Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат химических наук Трофимов, Антон Андреевич

• Трофимов, Антон Андреевич
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Трофимов, Антон Андреевич

Содержание

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

4

5

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .

Выделение Ту№11 . Кристаллизация .

Сбор и обработка данных, уточнение структур Измерение активности .

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .

5.1. Общая характеристика структур Ту]>Ш

5.2. Каналы ТуМЬ* .

58 58 60

17

3.1. Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из ТМоа1ка1МЬгю пкгаигейисет

3.1.1. Структура Ту№Я

Структура мономера

Гексамер

Гемы

Активный центр

Каналы

Ионы кальция

3.1.2. Активность Ту№Я

3.2. Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы 1Уг£А

3.2.1. СтруктураША

Структура мономера

Димер

Гемы

Активный центр и комплексы с субстратами и ингибиторами

Ионы кальция

Каналы

3.2.2. Активность ША

3.2.3. Механизм восстановления нитрита ШГА

3.2.4. Физиологические доноры электронов ША

3.3. Цитохром с гидроксиламиноксидоредуктаза из ^гоьотопав еигораеа

3.4. Цитохром с тетратионатредуктаза из 8Ъ.емапе11а опе1йетЫ .

3.5. Сирогем-содержащие сульфитредуктазы

3.6. Модификация остатка тирозина в активном центре ферментов Связь Туг-Шэ в цитохром с оксидазе

38

42

43

58

64

64

65

5.3. Связывание лигандов в активном центре фермента

Связывание фосфат-иона

Связывание цианид-иона

Связывание сульфит-иона

Связывание нитрит-иона

Связывание гидроксиламина

5.4. Получение TvNiRb

5.5. Активности TvNiR и TvNiRb

5.6. Структурно-функциональные аспекты катализа TvNiR и TvNiRb

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

NrfA - пятигемовая цитохром с нитритредуктаза

TvNiR - восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из Thioalkalivibrio nitratireducens

TvNiRb - модифицированная форма TvNiR, в которой СЕ 1-атом каталитического остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с CG-атомом остатка Gln360 НАО - цитохром с гидроксиламиноксидоредуктаза

OTR - цитохром с тетратионатредуктаза

NrfH и NrfB - физиологические доноры электронов NrfA SiR - сирогем-содержащая сульфитредуктаза

СсР - цитохром с пероксидаза

RMSD - среднеквадратичное отклонение PFV - циклическая вольтамперометрия в белковых пленках

MV - метилвиологен

ПЭГ - полиэтиленгликоль

NEDA - N-( 1 -нафтил)этилендиамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структуры комплексов восьмигемовой цитохром с нитритредуктазы из Thioalkalivibrio nitratireducens с субстратами, продуктами и ингибиторами»

2. ВВЕДЕНИЕ

Выяснение принципов функционирования ферментов на основе знания их пространственной структуры является одной из основых задач молекулярной биологии. На сегодняшний день надежную информацию о структурно-функциональных закономерностях ферментативных реакций предоставляет метод рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением, который позволяет изучать связывание лигандов в активном центре фермента.

Объектом настоящей работы является цитохром с нитритредуктаза. Данные ферменты катализируют восстановление нитрита и гидроксиламина до аммония и сульфита до сульфида.

N02" + 8Н+ + бе = NH4+ + 2Н20 NH2OH + ЗН* + 2е = NH4+ + Н20 HS03' + 6Н+ + бе = HS" + ЗН20 Цитохром с нитритредуктазы выполняют важную функцию в биологическом цикле азота, катализируя последнюю стадию анаэробного дыхательного процесса аммонификации нитрита.

На сегодняшний день наиболее изученной группой ферментов данного класса являются пятигемовые цитохром с нитритредуктазы бактерий (NrfA). Скорость восстановления нитрита для NrfA на три порядка выше скорости восстановления сульфита. Относительно высокое значение сульфитредуктазной активности для NrfA из сульфат-восстанавливающей бактерии Desulfovibrio desulfuricans может быть связано с тем, что данный фермент выполняет также функцию сульфитредуктазы. В некоторых сульфат-восстанавливающих бактериях, которые не могут расти за счет аммонификации (например Desulfovibrio vulgaris), NrfA, вероятно, отвечает за удаление токсичного для них нитрита, который производят другие бактерии, окисляющие сульфид и восстанавливающие нитрат.

Определены кристаллические структуры NrfA из различных бактерий. Мономер NrfA представляет собой а-спиральный белок с молекулярной массой 55-65 кДа. Функциональной единицей NrfA является гомодимер. Определены структуры комплексов NrfA с субстратами нитритом, гидроксиламином и сульфитом и с ингибиторами азидом и сульфатом. На основании структурных данных и квантовохимических расчетов предложен механизм восстановления нитрита для этих ферментов, подразумевающий последовательные стадии протонирования и восстановления субстрата. Показаны важность каталитического остатка тирозина для нитритредуктазной активности NrfA и

отсутствие влияния мутации этого остатка на остаток фенилаланина на сульфитредуктазную активность.

Из галоалкалофильной сероокисляющей у-протеобактерии ТЫоа1ка1тЪпо Шгайгейисет была выделена восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза (Ту№11). Фермент имеет молекулярную массу 64 кДа. Нитритредуктазная активность Ту№11 существенно выше активности №ГА. Следует отметить, что анаэробный рост клеток Т. пЫгайгесклсет в присутствии нитрата приводит к накоплению нитрита в среде.

Решены структуры свободной формы Ту№11 и комплексов фермента с нитритом и азидом, характеризующиеся неполной заселенностью лиганда. Функциональной единицей Ту№11 является гексамер. Мономер Ту№Ы состоит из двух доменов - уникального Н-концевого и каталитического, который похож на мономер Активные центры Ту№11 и №£А образованы лизин-координированным гемом и остатками гистидина, тирозина и аргинина. Важным отличием Ту№11 от №£А является наличие ковалентной связи между СЕ2-атомом каталитического остатка ТугЗОЗ и атомом серы соседнего остатка Суз305, место которого в структуре №ГА занимает остаток фенилаланина.

В данной работе проведены систематические структурные исследования связывания субстратов, продуктов и ингибиторов в активном центре ТуМШ, измерены скорости восстановления нитрита и сульфита нативным Ту№11 и его модифицированной формой, и проведено детальное сравнение структур комплексов ТуМЯ и №£А. Это позволило сделать предположения о функции каталитического остатка тирозина и о последовательности превращений субстрата в ходе каталитического процесса для цитохром с нитритредуктаз. Работа важна как с точки зрения изучения представителя сравнительно мало охарактеризованной группы восьмигемовых цитохром с нитритредуктаз, так и с точки зрения изучения свойств ферментов класса цитохром с нитритредуктаз.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 3.1. Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза из Thioalkalivibrio nitratireducens

Восьмигемовая цитохром с нитритредуктаза TvNiR была вьщелена из галоалкалофильной у-протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens [1]. Молекулярная масса мономера TvNiR составляет 64 кДа. Последовательность TvNiR (AJ880678 в EMBL Nucleotide Sequence Database) идентична на ~ 50 % десяти последовательностям цитохромов с из 5-протеобактерий, которые содержат семь классических гем(с)-связывающих мотивов СХХСН и один мотив СХХСК [2,3].

TvNiR катализирует реакции восстановления нитрита и гидроксиламина до аммиака и сульфита до сульфида [4].

N02" + 8Н+ + бе = NH4+ + 2Н20 NH2OH + ЗН+ + 2е = NH4+ + Н20 HS03" + 6Н+ + бе = HS" + ЗН20

Нитритредуктазная активность TvNiR выше активностей пятигемовых цитохром с нитритредуктаз NrfA, которые структурно близки TvNiR. Ранее решены структуры свободной формы TvNiR и комплексов фермента с субстратом нитрит-ионом и ингибитором азид-ионом [5,2] (таблица 1).

Таблица 1. Структуры TvNiR. N - число мономеров в независимой части ячейки.

Лиганд в активном центре Код PDB Разрешение, А R-фактор/ Rfree RMSD связей, А Группа симметрии N

Н20 20Т4 1.5 0.126/0.141 0.019 Р2,3 2

NCV 3D1I 1.78 0.149/0.166 0.021 Р2,3 2

N3" 2Z05 1.67 0.158/0.174 0.017 Р2(3 2

3.1.1. Структура ТуМЯ Структура мономера

Мономер ТуМЯ. образован 525 аминокислотными остатками. В нем можно выделить два домена — N-концевой и каталитический (рис. 1). N-концевой домен (остатки 1-69 и 269-287) содержит пять а-спиралей, два (3-лист а и первые три по последовательности гемовые группы типа с. Третичная структура этого домена не имеет аналогов среди известных структур белков. Каталитический домен (остатки 70-268 и 288525) подобен мономеру пятигемовой цитохром с нитритредуктазы МгГЛ [6] и, как и КгГЛ, содержит пять гемовых групп типа с, включая лизин-коордипированный Рем активного центра (рис. 2). Около 200 Си-атомов каталитического домена ТуМК и мономера NrfA могут быть совмещены с ЯМ Б О менее ] А. При этом совмещаются пять гемов ТуМК с темами К[гГА и 19 из 30 а-спиралей Ту№Я с соответствующими спиралями 1МгГА (в том числе три длинные спирали на С-конпе) (рис. 2).

