Токсоплазмоз кошек в условиях мегаполиса: эпизоотология, диагностика, терапия и профилактика тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Олейников, Сергей Николаевич

• Олейников, Сергей Николаевич
• кандидат ветеринарных наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Олейников, Сергей Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Жизненный цикл токсоплазм и их эпизоотическая опасность для сельскохозяйственных животных.

2.2 Эпизоотологический и серологический мониторинг токсоплазмоза кошек.

2.3 Семиотика токсоплазмоза кошек.

2.4 Диагностика токсоплазмоза.

2.4.1 Серологическая диагностика.

2.4.2. Паразитологическая диагностика токсоплазмоза.

2.4.3. Прямое микроскопирование.

2.4.4 Выделение токсоплазм методом биопробы.

2.4.5 Паразитологический дифференциальный диагноз.

2.4.6 Полимеразная цепная реакция.

2.4.7 Реакция флуоресцирующих антител.

2.5 Ферментная система: гиалуроновая кислота - гиалуронидаза.

2.6Лечение животных при токсоплазмозе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Токсоплазмоз кошек в условиях мегаполиса: эпизоотология, диагностика, терапия и профилактика»

Актуальность проблемы. ФАО и ВОЗ рассматривают токсоплазмоз как важную проблему медицины и ветеринарии. Убиквитарное распространение токсоплазм за счёт наличия 3-х форм развития (эндозоиты, цистозоиты, ооцисты), их устойчивость к неблагоприятным условиям среды, отсутствие у них хозяинной специфичности, инвазивность всех стадий жизненного цикла, колосальная репродуктивная способность и многообразие путей заражения делает указанных простейших опасными для животных и человека. Это подтверждается таким фактом, что около 350 видов позвоночных являются промежуточными хозяевами указанных паразитов (Т.В.Бейер,1989). Следует также учесть, что токсоплазмы наряду с угрозой здоровья животному имеют и определённое социальное значение, поскольку миллионы кошек, особенно в крупных городах, находясь в непосредственной близости к человеку, представляют угрозу для здоровья населения, особенно детей.

В условиях антропургических очагов большое значение в качестве источников токсоплазм имеет домашняя кошка, которая является окончательным хозяином этих паразитов (W.Hutchison, 1965, 1967; L.Jacobs, 1967; J.Dubey 1968,1970; H.Scheffild, 1970; M.Melton, 1969; И.Г.Галузо, 1970 и.т.д.) В частности сообщается, что кошка съевшая одну инвазированную мышь, выделяет с фекалиями до 20 млн. ооцист токсоплазм за одну дефекацию (W. Tadrds, J. Laarman, 1982). Хотя количество таких кошек в естественных условиях невелико и обычно составляет в среднем 1% (J.Dubey et al., 1977)

В естественных условиях число реагирующих на токсоплазмоз кошек в иммунологичеких исследованиях в различных странах неодинаково от 1 до 96% (J.Dubey, 1968, 1973,1976, V.Svobodova et al., 1998, В.Ф.Новинская, 1966 и др.), что объясняется существованием в природе штаммов неодинаковой вирулентности (Б.А.Тимофеев, 1975; И.И.Вершинин, 1996 и др.)

Следует учесть, что некоторые штаммы, указанных паразитов, циркулируют в природе, минуя своего окончательного хозяина, то есть существуют без прохождения кишечной фазы развития, подтверждая свою факультативную гетерогенность (И.Г.Галузо и др., 1970, 1971, И.И.Вершинин, 1996).

Рассматривая симптоматику токсоплазмоза у кошек необходимо отметить её разнообразие: общее истощение, истечения из носа и глаз, слабость, депрессия, лихорадка, диарея, различные нервные расстройства и патологию органов зрения (В.Ф.Новинская, 1966; МРейас, ЮагрепШег, 1965, М.Ьаррт е1 а1., 1993, М.СИаукт е1 а1., 1994 и др.), хотя существуют другие взгляды - бессимптомное носительство является обычным явлением у кошек (Т.На§^ага е1 а1., 1981, .ШиЬеу, 1988)

Касаясь последнего, необходимо отметить наличие ряда работ по установлению в глазной жидкости токсоплазменных и выраженных хориоретинитов, увеитов (М.СИаукт е1 а1, 1994, Б.Вигпеу е1 а1. 1998) К сожалению, в литературе очень мало сведений по особенностям этой инвазии у кошек в условиях крупного мегаполиса, хотя паразитарные болезни собак и кошек в мегаполисе города Москвы занимают 4-5 место среди других патологий (М.В.Розовенко, 2002).

Как известно, для диагностики токсоплазмоза животных широко используются серологические методы: реакция связывания комплемента, флюресцирующих антител и другие способы диагностики, например копрологические, а в последнее время - полимеразная цепная реакция (Э.А.Кузнецова, 2001). Однако, их практическая ценность не равнозначна, поэтому до установления связи патологии, наблюдаемой у животных, и положительно реагирующих на токсоплазмоз, необходимо иметь высокочувствительный и простой по технике исполнения метод, который в одинаковой степени был бы приемлем и для практических ветеринарных лабораторий. Очень скудными являются сведения по лечению животных, больных токсоплазмозом, хотя описывается применение с положительным результатом химкокцида и байкокса (А.Н.Крылов, 1982; Е.М.Кузовкин, 2000, О.НапБЭп, 1996 и др.). Однако токсические свойства химкокцида и его эффективность при токсоплазмозе кошек в полной мере не изучены.

