Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Бойко, Константин Михайлович

• Бойко, Константин Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бойко, Константин Михайлович

введение.з

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОПЮР.

1.1>иоло| ический цикл азота.

2. респираторная аммонификация 11ипч1га: структура ')т11.

3. Цшохром с содержащие питршредуктазы: локализация, выделение ii свойства.

3. /. Локализация в тетке.

3.2. Каталитические свойства.

3.3. Свойства UV-спектров.

3.4. Структура.

3.4.1. Первичная структура NrfAs.

3.4.2. Структурные исследования цитохром с нитритредуктаз.

3.4.2.1. Третичная и четвертичная структуры NrfA.

3.4.2.2. Расположение гемов в мономере и димере NrfA.

3.4.2.3. 0111', Мессбау >ровская спектроскопия и потеициометрическне исследования NrfA.

3.4.2.4. С'вя !ыванис донора >.ickiроно».

3.4.2.5. Структура активною центра.

3.4.2.6. Центры связывания ионов Са2+.

3.4.2.7. Каналы для транспорта субстрата и продукта.

3.4.2.8. Молекулярный механизм действия NrfA.

4. Цитохром спиттлтедуктлзл in i 'ллоллкллофилы юй бактерии Тшомжлшшю мтлттЕоисЕЮ.ЗЬ

4.1 Ooufue сведения о бактерии Thioalkalivibrio nitvatireducens.

4.2 Выделение и характеристика цитохром с нитритредуктазы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1 Получение нуклеошдной последовательности TvNiR.

1.2 Амллиз аминокислотной последовательности TvNiR.

1.3 Кристаллизация TvNiR.

1.4 Pit I гг п 10Структу рнля съемка, решением уточни in г структуры апо формы TvNiR и комплексов

1.5 Анализ мономера TvNiR.

1.6 Анализ олиеомерпых структур TvNiR.

1.7 Идентификация ионон кальция в структурах TvNiR.

1.8 расчетдпстугшостей гемов TvNiR для растворителя и донора 'электронов.

1.9 расчет распределения зарядов iia поверхности еексамера TvNiR, it о 111 iv i pit 1111.Й час 111, л тлк/ке i.i о kai1алов.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. 1 1укдеотпдпля и аминокислотная последовательности tvNir.

2. I lp< )с i pai 1с i вг.н11ая структура TvNiR.

2.1 Анализ независимой части элементарной ячейки кристалла TvNiR.

2.2 Мономер TvNiR.

2.3 Четвертичная структура TvNiR.

2.4. Расположение гемов в мономере TvNiR.

2.5 Меж-гемовые взаимодействия в геттере TvNiR.

2.6 Активный центр TvNiR.

2.7.Кальций вблизи активного центра TvNiR.

2.Х. Доступности гемов для растворителя и физиологического донора электронов.

2.9. Распределение заряда на поверхности и во внутренней части гексамера TvNiR. Сайт связывания физиологического донора электронов.МО

2. К). Каналы для транспорта продукта и субстрата в TvNiR.ИЗ

2. / I. Структуры комплексов TvNiR.cSW

2.12. Заключительные замечания.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные исследования цитохром С нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens»

Биологический цикл азота является одним из важнейших биохимических циклов в природе. Он объединяет большое количество различных организмов, осуществляющих в процессе своего функционирования окисление/восстановление различных соединений азота. Одним из ключевых ферментов этого цикла является цитохром с нитритредуктаза (NrfA), катализирующая реакцию респираторной аммонификации нитрита, а именно восстановление нитрита до аммония без высвобождения каких-либо промежуточных продуктов реакции. Цитохром с нитритредуктазы обнаружены у аммонифицирующих бактерий, принадлежащих к различным подкласам протеобактерий. Эти ферменты досточно хорошо изучены: в литературе имеется большое количество данных по их каталитическим и спектральным свойствам, ЭПР и мессбауэровской спектроскопии, а для ряда ферментов описана пространственная структура и предложен молекулярный механизм действия. В зависимости от типа протеобактерии NrfAs выделяют как из мембранной, так и из растворимой фракций в виде мономера или комплекса с белком-донором электронов. Помимо нитритредуктазной активности эти ферменты обладают также способностью к восстановлению гидроксиламина - предполагаемого промежуточного продукта процесса восстановления нитрита. Для NrfA из е- и 6-протеобактерий показана также сульфит редуктазная активность. В растворе эти ферменты существуют в виде сходным образом сформированных гомодимеров. Мономеры, NrfAs выделенные из разных протеобактерий имеют молекулярный вес порядка 53-61 кДа, а пространственная укладка составляющих их полипептидных цепей в целом гомологична. Мономеры NrfAs содержат по 5 гемов типа с в качестве простетических групп. Расстояния между этими темами предполагают возможность прямого электронного переноса! Характерной особенностью мономеров известных NrfAs является консервативность взаимного расположения и ориентации в пространстве всех 5-и гемов. Важной особенностью известных NrfAs является также наличие в их структурах ионов кальция, занимающих консервативное положение.

