имеет преимущество перед методом критической точки. Замораживание-высушивание проводилось в специальной установке, разработанной в нашей лаборатории. Высушенные объекты перед просмотром напылялись золотом для снятия заряда.

2.2.5. Рет гено-снектральпын анализ элементного состава клеток проводился на полутопких (1-2 мкм) замороженных срезах, приготовленных на криомикротоме Porter-Blum при -40°С. Срезы просматривались в сканирующем электронном микроскопе-микроанализаторе JSM-U3 (Япония). Разрешение метода составляет 1 мкм при диаметре электронного пучка 0,1 мкм. Ускоряющее напряжение составляло 10 и 25 кВ, ток не превышал 20 нА. В эксперименте регистрировалось наиболее интенсивная «„-линия характеристического рентгеновского спектра исследуемых элементов. В работе в основном изучалось содержание калия в клетках и внутриклеточных вакуолях.

2.3. Пммуннаи электрошпш микроскопий) была применена для определения локализации белкой в изучаемых объектах. Сохранение антигенных свойств белков и ультраструктуры клетки обеспечивалось соблюдением следующих условий препарирования образца: ]) использование "щадящего" фосфатного буфера (ФБ) для приготовления фиксаторов и растворов для дальнейшей обработки материала; 2) фиксация быстро проникающим в биологические ткани 2-4% формальдегидом с добавлением небольших концентраций ппотар-альдегпда (0,1-0,5%), способствующею лучшей сохранности ультраструктуры клеток; 3) блокирование остаточных альдегидных групп глютар-альдегида 0,05 М раствором глицина в ФБ или 1% водным раствором борогидрида натрия; 4) исключение осмиевой постфиксации, так как осмий, связываясь с белками, делает многие антигенные детерминанты недоступными для реакции с антителами; 5) кратковременная (30-40 мин) дегидратация объектов, исключающая абсолютный спирт; 6) пропитка смолой Ь11-\>Л1Пе при комнатной температуре, пропитка Ловикрилом при -28—30°С; 7) температура полимеризации смол должна быть ниже +60°С. Для заливки объектов для иммунной электронной микроскопии использовали гидрофильные акриловые смолы, полимеризующиеся как при низких температурах (-20— 30°С) под УФ (ЬК-вои, 11шсгу1, 1оичсгу1 К4М), так и при +52 - 55°С (1Л1-\Vhite).

В настоящей работе методами иммунной электронной микроскопии идентифицировались следующие белки: тубулин, актин, кератин, виментин, минорные желточные белки комара (вителлогенин, белок 44 КР, вителлогенная карбоксипептидаза -УСР), клатрин. Был использован метод непрямого мечения антигенов коллоидным золотом на ультратонких срезах материала, залитого в акриловые смолы (роБ1етЬес}с1ищ), и на ультратонких замороженных срезах. Для иммунолокализации белков цитоскелета были использованы фирменные антитела (АТ) (АтегэЬат, Ро1узс1епсе), а также АТ к специфическим желточным белкам и клатрину ооцитов комара, полученные в лаб. молекулярной биологии насекомых Мичиганского Университета (США).

2.3.1. I (ммуноннтохнмнческие реакции на ультратонких срезах материала, залитого в смолы и на замороженных срезах проводилось одинаково (ЯоН!, 1982). Прежде всего срезы инкубировались в растворе 1% бычьего альбумина в ФБ в течение 15-20 мин для уменьшения неспецифического связывания антител. Затем срезы инкубировались в первичных АТ с различным разведением (от 10 доЮОО раз) в течение 1-2 ч при КТ или в течение ночи при +4°С. Срезы промывались в ФБ, содержащем 0,05% детергента Т\уееп-20, и помещались на каплю конъюгата вторых А'Г или протеина А с золотом (разбавление от 3 до раз). Через 40-60 мин срезы тщательно промывались в ФБ и дистиллированной воде и замороженные срезы фиксировались в 1% водном растворе глюгар-альдегида. В том случае, когда определялась колокализация двух белков, применялся метод двойного мечения на двух сторонах среза, смонтированного на сетку без пленки подложки (Вепс1ауап, 1985). Использовалось два контроля: первые АТ замещались соответствующей неиммунной сывороткой или опускались.

Механизм непрямой иммунной реакции на ультратонком срезе, проиллюстрированный на рис. 1, заключается во взаимодействии специфических АТ с изучаемым антигеном на поверхности среза. Антитело связывается с антигенной детерминантой своим АВ-сайтом, в то время как С-фрагмент связывается со вторичными АТ: или молекулами белка А, коныогированными с коллоидным золотом. Электронноплотные частицы золота, таким образом, определяют локализацию данного антигена.

Рис. 1. Схема метода иммуноцитохпмпческон реакции на ультратонком срезе (р051етЬес1с]]|щ). А - метод двойной метки для определения колокализации двух антнгенов на разных сторонах среза (по Вепс^ап, 1989). На стороне «а» проводится реакция на один антиген (I) с помощью соответствующих антител. АВ-фрагмент антитела связывается с соответствующей детерминантой антигена. Комплекс антиген-антитело выявляется при взаимодействии его с конъюгатом вторых антител или белка А с коллоидным золотом (непрямой метод) с определенным размером частиц золота. На стороне «б» для определения локализации другого антигена (2) используются другие антитела и другой конъюгат с другим размером золотых частиц. Б - метод усиления интенсивности метки одного и того же антигена с использованием одних и тех же антител и одного и того же размера золотых частиц.

Чувствительность этого метода в значительной степени зависит от природы антигена и его сохранности во время электронномикроскопической обработ ки, а также от специфики используемых АТ. В тех случаях, когда иммунный ответ очень слаб, используются методы его амплификации. В настоящей работе был предложен метод амплификации иммунного сигнала для определения локализации белков в ооцитах комара (Рис. 1). Метод основан на принципе двойной метки, предложенном Вепс!ауап (1985) для локализации двух разных антигенов на двух сторонах среза. Для усиления интенсивности метки в настоящей работе также метились обе стороны среза, но не разными АТ, как при двойном мечении, а одними и теми же и затем коныогатом белка А с одним и тем же размером частиц коллоидного золота. Соответственно это увеличивало интенсивность золотой метки в два раза. Особенно этот метод пригоден для иммунолокализации белков в мелких компартментах, сечения которых находятся лишь на одной из поверхностей среза. Такое двойное мечение одного антигена может быть осуществлено простым погружением срезов, смонтированных на сетку без пленки подложки, в каплю с соответствующими реагентами.

3. Барьерная роль транспортирующих эпителиев в диффузии веществ между внешней средой и пптерстпцпалыюн жидкостью.

Физиологическими методами показано, что эпителиальные слои разных органов отличаются своей проницаемостью (Diamond, 1978). Различают эпителии с высокой и низкой трансэпителиальной проницаемостью, так называемые проницаемые (leaky) и плотные (tight) эпителии. Проницаемые эпителии характеризуются относительно низким электрическим сопротивлением, от 5 до 300 ом/см2, и участием в трансэпителиальном изотоническом транспорте жидкости. Для плотных эпителиев характерно высокое трансэпителиальное сопротивление, от 300 до 80000 ом/см2. Они ограничивают протоки с гипо- или гипертоническим содержимым и участвуют в гипертонической секреции или абсорбции, которые регулируются стероидными и пептидными гормонами (Sonsa, 1985).

Основными барьерами проницаемости эпителиальных пластов являются апикальные мембраны клеток и плотные контакты. Показано, что специализированные плотные контакты в значительной степени определяют функции эпителиев. Наряду с тем, что они осуществляют физическое сцепление клеток, они создают барьер для движения молекул и ионов по межклеточному пространству. В последние годы стало ясно, что плотный контакт не абсолютная пробка, а что он содержит селективные поры, определяющие проницаемость различных проницаемых эпителиев. Важной функцией плотных контактов является также ограничение латеральной диффузии мембранных белков апикального и базолатерального доменов плазматической мембраны (Staehelin, 1974). Различный белковый состав этих мембранных доменов представляет собой неотъемлемое свойство полярных эпителиальных клеток. Полярные свойства эпителиалных клеток, в свою очередь, способствуют созданию векторных путей транспорта поглощаемых веществ - от апикальной поверхности к базолатеральной (абсорбция) или в обратном направлении (секреция).

В настоящем разделе будут рассмотрены изменения ультраструктуры эпителиальных клеток тонкой кишки крысы и мочевого пузыря лягушки при стимуляции процессов абсорбции.

3.1. Морфологические изменения проницаемых эпителиев при различных физиологических нагрузках

Характерной морфологической особенностью транспортных эпителиев является их полярность, выражающаяся в наличии щеточной каймы на апикальной и иптердигитаций на базолатеральной поверхностях клеток. Целостность эпителиального слоя поддерживается апикальным соединительным комплексом, состоящим из трех типов специализированных межклеточных контактов: плотный, промежуточный и десмосома. Плотный контакт запечатывает межклеточное пространство, препятствуя диффузии веществ по межклеточному пространству. Непроницаемость зоны плотного контакта в желчных капиллярах для неэлектролитов и белковых молекул имеет, в частности, решающее значение для нормального функционирования печени. Плотный контакт разделяет пространство Диссе и желчных протоков, не позволяя проникать желчи в кровь (Easter et al., 1983).

Несмотря на интенсивные исследования функциональных характеристик проницаемых эпителиев, участвующих в изотоническом транспорте жидкости, до сих пор не существует единого мнения о путях транспортирующейся через них жидкости. Известно, что глюкоза всасывается клетками кишечника с помощью специфических белков -переносчиков. Этот перепое глюкозы сопряжен с транспортом ионов Na+. Многочисленными физиологическими исследованиями показано, что в проницаемых эпителиях с входом глюкозы и натрия сопряжен также транспорт воды в клетку (см. обзор Zeuhten, 1995). Разделить эти потоки экспериментально невозможно, поэтому, анализируя структурные корреляты всасывания глюкозы, мы фактически изучаем изменения ультраструктуры энтероцитов при изотоническом транспорте жидкости через проницаемый эпителий.