Рис. I. Слева. Мономер TvNiR. N-конпевой домен показан фиолетовым. В каталитическом домене a-спирали показаны желтым, ¡i-листы — синим. Нумерация гемов соответствует расположению гем-связывающих мотивов в последовательности. Каталитический гем показан красным. Справа. Топологическая карта TvNiR. Мономер содержит 30 а-спиралей и 13 (3-тяжей, расположсниыйх в 6 аптипараллельных [3-листах: al (остатки 11-15), п2 (1925), аЗ (35-37), а4 (42-47), а5 (64-67), аб (71-78), а7 (100-104), а8 (108-111), а9 (119-120), аЮ (122-129), all (142-146), а12 (148-153), а13 (155-158), а14 (182-187), al5 (198-200), aló (214-219), «17 (227-229), al8 (243-249), al9 (261-266), «20 (292-296), a21 (322-323), a22 (332-341). a23 (363-367), a24 (371-374), a25 (379-383), a26 (403-405), oil (407-410), a28 (420-457), a29 (462-484), a3(? (493-523); {pi (39-40), (32 (58-59)}, {(33 (137-139), [34 (159-161)}, Íp5 (239-240), (36 (269-276), ¡37 (279-287)}, {p§ (303-305), (39 (308-309)}, {(310 (316-317), (311 (325-327)}, {(312 (347-348), pl3 (355-356)}. Рисунки взяты из [5].

Рис. 2. Структуры мономеров TvNiR (слева) и NrfA из W. succinogenes (справа). Структурно эквивалентные элементы показаны синим. Каталитические гемы показаны красным. Рисунок взят из [5].

Гексамер

Независимая часть элементарной ячейки TvNiR содержит два мономера (мономеры А и В), связанные i ^кристаллографической поворотной осью второго порядка. Мономеры TvNiR образуют гексамер с точечной группой симметрии 32 (рис. 3). Ось симметрии третьего порядка гексамера является кристаллографической и связывает между собой три мономера А и три мономера В. Кристаллографически независимые мономеры в гексамере связаны между собой некристаллографическими поворотными осями второго порядка. Форма гексамера напоминает тригональную бипирамиду с основанием в ~ 120 А и высотой - 150 А. Гексамер TvNiR может быть описан как «димер тримеров». Каждый мономер TvNiR образует 36 водородных связей с соседними мономерами в три мере (площадь поверхности контакта составляет 3200 А2 на мономер) и 13 водородных связей с мономерами соседнего тримера в гексамере (площадь поверхности контакта — (650 А2).

В центре гексамера TvNiR находится большая полость, форму которой можно описать при помощи трех пересекающихся сфер. Большая сфера с радиусом 19 А расположена в центре гексамера, и две малые сферы с радиусом 12 А каждая расположены внутри гримеров. Расстояние между центрами большой и малой сфер составляет 17 А. Поверхность полости, соответствующая малой сфере, образована остатками 82-95, 114-116, 402-404 (а26) и 421-435 (а28) каждого мономера в гримере. Поверхность полости, соответствующая большой сфере, образована остатками 83, 404408, 419-421, 486-488 и пропиопатами гемов 6 и 7 всех мономеров. Растворитель

проникает в полость через три овальных отверстия размером 9*16 А, расположенных на некристаллографических осях гексамера.

Рис. 3. Гексамер TvNiR. Кристаллографическая ось симметрии третьего порядка проходит вертикально в плоскости рисунка. Кристаллографически независимые мономеры показаны одним цветом. Рисунок взят из [2].

Гемы

Семь гемов из восьми мономера TvNiR ковалеитно связаны с атомами серы остатков цистеина из классических ге м( с) - с вяз ы в а ю щ и х мотивов СХХСН. Гем 4 связан с остатками цистеина из мотива СХХСК. Остатки гистидина и лизина этих мотивов играют роль проксимального лиганда иона железа гема. Дистальную координационную позицию у гемов 1-3 и 5-8 занимает боковая цепь еще одного остатка гистидина. У гема 4 данная позиция свободна для взаимодействия с субстратом.

Гемы в мономере TvNiR располагаются парами в типичных для цитохромов с дигемовых мотивах (рис. 4). Гемы в парах 1/2, 3/5 и 6/7 параллельны друг Другу (стекинг), в то время как гемы в парах 2/3, 5/6 и 7/8 почти перпендикулярны друг другу, Гем 4 находится в группе с темами 6 и 7 и почти параллелен им. Расстояния Fe-Fe между соседними темами в моцвмере TvNiR составляют 9-13 Á, чего достаточно для эффективной передачи электронов между ними.

Гемы TvNiR 4-8 могут быть совмещены с пятью темами NrfA по эквивалентным атомам со значениями RMSD от 0.5 Á для фермента из S. deleyianum [6] до 0,6 Л для фермента из D. desuifuricans [7] (рис. 5, слева). Восемь гемов TvNiR можно совместить с восемью темами гидроксиламиноксидоредуктазы НЛО [8] со значением RMSD 1.3 А, В обоих случаях совмещаются друг с другом темы активных центров ферментов. Семь гемов TvNiR можно совместить с семью темами тетратионатредуктазы OTR [9] так, что каталитические гемы не участвуют в этом совмещении и оказываются по разные стороны

от цепи совмещенных гемов (рис. 5, справа). Такое совмещение дает значение КМБЭ 3.4

А.

Рис. 4. Гемы в мономере TvNiR. Гемьт пронумерованы в соответствии с порядком следования г ем-связывающих мотивов в последовательности. Показаны расстояния между ионами железа гемов.

Ё гсксамере TvNiR прямой перенос электронов между темами возможен только между мономерами А и В независимой части элементарной ячейки благодаря взаимодействию гемов 3 этих мономеров (расстояние Fe-Fe 13.1 А). Таким образом, в гексамере TvNiR присутствуют три обособленные группы гемов — каждая из 16 гемов.

Рис. 5. Слева. Совмещение гемов TvNiR (красный) и №£А (зеленый). Справа. Совмещение гемов Ту.^Л (красный) и OTR (синий).

Активный центр

Активный центр TvNiR находится в 10 Â от поверхности белка. Он включает в себя гем 4, координированный остатком Lys 188 (расстояние NZ-Fe 1.9 À), и каталитические остатки His361, ТугЗОЗ и Argl31 (рис. 6). СЕ2-атом остатка ТугЗОЗ ковалентно связан с атомом серы остатка Cys305. В структуре свободной формы TvNiR дистальная координационная позиция гема 4 занята молекулой воды (расстояние HiO-Fe 2.1 À), которая образует водородную связь с остатком His361.

Рис. 6. Активный центр свободной формы ТуШ*. Координационная связь и водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [2].

Активный центр №1А подобен активному центру Ту№Кп по отличается от него отсутствием связи Туг-С-ук. В структуре ГЧНА место остатка цистеина занимает остаток фенилаланина. Совмещение структур свободных форм TvNiR и NrfA по эквивалентным атомам каталитических гемов (ЯМБО 0.2 А) приводит к совмещению боковых цепей каталитических остатков аргинина и гистидина (рис. 7). При этом боковые цепи каталитического остатка тирозина совмещаются хуже (расстояние между ОН-атомами 1.2 А), что связано с наличием в структуре Т\г№К ковалентной связи Туг-Су5 (см. раздел 3.6). Координирующий гем остаток лизина имеет разные конфирмации в структурах и

Были определены структуры комплексов TvNiR с нитритом и азидом. Для получения комплексов кристаллы свободной формы фермента выдерживали в течение часа и 12 часов, соответственно, в растворах, приготовленных растворением нитрит или азида натрия в противорастворе Сгуо 13 (Hampton Research Crystal Screen Cryo № 13, pH 8.7). Концентрации нитрита и азида натрия в растворах для выдерживания составляли 100

NrfA.

и 10 мМ, соответственно. В структурах данных комплексов дистальная координационная позиция была описана молекулой воды и ионом л и ганда с заселенности ми 1/2 (рис. 8).

Рис. 7. (Совмещение активных центров структур Тл'МП1 (зеленый) и >ЗНА (черный) по эквивалентным атомам гемов. Показаны остатки гистиднна, тирозина и аргинина, остаток лизина, координирующий тем, остаток цистеина ТуИЖ. и тем TvNiR (серый).

Рис. 8. Связывание нитрит-иона (слева) и азид-иона (справа) в активном центре ТуМЯ. Координационная связь и водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [2].

Нитрит-иоп связывается атомом азота с ионом железа каталитического гема. 02-

Атом нитрит-иона образует водородные связи с боковыми цепями остатков Н1з361 и

ТутЗОЗ. 01-Атом образует водородную связь с боковой цепью остатка А)^ 131.

Связывание нитрита в активном центре ТуМЯ аналогично связыванию нитрита в

активном центре [10]. Но в последнем случае 02-атом нитрита образует водородную

связь только с остатком гиетидина.