Таким образом, изучение эпизоотической ситуации, диагностики, терапии и профилактики токсоплазмоза кошек в условиях крупного мегаполиса Москвы и Московской области, а также разработка мер борьбы с токсоплазмозом является актуальной проблемой.

Цель исследования. В связи с изложенным, целью наших исследований было изучить эпизоотическую ситуацию, некоторые вопросы иммунитета, диагностики, терапии и профилактики токсоплазмоза плотоядных в г. Москве и Московской области.

Для выполнения поставленной цели нашими задачами было:

• изучить пути распространения токсоплазмоза кошек в условиях мегаполиса на примере г. Москвы и Московской области;

• провести сравнительное изучение жизненных циклов 2-х штаммов токсоплазм - высоковирулентного «ЯН» и слабовирулентного «3» и их факторов патогенности;

• провести сравнительное изучение следующих методов диагностики токсоплазмоза: РСК (реакция связывания комплимента), РФА (реакция флюресцирующих антител), ПЦР (полимеразная цепная реакция), копрологический метод исследования;

• изучить семиотику экспериментального токсоплазмоза кошек и пути заражения указанной инвазией;

• изучить токсические и лечебные свойства химкокцида при токсоплазмозе кошек;

• усовершенствовать меры борьбы с токсоплазмозом кошек в условиях мегаполиса.

Научная новизна работы. Изучена роль и место токсоплазмоза в формировании инвазионной патологии у плотоядных; степень контаминации внешней среды токсоплазмами; уточнена трансмиссия инвазии в современных условиях г. Москвы и Московской области. Установлены различия жизненных циклов токсоплазм, их вирулентность, а также изучены токсические и лечебные свойства химкокцида для кошек при экспериментальном токсоплазмозе.

Практическая значимость работы. Разработаны «Методические рекомендации «Токсоплазмоз животных и цистоизоспороз собак и кошек. Профилактика и меры борьбы». Рекомендации одобрены Секцией инвазионные болезни животных и утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.03.2005. Разработана методика лечения кошек, заражённых и больных токсоплазмозом.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены:

1. На Всероссийской практической конференции 8 июня 2004 г., г.Волгоград, РПК «Политехник».

2. На ежегодных научных конференциях ветеринарного отделения аграрного факультета РУДН.

3. На научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», ВИГИС, 2005, 25-27 мая.

Положения, выносимые на защиту:

• особенности эпизоотического процесса при токсоплазмозе кошек в условиях г. Москвы;

• семиотика экспериментального и спонтанного токсоплазмоза кошек;

• токсические и лечебные свойства химкокцида при токсоплазмозе кошек.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы из 229 источников, в том числе 169 иностранных и приложения. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 1 графиком и 14 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Олейников, Сергей Николаевич

5. ВЫВОДЫ

1. Проведенные в 2000-2004 гг. обследования кошек клинико-серологическими и копрологическими методами в условиях мегаполиса показали, что положительно реагировало на токсоплазмоз по РФА и РСК соответственно 33,8% и 23,4%. При копрологической проверке выявлено 7,3% кошек, выделяющих ооцисты.

2. Изучение путей возможного заражения кошек токсоплазмами показало, что оно наиболее легко осуществляется через слизистые оболочки ротовой полости, глаз, при алиментарном введении, через молоко и скарифицированную кожу. Ооцисты токсоплазм (штамм «3»), выделенные от кошек, при заражении цистными формами паразитов и введенные алиментарным путем собакам и кроликам вызывают кратковременные переболевание у собак и тяжелое с гибелью у кроликов.

3. У штамма токсоплазм, выделенного от зайца «3», установлено наличие кишечного цикла развития в организме кошек с образованием ооцист токсоплазм. Споруляция этих форм осуществляется во внешней среде. У токсоплазм штамма «ЯН» половой цикл в кишечнике кошки выявить не удалось. При сравнительном исследовании вирулентных свойств штаммов «ЯН» и «3» показано более высокая выраженность признака у штаммов «ЯН». Наличие гиалуронидазы и диффузионного фактора у них не установлено.

4. Реакция флуоресцирующих антител для диагностики токсоплазмоза кошек является более чувствительная, чем РСК.

5. Полимеразная цепная реакция при экспериментальном заражении кошек штаммом «ЯН» выявляет ДНК токсоплазм при исследовании фекалий.

6. Химкокцид обладает лечебным действием при его алиментарном введении в дозе 18-24 мг/кг массы тела кошки, 1 раз в день в течение 7 дней. Назначения препарата сопровождалось прекращением выделения ооцист.

7. ЛД50 химкокцида составляет 3335.5 мг/кг массы тела, что позволяет отнести его к 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007-76). Коэффициент кумуляции равен 8.16, что свидетельствует о его слабовыраженной кумуляции.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. На основании проведённых исследований разработаны методические рекомендации «Токсоплазмоз животных и цистоизоспороз собак и кошек. Профилактика и меры борьбы» Рекомендации одобрены Секцией инвазионные болезни животных и утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 04.03.2005. В методических рекомендациях большое значение уделено вопросам профилактики инвазии среди животных природного биоценоза, которые включают в себя мероприятия организационного, зоогигиенического и ветеринарно-санитарного порядка с учётом особенностей эпизоотического процесса. Предупреждение заражения человека и животных токсоплазмозом включает:

• Ограничение популяции кошек, регулирование их содержания и дегельминтизация, в том числе и против токсоплазмоза. Бродячих кошек уничтожают.