Наиболее активное всасывание глюкозы и аминокислот происходит в эпителии проксимального отдела тонкой кишки, выстланного однослойным цилиндрическим эпителием (Madara, Trier, 1987). Согласно распространенной в настоящее время точке зрения, основанной на морфо-функциональном изучении процессов всасывания глюкозы в тонкой кишке крыс (Madara, Pappenheimer, 1987; Pappenheimer, 1990,1993), основным путем транспорта глюкозы через эпителий является парацеллюлярный путь. Паппенгеймер с соавт. наблюдали раскрытие плотных контактов (образование блистеров) и расширение межклеточных щелей при нагрузке выделенных участков тонкой кишки глюкозой и аминокислотами.

Следует отметить, что в литературе практически отсутствуют данные об изменении структурной организации апикальных мембран энтероцитов при поглощении нутриентов. Кроме того, нет работ, посвященных сравнительному изучению морфологических особенностей аппарата Гольджи в разных типах эпителиев и его поведению в условиях стимуляции транспорта различных веществ.

Целью настоящего раздела работы было изучение морфо-функциональных характеристик апикальной мембраны, плотного контакта и внутриклеточных структур двух проницаемых эпителиев: желчных капилляров печени и тонкой кишки крысы в разных экспериментальных условиях.

3.1.1. Постановка 'экспериментов

1. На печени белых лабораторных крыс изучалась роль ионов кальция в функциональной и структурной целостности плотного контакта. Сравнивалась ультраструктура клеточных контактов при короткой перфузии, 15 мин, и длительной перфузии, 1,5 час, раствором Рингера для теплокровных и бескальциевым раствором Рингера, содержащим 1 мМ ЭДТА. Подогретый до 38°С раствор Рингера вводился в печень наркотизированной крысы через портальную вену. Для выявления межклеточных щелей и межклеточных контактов использовалась электронно-плотная метка, хлористый лантан.

После перфузии печени нормальным или бескальциевым физиологическим раствором производилась перфузия физиологическим раствором, содержащим 0,3% LaCb в течение 3-5 мин, затем - глютар-альдегидом с такой же концентрацией хлористого лантана (Revel, Kaniovsky, 1967). Через 5 мин физиологический раствор заменялся фиксатором. Перфузия фиксатором производилась в течение 40 мин при комнатной температуре, после чего вырезанные кусочки ткани подвергались дальнейшей обработке для электронномикроскопического исследования.

2. Для острых и хронических опытов на тонкой кишке использовались крысы самцы линии Вистар. Хирургическая операция, заключающаяся в изоляции петель тонкой кишки, производилась на наркотизированных крысах (Уголев, Зарипов, 1979). В оба конца изолированной петли вводились фистульные трубки, которые выводились наружу. В течение эксперимента температура тела животных поддерживалась при 37°С. В дни отсутствия экспериментов для поддержания функционального состояния слизистой оболочки и замедления процесса её атрофии изолированный участок тонкой кишки перфузировался раствором глюкозы (25 мМ) в течение 1 час. В хроническом эксперименте нутриенты вводились в петли через 6-7 дней после операции. В остром эксперименте петли сразу же загружались нутриентами и для морфологического исследования материал брался через 20-25 мин.

В опытах с нагрузкой кишки нутриентами изолированные петли проксимального отдела тонкой кишки, длиной 3-5 см, загружались следующими субстратами: 1)10 мМ -75 мМ раствор глюкозы; 2) раствор Рингера с пониженной концентрацией NaCl.;

3) 10 мМ раствор глицина; 4) 0,5% эмульсия триолеина. Все растворы имели рН 7,4 и были изоосмотичны стандартному раствору Рингера. Одну из петель использовали как контрольную. Все субстраты готовили на растворе Рингера с пониженной концентрацией NaCl (120 мМ) для того, чтобы при наивысшей из используемых концентраций глюкозы (75 мМ) осмошчносп. перфузионного раствора была близка к осмотичности стандартного раствора Рингера. Для сохранения изоосмотичности исходных перфузионных растворов при более низких концентрациях субстрата (12,5-50 мМ) в них добавляли соответствующее количество маннита. Для приготовления эмульсии триолеина использовали 5% раствор гуммиарабика на растворе Рингера.

После предварительной 15-минутной перфузии субстратом данной концентрации отбирали последовательно 3 пробы (в течение 5 мин каждую) для последующего биохимического анализа.

Концентрацию глюкозы в пробах определяли глюкозооксидазным методом, а сумму концентраций глюкозы в мМ - антроновым методом (Уголев и др., 1986).

Для электронномикроскопического анализа из середины каждого изолированного участка тонокй кишки вырезались кусочки длиной 5-7 мм. 3.1.2. Барьсриан роль плотных контактов в печени крысы

Электронномикроскопическое изучение печени крыс стандартными методами позволяет выявить все известные для этой железы элементы, включая желчные капилляры. Просветы капилляров отделены от межклеточных пространств гепатоцитов зонами плотных контактов. Последние окружают апикальные области гепатоцитов сплошным поясом. На ультратонких срезах видно, что плотный контакт состоит из внутренних слоев плазматических мембран двух соседних клеток и среднего, часто прерывистого электронно-плотного слоя, отделенного от них электронно-прозрачными промежутками. Общая ширина контакта - 14-16 нм.

Барьерные свойства плотного контакта хорошо демонстрируются с помощью электронно-плотной метки, лантана. При перфузии печени крысы 0,3% раствором хлористого лантана метка выявляется в кровеносных сосудах (синусоидах) и в межклеточном пространстве печени, но никогда не встречается в просвете желчного капилляра, что свидетельствует о том, что лантан не проникает через плотные контакты.

При обработке ткани в течение 1,5 ч бескальциевыми растворами, содержащими 1 мМ ЭДТА, плотный контакт, запечатывающий желчные капилляры, может раскрываться и становиться проницаемым для лантана. Лантановая метка при раскрытии плотного контакта выявляется не только в межклеточной щели, но и внутри желчного капилляра.

Результаты этих опытов указывают на большое значение в сохранности струкчурной и функциональной целостности плотного контакта ионов кальция, а также поверхностных мембранных протеидов, которые вымываются при длительной обработке ткани бескальциевыми растворами.

3.1.3. Особенноеш структуры эпителия тонкой кишки крыс

Тонкая кишка млекопитающих является одним из важнейших внутренних органов, обладающих барьерной и транспортной функцией. В ней происходит переваривание и всасывание питательных веществ и воды.

Физиологические данные, полученные в настоящей работе, показали, что скорость всасывания воды возрастала (с 0,40 до 1,75 мкл/мин на 1 см кишечной петли) при увеличении концентрации глюкозы в исходном перфузате в диаиозоне низких и средних концентраций (12,5-50 мМ) и оставалась неизменной в диапозоне высоких концентраций субстрата (50-75 мМ).

Электронномикроскопическое исследование однослойного цилиндрического эпителия тонкой кишки позволяет выявить в его составе несколько типов клеток, преобладающими из которых являются всасывающие клетки, энтероциты (90%). На апикальной поверхности энтероцитов выявляются многочисленные плотно упакованные микроворсинки, создающие специализированную структуру кишечного эпителия, щеточную кайму. Апикальная плазматическая мембрана толщиной 10 нм с наружной стороны покрыта гликокаликсом, наиболее ярко выраженном на верхушках микроворсинок,имеющих диаметр в среднем 0,2 мкм и длину от 0,5 мкм до 2 мкм, в зависимости от положения клеток на ворсинке (наиболее короткие микроворсинки наблюдаются на всасывающих клепках крипт). Центральная часть микроворсинок заполнена микрофиламентами, собранными в аксиальный пучок. Между микроворсинкми встречаются отдельные окаймленные ямки, диаметром около 0,1 мкм.

Рис. 2. Р-поверхность апикальной мембраны энтероцитов на репликах, полученных методом заморажнвання-скалывання. А - равномерное распределение внутримембранных частиц (ВМЧ) в контроле; Б - перемещение ВМЧ в область микроворсинок при всасывании энтероцнгами глюкозы. Стрелками указаны участки мембраны, лишенные ВМЧ.

На репликах сколов кишки, полученных методом замораживания-скалывания со стороны мукозной поверхности, видна плотная гексагональная упаковка клеток, разделенных зонами плотных контактов. На поверхности клеток выявляются сколотые поперек пальцевидные микроворсинки. При большом увеличении участков реплик со сколов апикальной мембраны обнаруживается большое количество внутримембранных частиц (ВМЧ) на Р-поверхности и малое на - Е-поверхности, что типично для большинства клеточных мембран (Рис. 2). Большая часть Р-поверхности равномерно покрыта ВМЧ.

Клетки эпителия скреплены между собой типичными соединительными комплексами, включающими контакты трех типов: плотные контакты, промежуточные контакты и десмосомы. Межклеточные контакты кишечного эпителия имеют характерную структуру, не отличающуюся от таковой,описанной в литературе, как на ультратонких срезах, так и на репликах замораживания-скалывания (см. обзор Снигиревской, Комиесарчика, 1980).

Плотный контакт (zonula occiudens) опоясывает апикальные области клетки в виде сплошного пояса, отделяя межклеточное пространство эпителия ог просвета кишки. Мембраны соседних клеток в области контакта плотно прилежат друг к другу, образуя пятислойную структуру: два внутренних электропноплотных слоя, два электроннопрозрачных и один средний электронноплотный слой, образованный слившимися экстрацеллюлярпыми слоями соседних мембран. Общая ширина зоны плотного контакта около 15 им. На репликах сколов плазматической мембраны энтероцигов в области плотного контакта обнаруживаются гребни на Р-поверхпости и соответствующие им впадины на Е-поверхности (Рис. 3). Гребни плотного контакта образуют разветвленную сеть, отделенную от апикальной мембраны одним непрерывным гребнем.

Рис. 3. Схема ультрасгруктурнои и молекулярной организации плотного контакта. Внугрпмембранные фибриллярные структуры (вфс) выявляются на Е-поверхности (EF) в виде желобков, а на Р-поверхностн (PF) - в виде гребней. Микрофиламенты (МФ) связаны с цитоплазматическои поверхностью контактирующих мембран.

Ниже плотного контакта располагается промежуточный контакт (zonula adhaerens), также опоясывающий клетку по всему периметру. Мембраны в области промежуточного контаюа строго параллельны друг другу и расстояние между ними равно 14 им; со стороны цитоплазмы к ним тщVmtwnmx Мпп\^тш ^ушт^М примыкают электронноплотные пластины. На Р-поверхности латеральной мембраны в зоне промежуточного контакта выявляются рыхло расположенные крупные ВМЧ (диаметр 16-17 мм).