Ингибитор азид-ион также связывается с ионом железа тема 4. Ш-Атом азида образует водородные связи с боковыми цепями остатков Н153б1 и ТугЗОЗ. В структуре комплекса NrfA с азидом азид-ион связан у входа в активный центр [11].

Каналы

Активный центр Ту1\ПЯ, как и активный центр №ТА, связан с растворителем посредством двух каналов, служащих для входа субстрата и выхода продукта (рис. 9). Канал транспорта субстрата (диаметр - 6 Л) содержит пять связанных водородными связями молекул воды. Вход в канал имеет положительный потенциал благодаря присутствию остатков А^171, АгуЗ 16 и Аг§348. Центральная часть канала характеризуется почти нейтральным зарядом с отрицательной областью вокруг остатка Аар346. консервативного для ТуКЧЯ и НгГА,

Рис. 9. Расположение каналов транспорта субстрата и продукта в Поверхности

каналов покрашены в соответствии с их электростатическими потенциалами: синий —-положительный, красный — отрицательный. Рисунок взят из [5].

Канал транспорта продукта (диаметр - 5 А) занят шестью молекулами воды. Область канала у активного центра характеризуется отрицательным потенциалом из-за присутствия остатка 01и115 и пропионатных групп гема 4. Отрицательный заряд в глубине канала обеспечивается пропионатными группами гемов 6 и 7 и остатками 01и83, Gli.il 15 и Азп486. У выхода из канала находится положительно заряженная область, образованная остатками Аг^Ш, Шя85, А^96, А^404 и Ьуй431. Последние три остатка консервативны в восьмигемовых цитохромах гомологичных ТуТ^ЦЯ, что подтверждает важность этой положительно заряженной области для функционирования ферментов. В

гексамерной структуре ТуМЖ канал транспорта продукта выходит не на поверхность белка, как наблюдается для Щ£% а во внутреннюю полость гексамера.

В мономере Ту№К. было обнаружено два сайта связывания иона кальция. Во всех структурах вблизи активного центра локализован ион кальция (расстояние Са-Те 10.5 А), характеризующийся полной заселенностью и октаэдрическим окружением (рис. 10, слева). Он координирован остатками С1и302, ТугЗОЗ, Ьуз358 и СЛпЗбО, консервативными для Т\<№К и №ЕА, и двумя молекулами воды. Как и в случае №ТА, полагают, что данный ион кальция играет важную роль в структурировании активного центра фермента.

Рис. 10- Ионы кальция вблизи активного центра (слева) и вблизи гемов 6 и 7 Ту№Я (справа). Ионы кальция показаны зеленым. Контакты показаны пунктиром. Рисунки взяты

В структурах комплексов TvNiR с нитритом и азидом локализован второй, лабильный ион кальция (с заселенностью 1/2) {рис. 10, справа), аналогичный обнаруженному в структурах NrfA из D. desulfuricans [7], W. succinogeaes [11] и Е. coli [12]. Этот ион кальция связан с пропионатными группами А гемов б и 7, карбонильной группой остатка Pro 116 и тремя молекулами воды.

Ионы кальция

из [2].

ЗЛ.2. Активность TvNiR

Количественно охарактеризованы нитрит- и г и д р о к с и лам и н ре д у к газ пая активности TvNiR [4]. Каталитические реакции проводили в анаэробных условиях при 30°С в 0.1 М K-фосфатном буфере (pH 7.0). Для восстановления белка использовали дитиопит натрия и/или восстановленный дитионитом метилвиологеи (MV).

Нитритредуктазная активность TvNiR, определенная но скорости расходования нитрита, составила 2080 ± 200 цмоль NO2" / (мин^мг TvNiR) [2]. Из зависимости скорости восстановления от концентрации нитрита было рассчитано значение Км 16.7 ± 4.0 мМ (концентрацию нитрита варьировали от 1 до 20 мМ). При оценке активности TvNiR в отсутствие дитионита методом циклической вольтамперометрии в белковых пленках (Protein Film Voltammetry, PFV) было рассчитано значение Км 0.095 ± 0.015 мМ [2]. Последнее значение сопоставимо со значениями Км для нитрита, полученными д.|[я NrfA из D. desulfuricans и Е. coli (1.14 мМ \ i 3. ¡4] и 0.028 мМ [12], соответственно). Высокое значение Км в экспериментах с дитионитом обусловлено тем, что сульфит, который образуется в результате окисления дитионита. является сильным конкурентным ингибитором TvNiR. Константа ингибирования (К,) для сульфита, определенная методом PFV, составляет 0,3 ± 0.1 мМ [2]. Для TvNiR, как и для NrfA, показано, что аммоний является единственным продуктом восстановления нитрита [4J.

Нитритредуктазпая активность TvNiR почти не изменялась при значениях pH от 7 до 8.5. Для NrfA из D. vulgaris Hildenborough и Е. coli [15.16] pH-оптимум составил 7.5. Для NrfA из Д desulfuricans pH-оптимум находился в диапазоне от 8.0 до 9.5 [13].

TvNiR восстанавливает гидроксиламин до аммония, Гидроксиламинредуктазпая активность, определенная по скорости окисления MV, предварительно восстановленного дитионитом натрия, составляет 45 ± 6 (дмоль NPLf / (мин*мг TvNiR).

Качественно было показано, что TvNiR катализирует восстановление сульфита до сульфида [4].

Как и в случае NrfA, нитригредуктазная активность TvNiR ингибируетея азидом и цианидом. Цианид является наиболее эффективным ингибитором фермента со значением К; 10 цМ [4].

3.2. Пятигемовые цитохром с н и т р и т р еду кта з ы NrfA

Цитохром с ыитритреду ктаз;ы NrfA, катализаторы восстановления нитрита и гидрокс-иламина до аммиака и сульфита до сульфида. - хорошо изученная группа гомологичных белков, с подробно описанными каталитическими свойствами, структурами гена и оперона, физиологической функцией в клетке [17].

Кристаллические структуры были определены для NrfA из бактерий Sulfurospirillum deleyianum [6], Wolinella succinogems 110,11,180- E. coli [12]. Desulfovihrio desulfuricans [7] и Desulfovihrio vulgaris I lijdenborough [19] (таблица 2). Информация по структурам NrfA в значительной степени суммирована в обзоре [20].

NrfA функционируют в форме гомодимсра, Редокс-партпером NrfA в клетке может быть либо связанный с мембраной цитохром с NrfH [21], либо растворимый цитохром с NrfB [22]. Определены структуры NrfB из Е, coli [23] и комплекса NrfA с Nrfll из Д vulgaris Hildenborough [19] (таблица 2).

Таблица 2, Структуры NrfA. NrfH и NrfB. N - число мономеров в независимой части ячейки.

Белок Лиганд в активном центре Код PDB Разрешение, А R-фактор/ К-free RMSD связей, Ä Группа симметрии N

NrfA W. succinogenes |20 IFS7 1.6 0.180/0.207 0.006 14,22 1

NrfA W. succinogenes S042" 1 rss 1.6 0.184/0.206 0.005 14,22 1

NrfA W. succinogenes N3" IFS9 2.0 0. ] 80/0.208 0.006 14 [22 1

NrfA W, succinogenes NO," 2E80 1.6 0.186/0.210 0.005 14,22 1

NrfA W. succinogenes NH3OH 2 ESI 2.0 0.189/0.225 0.006 14,22 1

NrfA W. succinogenes itsor 3BNF 1.7 0.233/0.279 0.019 14,22 1

Мутант Y218F NrfA W. succinogenes H2Ö 3BNG 1.5 0.181/0.215 0,014 14,22 1

Мутант Y218F NrfA W. succinogenes N02" 3BNH 1.75 0,184/0.220 0.015 14,22 1

Мутант Y218F NrfA IV. succinogenes HSO," 3BNJ 1.3 0.181/0.208 0.01 I 14,22 1

NrfA E. coli H,0 IGU6 2.5 0.203/0.243 0.02 P2,2,2, 4

NrfA E. coli H:0 2RDZ 1.74 0.154/0.188 0.013 P2, 4

NrfA E. coli IISOj" 3L1T 2.3 0.177/0.238 0.01 IJ2, 4

Мутант Q263E NrfA Ii. coli H20 2RF7 2.04 0.171/0.226 0.018 P2,2,2, 4

NrfA .5, deleyianum so,2- 1QDB 1.9 0.184/0.220 0.01 1 P2|2,2 j

NrfA D. desulfwicum H20 10АИ 2.3 0.189/0.224 0.008 P2,2,2, 2

NrfA-bNrfH D. vulgaris Hildcnborough 11,0 2J7A 2.3 0.201/0.240 0.012 12 NrfA 6 NrfFI

NrfB окисленный E. coli - 20ZY 1.74 0.169/0.204 0.013 P2|2;2| 1

NrfB восстановленный E. coli - 2P0B 1.74 0,159/0.192 0.012 P2,2,2| 1

3.2.1 Структура 1ЧгГА Структура мономера

Т\1^А представляют собой однодоменные пятигемовьте белки с молекулярными массами 55-65 кДа, для которых а-спираль - преобладающий элемент вторичной структуры (рис. 11). Активный центр фермента расположен на геме 1 - низин -координированном геме с со свободной дистальной координационной позицией. В мономере №£А было обнаружено два сайта связывания иона кальция - вблизи активного центра (первый) и вблизи гемов 3 и 4 (второй).

