Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Юршев, Владимир Александрович

• Юршев, Владимир Александрович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юршев, Владимир Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие свойства транскетолазы.

1.2. Структура транскетолазы.

1.3. Сравнение структур ano- и холотранскетолазы.

1.4. Кофакторы транскетолазы.

1.4.1. Взаимодействие апотранскетолазы с коферментом.

1.5. Структура субстратного канала.

1.5.1. Интермедиат транс кето л азной реакции -дигидроксиэтилтиаминдифосфат.

1.6. Механизм транскетолазной реакции.

1.7. Оптические характеристики транскетолазы.

1.7.1. Изменение оптических характеристик транскетолазы при связывании субстратов. sy i 04

1.8. Влияние двухвалентных катионов, Са и Mg , на конформацию и стабильность транскетолазы.

1.9. Функциональная неэквивалентность активных центров транскетолазы.

1.9.1. Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков.

1.9.2. Неэквивалентность активных центров по связыванию кофермента.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Связывание субстратов с транскетолазой Saccharomyces Cerevisiae и их каталитические превращения»

Актуальность проблемы. Транскетолаза (ТК) катализирует расщепление С-С связи субстрата донора (кетозы) и перенос образовавшегося двууглеродного фрагмента, остатка гликольальдегида, на субстрат-акцептор, функцию которого выполняют различного рода альдегиды. Фермент обладает широкой специфичностью, как по отношению к субстрату-донору, так и по отношению к субстрату-акцептору. Наряду с двусубстратной, трансферазной реакцией, ТК способна катализировать и односубстратную реакцию, с использованием только субстрата-донора, в отсутствие субстрата-акцептора. Продуктом реакции в этом случае является эритрулоза, которая образуется в результате конденсации двух остатков гликольальдегида, образовавшихся в результате расщепления двух молекул субстрата-донора.

Транскетолазная реакция необратима только в том случае, когда в качестве субстрата-донора используется гидроксипируват.

Кофакторами ТК являются ТДФ и ионы двухвалентных металлов. В нативном холоферменте обнаружен только Са2+ в количестве 2 г • атом на моль белка. Другие двухвалентные катионы с успехом способны его заменить, причем на общей активности фермента это, по существу, не сказывается. В то же время, сравнительные исследования, проведенные с использованием в качестве кофактора Са и Mg , показали, что природа катиона существенно влияет на конформационные характеристики ТК.

Транскетолаза является простейшим представителем тиаминдифосфат-зависимых ферментов, состоит из двух идентичных субъединиц, имеет два активных центра. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была первым тиаминдифосфат-зависимым ферментом, для которого был сделан РСА, определена пространственная структура ano- и холофермента, идентифицированы функциональные группы кофермента и апобелка, подтверждены данные о наличии в ферменте ионов кальция, по одному на активный центр.

Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы было исследование взаимодействия холотранскетолазы с физиологическими субстратами, ксилулозо-5-фосфатом и рибозо-5-фосфатом, и их каталитических превращений в отсутствие и в присутствии извне

24* 24* добавленных катионов - Са и М^ .

Задачи исследования.

1. Выявить влияние ионов двухвалентных металлов на кинетические характеристики фермента.

2. Определить неэквивалентность активных центров для транскетолазы.

3. Исследовать влияние ингибитора феррицианида на активные центры транскетолазы.

Научная новизна работы. Впервые показано, что для проявления каталитической активности холотранскетолазы достаточно наличия только структурированных в её составе ионов кальция.

24*

Установлено, что извне добавленный Са повышает общую активность холотранскетолазы, в равной степени выраженную по отношению к каждому из двух активных центров.

На основе данных проведен количественный анализ процесса взаимодействия с транскетолазой как субстрата-донора (ксилулозо-5-фосфата), так и субстрата-акцептора (рибозо-5-фосфата). Определены соответствующие значения Кш и Ушах.