Входящие в соединительный комплекс 2-3 десмосомы (macula adhaerens), так же как и промежуточные контакты, характеризуются наличием электронноплогных пластин на цитоплазматической стороне соседних мембран. Кроме того, в межклеточном пространстве десмосомы обнаруживаются центральная элсктрошюплотная пластина с отходящими от неё тонкими фибриллами. На сколотых Е- и Р-поверхностях латеральной мембраны десмосомы выявляются как округлые скопления крупных ВМЧ. Латеральные мембраны эпителиальных клеток тонкой кишки идут строго параллельно друг другу на расстоянии 15-18 нм, образуя в базальной части эпителия многочисленные интердигитации. На репликах в них выявялется обычное распределение ВМЧ: много частиц на Р-поверхности и мало на Е- поверхности.

3.1.4. Структурные изменения плазматической мембраны энтероцитов при всасывании нутрнеитов

При нагрузке изолированной петли тонкой кишки крысы липидом триолеином не удалось выявить каких-либо изменений в структуре апикальной мембраны и специализированных межклеточных контактов энтероцитов. Распределение иммунной метки к актину в пределах апикальной области энтероцитов и вблизи соединительного комплекса при всасывании триолеина практически не отличается от соответствующих участков контрольных объектов.

При нагрузке кишки глюкозой в ультраструктурной организации апикальной мембраны энтероцитов наблюдаются некоторые изменения. При всасывании глюкозы между микроворсинками появляются участки мембраны, лишенные ВМЧ, тогда как на мембранах оснований микроворсинок выявляется большое количество плотно упакованных частиц (Рис. 2). Таким образом, происходит перемещение ВМЧ в пределах апикальной мембраны, отражающее, по-видимому, функциональное состояние белков мембраны. Изменений в ультраструктуре плотного контакта в этих условиях не выявляется. Лишь при высоких концентрациях глюкозы (40-75 мМ) на ультратонких срезах в области плотного контакта в очень редких случаях (1%) наблюдалось нарушение структуры контакта, выражающееся в появлении блистеров. Ниже соединительного комплекса в межклеточном пространстве при всасывании глюкозы появляются лакунообразные расширения, но перераспределения ВМЧ в латеральных мембранах не происходит (Рис.4).

3.1.5. Особенное in структуры аппарата Гольджп эптсроцптов в контроле н при всасывании глюкозы

Рис. 4. Схематическое изображение изменений ультраструктуры всасывающих клеток тонкой кишки крысы при всасывании глюкозы. А - Энтероциты голодной крысы (контроль). Апикальная поверхность клеток покрыта многочисленными, регулярно расположенными микроворспнками (MB). Узкое на всем протяжении межклеточное пространство в базалыюй части эпителия имеет извилистые контуры. Микрофиламеиты располагаются в виде пучков в микроворсинках, вблизи плотного контакта (ПЛК), а также в составе терминального сплетения (ТС), локализованного на уровне промежуточных контактов (1IPKJ. Ниже промежуточных контактов выявляются десмосомы (Д). Аппарат Гольджп состоит из 4-5 параллельных цистерн, часто слегка набухших. Б - При нагрузке тонкой кишки глюкозой межклеточное пространство ниже зоны соединительного комплекса разбухает, тогда как контакты остаются интактными. При использовании высоких концентраций глюкозы появляются сгуШепия актпновых фпламентов в области плотных контактов и между корневыми нитями. Цистерны аппарата Гольджп набухают.

Цитоплазма энтероцитов заполнена большим количеством митохондрий, каналов шероховатого эндоплазматического ретикулюма, рибосом и полисом. Некоторые клетки содержат большое количество липидных включений. Комплекс Гольджи, выявляемый над ядром, состоит из стопки 5-6 параллельных цистерн, обычно сильно изогнутых таким образом, что транс-поверхность находится в вогнутой части. С цистернами связано большое количество гладких и окаймленных пузырьков. Конденсированные вакуоли и продукты секреции аппарата Гольджи находятся внутри чаши, образованной цистернами. Ближе к апикальной поверхности энтероцитов обнаруживаются лизосомы и вторичные лизосомы. Следует отметить, что клетки, находящиеся в хроническом опыте, содержат- несколько большее количество вторичных лизосом по сравнению с клетками из острого опыта. Для некоторых энтероцитов контрольных участков кишки характерно наличие набухших цистерн аппарата Гольджи, в особенности цис-цисгерн.

Но особенно сильное набухание цистерн аппарата Гольджи наблюдается в условиях нагрузки петель кишки глюкозой и раствором Рингера, содержащим маннит, тогда как митохондрии и цистерны эндоплазматического ретикулюма выглядят гак же как и в контроле. Возможно, это связано именно с тем, что энтероциты всасывают не только глюкозу и ионы, содержащиеся в растворе Рингера, но и воду, которая также транспортируется через стенку кишки. Можно предположить, что аппарат Гольджи сегрегирует из цитоплазмы излишки воды, спасая клетку от обводнения и выполняя тем самым функцию внутриклеточной осморегуляции.

3.1,6. Анализ распределении Г-актипа в апикальной области энтероцитов

Отдельного рассмотрения требует ультраструктура цитоскелета энтероцитов, который представлен немногочисленными микротрубочками и очень большим количеством промежуточных и актиновых филаментов. Промежуточные филаменты с диаметром 10 им связаны с промежуточными контактами и десмосомами и собраны в пучки на уровне этих контактов, часто простирающиеся в цитоплазму вплоть до ядра. Иммуноцитохимическое исследование промежуточных филаментов продемонстрировало их кератииовую природу, тогда как виментин в них обнаружен не был. Между зонами промежуточных контактов промежуточные и актиновые филаменты образуют непрерывную сеть, терминальное сплетение, отделяющее апикальную примембранную зону клетки от остальной цитоплазмы. Для этой зоны характерно отсутствие каких-либо органелл, за исключением корневых нитей микроворсинок, представляющих собой пучки микрофиламентов. В этой области выявляются также отдельные микрофиламенты и тонкие филаменты (3-4 нм), возможно, представляющие собой актин-связывающие белки. Отдельные микротрубочки и микрофиламенты встречаются в остальной части цитоплазмы. При идентификации актина с помощью антител, конъюгированпых с коллоидным золотом, метка выявляется на всем протяжении пучка микрофпламентов, проходящих в микроворсинках от их верхушек до конца корневых нитей, в терминальном сплетении и в базолагеральных выростах клеток. В контроле метка практически не обнаруживается в области десмосом и достаточно редко вблизи плотного и про м е жу точ н о го ко нта кт о в.

Распределение описанных цитоскелетных элементов в энтероцитах крыс, использованных в условиях различных диет, в основном было сходным, за исключением тех случаев, когда использовались высокие концентрации глюкозы. При введении в петлю 40 мМ глюкозы в энтероцитах появляются сгущения актиновых филаментов вблизи плотного контакта и в терминальном сплетении. Однако признаки дезорганизации самого плотного контакта практически отсутствовали (лишь в 1% исследованных памп случаев мы наблюдали блистеры в зоне плотных контактов), тогда как базолагеральные межклеточные пространства оказывались разбухшими. Нам не удалось повторить результаты Папненгеймера с соавт. (¡987) по интенсивному раскрытию плотного контакта в этих условиях.

При иммуноцнтохимическом исследовании в условиях всасывания глюкозы плотность распределения анти-актиновой метки увеличивается по сравнению с контролем в области терминального сплетения, между корневыми нитями и вблизи плотного контакта. 3.1.7. Заключение

Исследование особенностей ультраструктуры двух проницаемых эпителиев: желчные капилляры печени и тонкая кишка крыс продемонстрировало барьерные свойства плотного контакта, запечатывающего межклеточное пространство. Эта функция плотного контакта определяется особенностями его структурной организации: наружные слои мембран двух соседних клеток в зоне контакта сливаются, образуя плотное соединение клеток с помощью длинных разветвленных фибрилл, залитых в мембранный матрикс. Интегральный белок плотного контакта обладает адгезионными свойствами, а также свойствами селективной поры (СпшЫпег, 1995). Кроме того, в состав плотного контакта входит несколько периферических белков, участвующих в его сборке и поддержании клеточной полярности : 20-1, 2.0-2, цингулин (см. Сш е( а1., 1991). В настоящее время эти белки идентифицированы, клонированы и секвенированы.

На электронномикросколическом уровне барьерная роль плотного контакта в нормальной печени была выявлена нами с помощью электронноплогиой метки, хлористого лантана, который, заполняя межклеточное пространство между гепатоцитами, никогда не проникает в желчный капилляр. При перфузии печени бескальциевыми растворами, вымывающими кальций и поверхностные мембранные протеиды, целостность плотного контакта нарушается и лантан проникает в желчный капилляр.

Следует отметить, что наблюдаемые в настоящей работе изменения структуры пропинаемых эпителиев, вызванные физиологическими нагрузками, существенно отличаются от изменений, являющихся результатом экспериментальных воздействий. По-видимому, такие обработки, как вымывание кальция и поверхностных мембранных протеидов, приводящие к раскрытию плотных контактов гепатоцитов, являются повреждающими и ни в коей мере не могут моделировать естественные процессы модуляции проницаемости эпителиев, хотя и свидетельствую!' о динамичности структуры и функции плотного контакта.

Используя физиологические нагрузки тонкой кишки крысы гидрофильными питательными веществами, мы получили ряд доказательств трасцеллюлярного переноса этих веществ всасывающими клетками. Как известно, одним из барьеров проницаемости эпителиев является апикальная мембрана клеток. В настоящей работе впервые были получены результаты о перераспределении интегральных белков апикальной мембраны энтероцитов при нагрузке тонкой кишки крысы глюкозой, а именно, о концентрировании ВМЧ в областях микроворсинок. Можно думать, что перераспределение ВМЧ вызвано трансмембранным переносом этого моносахарида.