Рис. 11. Слева. Мономер NrfA из Е. coli. Голубым цветом показан участок цегш 169-175. Справа. Мономер NrfA из Ш desulfuricans. Голубым цветом показаны неконсервативный С-концевой участок, а также петли LI и L2. Каталитический гем показан красным цветом, остальные - синим. Нумерация гемов соответствует положениям гем-связывающих мотивов в аминокислотной последовательности. Ионы кальция изображены в виде сфер.

Во всех структурах NrfA присутствует пучок из грех длинных а-спиралей (h21, h22 и Ь23), а в структурах NrfA из S. deleyicmwn ¡"61, W. succinogenes [11] и Е. coli [12] присутствует также длинная а-спираль на С-конпе (рис. 11). Структуры этих ферментов сильно похожи между собой.

Структура NrfA из D. äesulfuricans [7] существенно отличается от других N- и С-концевым районами (рис. 11, справа). В С-концевой области данного фермента остатки 68-76 образуют дополнительную петлю (петля LI), которая участвует в координации

второго иона кальция. За этой петлей остатки 84-94 образуют еще один дополнительный участок, который частично блокирует место выхода продукта (петля L2). В С-концевой области остатки 465-470 образуют короткую дополнительную спираль h24. участвующую во взаимодействии мономеров в д им ере. За ней следует длинный участок, содержащий и-спиральный поворот и три коротких Зю-спираля (Ь26. Ь27 и h28) и заканчивающийся коротким антипараллельпым ß-листом на С-конце.

Важным отличием структуры фермента из Е. coli [12] от других является наличие в ней участка, образованного остатками 169-175 (рис. 11, слева). Данная вставка находится вблизи тема 2 (возможный вход для электронов) и поэтому может принимать участие во взаимодействии с электронным донором NrfB. Аналогичная вставка из семи остатков присутствует в ферментах NrfA Salmonella typhi и Haemophilus influenzae; иг/-опероны которых содержат ген nrfB [12].

NrfA из D. vulgaris Hildenborough [19] наиболее гомологичен ферменту из D. de sulfur team, структура которого может быть совмещена с данной с RMSD 0,9 А для 474 совмещаемых Са-атомов. В структуре NrfA из D. vulgaris локализованы остатки 25-40, которые отсутствуют во всех других известных структурах Nr ГЛ.

Дим ер

В кристаллах и в растворе мономеры NifA образуют димерные молекулы, в которых мономеры связаны между собой поворотной осью симметрии второго порядка (рис. 12). Рассмотрим димерный контакт NrfA на примере структуры фермента из D. desulfuricans. Основное взаимодействие осуществляет спираль h23, которая располагается напротив спиралей h23 и h21 из другого мономера (рис. 11). N-концевой участок спирали Ь21 осуществляет также взаимодействие с короткой а-спиралью hl8 другого мономера. Еще одно взаимодействие имеет место между спиралями h24 (остатки с 465 по 470) из обоих мономеров. Общая площадь поверхности контакта мономер-мономер составляет 1530 А2.

Взаимодействие мономеров в димере в основном гидрофобное. Главные гидрофобные взаимодействия имеют место в области контакта спиралей h23 и И24 с ними же из другого мономера. Однако, имеется и важный электростатический вклад во взаимодействие благодаря спирали Ь21, которая содержит набор основных остатков (лизина, аргинина), взаимодействующих е отрицательно заряженными группами другого мономера (пропиоиат D гема 5, остатки асиартата и глутамата из спиралей hl 8 и Ь23). Эта область контакта расположена рядом с местом выхода продукта. Поэтому образование

ли мера является важным для создания отрицательного электростатического потенциала вокруг места выхода продукта [7].

Рис 12. Димер NrfA из W. succinogenes. Каталитический гем показан красным цветом, остальные - синим. Розовая сфера - ион кальция, черная сфера - ион иттрия.

Гемы

Гемы 2-5 NrfA - бис (шетиди некоординированные, связанные с полипептидной цепью при помощи классических гем(с)-связывающих мотивов СХХСН. Гем 1 связан при помощи мотива СХХСК и является ли з и н - к о о р л и н яр о в а н н ы м со свободной дистальной координационной позицией, Гемы 1, 3 и 4 располагаются группой и почти копланарны. Гемы в парах 2/3 и 4/5 почти перпендикулярны друг другу (рис. 1 I). Расстояние Fe-Fe между соседними темами в мономере нитритредуктазы изменяется от 9 до 12.8 Á (5. deleyianum), чего достаточно для прямой передачи электронов между гемовьтми центрами. Короткое расстояние Fe-Fe (13.7 А для S. deleyianum) между т емами 5 в димере NrfA предполагает их электронное взаимодействие, видимо, имеющее функциональную роль. Более того, гемы контактируют друг с другом пропионатами.

Ак тивный центр и комплексы с субстратами и ингибиторами

Для NrfA из W. succinogenes определены структуры комплексов с субстратами нитритом [10], сульфитом [18] и гидроксиламином [10] и ингибиторами азидом и сульфатом [11] (табл. 2). Кристаллизацию проводили в 100 мМ Na-ацетатном буфере (рН 5.7). содержащем 12 % ПЭГ 4000, 200 мМ сульфат аммония и 15 мМ YCh. Поэтому исходно белок содержал сульфат-ион в активном центре. Для получения свободной формы фермента [11] кристаллы сульфатного комплекса помещали в 100 мМ буфер HEPES/NaOH (рН 7.5) с 14 % ПЭГ 4000. Остальные комплексы были получены выдерживанием кристаллов сульфатного комплекса в растворах, содержащих необходимый лиганд, 14 % ПЭГ 4000 и либо 100 мМ HEPES/NaOH (рН 7.5), либо 100 мМ ацетат натрия (рН 5.7). В таблице 3 приведены условия получения комплексов NrfA.

Гидроксиламии разрушал кристаллы №ГА, поэтому концентрация лиганда и время выдерживания были малы в случае получения соответствующего комплекса. Все дифракционные данные, собранные с использованием синхротронного излучения, показали смесь состояний в активном центре для комплекса №1А с гидроксиламии ом [10]. Вероятно, это связано с фотовосстановлением, вызванным интенсивным излучением. Сбор данных на лабораторном источнике рентгеновского излучения с использованием С и К„-и з л уче ния привел к однозначной интерпретации электронной плотности для координированного гидроксиламина.

Таблица 3. Условия получения комплексов Указаны время выдерживания

кристалла, концентрация лиганда в растворе для выдерживания и рН буфера. О комплексе К'г ГА с сульфатом см. в тексте.

Лиганд NCV N1LOH HS03" Nj"

[лиганд|. мМ 100 5 10 50

рН 5.7 5.7 5.7 7.5

Время, мин 60 15 120 120

Рассмотрим активный центр NrfA и связывание в нем лигапдов на примере фермента из W. succinogenes. Активный центр NrfA образован л из и н - ко о р д и н и р о в ан н ым гемом 1 и остатками Arg! 14, His277 и Туг218 (аналогичен активному центру TvNiR. рис. б). В структуре свободной формы фермента дистальную координационную позицию гема 1 занимает молекула воды, находящаяся на расстоянии 2.0 А от иона железа гема и образующая водородную связь с NC2-aTOMOM остатка His277 (длина связи 2.9 А).

Слабый ингибитор нитритредуктазной активности сульфат-ион связывается в активном центре NrfA (рис. 13, А) так. что один его атом кислорода координирован ионом железа гема (2.0 А), а три других образуют по одной водородной связи с ближним окружением дистапьной координационной позиции. С сульфатом взаимодействуют гидроксильная группа остатка Tyr218 (2.6 А), молекула водьт, связанная с пропнонатами гема 1, и молекула воды, связанная с боковой цепью остатка Arg 114.

Рис. 13. Связывание ингибиторов в активном центре №1А из IV. зиссШЩсШЩ, А -комплекс с сульфатом, В — комплекс с азидом. Водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [ 11 ],

В структуре комплекса №1А с азидом (рис. 13, В) дистальпую координационную позицию гема 1 занимает молекула воды (2.0 А). Азид связывается у входа в активный центр, образуя водородные связи с остатками 01п276 (3.0 А), Туг218 (2.8 А) и А^114 (МБ - 3.0 А, N112 - 2.9 А),

Нитрит-ион связывается в активном центре NrfA, взаимодействуя атомом азота с ионом железа гема 1 (1.9 А). 01-Атом нитрита образует водородную связь с ВШ2-атомом остатка №$277 (2,6 А), 02-атом - с ЫН2-атомом остатка А^114 (2.8 А) (рис. 14, А). Гидроксиламин также связан с ионом железа гема 1 атомом азота. Его атом кислорода находится примерно в той же позиции, что и 02-атом нитрита, и образует водородную связь с ^12-атомом остатка А^114 (3.0 А) (рис. 14, В).