Не так давно, из растворимой фракции нитрат восстанавливающей облигатной хемолитоавтотрофной и галоалкалофильной сероокисляющей у-протеобактерии Thioalkalovibrio nitratireducens (штамм ALEN 2), обнаруженной в содовом озере Fazda в Египте, был выделен фермент, обладающий нитритредуктазной активностью. Кинетические исследования этого фермента, названного TvNiR, показали, что помимо нитритредуктазной активности он способен восстанавливать гидроксиламин и сульфит, используя дитионит в качестве донора электронов. Было показано, что единственным продуктом нитрит и гидроксиламин редуктазной активностей является аммоний. При этом TvNiR обладал более высокой нитритредуктазной активностью по сравнению с известными NrfAs. Молекулярная масса мономерной формы TvNiR составляла величину около 60 «Да. Эксперименты по гель-фильтрации продемонстрировали, что TvNiR в растворе преимущественно существует в форме гомогексамера, с небольшой долей тримерной и мономерной форм, при этом активностью обладали только гексамерная и тримерная формы. Анализ на металлы показал, что этот фермент содержит атомы железа и кальция, а спектрофотометрические исследования показали, что TvNiR имеет характерный спектр цитохром с белков. Помимо этого фермент характеризовался высокой термостабильностью.

Таким образом, было показано, что новая цитохром с нитритредуктаза из у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens, несмотря на имеющиеся сходства с известными NrfAs из различных протеобактерий, имеет ряд уникальных признаков, свойственных только этому ферменту и резко выделяющих его на фоне других известных цитохром с нитритредуктаз. Поэтому цель данной работы заключалась в детальном исследовании методом рентгеноструктурного анализа пространственной структуры TvNiR для того, чтобы понять в чем причина указанных выше отличий в свойствах этого фермента от известных NrfAs, а также чтобы выяснить накладывают ли экстремальные условия существования родительского организма отпечаток на структуру функционирующего в нем фермента.

Литературный обзор

1. Биологический цикл азота

Нитрит широко используется различными бактериями в качестве акцептора электронов в анаэробных условиях. В этих организмах он является компонентом биологического цикла азота, который заключается в восстановлении нитрата (денитрификация) или в окислении аммония (нитрификация) (Рис. 1.). Цикл азота представляет из себя каскад реакций, катализируемых ферментами с различными металл-содержащими кофакторами и простетическими группами, при этом осуществляется редокс переход азота между его окисленным (+5), как в нитрате, и восстановленным (-3), как в аммонии, состояниями.

Первичным процессом денитрификации является процесс восстановления нитрата до нитрита, который катализуируется молибден-содержащими нитрат редуктазами [1].

Восстановление нитрита можно рассматривать как ассимиляторный, диссимиляторный и респираторный процесс [2].

Ассимиляторное восстановление заключается в образовании аммония, для последующего его включения в клеточный материал. Этот процесс позволяет организмам использовать нитрат и нитрит в качестве источников питания. Данный механизм используется различными бактериями, а также растениями и грибами и катализируется цитоплазматической сирогем-содержащей нитритредуктазой, использующей либо NAD(P)H, либо ферредоксин в качестве донора электронов [3,4,5]. Указанный процесс можно рассматривать и как диссимиляторное восстановление, так как он сопровождается регенерацией кофактора - NAD(P).

Респираторное восстановление нитрита сопровождается генерацией электрохимического протонного потенциала на мембране, что является необходимым условием для производства АТР, в соответствии с хемиосмотическим механизмом. Рост с использованием респираторного восстановления нитрита описан только для бактерий, в которых он ведет к образованию либо N2 (респираторная денитрификация), либо аммония (респираторная аммонификация) (Рис.1). Оба процесса проходят при анаэробных условиях и не встречаются одновременно ни у одного вида бактерий.