Показано, что исходно, в отсутствие свободных двухвалентных катионов, активные центры холотранскетолазы эквивалентны как по отношению их сродства к обоим субстратам, так и по их каталитической активности. В присутствии свободного, извне добавленного Са , выявляется их неэквивалентность — индуцируется отрицательная кооперативность при связывании обоих субстратов и положительная кооперативность - при их каталитическом превращении. В присутствии же М§2+, вместо ионов кальция, неэквивалентность активных центров не проявляется.

Выявлена неэквивалентность активных центров холотранскетолазы по их восприимчивости к ингибирующему действию искусственных акцепторов электронов.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в формировании новых фундаментальных представлений о механизме функционирования и регуляции транскетолазы. Под механизмом функционирования, в данном случае, следует понимать процессы взаимодействия фермента с кофакторами, связывания субстратов и их каталитические превращения, характеристики индивидуальных стадий этих процессов, что открывает новые возможности в исследовании тиаминдифосфат-зависимых ферментов.

Практическое значение работы: предлагаемые методы получения транскетолазы с одним функционирующим активным центром могут служить основой при разработке аналогичных методов, применительно к другим ферментам.

Результаты работы, касающиеся влияния двухвалентных катионов на кинетические характеристики транскетолазы, могут быть использованы при изучении других тиаминдифосфат-зависимых ферментов.

Представленные в работе результаты, заключения и выводы могут быть использованы при чтении лекций по энзимологии и биохимии, а также в лабораторной практике на кафедрах биохимии биологических факультетов и медицинских институтов.

Научные положения, выносимые на защиту.

Наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента.

2. Ионы двухвалентных металлов влияют на общую активность холотранскетолазы.

3. Неэквивалентность активных центров транскетолазы определяется только в присутствии свободного, извне добавленного Са , в отличие от ионов магния, которые не способны индуцировать неэквивалентность.

4. Восприимчивость активных центров транскетолазы, сформированных при участии разных таутомерных форм тиаминдифосфата, неодинакова к воздействию феррицианида.

Апробация результатов исследований. Результаты исследований были неоднократно представлены и обсуждены на семинарах отдела биохимии животной клетки НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского и на совместном заседании отдела биохимии животной клетки и факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В Ломоносова, а также на конференциях молодых ученых "Ломоносов 2006" (Москва, 2006) и "Ломоносов 2008" (Москва, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению результатов и их обсуждений, а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 33 рисунками и содержит 4 таблицы. Библиографический указатель включает в себя 84 источника: 22 отечественных и 62 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Юршев, Владимир Александрович

выводы

1. Разработаны методы получения форм транскетолазы только с одним функционирующим активным центром: соответственно полухолотранскетолаза 1 и полухолотранскетолаза 2.

2. Активные центры холотранскетолазы, содержащие в своем составе структурированные ионы кальция, не различаются по каталитической активности и имеют одинаковое сродство к субстратам.

3. В присутствии свободных ионов кальция активные центры становятся неэквивалентными: индуцируется отрицательная кооперативность при связывании как ксилулозо-5-фосфата, субстрата-донора, так и рибозо-5-фосфата, субстрата-акцептора, и положительная кооперативность при их каталитическом превращении; кроме того — повышается общая активность фермента.

4. Ионы магния, в противоположность ионам кальция, не способны индуцировать неэквивалентность активных центров транскетолазы.

5. Структурно идентичные активные центры транскетолазы не являются функционально идентичными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Двухвалентные катионы, в том числе и кальций, который обнаружен в нативном холоферменте, являются кофакторами транскетолазы. Другими словами, при определении активности всегда добавляют в среду двухвалентные катионы и ТДФ. Оказалось, что если в качестве ферментного препарата использовать холоТК, то добавление двухвалентных катионов не требуется. Активность определяется и в их отсутствие, хотя и несколько пониженная (рис. 19 и табл. 2, 3). Естественно при этом, что до добавления Са свободные двухвалентные катионы были удалены из реакционной среды.