• Охрана кошек от заражения. Для предупреждения заражения кошек необходимо строго соблюдать правила убоя сельскохозяйственных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса.

• Кошек, находящихся в личном пользовании работников животноводства, а также в животноводческих помещениях, подвергают профилактической обработке химкокцидом в дозе 24 мг/кг корма 1 раз в день 7 дней подряд 1 раз в полгода или байкоксом в дозе 7 мл на 1 кг массы тела 3 раза в день двумя 3-х дневными курсами с интервалом 3 дня с питьевой водой.

• Больных токсоплазмозом сельскохозяйственных животных подвергают убою. Мясо от них используют после проварки или глубокого замораживания согласно п. 134, литеров «а» и «б» «Правила ветеринарно-санитарного осмотра убойных животных и ветеринарносанитарной экспертизы мяса и мясопродуктов». Субпродукты уничтожают.

• Подозрительных по заболеванию животных ставят на учёт. Молоко от таких животных разрешается использовать только после пастеризации.

• За всеми подозрительными по заболеванию животными ведут ветеринарные наблюдения и через 2-3 недели (в течение 3-х месяцев) проводят исследования сыворотки крови на токсоплазмоз с помощью РСК, или РФА. При отсутствии повышение или снижении титра антител этих животных переводят в группу здоровья.

• Мёртворожденные и абортированные плоды направляют для исследования в лабораторию.

• При дифференциальной диагностики у кошек необходимо исключить вирусный энтерит, ринотрахеит и панлейкопении.

• Шкуры, полученные после убоя больных или подозрительных по заболеванию токсоплазмозом животных, выпускают без ограничения после их консервирования (посолка, высушивание и др.)

• Личная профилактика. Поскольку заражение возможно при проглатывании ооцист с загрязнёнными фекалиями продуктов питания нельзя употреблять их в пищу в немытом виде, а также пить некипяченую воду из природных водоёмов.

• Дезинфекция. Помещение, где находились больные и подозрительные по заболеванию животные, дезинфицируют одним из следующих дез. растворов: 3%-ным раствором едкой щёлочи, 2%-ным раствором формальдегида, 2%-ным раствором формалина, суспензии хлорной извести с 5% активного хлора.

2. Разработана методика химиопрофилактики токсоплазмоза кошек с помощью химкокцида, который оказался малотоксичным препаратом со слабовыраженной кумуляцией.

109

2.7 Заключение

Приведённые литературные данные свидетельствуют о большом внимании различных исследователей к токсоплазмозу кошек. Это связано в первую очередь с тем, что кошка является окончательным хозяином токсоплазм и считается основным звеном в эпидемиологии этой болезни. Приведённые материалы показывают, что число положительно реагирующих на токсоплазмоз кошек в разных странах различное, как впрочем и количество у этих животных, выделяющих ооцисты.

Необходимо отметить, что в природе циркулируют штаммы токсоплазм неодинаковой вирулентности, что приводит часто к латентному течению болезни при заражении животных.

Хотя токсоплазмам присуще гетероксенный путь существования, тем не менее не у всех штаммов наблюдается кишечный цикл развития с образованием ооцист с последующей спорогонией. В частности существуют противоречивые сведения в этом отношении по эталонному штамму «ЯН».

Далее с появлением новых методов диагностики, например ПЦР, возникла необходимость сравнительного изучения существующих: РСК, РФА, полимеразной цепной реакции и копрологических методов исследования.

До настоящего времени также нет полной ясности по химиотерапии и химиопрофилактики кошек, больных токсоплазмозом, особенно по токсичности рекомендуемого для этой цели химкокцида.

Таким образом, становится очевидным необходимость изучения ряда вопросов по изучению серологического и клинического мониторинга указанной болезни у кошек в условиях мегаполиса на примере Москвы, как впрочем и других обстоятельств, которые изложены в задачах исследования.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Материалы и методы исследования, штаммы возбудителей.

Распространение и семиотику токсоплазмоза изучали путём клинических, серологических и копрологических методов исследования кошек, поступивших на приём в ветеринарные учереждения г. Москвы и Московской области в 2000-2004 гг. Для изучения жизненного цикла токсоплазм и клинического течения болезни у кошек осуществляли их заражение в лабораторных условиях.

В работе использовали 2 штамма токсоплазм: 1-й - известный как «ЯН», выделенный в Америке из головного мозга умершего ребёнка, по имени которого и назван указанный штамм; 2-й - маловирулентный, выделенный от зайца в Чехословакии - условно обозначенный «3». Оба штамма были получены из института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи.

Штаммы поддерживали путём периодических пассажей на белых мышах. Штамм «ЯН» перевивали один раз в 7 дней, штамм «3» один раз в 25-30 дней.

Сравнительное изучение этих штаммов проводили на белых мышах (200 голов) по следующим показателям:

• вирулентность при внутрибрюшном введении;

• наличие у штаммов гиалуронидазы и диффузнного фактора;

• степень инвазированности паренхиматозных органов мышей эндозоитами;

• наличие цист в головном мозге мышей;

• содержание паразитов в перитонеальном экссудате мышей;

• наличие токсоплазменных антител в сыворотке крови и кишечного цикла развития токсоплазм у котят;

• морфологические показатели: длину и ширину эндозоитов в микронах.