Респираторная денитрификация катализируется либо цитохром cd, либо медьсодержащими нитритредуктазами [6,7]. Оба фермента катализируют реакцию превращения нитрита в N0, которая затем последовательно, с использованием других ферментов, восстанавливается до N2. Последний усваивается прокариотическими азот-фиксирующими организмами и восстанавливается ими до аммония (Рис.1). Таким образом, аммонификацию нитрита можно рассматривать как укороченный цикл, исключающий денитрификацию и фиксацию азота (Рис.1) [8].

Цикл азота завершается респираторной нитрификацией - процессом, в результате которого, аммоний окисляется до нитрата, при этом в качестве акцептора электронов выступает кислород (Рис.1). Этот процесс катализируется организмами рода Nitrosomonas, при этом в качестве промежуточного соединения образуется гидроксиламин.

Nitrate reduction

Assimilatory: Nas Respiratory: Nar Nap Dissimilatory: Nap

Respiratory denitrificotion

Respiratory nitrification V

Respiratory nitrification

Respiratory denitnfication

Respiratory aenitnfication

Nitrogen fixation

Nitrite ammonification

Assimilatory: Nir Respiratory: Nrf

Fermentative (dissimilatory):Nir/NrF

Respiratory nitrification nh4

Рис. I Биологический цикл азота. Аммонификация нитрита подразделяется на три типа: ассимиляторная, респираторная и диссимиляторная. Процессы денитрификации и аммонификации показаны желтыми стрелками, процессы нитрификации - зелеными. Аббревиатуры: Nas -ассимиляторная нитрат редуктаза, Nar - респираторная нитрат редуктаза, Nap - периплазматическая низ раз редуктаза, Nir - NADH-зависимая низ риз редуктаза, Nrf - цитохром с нитритредуктаза. Рисунок с незначительными модификациями взят из |1|.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Бойко, Константин Михайлович

Основные выводы

1. Определена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего цитохром с нитритредуктазу (TvNiR).

2. Методом рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением определена структура апо-формы TvNiR. Структура уточнена до Rf=14.4%. Для комплексов TvNiR с субстратами (нитритом, гидроксиламином и сульфитом) и ингибиторами (азидом, цианидом, тиоцианатом, нитратом) собраны наборы дифракционных данных и проведено предварительное ренггеноструктурное исследование.

3. Проведен анализ пространственной структуры фермента. Мономер TvNiR содержит 8 гемов типа с в качестве простетических групп и состоит из двух доменов. N-концевой домен имеет уникальный ход полипептидной цепи и связывает три первых гема фермента. Ход полипептидной цепи второго домена сходен с фолдингом 5-ти гемовых цитохром с нитритредуктаз (NrfAs). Этот домен связывает пять остальных гемов TvNiR (включая каталитический гем;4), причем расположение этих гемов совпадает с расположением всех пяти гемов известных цитохром с нитритредуктаз (NrfAs).

4. Проведен анализ чевертичной структуры фермента. В кристалле как и в растворе TvNiR существует в виде гомогексамера. В центре гексамера обнаружена обширная полость.

5. Проведен анализ активного центра фермента. Активный центр TvNiR образован каталитическим гемом, в котором атом железа координирован остатком лизина в дистальном положении, и аминокислотными остатками аргинина, тирозина и гистидина. Он структурно гомологичен активным центрам NrfAs. Существенным отличием активного центра TvNiR от активных центров NrfAs является обнаруженая в TvNiR уникальная ковалентная связь атома СЕ2 каталитического тирозина с атомом серы остатка цистеина (в структурах NrfA остаток цистеина заменен на фенилаланин). Эта ковалентная связь обеспечивает дополнительную фиксацию боковой цепи каталитического тирозина и уменьшает рК его ОН-группы, что может облегчать перенос протона от тирозина к субстрату. Проанализированы каналы для входа субстрата в активный центр фермента и вывода из него продукта. Канал для продукта выходит во внутреннюю полость гексамера TvNiR.

6. Проведен анализ укладки гемов в гексамере TvNiR. Показано, что в гексамере межсубъединичный гемовый контакт возможен только между темами в димере, при этом прямых контактов между темами в тримере не обнаружено. Проведено сравнение укладки гемов TvNiR с укладками гемов в других мультигемовых ферментов с известной структурой.