Таким образом, наличие двух структурированных в составе молекулы холоТК атомов кальция оказывается достаточным для проявления каталитической активности фермента. При этом, сродство двух активных центров и к субстрату-донору, К5Ф, и к субстрату-акцептору, Р5Ф, определяется одинаковым. Не различаются они и по величине каталитической активности. Картина резко меняется, когда в реакционную среду добавляют ионы кальция (табл. 2 и 3). Активные центры становятся неэквивалентными: повышается сродство обоих субстратов к одному из них и понижается - к другому. В противоположном направлении меняется каталитическая активность активных центров: тот, который в присутствии Са2+ приобретает более высокое сродство к субстратам, становится менее активным и наоборот. Обращает на себя внимание одинаковая направленность изменений, в присутствии Са , кинетических параметров для обоих субстратов и идентичность, или малое различие их цифровых значений (табл. 2 и 3). Этого, по-видимому, следовало ожидать, так как субстраты близки по структуре, имеют общий субстратный канал и общую субстратную площадку на ферменте.

Кинетические характеристики полухолоТК 1 и полухолоТК 2, ферментов, в которых функционирует только один из двух активных центров, по существу не различаются между собой. Это справедливо, как для К5Ф, так и для Р5Ф, что означает, принимая во внимание данные,

Л | полученные с холоТК в отсутствие Са (табл. 2 и 3), что исходно эквивалентные активные центры ТК становятся неэквивалентными под влиянием извне добавленного Са2+: индуцируется отрицательная кооперативность при связывании субстратов и положительная кооперативность - при их каталитическом превращении.

1 О г

В отличии от Са , кинетические характеристики, полученные с М^ , не отличаются от кинетических характеристик, полученных в отсутствие извне добавленных катионов, если только не считать некоторого повышения значения Кш для Р5Ф (ср. табл. 3 и 4). То есть, М§2+ не способен, в отличие

Гу I от Са , индуцировать неэквивалентность активных центров ни при связывании субстратов, ни при их каталитическом превращении.

По существу, подобная картина наблюдалась и ранее при изучении п I взаимодействия ТДФ с апоТК. В присутствии Са активные центры проявляли явно выраженную отрицательную кооперативность - значение

Кт для одного из активных центров примерно на порядок превышало

2+ значение Кш для другого активного центра. В присутствии же М^ неэквивалентность активных центров или не выявлялась или если и выявлялась, то в очень слабой степени. И только в присутствии субстрата-донора (но не субстрата-акцептора) наличие отрицательной кооперативно сти обнаруживалось в явной степени [ЕБакоуа, О.А., МезЬа1кта, Ь. Е., Оо1Ык, К, НйЬпег, в., КосЬе1:оу, О.А., 2004; Есакова, О.А., Ханова, Е.А., Мешалкина, Л.Е., Голбик, Р., Хюбнер, Г., Кочетов, Г.А., 2005].

Инактивация транскетолазы под действием феррицианида обусловлена, по всей видимости, нарушением целостности тиаминдифосфата. Активные центры транскетолазы работают одновременно, но в противофазе, то есть, когда в одном из них кетоза расщепляется (первая стадия транскетолазной реакции), в другом она образуется (вторая стадия транскетолазной реакции - конденсация остатка гликольальдегида с субстратом-акцептором) [Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А., 19936; Kovina, M.V., and Kochetov, G.A., 1998]. Исходно, по-видимому, тиаминдифосфат в одном из активных центров находится, в аминоформе, а в другом - в иминоформе [Kovina M.V., De Kok, A., Sevostyanova, I.A., Khailova, L.S., Belkina, N. V., Kochetov, G.A., 2004]. В процессе катализа осуществляется взаимопереход этих двух таутомерных форм кофермента [Schellenberger, А., 1998]. Нельзя исключить, что восприимчивость активных центров транскетолазы, сформированных при участии разных таутомерных форм тиаминдифосфата, неодинакова к воздействию феррицианида. Это и могло бы быть объяснением инактивации одного из них и стабильности - другого.