Преимущественно трансцеллюлярный транспорт глюкозы энтероцитами подтверждается и данными по отсутствию изменений структуры плотных контактов в эпителии при нагрузке кишки глюкозой. Таким образом, полученные в настоящей работе данные опровергают популярную в последние годы точку зрения о том, что плотные контакты проницаемого эпителия тонкой кишки млекопитающих могут легко перестраиваться при функциональных нагрузках, становясь высокопроницаемыми для воды, ионов и неэлектролитов (Madara, Pappenheimer, 1989; Pappenheimer, 1990, 1993). Возможно, появление блистеров в зоне плотного контакта кишки, наблюдаемое в работах Паппенгеймера и соавт., может быть связано с отличающимся от используемого в нашей работе методического подхода, а именно, постановкой опытов на изолированных из организма участках кишки. По нашему мнению, наиболее адекватной методикой для изучения транспорта нутриентов через эпителии является постановка экспериментов in situ, на перевязанных петлях кишки в острых или хронических условиях (Уголев и др., 1986). Вместе с тем, пе исключено, что некоторый вклад в трансэпителиальную проницаемость тонкой кишки для глюкозы вносит и парацеллюлярныи путь. Косвенным доказательством этого является наблюдаемая при высоких концентрациях глюкозы конденсация актина вблизи плотного контакта, который, как известно, в значительной степени стабилизирует структурную организацию этого межклеточного соединения (Hull, Staehelm, 1979).

Рис. 5. Схематическое изображение путей транспорта глюкозы через эпителий тонкой кишки крысы. Глюкоза входит в клетки путем котранспорта с ионами натрия через апикальную мембрану и, выходя из клеток с током изотонической жидкости, расширяег межклеточное пространство , эпителия (длинные стрелки). Короткими стрелками указан возможный незначительный вклад в транспорт глюкозы парацеллюлярного пути.

Характерной особенностью структуры эпителия, нагруженного глюкозой, является увеличение расстояния между клетками ниже плотного контакта (Рис. 4). По-видимому, эти расширения межклеточных пространств могут быть вызваны повышением в них гидравлического давления в результате входа в них жидкости, транспортирующейся через клетки. Как полагают сторонники гипотезы локального осмоса (см. обзор Diamond, 1979), через плотные контакты могут пассивно по элекгро-химическому градиенту перемещаться ионы, вследствие чего в межклеточном пространстве создается небольшая гипертония, что, в свою очередь, приводит к выходу воды из клеток. Однако, как отмечает ряд физиологов (Sackin, Bonlpaep, 1975, Boulpaep, 1979; Zenliten, 1995) вряд ли можно объяснить индукцию транспорта воды против осмотического градиента через кишечный эпителий, обладающий довольно низкой водной проницаемостью, повышением концентрации ионов в межклеточном пространстве. К тому же, данные о наличии в энтероцитах водных каналов, которые обнаружены в последние годы в плазматических мембранах многих клеток и которые обеспечивают большие пассивные водные потоки, пока еще очень спорны. В связи с этим Цойтен (Zeuhten, 1995) предлагает гипотезу вторично активного транспорта воды в проницаемых эпителиях. По мнению Цойгена, вода входи т в клетки с помощью переносчика глюкозы и натрия, а выходит из клеток с переносчиком калия и хлора (Zeuhten, 1995; Loo et al., 1996). Принимая во внимание выводы Цойтена и полученные в настоящей работе данные об отсутствии существенных перестроек структуры

ТФ Ф(>

I) (, плотного контакта энтероцитов при поглощении ими глюкозы и изменении структуры их апикальной мембраны, логично предположить, что глюкоза, натрий и вода входят в энгероциты посредством активного транспорта и, выходя из клеток в базолатеральные межклеточные пространства также посредством вторично активного транспорта, расширяют их (Рис. 5).

Одним из изменений, которые были выявлены в энтероцитах участков тонкой кишки, нагруженных глюкозой и раствором Рингера, а иногда и в энтероцитах контрольных участков кишки с помощью стандартных электронно-микроскопических методов, является набухание цистерн аппарата Гольджи, подобное тому, какое наблюдается при обводнении клеток, находящихся в условиях гипотонии. Такое изменение цистерн аппарата Гольджи, по-видимому, связано с тем, что транспортирующийся через энтероциты раствор Рингера, содержащий глюкозу, несколько гипотоничен по отношению к их цитоплазме. И действительно, имеются данные о том, что цитоплазма клеток ряда проницаемых эпителеев несколько гипероосмотична по отношению к плазме крови, и если эпителий омывается гипотонической жидкостью, разность осмотического давления между средой и цитоплазмой энтероцитов может достигать 40 мМ/л ^еиЫеп, 1995). Предполагается, что Ыа,К -А'ГФаза и К. -С1-переносчнки базолатеральной мембраны осуществляют осмотическую регуляцию внутриклеточной среды ^еиЫеп, 1995). Однако, несмотря на такую осморегуляцию, наблюдаемые картины набухания цистерн аппарата Гольджи энтероцитов в условиях транспорта глюкозы через кишечный эпителий свидетельствуют о некотором обводнении цитоплазмы энтероцитов. Можно предположить, что аппарат Гольджи поглощает' воду из цитоплазмы, спасая клетку ог излишнего обводнения и выполняя тем самым функцию внутриклеточной осморегуляцпи.

Итак, результаты настоящей работы, свидетельствующие об отсутствии существенных перестроек структуры плотного контакта, наличии изменений в структуре апикальной мембраны, а также набухании цистерн аппарата Гольджи энтероцитов в условиях нагрузки тонкой кишки глюкозой позволяют поддержать точку зрения о том, что доминирующим является транспорт глюкозы через клетку и, возможно, лишь незначительная её часть может транспортироваться парацеллюлярно. 3.2. Проницаемость плотною эпителия мочевого пузыря амфибий для воды

Плотные эпителии отличаются от проницаемых эгштелиев низкой ионной и водной проницаемостью. В связи с тем, что они могут поддерживать высокий осмотический и ионный градиент между внешней средой и ннтерстициальной жидкостью, наличие плотных эпителиев характерно для органов, содержащих в своем просвете гипотоническую жидкость, в частности, для осморегулирующих органов, проницаемость которых для воды и ионов регулируется пептидными и стероидными гормонами. Вопрос о путях транспорта воды в плотных эпителиях дебатировался в течение многих десятилетий и лишь в 1974 г были получены данные, указывающие на преимущественно грансцеллюлярный путь переноса воды (Chevalier et al., 1974). В последние годы достигнут большой прогресс в исследовании молекулярных механизмов изменений мембранной проницаемости для воды, обнаружены и клонированы белки, формирующие водные каналы, аквапорины (Agre et al., 1993).

Одним из типичных плотных эпителиев, обладающих высоким электрическим сопротивлением, 20000 ом/см2, является эпителий мочевого пузыря лягушки, являющийся моделью собирательных трубок почки млекопитающих. Его осмотическая проницаемость регулируется антидиуретическим гормоном (АДГ), аргинин-вазотоцином. В настоящее время довольно хорошо изучены биохимические и функциональные аспекты гидроосмотического эффекта АДГ на эпителии мочевого пузыря амфибий и собирательных трубок почки млекопитающих. Предполагается, что аргинии-вазопрессип (АДГ млекопитающих) связывается со специфическими рецепторами, локализованными в базо-латеральной мембране эпителиальных клеток, запуская каскад биохимических реакций, приводящих к изменению водной проницаемости апикальной плазматической мембраны. Согласно современным представлениям, имеется но крайней мере два типа рецепторов вазопрессина, обозначаемых V| и V2 (Bourgiiet et al., 1989; Наточин и др., 1989).

Связывание вазопрессина с У2-рецепторами опосредованно через Gs-белок приводит к активации аденилат-циклазы и синтезу ц-АМФ (Orloff, Handler, 1962). ц-АМФ зависимая протеинкиназа А катализирует процессы фосфорилирования белков, способствующих встраиванию водных каналов в апикальную мембрану. Установлено, что повышение проницаемости апикальной мембраны клеток для воды пропорционально доле рецепторов, связанных с вазоирессином, и количеству синтезированной цАМФ (Soasa, Grosso, 1985). Участие V (-рецепторов приводит к гидролизу полифосфоинозитола до инозитол-трифосфата и 1,2-диацилглицерина, к освобождению Са2+ из внутриклеточных запасов и к активации протеинкиназы С.

В качестве вторичных мессенджеров генерации ответа на воздействие гормона являются цАМФ и ионы Са2+ (Sousa, 1985). Этот путь рассматривается как негативная модуляция сигнального пути, связанного с Vj-реиепторами (Парнова, 1996). Как и в других тканях, в клетках вазопресснн-чувстшпельных эиителиев обнаружен внутриклеточный рецептор ионов Са2+ - белок кал i. модул и н (Sonsa, 1985).

Однако, расшифровка механизмов стимуляции вазопрессином водного транспорта осложняется тем, что в регуляции этого процесса важную роль играют многие факторы, связанные с жизнедеятельностью эпителия: синтез иростагландинов в клетках, транспортирующих воду, концентрация ионов натрия в клетке и ионов калия в среде, омывающей серозную оболочку и др.

В настоящей работе охарактеризована структура межклеточных контактов, клеточных мембран и внутриклеточных органелл в условиях стимулированного вазопрессином транспорта воды. 3.2.1. Постановка физиологического эксперимента

Исследования проводились на мочевом пузыре лягушки Rana temporaria. Удобство этого объекта для экспериментальной работы объясняется рядом причин: 1) выделенный мочевой пузырь сохраняет основные функции и удобен для параллельных структурно-химических и физиологических исследований; 2) водная проницаемость стенки пузыря регулируется антидиуретичсскпм гормоном (АДГ), добавленным в омывающий раствор со стороны серозной оболочки; 3) большая часть поверхности слизистой оболочки эпителия пузыря занята апикальными мембранами гранулярных клеток (более 90%), ответственных за его водную проницаемость.

Опыты с изучением проницаемости для воды проводили на выделенных мочевых пузыря лягушки, помещенных в аэрируемый раствор Рингера (осмоляльиость 220 моем на 1 кг Н2О). Просвет пузыря заполняли раствором Рингера или гипотоническим раствором Рингера, для чего стандартный раствор разводили дистилированной водой в 10 раз (осмоляльиость 2,5 моем на 1 кг Н2О). Осмотическую проницаемость оценивали гравиметрическим методом rio величине потока воды по осмотическому градиенту в направлении от слизистой к серозной оболочке (Наточин, Шахматова, 1968). Взвешивание проводили на электронных весах ВЛЭ-200. Величину потока воды рассчитывали и мкл/мин на 1 см2 поверхности мочевого пузыря.