На основе анализа доступности гемов и распределения заряда на поверхности гексамера предположено, что местом связывания с TvNiR белка-донора электронов является окрестность гема 8. Предположено, что связывание этого белка может обеспечивать образование электрон-транспортной цепи между всеми темами в гексамере TvNiR.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бойко, Константин Михайлович, 2006 год

1. Simon, J. Enzymology and bioenergetics of respiratory nitrite ammonification. FEMS Microbiology Reviews, 2002, 26, 285-309.

2. Moreno-Vivian, C., Ferguson, S.J. Denitrification and distinction between assimilatory, dissimilatory and respiratory pathways. Mol. Microbiol., 1998, 29, 661669.

3. Lin, J.T., Stewart, V. Nitrate assimilation by bacteria. Adv. Microbiol. Phys., 1998, 39, 1-30.

4. Campbell, W.H., Kinghorn, J.R. Functional domains of assimilatory nitrate reductases and nitrite reductases. Trends Biochem. Sci., 1990, 15, 315-319.

5. Cole, J. Nitrate reduction to ammonia by enteric bacteria: redundancy, or a strategy for survival during oxygen starvation? FEMS Microbiol. Lett, 1996, 136, 1-11.

6. Zumft, W.G. Cell biology and molecular basis of denitrication. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1997, 61, 533-616.

7. Moura, I, Moura, J.J.G. Structural aspects of denitrifying enzymes. Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 168-175.

8. Cole, J.A., Brown, C.M. Nitrite reduction to ammonia by fermentative bacteria: a short circuit in the biological nitrogen cycle. FEMS Microbiol. Lett., 1980, 7, 65-72.

9. Fujita, T. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. I. Detection, purification, and properties of cytochrome c-552 in anaerobically grown cells. J. Biochem., 1966, 60, 204-215.

10. H.Kajie, S., Anraku, Y. Purification of a hexaheme cytochrome c552 from Escherichia coli K12 and its properties as a nitrite reductase. Eur. J. Biochem., 1986, 154, 457463.

11. Liu, M.-C., Peck Jr., H.D. The isolation of a hexaheme cytochrome from Desulfovibrio desulfuricans and its identification as a new type of nitrite reductase. J. Biol. Chem., 1981, 256, 13159-13164.

12. Liu, M.-C., Liu, M.-Y., Payne, W.J., Peck Jr., H.D., LeGall, J. Wolinella succinogenes nitrite reductase: purification and properties. FEMS Microbiol. Lett., 1983, 19, 201206.

13. Schroder, I., Roberton, A.M., Bokranz, M., Unden, G., Bocher, R. and Kroger, A. The membraneous nitrite reductase involved in the electron transport of Wolinella succinogenes. Arch. Microbiol., 1985, 140, 380-386.

14. Prakash, O., Sadana, J.C. Purification, characterization and properties of nitrite reductase of Achromobacter fischeri. Arch. Biochem. Biophys., 1972, 148, 614-632.

15. Liu, M.-C., Bakel, B.W., Liu, M.-Y., Dao, T.N. Purification of Vibrio fischeri nitrite reductase and its characterization as a hexaheme c-type cytochrome. Arch. Biochem. Biophys., 1988, 262, 259-265.

16. Shumacher, W., Kroneck, P.M.H. Dissimilatory hexaheme с nitrite reductase of "Spirillum" strain 5175: purification and properties. Arch. Microbiol., 1991, 156, 7074.

17. Wolin, M.J., Wolin, E.A., Jacobs, N.J. Cytochrome-producing anaerobic vibrio, Vibrio succinogenes sp. n. J. Bacterid., 1961, 81, 911-917.

18. Simon, J., Pisa, R., Stein, Т., Eichler, R., Klimmek, O., Gross, R. The tetraheme cytochrome с NrfH is required to anchor the cytochrome с nitrite reductase in the membrane of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem., 2001, 268, 5776-5782.

19. Bokranz, M., Katz, J., Schroder, I., Roberton, A.M., Kroger, A. Energy metabolism and biosynthesis of Vibrio succinogenes growing with nitrate or nitrite as terminal electron acceptor. Arch. Microbiol., 1983, 135, 36-41.

20. Bokranz, M., Gutmann, M., Kortner, C., Kojro, E., Fahrenholz, F., Lauterbach, F., Kroger, A. Cloning and nucleotide sequence of the structural genes encoding formate dehydrogenase of Wolinella succinogenes. Arch. Microbiol., 1991, 156, 119128.