Так или иначе, полученные результаты являются еще одним доказательством функциональной неэквивалентности активных центров транскетолазы.

Согласно данным РСА, субъединицы димерной молекулы транскетолазы и ее активные центры не различаются между собой. Однако, структурная идентичность (или отсутствие различий) еще не говорит об их (активных центров) функциональной идентичности. Свидетельством чему являются результаты, полученные в процессе проведения настоящей диссертационной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юршев, Владимир Александрович, 2010 год

1. Есакова O.A. Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами. Дис. . канд. биол. наук: 03.00.04 М.: МГУ. - 2005. - 140 с.

2. Есакова, O.A., Ханова, Е.А., Мешалкина, Л.Е., Голбик, Р., Хюбнер, Г., Кочетов, Г.А. Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию холофермента и его стабильность // Биохимия. 2005. — Т. 70. - С. 933940.

3. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. I. Определение типа и количества существенных остатков // Биохимия. 1993а. - Т. 58. - С. 1330-1340.

4. Ковина М.В., Куимов А.Н., Кочетов Г.А. Существенные остатки тирозина транскетолазы пекарских дрожжей. II. Исследование функции существенных остатков тирозина И Биохимия. 19936. — Т. 58. - С. 1341— 1350.

5. Ковина М.В., Селиванов В.А., Кочевова Н.В., Кочетов Г.А. Исследование кооперативного связывания кофермента активными центрами транскетолазы методом кинетического моделирования // Биохимия. -1997.-Т. 63.-С. 1155-1163.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа, 1980.-272 с.

7. Кочетов Г.А. Транскетолаза: структура и механизм действия // Биохимия. 1986. - Т. 51. - С. 2010-2029.

8. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. Реконструкция холотранскетолазы из апофермента и кофермента // Биохимия. 1973а. - Т. 38. - С. 552-559.

9. Кочетов Г.А., Изотова А.Е. Условия отщепления тиаминпирофосфата от холотранскетолазы // Биохимия. 19736. — Т. 38. — С. 954-957.

10. Кочетов Г.А., Кобылянская K.P., Белянова Л.П. Аминокислотный состав транскетолазы пекарских дрожжей // Биохимия. 1973. — Т. 38. — С. 1303-1306.

11. Кочетов Г.А., Усманов P.A. Изучение транскетолазы методом дисперсии оптического вращения // Биохимия. — 1970. Т. 35. - С. 611-621.

12. Кочетов Г.А., Филиппов • П.П. Влияние двухвалентных металлов на положение оптимума pH транскетолазной реакции // ДАН СССР. -1970а.-Т. 191.-С. 234-236.

13. Кочетов Г.А., Филиппов П.П. Кальций кофактор транскетолазы пекарских дрожжей // Биохимия. -19706. — Т. 35. - С. 422-424.

14. Куимов А.Н., Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Функциональная карбоксильная группа в активном центре транскетолазы // Биохимия. -1993.-Т. 51.-С. 1908-1918.

15. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Роль остатков гистидина транскетолазы пекарских дрожжей // ДАН СССР. 1979. - Т. 246. - С. 228-231.

16. Мешалкина JI.E., Кочетов Г.А. Участие двухвалентных катионов во взаимодействии тиаминпирофосфата с апотранскетолазой пекарских дрожжей // ДАН СССР. 1979. - Т. 248. - С. 1482-1486.

17. Пустынников М.Г., Нейф X., Усманов P.A., Шелленбергер А., Кочетов Г.А. Функциональные группы тиаминпирофосфата в холотранскетолазе //Биохимия. 1986.-Т. 51.-С. 1003-1016.

18. Соловьева О.Н. Выделение и свойства нековалентного комплекса транскетолазы с РНК // Биохимия. 2002. - Т. 67. - С. 804-809.

19. Страйер Л. Биохимия. М.: Мир, 1985. - Т. 2. - 402 с.