Для стимуляции осмотической проницаемости пузыря использовали как традиционный способ обработки пузыря вазопрессином (10"2-10"3 Ед на 1 мл), так и метод, разработанный в процессе проведения настоящей работы - многократная смена раствора Рингера (4-5 смен по 15 мин) со стороны серозной оболочки (Наточин, Шахматова, 1995). Обработке подвергали одну из двух половинок пузыря, тогда как другая половина служила контролем для первой.

При инкубации изолированного мочевого пузыря в одном и том же растворе Рингера с аэрацией и непрерывном перемешиванием сохраняется низкая осмотическая проницаемость и способность многократно реагировать на назоиресснн. Добавление АДГ к раствору Рингера, омывающему серозную поверхность стенки мочевого пузыря, значительно увеличивает его осмотическую проницаемость. В присутствии осмотического градиента при добавлении МО"3 мЕд/мл вазопрессина поток воды через пузырь может увеличиваться в течение 30 мин с 0,07±0,01 до 1,71 ±0,29 мкл/(см2-мнн). Вследствие набухания клеток и возможного увеличения обьема содержание воды в ткани возрастает' с 3,8±0,14 до 4,99±0,22 кг воды на 1 кг сухого вещества. Эти изменения осмотической проницаемости обратимы.

При многократной смене раствора Рингера со стороны серозной оболочки через каждые 15 мин на идентичный свежий раствор в устойчивом режиме перемешивания и аэрации постепенно увеличивается проницаемость эпителия. Через 75 мин повышение потока воды сопоставимо по величине с действием 1нМ АДГ. Так как контрольная половина пузыря, находящаяся в одном и том же растворе Рингера, не обнаруживает повышения водного потока через ее эпителий, можно предположить, что причиной возрастания проницаемости опытной доли является удаление какого-то регуляторного фактора, поступающего из клеток пузыря в раствор Рингера у серозной оболочки. 3.2.2. Особенности структурной организации мембран с низкой водной проницаемостью

Характерной особенностью клеток плотных эпителиев является крайне низкая водная проницаемость их апикальных (люминальных) мембран. Па ультратопких срезах апикальная мембрана эпителиальных клеток мочевого пузыря лягушки обнаруживает типичную для всех мембран трехслойную структуру с более толстым наружным слоем, покрытым тли ко кал иксом. Толщина мембраны составляет 9-10 нм, толщина гликокаликса - 30-40 нм. Особенно сильного развития гликокаликс достигает на микроворсинках, отходя от их верхушек в виде длинных радиальных нитей.

Использование для изучения структуры апикальной мембраны плотных эпителиев метода замораживания-скалывания позволило установить корреляцию между ультраструктурной организацией этой мембраны и её подпой проницаемостью. Оказалось, что для гранулярных и "митохондриалытых" клеток мочевого пузыря характерно инвертированное по сравнению с остальными типами клеток распределение ВМЧ на Р- и Е-поверхпостях сколов апикальной мембраны, т.е. много ВМЧ на Е-поверхпости (616+77 на 1мкм2) и мало - на Р-новерхности (302+39 на 1 мкм2). При исходно низкой водной проницаемости ВМЧ распределены относительно равномерно по поверхностям сколов апикальной мембраны и не образуют четко выраженных агрегатов (Рис. 6). Вместе с тем следует подчеркнуть, что в разных клетках одного и того же эпителия количество ВМЧ существенно варьирует, что свидетельствует, по-видимому, о разном функциональном состоянии клеток.

Рис. 6. Участки апикальной мембраны гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки на сколах (замораживание-скалывание). А - Р-поверхность с небольшим количеством мелких ВМЧ. Внизу видны гребни плотного контакта. Б - Е-поверхность, покрытая крупными ВМЧ. МВ - сколотые микроворсинки.

В гранулярных клетках различаются не только количество ВМЧ на Р-и Е-поверхностях сколов апикальной мембраны, но и размеры частиц: на Р-поверхности средний диаметр ВМЧ меньше (14,5 нм), чем на Е-поверхности (17 нм).

Плотный контакт, имеющий па ультратонких срезах типичную пяти-слойную структуру, сплошным поясом опоясывает апикальные области клеток, отделяя межклеточное пространство пузыря от его просвета. На репликах, полученных методом замораживания-скалывания, выявляется широкая зона плотного контакта, состоящая из 8-9 анастомозирующих, непрерывных гребней на Р-поверхности латеральной мембраны и комплементарных им бороздок на Е-поверхности (Рис. 6). 3.2.3. Динамика изменений структуры апикальной мембраны клеток плотных эшггслнев при действии АДГ и многократной смены раствора Рннгера

При электронно-микроскопическом исследовании апикальных мембран клеток мочевого пузыря лягушки в условиях осмотического потока, стимулированного АДГ или сменой раствора Рингера, было установлено, что в этих условиях структура апикальных мембран существенно изменяется, тогда как плотные контакты остаются без видимых изменений. На Р-поверхности сколов апикальной мембраны гранулярных клеток обнаруживаются агрегаты крупных ВМЧ, а на комплементарной Е-поверхности - соответствующие им участки, содержащие бороздки и несколько крупных частиц (Рис. 7). Форма агрегатов может быть самой различной: округлой, звездчатой, кольцевидной, прямоугольной и т.д. Форма и размеры частиц, собранных в агрегаты, резко отличаются от ВМЧ, распределенных по остальной части Р-поверхности мембраны: они более крупные и имеют неправильную форму. Часто агрегаты располагаются вблизи мест слияния мембран гранул с апикальной мембраной. Интересно, что в соседних гранулярных клетках количество агрегатов ВМЧ существенно варьирует. Возможно, этот факт отражает разную реактивность клеток в отношении гормона, обусловленную их различным функциональным состоянием в момент его воздействия. Однако, в среднем доля площади мембраны, занятая агрегатами ВМЧ, зависит от степени водной проницаемости эпителия. Наличие связи между площадью, запятой агрегатами, и величиной водного потока была обнаружена при изучении ингибирующего влияния ионов Со2+ на стимулируемый АДГ водный транспорт. Оказалось, что при больших водных потоках (1.56±0,16 мкл-см"2-мин~') относительная площадь апикальной мембраны, занимаемая агрегатами, составляет 1,8%, в то время как при их ингибировании ионами кобальта ( 0,44+0,02 мкл-см"2-мин"') эта площадь равна лишь 0,3%.

Рис. 7. Комплементарные сколы апикальной мембраны гранулярных клеток при стимуляции трансмембранного транспорта воды. А - агрегаты крупных ВМЧ на Р-поверхностн, Б - соответствующие им гладкие участки Е-поверхности, содержащие отдельные крупные ВМЧ и бороздки.

О том, что выявляемые в апикальных мембранах клеток вазопрессин-чувствительных эпнтелиев агрегаты ВМЧ не являются следствием водного потока через другие участки мембраны, а служат для трансмембранного переноса воды, свидетельствуют данные об их наличии в апикальных мембранах эпителиальных клеток пузырей, обработанных АДГ в отсутствие осмотического градиента. В присутствии осмотического градиента наличие функционирующих водных каналов может обеспечить очень высокую водную проницаемость эпителиального слоя.

Проблема происхождения агрегатов ВМЧ в АДГ-чувствительных эпителиях представляется очень важной для понимания механизмов стимуляции высокой водной трансмембранной проницаемости. Существуют' достаточно убедительные данные, как морфологические, так и биохимические, которые указывают на существование обмена доменами, обладающими высокой водной проницаемостью, между внутриклеточными и апикальными мембранами. Однако, если участки высокой водной проницаемости хороню идентифицируются в электронном микроскопе (агрегаты ВМЧ), то идентификация аналогичных участков на мембранах клеточныз органелл чрезвычайно затруднена. Тубулярные структуры («агрессоры»), мембраны которых иногда содержат определенным образом организованные ВМЧ и которые ряд исследователей считает предшественниками высокопроницаемых участков апикальной мембраны, обнаруживаются крайне редко как в условиях исходно низкой, так и стимулированной АДГ водной проницаемости. Другой причиной, в силу которой участие этих структур п возникновении участков высокой водной проницаемости апкалыюй мембраны нельзя считать доказанным, является то, что что сплавление этих органелл с апикальными мембранами практически нельзя отличить от сплавления с ней специфических гранул. Расположение ч агрегатов ВМЧ вблизи мест слияния мембран специфических гранул с апикальной мембраной и миграция гранул к апикальной мембране при действии АДГ, выявляемая на ультратонких срезах, свидетельствуют об участии гранул в формировании доменов апикальной мембраны с высокой водной проницаемостью. Таким образом, полученные нами данные противоречат широко распространенному мнению о том, что источниками агрегатов служат специфические мембранные канальцы, агрессоры, сливающиеся с апикальной мембраной при стимуляции водного т ранспорт а.

Особый интерес представляют данные о том, что не только АДГ, но и многократная смена раствора Рингера со стороны серозной оболочки мочевого пузыря может стимулировать значительную осмотическую проницаемость эпителия, сопровождающуюся формированием агрегатов ВМЧ в апикальной мембране По-видимому, при смене раствора Рингера из эпителия вымываются какие-то физиологически активные вещества лмппднои природы, аутакоиды, которые в нормальных условиях стабилизируют ею структуру и обеспечивают низкий уровень осмотической проницаемости. Добавление 5 мкл раствора арахидоновой кислоты в смеси метанол-гексан (5:1) в конечной концентрации 7 мкМ приводило к резкому снижению уровня потока воды. Эти данные позволяют предположить, что функцию стабилизации его низкой водной проницаемости могут выполнять в плотном эпителии регуляторные липиды (арахидоновая кислота или продукты её метаболического превращения). 3.2.4. Состояние вакуолнрной системы клеток, участвующем в стимулируемом АДГ транспорте воды

Наряду с изменениями апикальной мембраны стимуляция вазопресснпом осмотических потоков воды вызывает заметные изменения и в других комиартмеп тах клеток эпителия мочевого пузыря лягушки. Гранулярные клетки набухают, их апикальные области выпячиваются в просвет, микроворсинки становятся менее четко выраженными. Межклеточные пространства в базо-латеральной части эпителия разбухают (Рис. 8).