21. Jankielewicz, A., Schmitz, R.A., Klimmek, O., Kroger, A. Polysulphide reductase and formate dehydrogenase from Wolinella succinogenes contain molybdopterin guanine dinucleotide. Arch. Microbiol., 1994, 162, 238-242.

22. Unden, G., Kroger, A. Reconstitution in liposomes of the electron transport chain catalyzing fumarate reduction by formate. Biochim. Biophys. Acta, 1982, 682, 258263.

23. Unden, G., Kroger, A. Low-potential cytochrome b as an essential electron-transport component of menaquinone reduction by formate in Vibrio succinogenes. Biochim. Biophys. Acta, 1983, 725, 325-331.

24. Kroger, A., Dorrer, E., Winkler, E. The orientation of the substrate sites of formate dehydrogenase and fumarate reductase in the membrane of Vibrio succinogenes. Biochim. Biophys. Acta, 1980, 589, 118-136.

25. Dross, F., Geisler, V., Lenger, R., Theis, F., Krat, Т., Fahrenholz, F., Koj'ro, E., Duchene, A., Tripier, D., Juvenal, K. and Kroger, A. The quinone-reactive Ni/Fe-hydrogenase of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem., 1992, 206, 93-102.

26. Kroger, A., Biel, S., Simon, J., Gross, R., Unden, G. and Lancaster, C.R.D. Fumarate respiration of Wolinella succinogenes: enzymology, energetics, and coupling mechanism. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1553, 23-38.

27. Pisa, R., Stein, Т., Eichler, R., Gross, R., Simon, J. The nrfl gene is essential for the attachment of the active site haem group of Wolinella succinogenes cytochrome с nitrite reductase. Mol. Microbiol., 2002, 43, 763-770.

28. Pereira, I.A.C., LeGall, J., Xavier, A.V., Teixeira, M. Characterisation of a heme с nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism, Desulfovibro vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1481, 119-130.

29. Steenkamp, D.J., Peck Jr., H.D. The association of hydrogenase and dithionite reductase activities with the nitrite reductase of Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 94, 41-48.

30. Liu, M.-C., DerVartanian, D.V., Peck Jr., H.D. On the nature of the oxidation-reduction properties of nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, 96, 278-285.

31. Pereira, I.A.C., Abreu, I.A., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira, M. Nitrite reductase from Desulfovibro desulfuricans (ATCC 27774) a heterooligomer heme protein with sulfite reductase activitiy. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 224, 611618.

32. Pereira, I.A.C., Romao, C.V., Xavier, A.V., LeGall, J., Teixeira, M. Electron transfer between hydrogenases and mono- and multiheme cytochromes in Desulfovibrio spp. J. Biol. Inorg. Chem., 1998, 3, 494-498.

33. Nicolet, Y., Piras, C., Legrand, P., Hatchikian, C.E., Fontecilla-Camps, J.C. Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure shows unusual coordination to an active site Fe binuclear center. Structure, 1999, 7, 13-23.

34. Matias, P., Saraiva, L.M., Soares, C.M., Coelho, A.V.J., LeGall, J., Carrondo, M.A.

35. Nine-haem cytochrome с from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: primaryisequence determination, crystallographic refinement at 1.8 AV and modelling studies of its interaction with the tetrahaem cytochrome C3. J. Biol. Inorg. Chem., 1999,4,478-494.

36. Saraiva, L.M., da Costa, P.N., LeGall, J. Sequencing the gene encoding Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774 nine-heme cytochrome c. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 262, 629-634.

37. Abou-Jaoude, A., Chippaux, M., Pascal, M.-C. Formate-nitrite reduction in Escherichia coli K12. 1. Physiological study of the system. Eur. J. Biochem., 1979, 95, 309-314.

38. Gray, C.T., Wimpenny, J.W.T., Hughes, D.E., Ranlett, M. A soluble c-type cytochrome from anaerobically grown Escherichia coli and various Enterobacteriaceae. Biochim. Biophys. Acta, 1963, 67, 157-160.

39. Fujita, Т., Sato, S. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. IV. Possible involvement of cytochrome c-552 in anaerobic nitrite metabolism. J. Biochem., 1966, 60, 691-700.

40. Fujita, Т., Sato, S. Studies on soluble cytochromes in Enterobacteriaceae. III. Localization of cytochrome c-552 in the surface layer of cells. J. Biochem., 1966, 60, 568-577.)