20. Усманов Р.А., Кочетов Г.А. Связывание субстратов с транскетолазой пекарских дрожжей. Функция анионной группы субстрата-донора // Биохимия. 1983.-Т. 48.-С. 550-558.

21. Филиппов П.П., Тихомирова Н.К., Кочетов Г.А. Использование гель-фильтрации для изучения связывания лигандов с ферментами // В кн. Физико-химические методы молекулярной биологии. М.: Изд-во МГУ, 1978.-С. 57-64.

22. Cavalieri, S., Neet, K.E., Sable, H.Z. Enzymes of pentose biosynthesis. The quaternary structure and reacting form of transketolase from baker's yeast // Arch. Biochem. Biophys. 1975. -V. 171. - P. 527-532.

23. Christen, P., Cogoli-greuter, M., Healy, M.J., Lubin, D. Specific irreversible inhibition of enzymes concomitant to the oxidation of carbanionic enzyme substrate intermediates by hexacyanoferrate (III) // Eur. J. Biochem. — 1976. -V. 63.-P. 223-231.

24. Christen, P., Gasser. A. Production of glycolate by oxidation of the 1, 2-dihydroxyethyl-thiamin-diphosphate of transketolase with hexacyanoferrate (III) or H202 // Eur. J. Biochem. 1980. - V. 107. - P. 73-77.

25. Datta, A., Racker, E. Mechanism of action of transketolase. I. Properties of the cristalline yeast enzyme // J. Biol.Chem. 1961a. - V. 236. - P. 617-624.

26. Datta, A.G., Racker, E. Mechanism of action of transketolase. II. The substrate-enzyme // J. Biol.Chem. 19616. - V. 236. - P. 624-628.

27. Dobritzsch, D., Konig, S., Schneider, G., Lu, G. High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis. Implications for substrates activation in pyruvate decarboxylases // J. Biol. Chem. 1998.- V. 273. P. 20196-20204.

28. Dyda, F., Furey, W., Swaminathan, S., Sax, M., Farrenkopf, B., Jordan, F. Catalytic centers in the thiamin diphosphate enzyme pyruvate decarboxylase at 2,4 Ä resolution // Biochemistry. 1993. - V. 32. - P. 6165-6170.

29. Egan, R.M., Sable, H.Z. Transketolase kinetics. The slow reconstitution of the holoenzyme is due to rate-limiting dimerization of the subunits // J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 4877-4883.

30. Esakova, O.A., Meshalkina, L. E., Golbik, R., Hübner, G., Kochetov, G.A. Donor substrate regulation of transketolase // Eur. J. Biochem. 2004. - V. 271.-P. 4189-4194.

31. Esakova., O.A., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. Effects of transketolase cofactors on its conformation and stability // Life Sei. 2005. - V. 78. - P. 813.

32. Fiedler, E., Golbik, R., Schneider, G., Tittmann, K., Neef, H., König, S., Hübner, G. Examination of donor substarte conversion in yeast transketolase //J.Biol. Chem. -2001.-V. 276.-P. 16051-16058.

33. Fletcher, T., Kwee, I., Nakada, T., Largman, C., Martin B. DNA sequence of the yeast transketolase gene // Biochemistry. 1992. - V. 31. - P. 1892-1896.

34. Frank R.A., Titman C.M., Pratap J.V., Luisi B.F., Perham R.N. A molecular switch and proton wire synchronize the active sites in thiamine enzymes //

35. Science. 2004. - V. 306. - P. 872-876.

36. Golbik, R., Neef, H., Hubner, G., Konig, S., Seliger, B., Meshalkina, L., Kochetov, G., Schellenberger, A. Function of the aminopyrimidine part in thiamine pyrophosphate enzymes // Bioorg. Chem. 1991. - V. 19. - P. 10— 17.

37. Heinrich, C. P., Steffen, H., Janser, P., Wiss, O. Studies on the reconstitution on of apotransketolase with thiamine pyrophosphate and analogs of the coenzyme // Eur. J. Biochem. 1972. - V. 30. - P. 533-541.