Для определения степени инвазированности паренхиматозных органов мышей делали мазки-отпечатки, которые фиксировали метиловым спиртом и окрашивали по Романовскому. Головной мозг мышей на наличие цист просматривали в нативном состоянии под микроскопом при увеличении х320. Размеры токсоплазм определяли с помощью окулярмикрометра под иммерсионным объективом микроскопа, количество паразитов в перитонеальном экссудате белых мышей подсчитывали в камере Горяева.

При изучении восприимчивости лабораторных животных (белых мышей и кроликов) к различным дозам токсоплазм штамм «ЯН» было проведено 14 опытов на 153 белых мышах и 3 опыта на 53 кроликах. Дозы токсоплазм для мышей составляли от 100 паразитов до 1320 тыс., для кроликов от 404 тыс. до 23 млн. Материал от павших кроликов подвергали патоморфологическому исследованию.

Изучение жизненного цикла развития токсоплазм проводили на 12 новорожденных котятах, которых заражали перорально эндозоитами токсоплазм штамма «ЯН» из перитонеального экссудата белых мышей. Для изучения жизненного цикла штамма «3» использовали 5 новорожденных котят. Для этой цели приготовляли суспензию из головного мозга мышей, заражённых этими штаммами, и вводили животным алиментарным путём. Котят убивали по 1-3 головы через 24, 48, 72, 96 и 144 часов. Из разных отделов тонкого кишечника (12-ти перстной, тощей и подвздошной) делали мазки-отпечатки со слизистой оболочки, а также брали по 2-3 кусочка, которые подвергали гистологической обработке по общепринятой в патологической анатомии методике.

Для получения ооцист токсоплазм 4 взрослые кошки и 9 котят (предварительно исследованных на наличие изоспор и яиц аскарид) заражали алиментарным путём соответственно эндозоитами токсоплазм штамма «ЯН» (перитонеальный экссудат белых мышей) и штамма «3» (суспензия головного мозга белых мышей). У животных через 2 -4 дня брали кал для исследования на наличие ооцист токсоплазм. С этой целью кал обрабатывали с помощью флотационного метода (И.И. Вершинин, 1966).

Изучение инвазивных свойств ооцист токсоплазм штамм «3». В надосадочный материал, содержащий ооцисты токсоплазм штамма «3», добавляли антибиотики (по 100000 ед. пеницилина, стрептомицина) для обезвреживания посторонней микрофлоры и вводили его в этот же день внутрибрюшинно 2-3 белым мышам. Остальную часть собранного материала сохраняли при температуре (+25 - +28°С) в течение 30-40 дней (для споруляции). Этот же материал вводили алиментарным путём в объёме 1 мл 2-3 белым мышам через 33, 34, 37 дней хранения. Через 25-30 дней мышей (если они не погибали) убивали, из органов делали мазки-отпечатки. Затем паренхиматозные органы в ступке измельчали с добавлением стерильного физиологического раствора хлорида натрия и антибиотиков и вводили новой партии из 2-3 мышей. Таким путём были проведены 5 пассажей. Мазки-отпечатки фиксировали в метиловом спирте, окрашивали по Романовскому и исследовали их на наличие токсоплазм.

Для изучения эпизоотической опасности ооцист токсоплазм для животных 5 собакам и 7 кроликам в возрасте 10 мес. была введена алиментарным путём суспензия фекалий кошек, заражённых токсоплазмами штамма «3» и 5 собакам суспензия фекалий кошек, заражённых штаммом «ЯН» после флотационной обработки и выдерживания при комнатной температуре в течение 33 дней. Объём вводимой суспензии составлял для кроликов - 0,5 мл (250 тыс. ооцист), для собак - 2 мл (около 1 млн. ооцист). Исследование подопытных животных включало тщательный клинический осмотр с определением общего состояния, упитанности, цвета видимых слизистых оболочек тела и отправления физиологических функций. Через 7; 9; 20 и 30 дней определяли уровень антител в крови с помощью реакции флюоресцирующих антител. Через 30 дней 3 собаки и 5 кроликов были убиты. Для гистологического исследования от них брали следующие органы: печень, селезёнку, почки, сердце, лёгкие, лимфатические узлы. Патматериал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. В работе использовали замороженные срезы. При окраске срезов использовали гематоксилин-эозин.

Для сравнения наблюдаемой патологии после заражения подопытных животных ооцистами токсоплазм во внимание принимали клинические признаки, отмечаемые у собак и кроликов после подкожного введения им эндозоитов штамма «ЯН».

Изучение наличия гиалуронидазы и диффузионного фактора у токсоплазм. Для проведения опытов было использовано два штамма токсоплазм: высоковирулентный «ЯН» и маловирулентный «3». С целью установления диффузионного фактора и гиалуронидазы были испытаны следующие препараты, изготовленные из токсоплазм:

1. Центрифугат перитонеального экссудата белых мышей. Для этого экссудат центрифугировали в течение 5 минут при 500 оборотов для осаждения клеточного детрита. Затем материал подвергали центрифугированию в течение 20 минут при 4000 оборотов для осаждения токсоплазм, которые затем 2 раза отмывали физиологическим раствором хлорида натрия. После этого осадок растворяли в дистилированной воде. Для работы также использовали надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования. Концентрация токсоплазм в дистилированной воде составляла в 1 мл от 100 тыс. до 5 млн. Этот препарат получали только из штамма ЯН и условно называли центрифугат.