Рис. 14. Связывание субстратов в активном центре №£А из Ж тсс'то^епез. А - комплекс с нитритом, В - комплекс с гидроксиламииом. Водородные связи показаны пунктиром. Рисунок взят из [10].

Сульфит-ион связывается с ионом железа гема 1 N1-1^ атомом серы (рис. 15, В). Атомы кислорода сульфита образуют водородные связи со всеми каталитическими

остатками NrfA и с консервативной молекулой воды, связанной с карбоксильными группами тема 1. Длина связи Fe-S составляет 2.4 А, длина связи Fe-NZ(Lysl34) — 2.1 Ä (как и в структуре свободной формы фермента). Боковая цепь остатка Тут218 в структуре сульфитного комплекса NrfA повернута на - 5° к остатку His277 по сравнению с ее положением в свободной форме фермента.

Определена структура комплекса восстановленного NrfA Е. coli с сульфит-ионом (разрешение 2.3 Ä) [24]. Кристалл NrfA выдерживали в растворе, содержащем 50 мМ NaiSiOs. С использованием микроспектрофотометра было показано, что за 100 с воздействия рентгеновских лучей (станция ID14.2, синхротрон ESRF, Гренобль) на кристалл фермент был полностью восстановлен. Электронная плотность лиганда в активном центре фермента была интерпретирована сульфит-ионом, связанным аналогично сульфит-иону в структуре комплекса NrfA W. succinogenes. Авторы работы [24] объясняют присутствие сульфит-иона в активном центре восстановленного NrfA тем, что скорость каталитического превращения должна быть очень низкой при температуре рентгеновского эксперимента (100 К).

ТугМ1е213 Ту1/РЬе 218

Рис. 15. Сравнение связывания субстрата в структурах комплексов нативного NrfA (зеленый) и мутанта У218И (серый). А - связывание нитрит-иона, В - связывание сульфит-иона. Рисунок взят из [18].

Для NrfA из W.succinogenes решены структуры свободной формы мутанта У218Р и его комплексов с нитрит- и сульфит-ионами [18]. В структурах мутанта боковая цепь остатка РЬе218 повернута на ~ 5° к остатку Шк277 по сравнению с кольцом каталитического тирозина в свободной форме нативного фермента, и ее положение совпадает с положением боковой цепи остатка тирозина в структуре сульфитного комплекса

В нитрит ном комплексе мутанта плоскость 0-N-0 иона нитрита почти перпендикулярна плоскости атомов азота тема 1 (рис. 15, А). При совмещении структур нитритных комплексов нативного белка и мутанта видно, что атом кислорода нитрита, образующий водородную связь с остатком Arg 114, не меняет своего положения. Другой атом кислорода смешается па 0.6 А, в результате чего водородная связь, образуемая этим атомом с остатком His277, укорачивается до 2.5 А, а боковая цепь гистидина смещается на 0.4 Ä от иона железа по сравнению с нагивным белком. Для сульфитных комплексов нативной и мутантной форм NrfA наблюдается одинаковое расположение сульфит-иона и остатков в активном центре (рис. 15, В).

В структурах свободных форм NrfA молекулы воды в полости активного центра расположены одинаково [25]. На рисунке 16, А показаны пять консервативных молекул воды в активном центре NrfA Е, coli (разрешение 1.74 А) [25]. Молекула воды W1 связана с ионом железа гема и образует водородную связь с боковой цепью остатка His264. Расстояние Fe-Wl составляет 2.26 ± 0.03 А. Молекула воды W2 образует водородные связи с молекулой W1 и с гидроксильной группой остатка Туг216. Молекула W3 образует водородные связи с молекулой W1 и с гидроксильными группами гема 1. Молекула воды W4 образует водородные связи с молекулой W2 и с гуанидиновой группой остатка Arg 106. Молекула W5 образует водородные связи с гидроксильной группой остатка Туг216 и с амидной группой остатка Gln263.

Решена структура мутанта Q263E NrfA Е. coli (разрешение 2.04 А), в котором остаток глутамина, координирующий первый ион кальция, замещен на остаток глутамата (рис. 16, В) [25]. Атомы аминокислотных остатков активных центров нативного NrfA и мутанта Q263E могут быть совмещены с RJV1SD 0.15 А. В структуре мутанта остаток Glu263 координирует ион кальция одним атомом кислорода и характеризуется конформацией, которая близка коыформации остатка глутамина в структуре нативного фермента. Взаимодействия молекул воды в активных центрах нативного NrfA и мутанта Q263E различаются (рис. 16). В структуре мутанта расстояние Fe-Wl составляет 2.58 ± 0.06 Ä, а пики электронной плотности для молекул воды Wl, W2 и W3 меньше, чем в структуре нативного NrfA. Это может быть связано с большой подвижностью молекул воды в активном центре мутанта и коррелирует с высокими значениями B-фактора для данных молекул воды. Среднее значение B-фактора, рассчитанное для всех молекул воды в структуре мутанта, близко такому значению для структуры нативного NrfA. Значения В-фактора молекулы воды W6 и остатка Lysl26 (рис. 16) для мутанта и нативного фермента также близки, что согласуется с предположением о том, что причиной делокализации

молекул воды активного центра являются изменения с дистальнои стороны гема активного центра.

В

/\

г

и

Y82-,.-::

Е263 Н264

i

ът К126

и v

rL

/У32

Ёёез Н264 -11

Рис. 16. Стереоизображения активных центров нативного NrfA из Е. coli (А, разрешение 1.74 А) и его мутанта Q263E (В, разрешение 2.04 А). Показаны omii-карты для молекул воды активного центра (5 о для А и 4 Щ для В). Пунктирные линии показывают водородные связи с длинами меньше 3.1 А. Ион кальция изображен в виде зеленой сферы. Рисунок взят из [25].

Ионы кальция

Ион кальция вблизи активного центра в структуре КгГА связан аналогично иону кальция в структуре Т\?МК (рис. 10. слева). В случае №1А из Щ &Шсшщте5 [11] ион кальция координирует остатки Туг218 (карбонильный атом кислорода), Ьуа274 (карбонильный атом кислорода), С1п276 (атом кислорода амидной группы), 01и217 (карбоксильная группа) и две молекулы воды, связанные с остатком А$р262. Считают, что

данный ион кальция стабилизирует структуру, необходимую для катализа (10.7 Ä от иона кальция до иона железа гема 1). Так. остаток Туг218 является остатком активного центра, а за остатками Lys274 и Gln276 в первичной структуре следует еще один остаток активного центра - His277. Остатки Lys274 и Gln276 принимают участие в образовании полости активного центра. Ион кальция вносит вклад в положительный электростатический потенциал полости активного центра [11].

Второй сайт связывания иона металла обнаружен вблизи гемов 3 и 4 NrfA и аналогичен сайту связывания второго иона кальция TvNiR. В структуре NrfA из D. desulfuricans [7] второй ион кальция характеризуется полной зеселенностью и октаэдрической координацией (рис. 17, А). Лиганлы иона кальция - пропионаты А гемов

3 и 4, карбонильные группы остатков Gly75 (из петли LI) и ТЬгПЩ и боковые цепи остатков Gl Ii 114 и Thrl 15, Все лиганды находятся па расстояниях 2.4 А от иона кальция.

В NrfA из Е. coli и W. succinogenes вместо остатков Glul 14 и Thrl 15 находятся остатки, чьи боковые цепи не могут координировать ион кальция. В структуре NrfA из Е, coli (рис. 17, С) второй ион кальция координирован пропионатами А гемов 3 и 4 и карбонильной группой остатка Рго91. Он имеет неполную координационную сферу с молекулой воды в роли четвертого лиганда. В структуре NrfA из W. succinogenes (рис. 17, В) на месте второго нона кальция находится ион Y3', появляющийся из-за использования YCU в условиях кристаллизации. Ион У3' также координирован пропионатами А гемов 3 и

4 и карбонильной группой остатка Рго99. Другие координационные позиции заняты тремя молекулами воды и ацетатом. В структуре NrfA из S. deleyiamtm (рис. 17, D) пропионат А гема 3 образует водородную связь с карбонильной группой остатка Val320. В этом случае сайт связывания второго иона кальция отсутствует, что, видимо, также связано с условиями кристаллизации [7].

В связи с фактом, что второй ион кальция в ферменте D. desulfuricans крепко связан белковыми лигандами, этот ион может иметь важное физиологическое значение. Так, конформация дополнительной петли, которая координирует ион кальция, оказывает влияние на проникновение растворителя во внутренние области белка, а именно в полость гема 4. что может сказываться на его редокс-потенциале. В NrfA из D. desulfuricans гем 4 характеризуется очень низкой доступностью для растворителя (3.2 Ä2) по сравнению с другими NrfA (6L7-83.6 Ä2). Для гема 3 значение данной величины меняется в области 2.5 - 17.5 Ä2 в известных структурах. Низкая доступность для растворителя гемов 3 и 4 подразумевает низкую диэлектрическую постоянную среды вокруг этих гемов. что может объяснить их сильно отрицательные потенциалы [7].