41. Cole, J.A. Cytochrome C552 and nitrite reduction in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1968, 162, 356-368.

42. Rehr, В., Klemme, J.-H. Metabolic role and properties of nitrite reductase of nitrate-ammonifying marine Vibrio species. FEMS Microbiol. Lett., 1986, 35, 325-328.

43. Bamford, V.A., Angrove, H.C., Seward, H.E., Thomson, A.J., Cole, J.A., Butt, J.N., Hemmings, A.M., Richardson, D.J. Structure and spectroscopy of the periplasmic cytochrome с nitrite reductase from Escherichia coli. Biochemistry, 2002, 41, 29212931.

44. Grove, J., Busby, S., Cole, J. The role of the genes nrfEFG and ccmFH in cytochrome с biosynthesis in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 1996, 252, 332341.

45. Hussain, H., Grove, J., Grffiths, L., Busby, S., Cole, J. A seven-gene operon essential for formate-dependent nitrite reduction by enteric bacteria. Mol. Microbiol.,. 1994, 12, 153-163.

46. Berks, В. C., Ferguson, S. J., Moir, J. W., Richardson, D.J. Enzymes and associated electron transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and oxyanions. Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1232, 97-173.

47. Hussain, H., Grove, J., Griffiths, L., Busby, S., Cole, J. A seven-gene operon essential for formate-dependent nitrite reduction to ammonia by enteric bacteria. Mol. Microbiol., 1994, 12, 153-63.

48. Darwin, A., Tormay, P., Page, L., Griffiths, L., Cole, J. Identification of the formate dehydrogenases and genetic determinants of formate-dependent nitrite reduction by Escherichia coli K12. J. Gen. Microbiol., 1993, 139, 1829-1840.

49. Berks, B.C., Page, M.D., Richardson, D.J., Reilly, A., Cavill, A., Outen, F., Ferguson,i

50. S.J. Sequence analysis of subunits of the membrane-bound nitrate reductase from a denitrifying bacterium: the integral membrane subunit provides a prototype for the dihaem electron-carrying arm of a redox loop. Mol. Microbiol., 1995, 15, 319-331.

51. Jones, R.W. Proton translocation by the membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli. FEBS Microbiol. Lett., 1980, 8, 167-171.

52. Jormakka, M., Tornroth, S., Byrne, В., Iwata, S. Molecular basis of proton motive force generation: Structure of formate dehydrogenase-N. Science, 2002, 295, 18631868.

53. Stanley, N.R., Sargent, F., Buchanan, G., Shi, J., Stewart, V., Palmer, Т., Berks, B.C. Behaviour of topological marker proteins targeted to the Tat protein transport pathway. Mol. Microbiol., 2002, 43, 1005-1021.

54. Stach, P., Einsle, O., Schumacher, W., Kurun, E., Kroneck, P.M.H. Bacterial cytochrome с nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem., 2000, 79, 381-385.

55. Newton, N. The two-haem nitrite reductase of Micrococcus denitrificans. Biochim. Biophys. Acta, 1969, 185, 316-331.

56. Nicholas, D.J.D., Nason, A. Determination of nitrate and nitrite. Methods Enzymol., 1957, 3, 981-984.

57. Stach, P.; Einsle, O.; Schumacher, W.; Kurun, E.; Kroneck, P. M. Bacterial cytochrome с nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem., 2000, 79, 381-385.

58. Rudolf, M., Einsle, O., Neese, F., Kroneck, P.M.H. Pentahaem cytochrome с nitrite reductase: reaction with hydroxylamine, a potential reaction intermediate and substrate. Biochemical Society, 2002, 649-653.

59. Einsle, O.; Messerschmidt, A.; Huber, R.; Kroneck, P. M. H.; Neese, F. Mechanism of six-electron reduction of nitrite to ammonia by cytochrome с nitrite reductase. J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 39, 11737-11745.

60. Barker, P.D., Ferguson, S.J. Still a puzzle: why is haem covalently attached in c-type cytochromes? Structure, 1999, 7, R281-R290.

61. Murzin, A. G., Brenner, S. E., Hubbard, Т., Chothia, C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J. Mol. Biol., 1995, 247, 536-540.

62. Page, C.C.; Moser, C.C.; Chen, X.; Dutton, P.L. Natural engineering principles of electron tunnelling in biological oxidation-reduction. Nature, 1999, 402, 47-52.