2. Суспензия токсоплазм, полученная из перитонеального экссудата белых мышей. Принцип обработки аналогичен вышеуказанному, но только после внесения токсоплазм в дистилированную воду суспензию подвергали 10-кратному замораживанию и оттаиванию. Для работы использовали также надосадочную жидкость. Количество токсоплазм слабовирулентного штамма «3» и штамма «RH» состовляло соответственно в 1 мл от 2,7 тыс. до 13,500 тыс. и от 500 тыс. до 44 млн. Препарат условно назван лизат.

3. Лиофилизированный токсоплазмозный антиген для PCK, полученный из института им. Н.Ф.Гамалеи.

4. Необработанный перитонеальный экссудат белых мышей, заражённых слабо- и вирулентным штаммами токсоплазм. Количество паразитов соответственно составляло от 3 до 10 и от 10 до 30 млн. в 1 мл. Для получения перитонеального экссудата при заражении маловирулентным штаммом белым мышам вводили внутримышечно кортизон в дозе 1,25 мг 3 раза в течение 3-х дней.

Для изучения гиалуронидазной активности токсоплазм нами приготавливались растворы гиалуроновой кислоты. Растворы гиалуроновой кислоты готовили по методике Смирновой Л.Г. (1951). Методика определения гиалуронидазы in vitro предложена Мак-Клином в 1943 (McClean). В СССР Л.Г.Смирнова и В.И.Штуцер (1946) при упрощённой методике получения гиалуроната впервые применили эту реакцию для диагностики газовой гангрены у раненых. В последующем Л.Г.Смирнова (1951) упростила методику получения гиалуроновой кислоты.

Перед постановкой реакции муцинового теста производили титрование гиалуроновой кислоты. Цель титрования: определить наименьшую дозу раствора гиалуроновой кислоты, которая после пребывания в термостате даёт чёткий сгусток с уксусной кислотой. В наших исследованиях рабочая доза гиалуроновой кислоты составила 0,10,2 мл.

Для проведения реакции в 5 пробирок наливали от 0,1 до 0,5 мл препарата, полученного из токсоплазм. В каждую пробирку наливали по 0,1 - 0,8 мл гиалуроновой кислоты и дистилированной водой доводили до объёма 1 мл. После этого пробирки встряхивали и ставили в термостат при 37°С на 15 минут. Однако после ряда попыток мы стали проводить инкубирование смеси в течение 1 часа. После инкубирования пробирки охлаждали в течение 5 минут, затем прибавляли по 3 капли 15% раствора уксусной кислоты и производили учёт реакции.

Кроме того, гиалуронидазную активность изучали также по методике Бони и Орси (1963).

Кожный метод или метод in vivo отличается чувствительностью, но не специфичен, так как способностью усиливать распространение, кроме гиалуронидазы, обладают азопротеин, пептон и аскорбиновая кислота. Испытуемое вещество (0,2 мл) совместно с тушью (0,2), которая являлась индикатором, вводили внутрикожно белому кролику. На расстоянии 1015 см от этого места вводили контрольный раствор (0,2 мл физораствора натрия хлорида и 0,2 мл туши). Результаты опытов учитывали через 10-20 минут и через 24 часа после введения смеси путём измерения кутиметром площади распространения туши как при введении с испытуемым веществом, так и с физиологическим раствором. Показателем активности служит отношение площади опытного пятна к контрольному; вычисление площади пятна производили по формуле определения величины эллипса. Полученное отношение представляло собой так называемый показатель кожной диффузии.

Каждый препарат, полученный из токсоплазм, проверяли тремя вышеуказанными методиками одновременно: Мак-Клина-Смирновой, Бони и Орси и на кроликах. Из штамма «RH» центрифугатов было приготовлено 7 серий, лизатов - 7; из слабовирулентного штамма - 4 серии лизата; токсоплазмозный антиген для РСК-1 серия; перитонеальный экссудат белых мышей, заражённых сильно и слабовирулентным штаммом - по 1 пробе.

При экспериментальном токсоплазмозе кошек заражали воздушно-капельным, алиментарным и подкожным путями различными дозами токсоплазм (эндозоитами, цистами) 30-40-100-150-400 тыс. паразитов; нанесением перитонеального экссудата белых мышей, содержащих эндозоиты токсоплазм на конъюнктиву и кожу. Определяли возможность заражения через молоко, а также контактным путём. Под опытом находилось 12 котят, 33 кошки разного возраста и пород. У животных перед заражением брали кровь из v. saphena для серологических исследований в целях исключения спонтанного токсоплазмоза.

Серологические методы исследования. а) Реакция флуоресцирующих антител.

Антивидовые сыворотки кошек приобретали в институте иммунологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи.

Антиген. Для приготовления антигена 1 часть перитонеального экссудата белых мышей, заражённых токсоплазмами (штамм «RH») , разводили 9 частями 1% формалина и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. После центрифугирования осадок разводили стерильным физиологическим раствором (Гольдман, 1957).

При получении токсоплазмозного антигена использовали разное количество токсоплазм в 1 мл: 400 тыс., 750 тыс., 2,1 млн., 3,35 млн., оптимальным количеством указанных простейших, по нашему мнению, оказалось 2,1 млн. токсоплазм. Три капли этой суспензии наносили на предметное стекло, после чего мазок высушивали. В таком виде мазок может храниться в течение 4-6 месяцев при температуре +3-4°С.