Некоторым изменениям подвергаются и внутриклеточные структуры, из которых наиболее существенными, по нашему мнению, являются перестройки элементов вакуолярной системы и цитоскелета, впервые обнаруженные в настоящей работе.

Для гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки характерен хорошо развитый аппарат Гольджи, состоящий из параллельных уплощенных цистерн, вблизи которых локализуются его дериваты. Наряду с лизосомами к ним относятся гладкие и окаймленные мелкие пузырьки, тубулярные мембранные структуры диаметром 30-40 им, названные нами электронно-плотными канальцами, а также многочисленные специфические гранулы овальной или округлой формы с диаметром 30 нм -1 мкм. Последние распределены по всей цитоплазме, за исключением базальных областей клеток, и имеют разнообразную внутреннюю структуру: от гомогенной до кристаллической. Часто с гранулами связаны актиновые и промежуточные филаменты.

Анализ ультраструктуры аппарата Гольджи гранулярных клеток, находящихся в разном функциональном состоянии, указывает на высокую реактивность этой органеллы на гидроосмотическое действие АДГ. На основании наблюдаемых картин можно представить себе следующую динамику изменений аппарата Гольджи при стимуляции водного потока АДГ (Рис. 8, 18).

Рис. 8, Схематическое изображение изменений структуры гранулярных клеток при стимуляции трансэппгелпалыюго транспорта воды АДГ пли вымыванием аутакоидов. А- гранулярные клетки при исходно низкой водной проницаемости (контроль). Апикальная поверхность образует небольшие микроворсинки (МВ), межклеточное пространство узкое, в апикальной области эпителия клетки скреплены соединительным комплексом, состоящим их плотного контакта (ПЛК), промежуточного контакта (ПРК) и десмосом (Д). Клетки содержат хорошо развитый аппарат Гольджи (АГ) и располагающиеся вблизи него многочисленные специфические гранулы (ГР). Под апикальной мембраной располагается слой кортикальных актиновых филаментов (МФ - микрофиламенты). Б - гранулярные клетки в условиях сильных водных потоков через эпителий. Цитоплазма клеток просветляется, специфические гранулы мигрируют к апикальной поверхности, в области аппарата Гольджи появляются крупные вакуоли, межклеточное пространство в базальноп части эпителия разбухает, специализированные межклеточные контакты не изменяются.

При исходно низкой водной проницаемости стенки мочевого пузыря аппарат Гольджи гранулярных клеток представляет собой, как упоминалось выше, хорошо развитый комплекс, состоящий из уплощенных параллельных цистерн, тубул, пузырьков, конденсированных вакуолей и специфических гранул (структура, подобная описанной в литературе для секреторных клеток). При кратковременном действии АДГ (5 мин), вызывающем незначительный осмотический поток воды, происходит фрагментация комплекса Гольджи на отдельные стопки цистерн, дикпюсомы. Возможно, что обособление и транслокация диктиосом в клетке происходит при участии микротрубочек, количество которых при действии АДГ увеличивается во много раз. После 5-минутного действия АДГ на мочевой пузырь часть цистерн аппарата Гольджи слегка набухает, тогда как заметного расширения базо-латеральных межклеточных щелей, характерного для стадии максимального эффекта АДГ (20 мин), ещё нет. При максимальном водном нотке (через 20-25 мин) специфические гранулы перемещаются к апикальной мембране и в цитоплазме появляются крупные вакуоли, к которым прилегают компоненты аппарата Гольджи: цистерны, мелкие гладкие и окаймленные пузырьки, электронно-плотные канальцы, а также элементы цитоскелета: микротрубочки и мнкрофиламенты (Рис. 9). Эти данные, а также аналогичное распределение ВМЧ в мембранах вакуолей и в цис-цистернах аппарата Гольджи указывают на то, что эти вакуоли формируются из цис-цистерн аппарата Гольджи. Наблюдаемые картины набухания цистерн аппарата Гольджи 'в ответ на действие АДГ демонстрируют его участие во внутриклеточной осморегуляции во время возросшей во много раз водной проницаемости эпителия. Такая интерпретация полученных данных объясняет отсутствие повреждения клеток в условиях сильной гипотонии.

Появление крупных вакуолей только в условиях сильных водных потоков в присутствии осмотического градиента, по-видимому, указывает на их участие в транспорте воды через клетки (иногда можно наблюдать картины подхода вакуолей к базолатеральной мембране гранулярных клеток). Это предположение подтверждается опытами по набуханию эпителиальных клеток со стороны серозы. При погружении мочевых пузырен лягушек в гипотонический раствор Рингера обнаруживалось увеличение объема всех типов клеток. При этом в цитоплазме гранулярных клеток описанные выше крупные вакуоли с характерными примембраниыми структурами не обнаруживались никогда, но наблюдались многочисленные мелкие вакуоли, не связанные с элементами цитоскелета и характерные для обводненных клеток.

Исследование ультраструктурных особенностей крупных вакуолей гранулярных клеток, а именно, связь с мембраной вакуоли электрон ношютных канальцев и микротрубочек, указывает на их морфологическое сходство с сократи тельными вакуолями некоторых простейших, в частности 1'агашеаит, изучавшейся в настоящей работе. Наличие гипотонического содержимого в вакуолях гранулярных клеток, подобно том)', что имеет место в сократительных вакуолях простейших, было продемонстрировано нами с помощью рентгено-спектрального анализа. На стимулированных АДГ мочевых пузырях лягушки было показано резкое падение содержания в вакуолях ионов калия. При этом концентрация К" в цитоплазме фанулярных клеток не отличается от таковой других клеток и равна 110-120 мМ. * . V. у Г '

• 0.25 и

Рис. 9. При стимуляции больших водных потоков через эпителий мочевого пузыря лягушки в гранулярных клетках появляются крупные вакуоли, располагающиеся в области аппарата Гольджи.

Наряду с появлением крупных вакуолей в цитоплазме гранулярных клеток при воздействии АДГ происходит изменение локализации специфических гранул. Наиболее четко миграция гранул к апикальной мембране выражена в отсутствие осмотического градиента. При использовании метода замораживания-замещения часто наблюдаются картины слияния мембран гранул с апикальной мембраной, тогда как при использовании стандартных методов электронной микроскопии этот, по-видимому, быстрый процесс выявить удается крайне редко. Перед полным слиянием мембран гранул с апикальной мембраной целостность мембран гранул нарушается и в таких гранулах выявляются тубулярные структуры с диаметром 35-40 нм. В большинстве случаев гранулы, мембраны которых сливаются с апикальной мембраной, обладают содержимым с низкой электронно-оптической плотностью. Содержимое этих гранул как бы растворяется в цитоплазме, не экзоцитируясь в экстрацеллюлярное пространство.

3.2.5. Участие цп тоскелета во внутриклеточном транспорте воды

В последние годы большое внимание при анализе механизмов стимулируемого АДГ водного транспорта было уделено участию цитоскелетных элементов клеток: микротрубочек и микрофиламентов. В ряде работ было показано, что апикальная плазматическая мембрана клеток плотных эпителиев является не единственным барьером для стимулируемых осмотических потоков. В качестве второго постлюмииальиого барьера рассматривается сеть цитоскелетных элементов (микрофиламентов и актин-связыпающих белков) в апикальной цитоплазме клетки. Воздействие вазопрессина приводит, по мнению ряда исследователей, к увеличению проницаемости также и этого второго барьера (КасЬаёопап, 1979).

Результаты настоящего электронно-микроскопического исследования продемонстрировали существенную роль элементов цитоскелета гранулярных клеток мочевого пузыря лягушки в ответе на гидроосмотическое действие АДГ

Рис. 10. Пучок «толстых» микротрубочек в цитоплазме гранулярных клеток, транспортирующих воду.

При сравнении ультраструктуры эпигелиев с исходно низкой и стимулируемой АДГ водной проницаемостью получены прямые данные, указывающие на возрастание количества микротрубочек во много раз. Причем, в условиях стимулированных водных потоков выявляется две популяции микротрубочек: с диаметром 20-24 нм, как в контрольных пузырях, и с большим диаметром, 35-40 нм. Последние очень лабильны и обнаруживаются лишь при щадящих методах фиксации (отсутствие осмиевой постфиксацин, замораживание-замещение) (Рис. 10). При больших увеличениях электронного микроскопа на поперечных срезах микротрубочек обнаруживается их субъединичное строение. Однако, в отличие от обычных микротрубочек стенка "толстых" микротрубочек состоит не из 9, а из 15-17 субъединиц, размером 7,5 им. Часть этих толстых микротрубочек имеет на своей поверхности регулярно располагающиеся осмиофильные глобулы (21-23 нм) представляющие собой, по-видимому, белки, ассоциированные с микротрубочками (МАРэ). Возможно, они выполняют транспортную функцию, тогда как обычные стабильные микротрубочки, выявляющиеся в опыте и в контроле, являются опорными. Не исключено, что связь микротрубочек с вакуолярной мембраной при больших водных потоках способствует их миграции по цитоплазме. Тубулпновая природа толстых микротрубочек подтверждается электронном и кроскон и ческим и иммуиоцитохимическими методами. Поликлоцальные антитела к тубулину метят как микротрубочки, свободно расположенные в цитоплазме, так и микртрубочки, содержащиеся внутри специфических гранул. Кроме того, метка встречается на кристаллическом содержимом гранул, что указывает на присутствие в нем тубулинового эпитопа. Возможно, это - кристаллическая форма мономерного тубулина, запасаемого гранулами.

Важную роль в стимулированном АДГ транспорте воды через клетки плотных эпителиев наряду с мнкротрубочками играют также микрофиламенты.