38. Heinrich, C.P., Noack, K., Wiss, O. Chemical modification of thryptophan at the binding site of thiamine pyrophosphate in transketolase from baker's yeast //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. - V. 49. - P. 1427-1432.

39. Jordan, F., Chen, G., Nishikowa, S., Sundoro, W. Potential roles of the aminopyrimidine ring in thiamin catalyzed reaction // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1982.-V. 378.-P. 14-29.

40. Jung, E.N., Takeuchi, T., Nishino, K., Itokawa, Y. Studies on the nature of thiamine pyrophosphate binding and dependency on bivalent cations of transketolase from human erythrocytes // Int. J. Biochem. 1988. - V. 20. -P. 1255-1259.

41. Kern, D., Kern, G., Neef, H., Tittmann, K., Killenberg, M., Wikner, Ch., Scneider, G., Hubner, G. How thiamine diphosphate is activated in enzymes // Science. 1997. - V. 275. - P. 67-70.

42. Kochetov G.A., Philippov P.P., Razjivin A.P., Tikhomirova N.K. Kinetics of reconstruction of holotransketolase // FEBS Lett. 1975. - V. 53. - P. 211212.

43. Kochetov G.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P. The binding of thiaminepyrophospate with transketolase in equilibrium conditions // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. - V. 63. - P. 924-930.

44. Kochetov, G.A., Philippov, P.P. Calcium: cofactor of transketolase from baker's yeast // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. - V. 38. - P. 930933.

45. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A. Charge transfer interactions in transketolase-thiamine pyrophosphate complex // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1970.-V. 41.-P. 1134-1140.

46. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Merzlov, V.P. Thiamin pyrophosphate induced change of the optical activity of baker's yeast transketolase // FEBS Lett. 1970. - V. 9. - P. 265-266.

47. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Meshalkina, L.E. The number of active sites in a molecule of transketolase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. -V. 69.-P. 839-843.

48. Kochetov, G.A., Usmanov, R.A., Mevkh, A.T. The role of the charge transfer complex in the transketolase catalized reaction // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973.-V. 54.-P. 1619-1626.

49. Kovina M.V., Bykova I.A., Solovjeva O.N., Meshalkina L.E., Kochetov G.A. The origin of the absorption band induced through the interaction between apotransketolase and thiamin diphosphate // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2002.-V. 294.-P. 155-160.

50. Kovina M.V., De Kok, A., Sevostyanova, I.A., Khailova, L.S., Belkina, N. V., Kochetov, G.A. Structure, Function, and Bioinformatics // Proteins. 2004. -V. 56.-P. 338-345.

51. Kovina, M.V., and Kochetov, G.A. Cooperativity and flexibility of active sites*in homodimeric transketolase // FEBS Lett. 1998. - V. 440. - P. 81-84.

52. Kovina, M.V., Selivanov, V.A., Kochevova, N.V., Kochetov, G.A. Kinetic mechanism of active site non-equivalence in transketolase // FEBS Lett. -1997.-V. 418.-P. 11-14.

53. Lindqvist Y., Schneider G., Ermler V., Sundstrom M. Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution//EMBO J. 1992. - V. 11. - P. 2373-2379.

54. Meshalkina, L., Nilsson, U., Wikner, Ch., Kostikowa, T., Schneider, G. Examination of the thiamin diphosphate binding site in yeast transketolase by site-directed mutagenesis // Eur. J. Biochem. 1997. - V. 244. - P. 644-652.

55. Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. The functional identity of the active centers of transketolase // Biochim. Biophys. Acta. 1979. - V. 571. - P. 218-223.

56. Muller, Y. A., Schumacher, G., Rudolph, R., Schulz, G. E. The refined structures of a stabilized mutant and of wild-type pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum // J. Mol. Biol. 1994. - V. 237. - P. 315-323.

57. Muller, Y., Shulz, G. Structure of the thiamin and flavin-dependent enzyme pyruvate oxidase // Science. 1993. - V. 259. - P. 965-967.