Для фиксации токсоплазменных мазков (антиген) использовали 1% форматированный физиологический раствор, метиловый спирт и ацетон. Лучшими свойствами фиксатора обладал 1% формалинизированный физраствор. Для гашения аутофлюоресценции токсоплазм в некоторых опытах применяли растворы марганцевокислого калия (1:1000 в течение 5 сек) и метиленовой синьки (1:1000 в течение 30 сек). Необходимо отметить, что при их использовании получили отрицательный результат (свечение отсутствовало в положительных случаях).

В своих опытах мы изучали возможность сохранения и транспортировки токсоплазмозного антигена в виде суспензии на физ. растворе хлорида натрия в ампулах и пробирках. Суспензия токсоплазм, полученная по методу Гольдмана, после различного периода хранения (1; 3; 6 мес.) при температуре +2, +4°С наносились на предметные стёкла. После чего мазки высушивали и использовали в работе.

В качестве гетерологического антигена служили трихомонады. Систему оценки выясняли в процессе работ при сравнении свечения испытуемой, контрольной токсоплазмозной, отрицательной и гетерологичной сывороток ( от животных, больных паратуберкулёзом, инфекционным атрофически ринитом и вирусной пневмонией). Степень специфического свечения обозначали условными знаками: (-), (±), (+), (++), (+++), (++++).

Оценка свечения: (-), (±) - слабая флюоресценция токсоплазм в неопределённый цвет; (+), (++)- слабая флюоресценция токсоплазм в зелённый цвет; (+++), (++++)- флюоресценция токсоплазм в интенсивный зелённый цвет. Специфическим свечением считали свечение токсоплазм по их перифирии «феномен венчика» (рисунок 6).

В качестве контроля при непрямой реакции использовали мазок токсоплазм с испытуемой и меченой гомологичной и гетерологичной сыворотками; мазок токсоплазм с положительной и меченой гомологичной и гетерологичной сыворотками; мазок токсоплазм с отрицательной и меченой гомологичной и гетерологичной сыворотками.

Рис. 6. Реакция флуоресцирующих антител. Свечение токсоплазм ++++. Феномен «венчика».

При прямом методе использовали мазок токсоплазм с меченной нормальной; препарат с токсоплазмами, обработанный меченной положительной сывороткой, истощённой гомологичным антигеном.

Обработку мазков испытуемыми и мечеными сыворотками в прямой и непрямой реакции проводили общепринятыми методами. В работе использовали микроскоп МЛ-2, светофильтры СЗС-7-2, БС-8-2, ФС -1-2, запирающий Т-211. б) РСК ставили согласно наставлению по применению для диагностики токсоплазмоза животных в РСК № 13-7-2/1107 от 04.12.97. в) Постановка ПЦР осуществляется согласно временного наставления по применению тест-системы для диагностики токсоплазмоза животных методом полимеразной цепной реакции (ТОКС) №13-5-02/0941, ТУ № 9388-097-06-49-41-09-03.

Сравнительное изучение реакции флуоресцирующих антител, полимеразной цепной реакции и копрологического исследования. Для этой цели 2 кошки в возрасте 2-х лет (беспородные) были заражены алиментарным путём эндозоитами штамма « RH». У этих животных брали кровь и фекалии для исследования каждые 7 дней в течение 2-х месяцев.

Изучение токсических свойств химкокцида изучали на белых мышах при алиментарном введении препарата в дозе от 1500,4 до 6000 мг/кг (в объёме от 0,2 до 0,7 мл). Основные параметры токсичности вычисляли по методу Кербера (1931). Кумулятивные свойства химкокцида изучали по методу Lim (1961).

Лечебную эффективность химкокцида изучали на 14 котятах (2 группы по 7 животных) в возрасте 1,5-2 месяца, которых заражали подкожно токсоплазмами штамма «RH» в количестве 50-70 тыс. паразитов.

Котятам 1 группы химкокцид наносили на корень языка однократно в дозе 18 мг/кг; 2 - таким же образом один раз в день в течение 7 дней. Во второй серии опытов 8 котят (2 группы по 4 животных) в возрасте 1,5-2 месяца заражали алиментарным путём суспензией головного мозга мышей, содержащей цисты токсоплазм (маловирулентный штамм «3»). Химкокцид им наносили на корень языка в дозе 24 мг/кг в 1 группе однократно, в 2 - 1 раз в день в течение 7 дней.

Весь цифровой материал, полученный в работе, обрабатывали статистически по Стьюденту. Оценку среднестатистической ошибки проводили по таблице распределения Стьюдента для малых выборок значимости (ЛакинГ.Ф., 1990).

3.2 Результаты собственных исследований 3.2.1 Клинико-эпизоотологический мониторинг токсоплазмоза кошек

В течение 2000-2004 г. в Москве паразитологическому исследованию было подвергнуто 81 кошка различных пород и возраста. У этих животных брали кровь для серологических исследований (РСК, РФА) и фекалии на наличие ооцист токсоплазм. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Олейников, Сергей Николаевич, 2006 год

1. Агеев A.K. К вопросу о соотношениях между инвазивными и патогенными свойствами К. perfringens.//ЖМЭИб 1951, 10, 56-69.

2. Акиншина Г.Т., Быковский А.Ф.//Зоологический журнал 1964, 9:1391-1394.

3. Бейер Т.В. Клеточная биология споровиков возбудителей протозойных болезней животных и человека. JI. Наука, 1989, 184с.