63. Haladjian, J.; Bianco, P.; Guerlesquin, F.; Bruschi, M. Electrochemical study of the electron exchange between cytochrome c3 and hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans Norway. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1987, 147, 3, 1289-1294.

64. Moura, I., Bursakov, S., Costa, C., Moura, J.J.G. Nitrate and nitrite utilization in sulfate-reducing bacteria. Anaerobe, 1997, 3, 279-290.

65. Britain, Т., Blackmore, R., Greenwood, C., Thomson, A.J. Bacterial nitrite-reducing enzymes. Eur. J. Biochem., 1992, 209, 793-802.

66. Liu, M.-C., Liu, M.-Y., Payne, W.J., Peck Jr., H.D., LeGall, J. and DerVartanian, D.V. Comparative EPR studies on the nitrite reductase from Escherichia coli and Wolinella succinogenes. FEBS Lett., 1987, 218, 227-230.

67. Blackmore, R.S., Brittain, Т., Gadsby, P.M., Greenwood, C. and Thomson, A.J. Electron paramagnetic resonance and magnetic circular dichroism studies of a hexaheme nitrite reductase from Wolinella succinogenes. FEBS Lett., 1987, 219, 244248.

68. Costa, C., Moura, J.J.G., Moura, I., Wang, Y. and Huynh, B.H. Redox properties of cytochrome с nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. J. Biol. Chem., 1996, 271, 23191-23196.

69. Blackmore, R.S., Gadsby, P.M., Greenwood, C., Thomson, A.J. Spectroscopic studies of partially reduced forms of Wolinella succinigenes nitrite reductase. FEBS Lett., 1990, 264, 257-262.

70. Gwyer, J.D., Angove H.C., Richardson, D.J., Butt, J.N. Redox-triggered events in cytochrome с nitrite reductase. Bioelectrochemistry, 2004, 63, 43-47.

71. Eaves,D.; Grove,J.; Staudenmann,W.; James.P.; Poole.R.; White,S.; Griffiths,L.; Cole,J. The nrfEFG gene products are required for the activity of the cytochrome c552 nitrite reductase from Escherichia coli. Biochem.Soc.Trans., 1998, 26, 3, S216.

72. Einsle, О., Messerschmidt, A., Stach, P., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., Huber, R., Kroneck, P.M.H. Structure of cytochrome с nitrite reductase. Nature, 1999, 400, 476-480.

73. Poulos, T.L.; Freer, S.T.; Alden, R.A.; Edwards, S.L.; Skogland, U.; Takio, K.; Eriksson, В.; Xuong, N.; Yonetani, Т.; Kraut, J. The crystal structure of cytochrome с peroxidase. J. Biol. Chem., 1980, 255, 575-580.

74. Poulos, T.L.; Edwards, S.L.; Wariishi, H.; Gold, M.H. Crystallographic refinement of lignin peroxidase at 2 A. J. Biol. Chem., 1993, 268, 4429-4440.

75. Sundaramoorthy, M.; Kishi, K.; Gold, M.H.; Poulos, T.L. The crystal structure of manganese peroxidase from Phanerochaete chrysosporium at 2.06-A resolution. J. Biol. Chem., 1994, 269, 32759-32767.

76. Schuller, D.J.; Ban, N.; Huystee, R.B.; McPherson, A.; Poulos, T.L. The crystal structure of peanut peroxidase. Structure, 1996,4, 311-321.

77. Gajhede, M.; Schuller, D.J.; Henriksen, A.; Smith, A.T.; Poulos, T.L. Crystal structure of horseradish peroxidase С at 2.15 A resolution. Nat. Struct. Biol., 4, 1032-1038.

78. Sutherland, G.R.; Zapanta, L.S.; Tien, M.; Aust, S.D. Role of calcium in maintaining the heme environment of manganese peroxidase. Biochemistry, 1997, 36, 3654-3662.

79. Sorokin, D.Y., Antipov, A.N., Kuenen, J.G. Complete denitrification in coculture of obligately chemolithoautotrophic haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria from a hypersaline soda lake, Arch. Microbiol., 2003, 180, 127-133.

80. Sorokin, D.Y., Touruva, T.P., Sjollema, K.A., Kuenen, J.G. Thioalkalivibrio nitratireducens sp. nov., a nitrate-reducing member of an autotrophic denitrifying consortium from a soda lake, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53, 1779-1783.