Рис. 17. Сайт связывания второго иона Са2~ у №Ь\. Ион кальция показан красным, ион иттрия - розовым. Водородные связи показаны пунктиром. А - Ыг1'А из О. йеьиЩлпсаш, В - ЫгГА из Ш. яисслгю^епе.ч, С - №£А из Е. соЦ О - ЫгГА из скНеушпшп. Рисунок взят из

[7]-

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Трофимов, Антон Андреевич, 2011 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sorokin, D. Y.; Antipov, A. N.; Kuenen, J. G., Complete denitrification in coculture of obligately ehemolithoautotrophie haloalkaliphilie sulfur-oxidizing bacteria from a hypersaline soda lake. Arch. Microbiol. 2003, 180, (2), 127-33.

2. Tikhonova, T. V.; Polyakov, K. M.; Boyko, K. M.; Safonova, T. N.; Popov, V. O., Octaheme cytochrome c nitrite reductase. 2010. Handbook of Metalloproteins. John Wiley & Sons, Ltd. UR - http://dx.doi.org/10.1002/0470Q28637.met276. DO -

10.1002/0470028637.met276

3. Methe, B. A.; Nelson, K. E.; Eisen, J. A.; Paulsen, I. T.; Nelson, W.; Heidelberg, J. F.; Wu, D.; Wu, M.; Ward, N.; Beanan, M. J.; Dodson, R. J.; Madupu, R.; Brinkac, L. M.; Daugherty, S. C.; DeBoy, R. T.; Durkin, A. S.; Gwinn, M.; Kolonay, J. F.; Sullivan, S. A.; Haft, D. H.; Selengut, J.; Davidsen, T. M.; Zafar, N.; White, O.; Tran, B.; Romero, C.; Forberger, H. A.; Weidman, J.; Khouri, H.; Feldblyum, T. V.; Utterback, T. R.; Van Aken, S. E.; Lovley, D. R.; Fraser, C. M., Genome of Geobacter sulfurreducens: metal reduction in subsurface environments. Science 2003, 302, (5652), 1967-9.

4. Tikhonova, T. V.; Slutsky, A.; Antipov, A. N.; Boyko, K. M.; Polyakov, K. M.; Sorokin, D. Y.; Zvyagilskaya, R. A.; Popov, V. O., Molecular and catalytic properties of a novel cytochrome c nitrite reductase from nitrate-reducing haloalkaliphilie sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1764, (4), 715-23.

5. Polyakov, K. M.; Boyko, K. M.; Tikhonova, T. V.; Slutsky, A.; Antipov, A. N.; Zvyagilskaya, R. A.; Popov, A. N.; Bourenkov, G. P.; Lamzin, V. S.; Popov, V. O., Highresolution structural analysis of a novel octaheme cytochrome c nitrite reductase from the haloalkaliphilie bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens. J. Mol. Biol. 2009, 389, (5), 846-62.

6. Einsle, O.; Messerschmidt, A.; Stach, P.; Bourenkov, G. P.; Bartunik, H. D.; Huber, R.; Kroneck, P. M., Structure of cytochrome c nitrite reductase. Nature 1999, 400, (6743), 476-80.

7. Cunha, C. A.; Macieira, S.; Dias, J. M.; Almeida, G.; Goncalves, L. L.; Costa, C.; Lampreia, J.; Huber, R.; Moura, J. J. G.; Moura, I.; Romao, M. J., Cytochrome c nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774. The relevance of the two calcium sites in the structure of the catalytic subunit (NrfA). J. Biol. Chem. 2003, 278, (19), 17455-65.

8. Igarashi, N.; Moriyama, H.; Fujiwara, T.; Fukumori, Y.; Tanaka, N., The 2.8 A structure of hydroxylamine oxidoreductase from a nitrifying chemoautotrophic bacterium, Nitrosomonas europaea. Nat. Struct. Biol. 1997, 4, (4), 276-84.

9. Mowat, C. G.; Rothery, E.; Miles, C. S.; Mclver, L.; Doherty, M. K.; Drewette, K.; Taylor, P.; Walkinshaw, M. D.; Chapman, S. K.; Reid, G. A., Octaheme tetrathionate reductase is a respiratory enzyme with novel heme ligation. Nat. Struct. Mol. Biol. 2004, 11, (10), 1023-4.

10. Einsle, O.; Messerschmidt, A.; Huber, R.; Kroneck, P. M. H.; Neese, F., Mechanism of the six-electron reduction of nitrite to ammonia by cytochrome c nitrite reductase. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, (39), 11737-45.

11. Einsle, O.; Stach, P.; Messerschmidt, A.; Simon, J.; Kroger, A.; Huber, R.; Kroneck, P. M., Cytochrome c nitrite reductase from Wolinella succinogenes. Structure at 1.6 A resolution, inhibitor binding, and heme-packing motifs. J. Biol Chem. 2000, 275, (50), 39608-16.

12. Bamford, V. A.; Angrove, H. C.; Seward, H. E.; Thomson, A. J.; Cole, J. A.; Butt, J. N.; Hemmings, A. M.; Richardson, D. J., Structure and spectroscopy of the periplasmic cytochrome c nitrite reductase from Escherichia coli. Biochemistry 2002, 41, (9), 2921-31.

13. Liu, M. C.; Peck, H. D., The isolation of a hexaheme cytochrome from Desulfovibrio desufuricans and its identification as a new type of nitrite reductase. J. Biol. Chem. 1981, 256, (24), 13159-64.

14. Pereira, I. C.; Abreu, I. A.; Xavier, A. V.; LeGall, J.; Teixeira, M., Nitrite reductase from Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 27774) - a heterooligomer heme protein with sulfite reductase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 224, (3), 611-8.

15. Pereira, I. A.; LeGall, J.; Xavier, A. V.; Teixeira, M, Characterization of a heme c nitrite reductase from a non-ammonifying microorganism, Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. Biochim. Biophys. Acta 2000, 1481, (1), 119-30.

16. Kajie, S.; Anraku, Y., Purification of a hexaheme cytochrome c552 from Escherichia coli K12 and its properties as a nitrite reductase. Eur. J. Biochem. 1986, 154, (2), 457-63.

17. Simon, J., Enzymology and bioenergetics of respiratory nitrite ammonification. FEMS Microbiol. Rev. 2002, 26, (3), 285-309.

18. Lukat, P.; Rudolf, M.; Stach, P.; Messerschmidt, A.; Kroneck, P. M. H.; Simon, J.; Einsle, O., Binding and reduction of sulfite by cytochrome c nitrite reductase. Biochemistry 2008, 47, (7), 2080-6.

19. Rodrigues, M. L.; Oliveira, T. F.; Pereira, I. A.; Archer, M., X-ray structure of the membrane-bound cytochrome c quinol dehydrogenase NrfH reveals novel haem coordination. EMBOJ. 2006, 25, (24), 5951-60.

20. Mowat, C. G.; Chapman, S. K., Multi-heme cytochromes - new structures, new chemistry. Dalton Trans. 2005, 21, 3381-9.

21. Simon, J.; Pisa, R.; Stein, T.; Eichler, R.; Klimmek, O.; Gross, R., The tetraheme cytochrome c NrfH is required to anchor the cytochrome c nitrite reductase (NrfA) in the membrane of Wolinella succinogenes. Eur. J. Biochem. 2001, 268, (22), 5776-82.

22. Clarke, T. A.; Dennison, V.; Seward, H.; Burlat, B.; Cole, J. A.; Hemmings, A. M.; Richardson, D. J., Purification and spectropotentiometric characterization of Escherichia coli NrfB, a decaheme homodimer that transfers electrons to the decaheme periplasmic nitrite reductase complex. J. Biol. Chem. 2004, 279, (40), 41333-9.

23. Clarke, T. A.; Cole, J. A.; Richardson, D. J.; Hemmings, A. M., The crystal structure of the pentahaem c-type cytochrome NrfB and characterization of its solution-state interaction with the pentahaem nitrite reductase NrfA. Biochem. J. 2007, 406, (1), 19-30.

24. Kemp, G. L.; Clarke, T. A.; Marritt, S. J.; Lockwood, C.; Poock, S. R.; Hemmings, A. M.; Richardson, D. J.; Cheesman, M. R.; Butt, J. N., Kinetic and thermodynamic resolution of the interactions between sulfite and the pentahaem cytochrome NrfA from Escherichia coli. Biochem. J. 2010, 431, (1), 73-80.

25. Clarke, T. A.; Kemp, G. L.; Van Wonderen, J. H.; Doyle, R. M.; Cole, J. A.; Tovell, N.; Cheesman, M. R.; Butt, J. N.; Richardson, D. J.; Hemmings, A. M., Role of a conserved glutamine residue in tuning the catalytic activity of Escherichia coli cytochrome c nitrite reductase. Biochemistry 2008, 47, (12), 3789-99.

26. Clarke, T. A.; Hemmings, A. M.; Burlat, B.; Butt, J. N.; Cole, J. A.; Richardson, D. J., Comparison of the structural and kinetic properties of the cytochrome c nitrite redyctases from Escherechia coli, Wolinella succinogenes, Sulfospirillum deleyianum and Desulfovibro desulfuricans. Biochem. Soc. Trans. 2006, 34, (1), 143-5.