4. Булава С.М. К вопросу о токсическом, терапевтическом и антитоксоплазменном действии хлоридина и сульфадимезина// Проблемы токсоплазмоза животных. Алма-Ата, 1966, 133-134.

5. Булат С.А., Стрелкова М.В., Сысоев В.В. Идентификация маркерных штаммов Leishmania major, L. turanica, L. gerbilli методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами. // Мед. паразитология и пар. болезни. 1992. -№1.- С. 21-22.

6. Бутабаева М., Абиджанов А. Спонтанная токсоплазмозная инфекция у котят в Узбекистане // Абстракты 9-й конференции паразитологов Украины.-Киев. 1980. часть I, с. 185-186.

7. Вершинин И.И. Кокцидозы животных и их дифференциальная диагностика-Екатеринбург, 1996.-256 с.

8. Вустина У.Ф. Серологическая диагностика токсоплазмоза животных. Алма-Ата- канд. дисс., 1970.

9. Галузо И.Г., Кравкова А.М. Авирулентность Т. gondii в формировании природных очагов токсоплазмоза. // В сб. Вопросы природной очаговости болезней, Алма-Ата- 1968- 156-195.

10. Галузо И.Г., Кривкова А.М. Новые каналы циркуляции токсоплазм в природе.// Изв. А.Н. Каз. ССР, серия биологическая, 1970. №5,38-44.

11. Галузо И.Г., Коновалова С.И. Диагностика токсоплазмоза животных. Алма-Ата, 1971, 100 с.

12. Галузо И.Г. и др. Жизненный цикл токсоплазм и их циркуляция в природе // В кн.: Вопросы природной очаговости болезней. Алма-Ата, 1972, 64-99.

13. Галузо И.Г., Коновалова С.И. Паразиты, как фактор, определяющий условия существования природного очага токсоплазмоза. // Вопросы природной очаговости болезней. Алма-Ата, 1973, 83-100.

14. Гейман Е.Я. Ферментная система гиалуронидазы гиалуроновая кислота в физиологии и патологии животного организма. // Успехи соврем, биологии. 1947,23,323-334.

15. Дука Т.В. Лечение экспериментального токсоплазмоза больных мышей делагилом. // Проблемы токсоплазмоза. Алма-Ата, 1966. С. 135-136.

16. Дука Т.В. Лечение токсоплазмоза в условиях эксперимента. // Проблемы токсоплазмоза. Алма-Ата, 1966.137 с.

17. Егоров A.C. О всасываемости бактерий лимфатическими железами // Русский архив патологии, клин, медицины и бактериологии. 1900, 9, 144-145.

18. Йыгисте А.К. Вопросы патогенеза и профилактики врожденного токсоплазмоза. Автореферат докт. дисс. Таллинн, 1973,32 с.

19. Каган Ю.С., Станкевич В.В. Актуальные вопросы гигиены труда, промышленной токсикологии и профессиональной патологии в нефтяной и нефтехимической промышленности. Уфа, 1964,203 с.

20. Ковбасюк Р. и др. Обнаружение ооцист токсоплазм у кошек. // Проблемы токсоплазмоза. 1975, Киев, часть 2-3.

21. Коновалова С.И. Биологические особенности токсоплазм, их циркуляция в природе и вопросы иммуногенеза. // Омск, 1972. Автореферат докт. диссертации. 40 с.

22. Контримавичус JI.M. Влияние гиалуронидазы на проявление иммуногенных и аллергенных свойств микробов. // Автореферат канд. дисс., М, 1956. 20 с.

23. Крамарж Я. Применение метода флуоресцирующих антител в серологической диагностике токсоплазмоза.// Мед. паразитология и паразитарные болезни, 1964,1963,4,454-460.

24. Кротенков В.П., Онуфриев В.А. Паразиты кишечника собак и кошек, их санитарно-эпидемиологическое значение. // Проблемы разработки регион, модели устойчивости. Доклады на практ. конференции. 1997, вып. 1,386-388.

25. Кудряшов A.A. Патоморфологические изменения при системаникозе, токсоплазмозе, вирусной лейкемии у кошек. // Вет. практика, 1998, №2, 13-15.

26. Кузнецова Э.А. Диагностика протозойных заболеваний животных с помощью полимеразной цепной реакции. // Автореф. дисс. канд. вет. наук-2001, 22 с.

27. Кузнецова Э.А., Бенедиктов И.И. и др. Разработка амплификационной тест-системы на основе ПЦР для идентификации Neospora caninum. // Тр.ВИГИС. 2000. 36. 85-95

28. Кузьмин H.A. Приготовление и использование флуоресцирующих антисывороток. // В кн.: Вет. лабораторная практика. 1963,1,174-87.

29. Ларионов А.П., Кузьмин H.A. Методика приготовления и использования флуоресцирующих антисывороток. Изд-во МВА, Москва, 1958.

30. Лапшин Н.М., Коломацкиа A.M. Проблемы токсоплазмоза животных. Алма-Ата, 1966, 39-40.

31. Левит A.B. Факторы, влияющие на заражение кошек токсоплазмозом // Труды 2-го Всесоюзного симпозиума по токсоплазмозу. Москва, 1976, 103-104.

32. Лутохин С.Ж. Ветеринария, 1962,3,60.

33. Магеррамов Б.Г., Алекперов A.C. Токсоплазмоз животных в Азербайджане. //Проблемы токсоплазмоза, Алма-Ата, 1966, 73.