При иммуноцигохимическом изучении гранулярных клеток в электронном и конфокальном микроскопах было обнаружено уменьшение плотности анти-акгиновой метки в кортикальной области цитоплазмы при стимуляции водных потоков как обработкой АДГ, так и вымыванием аутакоидов. Вместе с тем, в остальных частях клеток они по-прежнему многочисленны и четко выявляются в обводненной цитоплазме. В присутствии крупных вакуолей, принимающих, по нашему мнению, участие в переносе воды через клетку, обнаруживается связь микрофиламентов с ограничивающими их мембранами. На некоторых микрофотографиях можно видеть заякоривание микрофиламентов в мембранах вакуолей. Наличие ионов кальция в цитоплазме вблизи вакуоли, продемонстрированное нами с помощью пироантимонатного метода, может, по-видимому, обеспечить сократительную функцию актиновых филаментов, участвующих вместе с микротрубочками в миграции вакуолей по цитоплазме.Эти результаты указывают на гетерогенность пула актиновых филаментов в клетке и участие примембранного актинового цитоскелега в регуляции водной проницаемости. Возможно, что деполимеризация кортикального актина облегчает подход гранул к поверхности и слиянию их мембран с апикальной мембраной.

Следует отмстить, что картины изменения цитоскелета и миграции гранул к апикальной поверхности при действии АДГ наиболее ярко выражены в условиях равенства осмотических концентраций по обеим сторонам стенки мочевого пузыря (стандартный раствор Рингера со стороны слизистой и серозной оболочек). 3.2.6. Заключение

Полученные результаты показали, что при использовании разных способов стимуляции транспорта воды через стенку мочевого пузыря лягушки происходят сходные изменения ультраструкгуры гранулярных клеток эпителия. До последнего времени считалось, что стимуляция транспорта воды через плотный осморегулирующий эпителий может быть вызвана лишь добавлением к серозной оболочке АДГ или ц-АМФ, участвующей в осуществлении эффекта АДГ. Другие способы увеличения проницаемости для воды осморегулирующих эпителиев были неизвестны. В настоящей работе впервые было показано, что увеличение осмотической проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки возможно при неоднократной смене раствора Рингера у серозной оболочки в отсутствие АДГ. По-видимому, при этом из клеток вымываются какие-то физиологически активные вещества (аутакоиды), стабилизирующие эпителий и обеспечивающие низкий уровень его осмотической проницаемости. Их удаление приводит к повышению проницаемости эпителия для воды. Полученные данные указывают на то, что в регуляции водной проницаемости участвуют арахидоновая кислота или продукты ее метаболизма - простагландииы. Важным фактом является то, что при вымывании аутакоидов обнаружены те же молекулярные механизмы, что и при действии АДГ: активация аденилат-циклазы и накопление ц-АМФ (Парнова, 1996).

Обнаруженные при обоих способах стимуляции транспорта воды изменения структурной организации таких клеточных органелл, как апикальная мембрана, примембранный акгиновый цитоскелет, микротрубочки, вакуолярная система свидетельствуют о наличии трансцеллюлярного переноса воды из просвета мочевого пузыря в кровь через гранулярные клетки.

При исходно низкой водной проницаемости для клеток плотного эпителия характерны следующие ультраструктурные особенности: инвертированное распределение ВМЧ на сколотых поверхностях апикальной мембраны гранулярных клеток (большое количество ВМЧ на Е-поверхности и малое - на Р); широкая зона плотного контакта, состоящая из 8-9 гребней; хорошо развитый аппарат Гольджи; большое количество специфических гранул со структурированным содержимым, распределенных по всей цитоплазме.

Наиболее убеди тельными данными в пользу трансцеллюлярного пути транспорта воды являются данные по изменению ультраструктурной организации апикальной мембраны гранулярных клеток при увеличении её водной проницаемости. Обнаруженное в настоящей работе наличие корреляции между площадью, занятой агрегатами ВМЧ, и величиной водного потока подтверждает гипотезу Шевалье и соавт. (1974) о том, что агрегаты ВМЧ, возникающие в апикальной мембране при действии АДГ, являются участками мембраны, обладающими высокой водной проницаемостью. Согласно полученным в настоящей работе данным, источниками высокопроницаемых для воды участков апикальной мембраны служат мембраны специфических гранул, формирующихся в аппарате Гольджи (Рис. II). Этот вывод не согласуется с распространенным в литературе мнением, что водные каналы встраиваются в апикальную мембрану с помощью специфических мембранных структур - агрефоров (Muller, Kacliadorian, 1980; Wade, 1980). Наши результаты указывают на то, что в условиях наибольшей водной проницаемости эпителия, стимулированной АДГ или удалением аутакоидов, вблизи апикальной мембраны обнаруживается наибольшее количество специфических гранул, причем многие из их мембран сливаются с апикальной мембраной клетки, не выбрасывая своего содержимого во внеклеточное пространство (отсутствие нормального экзоцитоза). При этом в цитоплазму, по-видимому, выходит ряд веществ, депонируемых в гранулах, необходимых как для слияния гранул, так и для реализации ответа клетки на гормон. В частности, такими веществами могут быть тубулин и кальций, аккумулируемый гранулами (Шахматова т др., 1982). Как известно, ионы

С 2+ г а неооходимы для реализации клеточного ответа на гормон.

Рис. II. Схематическое изображение возможного участия аппарата Гольджи в гидроосмотическом ответе гранулярных клеток. В ответ на воздействие АДГ специфические гранулы (ГР), формирующиеся в аппарате Гольджи, мигрируют к апикальной клеточной поверхности и их мембраны сливаются с апикальной мембраной, встраивая в нее водные каналы (ВК). Часть специфических гранул содержит кристаллическое содержимое, вступающее в реакию с антителами к тубулину. При выходе из гранул Са2' (прерывистые стрелки) происходит полпмеризция микротрубочек (МТ), выход их из гранул и ассоциация с ними MAP'S и деполимеризация актинового цптоскелета (МФ). Вода, вошедшая в цитоплазму клетки (сплошные стрелки), сегрегируется цис-цистернами аппарата Гольджи, мембраны которых связаны с мпкротрубочками и микрофпламентами. Выходя в латеральные межклеточные пространства, вода расширяет пх.

Для решения проблемы трансмембранного переноса воды в плотных эпителиях очень важен факт обнаружения в последние годы специализированных белков, аквапоринов, которым приписывается функция водных каналов (Agre et а!., 1993; Nielsen et al., 1993). Определение локализации аквапоринов в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки на электронномикроскопическом уровне является одной из первоочередных задач нашей работы в будущем.

Обнаруженные в работе изменения вакуолярного аппарата гранулярных клеток также являются важным свидетельством трансцеллюлярного транспорта воды, стимулируемого АДГ. Полученные данные дают возможность предположить, что крупные вакуоли, возникающие при усиленных водных потоках через эпителий, принимают участие в транспорте гипотонической жидкости от апикальной к базолатеральной поверхности клетки. Факты локализации вакуолей вблизи везикулярных элементов аппарата Гольджи и сходного распределения ВМЧ на их мембранах и мембранах цис-цистерн Гольджи дают нам право считать эти вакуоли дериватами аппарата Гольджи (Рис. 9, 11). Почти полное отсутствие в литературе подобных результатов в отношении осморегулирующих энителиев объясняется, по-видимому, использованием лишь стандартных электронно-микроскопических методов исследования, тогда как вакуоли могут быть выявлены только при щадящих методах фиксации.

Обнаружение "сократительных" вакуолей в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки в условиях повышенного транспорта воды свидетельствует о более широком распространении этой структуры, чем предполагали до сих пор. Присутствие сократительных вакуолей отмечалось лишь в клетках низших организмов, не обладающих осморегулирующими органами: у пресноводных простейших и губок, а также у водорослей на тех стадиях жизненного цикла, когда клетки лишены оболочек. В связи с тем, что эти организмы обитают в пресной воде, для них существует опасность гипотонического шока, которую они избегают с помощью сократительной вакуоли, являющейся одним из регуляторов клеточного объема. В ходе эволюции при формировании органов и тканей, клетки которых находятся в изоосмотическом окружении и лишены опасности разбухания, необходимость в сократительной вакуоли отпала. Однако и у многоклеточных животных не все клетки находятся в изоосмотической среде. В некоторых органах, в полости которых содержится гипотоническая жидкость, имеются так называемые плотные эпителии с осмотически непроницаемыми межклеточными плотными контактами и апикальными мембранами клеток. В определенных условиях такой эпителий становится высокопроницаемым для воды и ионов. Для сохранения структуры клеток в этих условиях необходим совершенный механизм внутриклеточной оеморегуляции. В дополнение к натриевому насосу, эту роль, по-видимому, выполняют обнаруженные в гранулярных клетках мочевого пузыря эволюционно древние струетуры - крупные вакуоли с примембранными структурами, аналогичные сократительным вакуолям простейших. Возможно, эти вакуоли, возникающие из цистерн аппарата Гольджи, не только спасают клетку от разбухания, но и транспортируют воду из полости пузыря в кровь. Таким образом, на мочевом пузыре лягушки четко прослеживается, на наш взгляд, функциональная гомология сократительной вакуоли простейших и аппарата Гольджи многоклеточных, на которую указывал Насонов (Nassonov, 1924).

Результаты морфологического и иммуноцитохимического изучения изменений клеточных структур при стимуляции водного транспорта указывают на существенную роль в механизме гидроосмотического эффекта АДГ элементов цитоскелста: микротрубочек и микрофиламентов. Участие микротрубочек и микрофиламентов в транспорте воды через эпителий мочевого пузыря жабы было продемонстрировано в физиологических работах с помощью деполимеризующих их агентов: колхицина и винбластина, цитохалазина В (Taylor, 1977;Sousa, 1985). Использование разных методов их визуализации в настоящей работе впервые позволило обнаружить существенное возрастание количества микротрубочек и деполимеризацию кортикальных микрофиламентов при стимуляции водных потоков. Высказывается предположение о том, что микротрубочки и микрофиламенты могут участвовать как в транспортировке водных каналов в мембрану из цитоплазмы с помощью гранул, так и в перемещении по клетке крупных вакуолей, транспортирующих воду через клетки.