27. Stach, P.; Einsle, O.; Schumacher, W.; Kurun, E.; Kroneck, P. M. H., Bacterial cytochrome c nitrite reductase: new structural and functional aspects. J. Inorg. Biochem. 2000, 79, (1-4), 381-5.

28. Schumacher, W.; Hole, U.; Kroneck, P. M. H., Ammonia-forming cytochrome c nitrite reductase from Sulfurospirillum deleyianum is a tetraheme protein: New aspects of the molecular composition and spectroscopic properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 205,(1), 911-6.

29. Steuber, J.; Arendsen, A. F.; Hagen, W. R.; Kroneck, P. M. H., Molecular properties of the dissimilatory sulfite reductase from Desulfovibrio desulfuricans (Essex) and comparison with the enzyme from Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Eur. J. Biochem. 1995, 233, (3), 8739.

30. Schnell, R.; Sandalova, T.; Hellman, U.; Lindqvist, Y.; Schneider, G., Siroheme- and [Fe4-S4]-dependent NirA from Mycobacterium tuberculosis is a sulfite reductase with a covalent Cys-Tyr bond in the active site. J. Biol. Chem. 2005, 280, (29), 27319-28.

31. Eaton, D. R.; Wilkins, R. G., Reduction by dithionite ion of adducts of metmyoglobin with imidazole, pyridine, and derivatives. J. Biol. Chem. 1978, 253, (3), 908-15.

32. Gwyer, J. D.; Richardson, D. J.; Butt, J. N., Inhibiting Escherichia coli cytochrome c nitrite reductase: voltammetry reveals an enzyme equipped for action despite the chemical challenges it may face in vivo. Biochem. Soc. Trans. 2006, 34, (1), 133-5.

33. Gross, R.; Eichler, R.; Simon, J., Site-directed modifications indicate differences in axial haem c iron ligation between the related NrfH and NapC families of multihaem c-type cytochromes. Biochem. J. 2005, 390, (3), 689-93.

34. Rodrigues, M. L.; Scott, K. A.; Sansom, M. S.; Pereira, I. A.; Archer, M., Quinol oxidation by c-type cytochromes: structural characterization of the menaquinol binding site of NrfH A. J. Mol. Biol. 2008, 381, (2), 341-50.

35. Hooper, A. B.; Nason, A., Characterization of hydroxylamine-cytochrome c reductase from the chemoautotophs Nitrosomonas europaea and Nitrosocystis oceanus. J. Biol. Chem. 1965, 240,(10), 4044-57.

36. Hoshino, M.; Maeda, M.; Konishi, R.; Seki, H.; Ford, P. C., Studies on the reaction mechanism for reductive nitrosylation of ferrihemoproteins in buffer solutions. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118,(24), 5702-7.

37. Fernandez, M. L.; Estrin, D. A.; Bari, S. E., Theoretical insight into the hydroxylamine oxidoreductase mechanism. J. Inorg. Biochem. 2008, 102, (7), 1523-30.

38. Bergmann, D. J.; Zahn, J. A.; Hooper, A. B.; DiSpirito, A. A., Cytochrome P460 genes from the methanotroph Methylococcus capsulatus bath. J. Bacteriol. 1998, 180, (24), 6440-5.

39. Pearson, A. R.; Elmore, B. O.; Yang, C.; Ferrara, J. D.; Hooper, A. B.; Wilmot, C. M., The crystal structure of cytochrome P460 of Nitrosomonas europaea reveals a novel cytochrome fold and heme-protein cross-link. Biochemistry 2007, 46, (28), 8340-9.

40. Bollinger, J. A.; Brown, D. E.; Dooley, D. M., The formation of lysine tyrosylquinone (LTQ) is a self-processing reaction. Expression and characterization of a Drosophila lysyl oxidase. Biochemistry 2005,44, (35), 11708-14.

41. Colas, C.; Ortiz de Montellano, P. R., Autocatalytic radical reactions in physiological prosthetic heme modification. Chem. Rev. 2003, 103, (6), 2305-32.

42. Atkinson, S. J.; Mowat, C. G.; Reid, G. A.; Chapman, S. K., An octaheme c-type cytochrome from Shewanella oneidensis can reduce nitrite and hydroxylamine. FEES Lett. 2007, 581,(20), 3805-8.

43. Siegel, L. M.; Murphy, M. J.; Kamin, H., Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-sulfite reductase of enterobacteria. I. The Escherichia coli hemoflavoprotein: molecular parameters and prosthetic groups. J. Biol. Chem. 1973, 248, (1), 251-64.

44. Siegel, L. M.; Rueger, D. C.; Barber, M. J.; Krueger, R. J.; Orme-Johnson, N. R.; Orme-Johnson, W. H., Escherichia coli sulfite reductase hemoprotein subunit. Prosthetic groups, catalytic parameters, and ligand complexes. J. Biol. Chem. 1982, 257, (11), 6343-50.

45. Crane, B. R.; Getzoff, E. D., The relationship between structure and function for the sulfite reductases. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6, (6), 744-56.

46. Stroupe, M. E.; Getzoff, E. D., Sulfite reductase hemoprotein. 2001. Handbook of Metalloproteins. John Wiley & Sons, Ltd.

47. Crane, B. R.; Siegel, L. M.; Getzoff, E. D., Sulfite reductase structure at 1.6 A: evolution and catalysis for reduction of inorganic anions. Science 1995, 270, (5233), 59-67.

48. Crane, B. R.; Siegel, L. M.; Getzoff, E. D., Probing the catalytic mechanism of sulfite reductase by X-ray crystallography: structures of the Escherichia coli hemoprotein in complex with substrates, inhibitors, intermediates, and products. Biochemistry 1997, 36, (40), 12120-37.

49. Janick, P. A.; Rueger, D. C.; Krueger, R. J.; Barber, M. J.; Siegel, L. M., Characterization of complexes between Escherichia coli sulfite reductase hemoprotein subunit and its substrates sulfite and nitrite. Biochemistry 1983, 22, (2), 396-408.

50. Feltham, R. D.; Enemark, J. H. Top. Stereochem. 1981, 12, 155-215.

51. Himo, F.; Noodleman, L.; Blomberg, M. R. A.; Siegbahn, P. E. M., Relative acidities of ortho-substituted phenols, as model for modified tyrosines in proteins. J. Phys. Chem. 2002, 106, (37), 8757-61.

52. Itoh, S.; Takayama, S.; Arakawa, R.; Furuta, A.; Komatsu, M.; Ishida, A.; Takamuku, S.; Fukuzumi, S., Active site models for galactose oxidase. Electronic effect of the thioether group in the novel organic cofactor. Inorg. Chem. 1997, 36, (7), 1407-16.

53. Whittaker, M. M.; Chuang, Y. Y.; Whittaker, J. W., Models for the redox active site in galactose oxidase. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 10029-35.

54. Davies, K. J. A.; Delsignore, M. E.; Lin, S. W., Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids. J. Biol. Chem. 1987, 262, (20), 9902-5.

55. Gunther, M. R.; Sturgeon, B. E.; Mason, R. P., A long-lived tyrosyl radical from the reaction between horse metmyoglobin and hydrogen peroxide. Free Radio. Biol. Med. 2000, 28, (5), 709-19.

56. Barry, B. A.; el-Deeb, M. K.; Sandusky, P. O.; Babcock, G. T., Tyrosine radicals in photosystem II and related model compounds. Characterization by isotopic labeling and EPR spectroscopy.«/ Biol. Chem. 1990, 265, (33), 20139-43.

57. Larsson, A.; Sjoberg, B. M., Identification of the stable free radical tyrosine residue in ribonucleotide reductase. EMBO J. 1986, 5, (8), 2037-40.

58. Ivancich, A.; Jouve, H. M.; Sartor, B.; Gaillard, J., EPR investigation of compound I in Proteus mirabilis and bovine liver catalases: formation of porphyrin and tyrosyl radical intermediates. Biochemistry 1997, 36, (31), 9356-64.

59. Ivancich, A.; Mazza, G.; Desbois, A., Comparative electron paramagnetic resonance study of radical intermediates in turnip peroxidase isozymes. Biochemistry 2001, 40, (23), 68606.

60. Karthein, R.; Dietz, R.; Nastainczyk, W.; Ruf, H. H., Higher oxidation states of prostaglandin H synthase. EPR study of a transient tyrosyl radical in the enzyme during the peroxidase reaction. Eur. J. Biochem. 1988, 171, (1-2), 313-20.

61. Iwata, S.; Ostermeier, C.; Ludwig, B.; Michel, H., Structure at 2.8 A resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature 1995, 376, (6542), 660-9.

62. Ostermeier, C.; Harrenga, A.; Ermler, U.; Michel, H., Structure at 2.7 A resolution of the Paracoccus denitrificans two-subunit cytochrome c oxidase complexed with an antibody Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, (20), 10547-53.