34. Макаров В.В. О проблеме причинности инфекционных заболеваний. // Вестник PACXH, 2003, 5, 11-14.

35. Марков A.A. и др. Экспериментальный токсоплазмоз крупного рогатого скота и свиней// Малоизученые заболевания с.х. животных. М. Колос, 1967. 209-216.

36. Махташ К изучению токсоплазмоза домашних животных в Азербайджане. // Алма-Ата, 1966, 73-74.

37. Медведь Л.И. Справочник по пестицидам. Киев, 1974,424.

38. Миагирева М.Ф., Глейберман С.Е., Айлярова С.Т. Фермент гиалуронидаза в культурах Entamoeba histolytica. // Изв. АН Туркменской ССР, серия биологических наук, 1963, 6,34-41.

39. Новинская В.Ф. Токсоплазмоз ферменных животных. // Проблемы токсоплазмоза, 1966, Алма-Ата, 63-64.

40. Павловский E.H. Общие проблемы паразитологии и зоологии. М.-Л., 1961.

41. Пьянов Р.П., Котков C.B. Специфичность серологических сдвигов при токсоплазмозе, подтвержденное реакцией нейтрализации цитопатогенного действия токсоплазм в культуре ткани и реакцией связывания белка. //В кн.: «Токсоплазмоз». Киев, 1966, 180-185.

42. Поломошнов А., Петешев В.М. Домашняя кошка как источник токсоплазменной инфекции. // Жизненный цикл токсоплазм. Алма-Ата, 1974, 109-116.

43. Радченко А.И. Современное представление о жизненных циклах цитообразующих кокцидий (Eucoccidia, Sporozoa, Apicomplexa). // Цитология, 1994,4,6,466-478.

44. Розовенко M.B. Эпизоотологический надзор при основных паразитозах в европейской части НЗ России. Автореферат докт. дисс., Тюмень, 2002, 34 с.

45. Серебровский П.В. История органического мира. М, 1930.

46. Скавинский Ш.В. Новинская В.Ф. Влияние фолиевой кислоты на лечение токсоплазмоза белых мышей и кроликов. // Проблемы тоскоплазмоза. Алма-Ата, 1966, 134-135.

47. Смирнова Л.Г., Штуцер В.И. Опыт применения реакции Мак-Клина (фактор распространения в клинической практике). // Хирургия, 1946, 11,5-10.

48. Смирнова Л.Г. Препарат гиалуроновой кислоты для определения инвазивных свойств микробов. //ЖМЭИ, 1951, 10, 52-56.

49. Соколов А.Н. Химиопрофилактика и химиотерапия токсоплазмоза млекопитающих и птиц. Автореферат докт. дисс. Ленинград, 1982, 46 с.

50. Сченснович В.В., Губергриц М.В. Влияние гиалуронидазы на заражаемость крыс разными штаммами Entamoeba histolytica. // Мед. паразитология и пар. болезни, 1965, 5,536-539.

51. Теохаров Б.А. Экспериментальные исследования некоторых патогенных свойств Т. vaginalus. Тр. Омского мед. ин-та, 1957, 21, 287-233.

52. Тимофеев Б.А. Диффузионный фактор и гиалуронидаза у трихомонад свиней и Т. foe tus. Riedmüller, 1928. // Труды ВИЭВ, 1962, 28,306-308.

53. Тимофеев Б.А. Токсоплазмоз крупного рогатого скота (биология, паразита, эпизоотология, клиническая картина, диагностика, паразитоценозы и иммунитет). Автореферат докт. дисс. 1975. 42 с.

54. Троценко Н.И. Диагностика токсоплазмоза методом реакции нейтрализации в культурах ткани. // В сб. Проблемы токсоплазмоза. Алма-Ата, 1968,44-45.

55. Умбалиев Е. Латентная токсоплазменная инфекция у домашних кошек. // Труды 2-го конгресса протозологов в Киеве, 1978, С. 113114.

56. Хамцов В.Г. Обнаружение гиалуронидазы в культуре Balantidium coli. // Мед. паразитология и пар. болезни. 1966,2, 204-206.

57. Шевкунова Е.А., Виноградова Л.И., РФА (непрямой метод) при экспериментальном токсоплазмозе у белых крыс. // Мед. паразитология и пар. болезни, 1970, № 6, 653-657.

58. Яценко Т.Н. К вопросу о механизме действия фактора распространения. //ЖМЭИ, 1954,2, 65-68.

59. Arceher J. et al. Immunofluorescence in the diagnosis of ovine abortion due to T. gondii. // Vet. Rec. 1968, 78,369-373.

60. Archer J. et al. Further Field studies on the Fluorescent Antibody Test in the diagnosis of ovine Abortion to Toxoplasmosis. // Vet. Rec.,1971, 88, 178-180.

61. Balan J. et al. Antibiot.l963,16,4,157-160.

62. Bartels J. Toxoplasma pnevmonia in the cat. // Feline Pract. 1972, 2,11.

63. Berengo A. et al. Diffiisione della Toxoplasmosis in provincia di Terama. Indagine sierologica mediante la reaziovu di Sabine Feldman. // Parasitilogia (Rome). 1972,14,53.

64. Behymer B. et al. Serologic diagnosis of toxoplasmosis and prevalence of Toxoplasma gondii antibodies in selected feline, canine and humen population. //J. Am. Vet. Med. Ass. 1973,162,11,959-963.67,68.69,70,71,72,73,74