Ввиду обнаружения в гранулярных клетках при действии АДГ большого количества микротрубочек, возникает вопрос о механизмах инициации полимеризации тубулина. Можно предположить, что одним из факторов, обуславливающих отсутствие спонтанной полимеризации тубулина, является его депонирование. В гранулярных клетках местом депонирования тубулина могут быть специфические гранулы. При этом высокая концентрация в этих гранулах ионов Са2+, обнаруженная в работе Шахматовой и др. (1982), по всей вероятности, препятствует полимеризации тубулина. Известно, что одним из звеньев цепи реакций, запускаемой действием АДГ, является высвобождение из внутриклеточных запасов ионов кальция. К высвобождению ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ приводит сигнальный путь, возникающий в результате гидролиза инозитолфосфолипидов до инозитол-трифосфата (Volpe et al., 1988). Возможно, кальций высвобождается из гранул в тот момент, когда происходит нарушение целостности мембраны гранулы при её слиянии с апикальной мембраной, после чего создаются условия, способствующие полимеризации тубулииа. Именно в таких гранулах, имеющих фрагментировапную ограничивающую мембрану и располагающихся вблизи апикальной мембраны, часто выявляются толстые микротрубочки или кристаллический белок, имеющий эпитопы, специфически связывающиеся с АТ к тубулину. Ассоциация микротрубочек с электронно-плотными глобулами (МАРз) происходит, по-видимому, уже в цитоплазме.

Проведенный в настоящей работе анализ распределения микрофиламентов в гранулярных клетках мочевого пузыря лягушки при стимуляции транспорта воды АДГ или удалением аутакоидов показал снижение плотности апикального слоя микрофиламентов. Распределение микрофиламентов в других участках гранулярных клеток практически не меняется. Этот фа кг свидетельствует о существовании гетерогенной чувствительности двух пулов актиновых филаментов гранулярных клеток к факторам регуляции проницаемости эпителия. Фрагментация кортикальных актиновых микрофиламентов может быть вызвана резким повышением концентрации ионов Са2+(Уш, 1987), высвобождающихся из гранул. Деполимеризация Р-акгина в примембранной апикальной области способствует слиянию мембран специфических гранул с апикальной мембраной и встраиванию в неё водо-проницаемых каналов. Это предположение вполне согласуется с идеей, что апикальный актиновый цитоскелет является клеточным аппаратом, ограничивающим и регулирующим процессы экзоцитоза (МиаПеп е( а1., 1995).

4. Поглощение шгписльных веществ клеткой посредством рецептор-оиосредоваиного эндоцпточа

В отличие от малых полярных молекул и ионов, проникающих через клеточные мембраны с помощью мембранных переносчиков и каналов, большинство маркомолекул, необходимых для нормального функционирования клеток, поглощаются ими посредством эндоцитоза. Эффективность поглощения специфических лигандов в значительной степени усиливается с помощью так называемого рецептор-опосредованного эндоцитоза, который обеспечивает механизм концентрирования поглощаемых веществ (Goldstein et al., 1985). Рецептор-опосредованный эндонитоз описан при поглощении холестерина (липопротепны ппзкой плотноеiи-l.DL), трапсферрина, инсулина, эпидермальпого фактора роста (EOF), асиалогликопртсипов (ASGP), 'материнских антител у новорожденных млекопитающих, питательных веществ при развитии ооцитов. Для рецептор-опосредованного эндоцитоза характерно связывание лиганда со специфическими рецепторами, интернализация комплексов в составе клатриновых пузырьков в цитоплазму и перенос соответствующего сигнала в ядро или цитоплазматические структуры.

Одним пз классических объектов для изучения рецептор-опосредованною эндоцитоза являются ооциты комара, на которых впервые были обнаружены окаймленные клатрином ямки и пузырьки (Roth, Porter, 1964). Позже было показано, что они являются универсальными структурами эукариот ической клетки, участвующей в рецептор-опосредованном эпдоцнтозе.

В развивающихся ооцитах комара Aedes aegypli происходит интенсивное поглощение желточных белков, необходимых для их развития. В отличие от соматических клеток, в которых лиганд утилизируется или возвращается в экстрацеллюлярнос пространство, ооциты накапливают желточные белки, формируя в своей цитоплазме желточные гранулы. Только в последние годы удалось выделить белок рецептора к основному желточному белку ооцита комара, вителлогенину, охарактеризовать его и выработать к нему поликлональные антитела (Sappinglon et al., 1995). Используя эти антитела, а также антитела к двум минорным специфическим желточным протеинам, 44КР и VCP, было проведено исследование их иммуно-локализации в развивающихся ооцитах комара. 4.1. Постановка экспериментов

Для работы использовались взрослые самки комара Aedes aegypli , которые содержались при температуре +27°С и кормились 10% раствором сахарозы на физиологическом растворе. Для инициации вителлогенеза 3-х-5-и дневные самки кормились кровью белых лабораторных крыс. Через час после кормления из брюшных сегментов комара вырезались яичники, содержащие ооцигы, и фиксировались для целей электронно-микроскопического исследования.

4.2. Судьба комплекса ренеитор-вптеллогенин па ранних стадиях эндоцнгоза

Во время вителлогенеза комаров желточные белки, синтезированные в жировом геле, доставляются по гемолимфе к развивающимся ооцитам. Для ооцитов, находящхся на стадии вителлогенеза, характерно наличие большого количества микроворсинок на их поверхности, между которыми располагаются многочисленные окаймленные ямки. На поверхности ооцита и в межклеточных пространствах фолликулярного слоя на ультрагонких замороженных срезах и на срезах материала, залитого в смолу, коллоидное золото метит как шпеллогенин, так и два других белка, сопровождающих вителлогепин: белок 44КР и вителлогенную карбоксипептидазу, VCP. Рецепторный к вителлогенину белок более надежно выявляется на замороженных срезах, в связи с чем было проведено сравнительное исследование иммунолокализации вителлогенина и его рецептора на ультратонких замороженных срезах.

С помощью коллоидного золота выявляется одинаковая локализация вителлогенина и его рецептора на плазматической мембране ооцита, главным образом между микроворсинками, на мембране микроворсионок в их основании и в окаймленных ямках. Верхние части микроворсинок практически лишены метки. В кортикальной цитоплазме вителлогенных ооцитов, как уже было указано, имеется очень большое количество окаймленных пузырьков. Цитоплазматическая поверхность окаймленных ямок и пузырьков (100-120 нм в диаметре) содержит характерный фусс-слой, клагрииовая природа которого четко демонстрируется с помощью поликлональных антител п кокыогага Протеин А-золото. Реакция на клатрин была проведена с помощью поликлональных антител к клатрину, выработанных в лаборатории A.C. Райхеля путем клонирования ДНК тяжел 1.1 х цепей клатрпна ооцитов комаров Aedes aeg)>pti (Kokoza et al., 1997). Кроме того, в прпмембраиной области цитоплазмы встречаются гладкие везикулы несколько большего размера (150-300 нм), имеющие овальную или неправильную форму и представляющие собой, по-видимому, сливающиеся друг с другом ранние эндосомы. Известно, что ранние эндосомы формируются из клатриновых пузырьков, быстро теряющих после отпочковывапия от плазматической мембраны свое клатрииовое окаймление и сливающихся друг с другом. При иммуноцнтохимическом анализе выявляется сходная локализация метки к вителлогенину и его рецептору как в окаймленных пузырьках, так и в ранних эндосомах. Обе клеточные органеллы содержат также метки к женским специфическим белкам: 44К.Р и VCP.

4.3. Диссоциация комплекса лпгаид-рсцептор п возвращение рецептора в плазматическую мембрану

После слияния ранних эндосом образуются поздние эндосомы, представляющие собой в ооцитах комара так называемые переходные желточные тела, накапливающие питательные- вещества (КаЛсИе), 1992). Эти гранулы также располагаются в основном в кортикальной ооплазме и содержат золотые метки к вителлогенину, 44КР, УСР и к рецептору. Однако, локализация пптеллогеммма-м рецептора к нему совпадает в этом компартменте не полностью. Характерной особенностью переходных желточных тел является наличие большого количества отростков с диаметром 40-50 нм, отходящих от их ограничивающих мембран. Анализ многих замороженных срезов показывает, что большинство этих тубулярных структур простирается в сторону поверхности ооцита. Некоторые отростки соединяются с плазматической мембраной. По-видимому, гладкие мембранные тубулярпые структуры, располагающиеся в кортикальной цитоплазме, представляют собой отростки мембран желточных гранул.

Мммуноцитохпмпческий анализ переходных желточных тел показывает, что метки к вителлогенину и его рецептору имеют в этой органелле различную локализацию. Рецептор обнаруживается, в основном, по периферии желточного тела и в его отростках, тогда как электронно-плотное содержимое центрального резервуара гранулы специфически метится антителами к вителлогенину. Это наблюдение свидетельствует о диссоциации комплексов рецептор-лиганд на стадии формирования поздих эндосом, переходных желточных гранул. Выявление рецептора в тубулярных отростках эндосомы, часто располагающихся в контакте с плазматической мембраной, может указывать на возвращение его и встраивание в плазматическую мембрану. Вероятно, циркулирующий рецептор может функционировать одновременно с вновь синтезированными и встраивающимися в плазматическую мембрану рецепторными белками. Специфика ооцита заключается в том, что лиганд не деградирует с помощью лизосом, как это происходит в соматических клетках, а накапливается в цитоплазме в виде желточных тел. Зрелые желточные тела ооцитов комара не содержат метки к рецептору, но заполнены частицами коллоидного золота, интенсивно метящими желточные белки: вителлогенин, который по мере созревания превращается в кристаллическую форму, вителлин, белок 44КР и УСР. Использование двойного мечения продемонстрировало колокализацию всех трех желточных белков в зрелых желточных телах. Однако, в пределах гранулы этн белки сегрегированы таким образом, что вителлин всегда располагается в центральной части гранулы, тогда как 44КР и УСР занимают её периферическую часть (Рис. 12).

Рис. 12 Участок зрелой желточной гранулы ооцнта комара с двойной меткой двух желточных белков (Vg. VCP).

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Снигиревская, Екатерина Сергеевна

7.Вывод ы.63

8. Публикации по теме диссертации.65

4.4. Заключение.44

5.Участие специализированных межклеточных контактов в межклеточном обмене ионами и метаболитами.46

5.1. Постановка экспериментов.48

5.2. Высокопроницаемый компонен т сенсомоторного синапса лягушки.49

5.3. Усиление межклеточного обмена в культуре Ь-клеток при обработке лантаном.51

5.4. Индукция высокопроницаемых контактов в культуре эпителиальных клеток.52

5.5. Структура и функция ссптированных контактов грегарин .55 5.6.Заключение.56

6.Общее заключение.58