63. Muramoto, K.; Ohta, K.; Shinzawa-Itoh, K.; Kanda, K.; Taniguchi, M.; Nabekura, H.; Yamashita, E.; Tsukihara, T.; Yoshikawa, S., Bovine cytochrome c oxidase structures enable 02 reduction with minimization of reactive oxygens and provide a proton-pumping gate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, (17), 7740-5.

64. Buse, G.; Soulimane, T.; Dewor, M.; Meyer, H. E.; Bluggel, M., Evidence for a copper-coordinated histidine-tyrosine cross-link in the active site of cytochrome oxidase. Protein Sci.

1999, 8, (5), 985-90.

65. Kaila, V. R.; Johansson, M. P.; Sundholm, D.; Laakkonen, L.; Wikstrom, M., The chemistry of the CuB site in cytochrome c oxidase and the importance of its unique His-Tyr bond. Biochim. Biophys. Acta 2009, 1787, (4), 221-33.

66. Tsukihara, T.; Shimokata, K.; Katayama, Y.; Shimada, H.; Muramoto, K.; Aoyoma, H.; Mochizuki, M.; Shinzawa-Itoh, K.; Yamashita, E.; Yao, M.; Ishimura, Y.; Yoshikawa, S., The low-spin heme of cytochrome c oxidase as the driving element of the proton-pumping process. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, (26), 15304-9.

67. McCauley, K. M.; Vrtis, J. M.; Dupont, J.; van der Donk, W. A., Insights into the functional role of the tyrosine-histidine linkage in cytochrome c oxidase. J. Am. Chem. Soc.

2000, 122, 2403-4.

68. Babcock, G. T., How oxygen is activated and reduced in respiration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, (23), 12971-3.

69. Bravo, J.; Fita, I.; Ferrer, J. C.; Ens, W.; Hillar, A.; Switala, J.; Loewen, P. C., Identification of a novel bond between a histidine and the essential tyrosine in catalase HPII of Escherichia coli. Prorein Sci. 1997, 6, (5), 1016-23.

70. Cubitt, A. B.; Heim, R.; Adam, S. R.; Boyd, A. E.; Gross, L. A.; Tsien, R. Y., Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, (11), 448-55.

71. Diaz, A.; Horjales, E.; Rudino-Pinera, E.; Arreola, R.; Hansberg, W., Unusual Cys-Tyr covalent bond in a large catalase. J. Mol. Biol. 2004, 342, (3), 971-85.

72. Lledias, F.; Rangel, P.; Hansberg, W., Oxidation of catalase by singlet oxygen. J. Biol. Chem. 1998, 273, (17), 10630-7.

73. Mate, M. J.; Sevinc, M. S.; Hu, B.; Bujons, J.; Bravo, J.; Switala, J.; Ens, W.; Loewen, P. C.; Fita. I., Mutants that alter the covalent structure of catalase hydroperoxidase II from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1999, 274, (39), 27717-25.

74. Rovira, C.; Fita, I., The proximal hydrogenbonded residue controls the stability of the compound II intermediate of peroxidases and catalases. J. Phys. Chem. B 2003, 107, 5300-5.

75. Diaz, A.; Rangel, P.; Montes de Oca, Y.; Lledias, F.; Hansberg, W., Molecular and kinetic study of catalase-1, a durable large catalase of Neurospora crassa. Free Radio. Biol. Med. 2001,31,(11), 1323-33.

76. Huyett, J. E.; Doan, P. E.; Gurbiel, R.; Houseman, A. L. P.; Sivaraja, M.; Goodin, D. B.; Hoffman, B. M., Compound ES of cytochrome c peroxidase contains a Trp p-cation radical -characterization by CW and pulsed Q-band ENDOR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 1995,117, 9033-41.

77. Poulos, T. L.; Kraut, J., The stereochemistry of peroxidase catalysis. J. Biol. Chem. 1980, 255, (17), 8199-8205.

78. Bhaskar, B.; Immoos, C. E.; Shimizu, H.; Sulc, F.; Farmer, P. J.; Poulos, T. L., A novel heme and peroxide-dependent tryptophan-tyrosine cross-link in a mutant of cytochrome c peroxidase. J. Mol. Biol. 2003, 328, (1), 157-66.

79. Erman, J. E.; Vitello, L. B.; Miller, M. A.; Shaw, A.; Brown, K. A.; Koraut, J., Histidine 52 is a critical residue for rapid formation of cytochrome c peroxidase compound I. Biochemistry 1993, 32, (37), 9798-9806.

80. Milani, M.; Savard, P. Y.; Ouellet, H.; Ascenzi, P.; Guertin, M.; Bolognesi, M., A TyrCDl/TrpG8 hydrogen bond network and a TyrBlOTyrCDl covalent link shape the heme distal site of Mycobacterium tuberculosis hemoglobin O. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, (10), 5766-71.

81. I to, N.; Phillips, S. E. V.; Stevens, C.; Ogel, Z. B.; McPherson, M. J.; Keen, J. N.; Yadav, K. D. S.; Knowles, P. F., Novel thioether bond revealed by a 1.7 A crystal structure of galactose oxidase. Nature 1991, 350, 87-90.

82. Baron, A. J.; Stevens, C.; Wilmot, C.; Seneviratne, K. D.; Blakeley, V.; Dooley, D. M.; Phillips, S. E.; Knowles, P. F.; McPherson, M. J., Structure and mechanism of galactose oxidase. The free radical site. J. Biol. Chem. 1994, 269, (40), 25095-105.

83. Rogers, M. S.; Baron, A. J.; McPherson, M. J.; Knowles, P. F.; Dooley, D. M., Galactose oxidase pro-sequence cleavage and cofactor assembly are self-processing reactions. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, (5), 990-1.

84. Firbank, S. J.; Rogers, M. S.; Wilmot, C. M.; Dooley, D. M.; Halcrow, M. A.; Knowles, P. F.; McPherson, M. J.; Phillips, S. E., Crystal structure of the precursor of galactose oxidase: an unusual self-processing enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, (23), 12932-7.

85. Whittaker, M. M.; Whittaker, J. W., Cu(I)-dependent biogenesis of the galactose oxidase redox cofactor. J. Biol Chem. 2003, 278, (24), 22090-101.

86. McCoy, J. G.; Bailey, L. J.; Bitto, E.; Bingman, C, A.; Aceti, D. J.; Fox, B. G.; Phillips, G. N., Structure and mechanism of mouse cysteine dioxygenase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103,(9), 3084-9.

87. Simmons, C. R.; Liu, Q.; Huang, Q.; Hao, Q.; Begley, T. P.; Karplus, P. A.; Stipanuk, M. H., Crystal structure of mammalian cysteine dioxygenase: a novel mononuclear iron center for cysteine thiol oxidation. J. Biol. Chem. 2006, 281, (4), 18723-33.

88. Ye, S.; Wu, X.; Wei, L.; Tang, D.; Sun, P.; Bartlam, M.; Rao, Z., An insight into the mechanism of human cysteine dioxygenase: key roles of the thioether-bonded tyrosine-cysteine cofactor. J. Biol Chem. 2007, 282, 3391-3402.

89. Joseph, C. A.; Maroney, M. J., Cysteine dioxygenase: structure and mechanism. Chem. Commun. 2007, 28, (32), 3338-49.

90. Yamada, Y.; Fujiwara, T.; Sato, T.; Igarashi, N.; Tanaka, N., The 2.0 A crystal structure of catalase-peroxidase from Haloarcula marismortui. Nat. Struct. Biol. 2002, 9, (9), 691-5.

91. Laemmli, U. K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-5.

92. Otwinowski, Z.; Minor, W., Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Meth. Enzymol. 1997, 276, 307-26.

93. Kabsch, W., Automatic processing of rotation diffraction data from crystals of initially unknown symmetry and cell constants. J. Appl. Cryst. 1993, 26, 795-800.

94. Murshudov, G. N.; Vagin, A. A.; Dodson, E. J., Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1997, 53, (3), 24055.

95. Emsley, P.; Cowtan, K., Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2004, 60, (12), 2126-32.

96. Collaborative Computational Project, Number 4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1994, 50, (5), 760-3.

97. Cline, J. D., Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters. Limnol. Oceanogr. 1969, 14,454-8.

98. Nicolas, D. J. D.; Nason, A., Determination of nitrate and nitrite. Meth. Enzymol. 1957, 3, 981-4.

99. Fukuyama, K.; Okada, T., Structures of cyanide, nitric oxide and hydroxylamine complexes of Arthromyces ramosusperoxidase at 100 K refined to 1.3 A resolution: coordination geometries of the ligands to the haem iron. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2007, 63, (4), 472-7.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность:

• K.M. Полякову и В.О. Попову за чуткое руководство

• A.A. Филимоненкову и A.B. Тихонову за предоставленные препараты фермента

• П.В. Дороватовскому, K.M. Бойко, И.Г. Шабалину, А.Н. Попову и Г.П. Буренкову за помощь в сборе дифракционных данных

• Т.В. Тихоновой за ценные советы в области кинетики

• Т.Н. Сафоновой за помощь в подготовке англоязычных версий статей

Работа выполнена при поддержке государственного контракта № 02.740.11.0776 от 12 апреля 2010 г.