58. Nikkola, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. Refined structure of transketolase from Saccharomyces cerevisiae of 2.0 A resolution // J. Mol. Biol. 1994. — V. 238.-P. 387-404.

59. Nilsson, U., Lindqvist, Y., Kluger, R., Schneider, G. Crystal structure of transketolase in complex with thiamin thiazolone diphosphate, an analogue of the reaction intermediate, at 2,3 A resolution // FEBS Lett. 1993. - V. 326. -P. 145-148.

60. Nilsson, U., Meshalkina, L., Lindqvist, Y., Schneider, G. Examination of substrate binding in thiamine diphosphate-dependent transketolase by protein crystallography and site-directed mutagenesis // J.Biol.Chem. -1997. V. 272.-P. 1864-1869.

61. Schellenberger, A. Sixty years of thiamine diphosphate biochemistry // Biochim. Biophys. Acta. 1998. - V. 1385. - P. 177-186.

62. Schellenberger, A. Structure and mechanism of action of the active center of yeast pyruvate decarboxylase // Angew. Chem. 1967. - V. 6. - P. 10241035.

63. Schenk, G., Duggleby, R., Nixon, P. Properties and functions of the thiamine diphosphate dependent enzyme transketolase // Inter. J. Biochem. & Cell Biol. 1998. - V. 30.-P. 1297-1318.

64. Schneider G., Lindqvist Y. Crystallography and mutagenesis of transketolase: mechanistic implications for enzymatic thiamin catalysis // Biochim. Biophys. Acta.- 1998,-V. 1385.-P. 387-398.

65. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, • G.A. Kinetic study of the HI03A mutant yeast transketolase // FEBS Lett 2004. - V. 567. - P. 270-274.

66. Selivanov, V.A., Kovina, M.V., Kochevova, N.V., Meshalkina, L.E., Kochetov, G.A. Studies of thiamin diphosphate binding to the yeastapotransketolase // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. - V. 26.-P. 33-40.

67. Shin, W., Pletcher, J., Blank, G., Sax, M. Stereochemistry of intermediates in thiamin catalysis. 2. Crystal structure of DL-2-(oc-hydroxybenzyl) thiamine chloride hydrochloride trihydrate // J. Am. Chem.Soc. 1977. - V. 99. - P. 1396-1403.

68. Singleton, C., Wang, J., Martin, P. Conserved residues are functionally distinct within transketolases of different species // Biochemistry. 1996. -V. 35.-P. 15865-15869.

69. Sundstrom, M., Lindqvist, Y., Schneider, G. Three-dimensional structure of apotransketolase. Flexible loops at the active site enable cofactor binding // FEBS Lett. 1992. - V. 313. - P. 229-231.

70. Tittmann K., Golbik R., Uhlemann K., Khailova L., Schneider G., Patel M., Jordan F., Chipman D.M., Duggleby R.G., Hubner G. NMR analysis of covalent intermediates in thiamin diphosphate enzymes // Biochemistry. -2003. V. 42. - P. 7885-7891.

71. Usmanov R., Sidorova N., Kochetov G. Interaction of dihydroxyethylthiamine pyrophosphate with transketolase // Biochem. Mol. Biol. Intern. 1996. - V. 38.-P. 307-314.

72. Usmanov, R.A., and Kochetov, G.A. Interaction of baker's yeast transketolase with substrates // Biochem. Int. 1982. - V. 5. - P. 727-734.

73. Wikner Ch., Nilsson, U., Meshalkina, L., Udekwu, C., Lindqvist, Y., Schneider, G. Identification of catalytically important residues in yeast transketolase // Biochemistry. 1997. - V. 36. - P. 15643-15649.

74. Wikner, Ch., Meshalkina, L., Nilsson, U., Backstrom, S., Lindqvist Y., Schneider, G. His 103 in yeast transketolase is required for substrate recognition and catalysis // Eur. J. Biochem. 1995. - V. 233. — P. 750-755.