81. Antipov, A.N., Sorokin, D.Y., L'Vov, N.P., Kuenen, J.G. New enzyme belonging to the family of molybdenum-free nitrate reductases. Biochem. J., 2003, 369, 185— 189.

82. Sayavedra-Soto, L.A., Hommes, N.G., Arp, D.A. Characterization of the gene encoding hydroxylamine oxidoreductase in Nitrosomonas europaea, J. Bacterid., 1994, 176, 504-510.

83. Pereira, C., LeGall, J., Xavier, A.V.M., Teixeira, M. Characterization of a heme с nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1481, 119-130.

84. Bendtsen, J.D., Gunnar von Heijne, H.N., Brunak, S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol., 2004, 340, 783-795.

85. Roger, G.H. Expression of soluble heterologous proteins via fusion with NusA protein. inNovations, 2000, 4-7.

86. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410.

87. Altschul, S.F. Amino acid substitutions matrices from an information theoretic perspective. J. Mol. Biol., 1991, 219, 555-665.

88. Ducruix, A., Giege, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. A practical approach. EMBL, Hamburg, 2000.

89. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology, 1997, 276: Macromolecular Crystallography, part A, 307-326.

90. Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol., 1968, 33, 2, 491-497.

91. Vagin, A., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst., 1997, 30, 1022-1025.

92. Schneider, T.R.; Sheldrick, G.M. Substructure solution with SHELXD. Acta Cryst. D„ 2002, 58, 1772-1779.

93. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography. Acta Cryst., 1994, D50, 760-763.

94. Zwart, P.H., Langer, G.G. & Lamzin, V.S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr., 2004, D60, 2230-2239.

95. Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Cryst., 1997, D53, 240-255.

96. Carson, M. Ribbon models of macromolecules. J. Mol. Graphics, 1987, 5, 103106.

97. Воуко, K.M., Polyakov, K.M., Tikhonova, T.V., Slutskaya, E.S., Antipov, A.N., Popov, A.N., Lamzin, V.S., Popov, V.O. Crystall structures of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens. EMBL Annual Reports, 2004, 2, 7980.i

98. Воуко, K.M., Tikhonova, T.V., Slutsky, A., Antipov, A.N., Zvyagilskaya, R.A., Popov, V.O. Crystal structure of complexes of nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfide and nitrate. EMBL Annual Reports, 2005, 2, 91-92.

99. Holm, L., Sander, C. Searching protein structure databases has come of age. Proteins, 1994, 19, 165-173.

100. Lu G. A WWW service system for automatic comparison of protein structures, Protein Data Bank Quarterly Newsletter, 1996, 78, 10-11.

101. Kabsch, W.; Kabsch, H.; Eisenberg, D. Packing in a new crystalline form of glutamine synthetase from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1976, 100, 3, 283-291.

102. Lee, В., Richards, F.M. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. J.Mol.Biol., 1971, 55, 379-400.

103. Muller, P., Корке, S., Sheldrick, G.M. Is the bond-valence method able to identify metal atoms in protein structures? Acta Cryst. D„ 2003, 59, 32-37.

104. Brown, I.D., Altermatt, D. Bond-valence parameters obtained from a systematic analysis of the Inorganic Crystal Structure Database. Acta Cryst. В., 1985, 41, 244247.

105. Potterton, E„ McNicholas, S„ Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Cryst., 2002, D58, 1955-1957.

106. DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA, 2002.

107. Mowart, C.G., Chapman, S.K. Multi-heme cytochromes new structures, new chemistry. Dlaton Trans., 2005, 3381-3389.

108. Whittaker, M.M., Chuang, Y.Y., Whittaker, J.W. Models for the redox active site in galactose oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115,10029-10035.

109. Ito, N.; Phillips, S.E.; Stevens, C.; Ogel, Z.B.; McPherson, M.J.; Keen, J.N.; Yadav, K.D.; Knowles, P.F. Novel thioether bond revealed by a 1.7 A crystal structure of galactose oxidase. Nature, 1991, 350, 6313, 87-90.)

110. Whittaker, J.W. Free radical catalysis by galactose oxidase. Chem. Rev., 2003, 103, 6, 2347-2363.

111. Ostermeier, С., Harrenga, A., Ermler, U., Michel, H. Proc. Structure at 2.7 A resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome с oxidase complexed with an antibody FV fragment. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1997, 94, 1054710553.