Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Мартынова, Кристина Владимировна

• Мартынова, Кристина Владимировна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Мартынова, Кристина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Свойства пептидных фотоаффинных зондов.

1.1. Структурные требования к фотоаффинным зондам.

1.2. Фотоактивные производные арилазидов.

2. Фотоаффинное мечение.

2.1. Характеристики поглощения фотоактивных зондов.

2.2. Аппаратурное оформление.

2.3. Условия облучения.

2.4. Необходимые контрольные эксперименты.

2.5. Анализ продуктов фотоаффинного мечения белков.

3. Синтез фотоактивируемых арилазидных зондов.

4. Сравнение эффективности использования зондов с различными типами фотоактивных групп.

5. Проблемы и ограничения метода фотоаффинного мечения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы.

2. Методы.

2.1. Синтез фотоактивных производных семакса и Pro-Gly-Pro.

2.2. Фотолиз фотоактивных соединений.

2.3. Мечение бычьего сывороточного альбумина п-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензил-Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (XVII).

2.4. Культивирование клеток.

2.5. Радиорецепторный анализ.

2.6. Определение степени деградации семакса и Pro-Gly-Pro в культуре клеток РС12.

2.7. Моделирование окислительного стресса в культуре клеток РС

2.8. Моделирование глутаматной экзайтотоксичности в культуре первичных нейронов мозжечка.

2.9. Определение уровня внутриклеточного Са2+.

2.10. Определение жизнеспособности клеток в культуре РС12.

2.11. Статистический анализ данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Тест-системы для исследования нейропротективного действия глицин- и пролинсодержащих пептидов.

1.1. Модель гибели клеток под действием окислительного стресса.

1.2. Модель глутаматной экзайтотоксичности.

2. Исследование влияния пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость перевиваемых культур клеток крысы в условиях окислительного стресса.

2.1. Влияние Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культуры клеток РС12.

2.2. Влияние Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культуры Rat-2.

3. Структурно-функциональное исследование синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов на модели окислительного стресса.

4. Поиск мест специфического связывания пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с клетками РС12.

4.1. Влияние ингибиторов протеаз на стабильность Pro-Gly-Pro и семакса в культуре клеток.

4.2. Выбор оптимальной среды для проведения радиорецепторного анализа.

4.4. Связывание радиоактивномеченых Pro-Gly-Pro и семакса с клетками РС12.

5.1. Синтез фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

5.2. Фотолиз фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

5.3.Взаимодействие фотоактивного производного семакса с бычьим сывороточным альбумином.

6. Оценка биологической активности тетрафторарилазидных производных Pro-Gly-Pro и семакса.

6.1. Цитопротективное действие фотоактивных производных на модели окислительного стресса.

6.2. Нейропротективное действие фотоактивных производных в модели глутаматной экзайтотоксичности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональное исследование коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов»

Как известно, многие вещества пептидной природы служат регуляторами важных физиологических процессов в организме. В организме человека и животных эти пептиды контролируют ряд важнейших физиологических систем: нервную, иммунную, сердечнососудистую, пищеварительную, дыхательную и др. [1]. Несмотря на интенсивные исследования регуляторных пептидов в течение последней четверти XX века, функции многих из них остаются во многом неясными. Важное место среди регуляторных пептидов занимают эндогенные регуляторы ЦНС - нейропептиды. Эта категория включает свыше 600 пептидов [2]. Физиологическая активность нейропептидов во много раз превышает аналогичное действие непептидных соединений. Многие нейропептиды проявляют выраженные нейропротективные и нейротрофические свойства [3]. Эти пептиды, в отличие от белковых факторов роста, легко проникают через гематоэнцефалический барьер, поэтому исследование свойств и функций нейропептидов и их синтетических аналогов имеет важное значение с точки зрения разработки новых лекарственных веществ.

В настоящее время все большее внимание привлекают пептиды, содержащие в своей аминокислотной последовательности остатки глицина и пролина. Предполагается, что источником этих пептидов в организме является коллаген и родственные белки, как эндогенного происхождения, так и поступающие с пищей [4]. Было показано, что глицин-и пролинсодержащие пептиды обладают рядом биологических активностей, представляющих большой практический интерес. Так, например, пептиды Pro-Gly, Gly-Pro, Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly способны подавлять процессы свертывания крови [58]; Pro-Gly, Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly - защищать слизистую желудка от различных ульцерогенных воздействий и поддерживать ее гомеостаз [9-11], пептиды Pro-Gly-Pro и Gly-Pro - нормализовать поведение при стрессорных воздействиях [12], а циклический пептид Pro-Gly - оказывать когнитивное действие [13].

Присоединение глицин- и пролинсодержащих последовательностей к С-концу ряда биологически активных пептидов позволило увеличить их устойчивость к действию протеаз. При этом было обнаружено, что эффекты регуляторного фрагмента дополняются эффектами глицин- и пролинсодержащей последовательности [14-16]. Примером такого комбинированного пептида является семакс.

В настоящее время механизмы действия глипролинов и их мишени мало изучены. Важной задачей также является создание синтетических аналогов глипролинов с высокой стабильностью, эффективностью и селективностью действия. В связи с этим актуальным представляется проведение структурно-функциональных исследований глипролинов и их синтетических аналогов на модельных системах. Такие исследования целесообразно проводить на моделях in vitro с использованием клеточных культур.

Ранее было показано, что пептид Pro-Gly-Pro оказывал цитопротективное действие на нейронально дифференцированные клетки феохромоцитомы крысы PC 12 при окислительном стрессе (ОС) [17], а также препятствовал развитию отсроченной Са2+-дизрегуляции, индуцированной глутаминовой кислотой [18]. Эти данные дают основание рассматривать глипролины в качестве потенциальных нейропротекторов. Однако систематических исследований нейропротективных свойств глипролинов ранее не проводилось. Также нам представлялось интересным получить фотоаффинные зонды глипролинов для последующего поиска и идентификации специфических мишеней глипролинов на нейрональных клетках.

Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было выявление характерных особенностей строения коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов, проявляющих нейропротективное действие на моделях повреждения нейронов in vitro, а также получение фотоаффинных зондов, пригодных для поиска специфических мишеней таких пептидов.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние пептида Pro-Gly-Pro и его производных на выживаемость культивируемых недифференцированных и нейронально дифференцированных клеток феохромоцитомы крысы РС12 и фибробластов из эмбрионов крысы Rat-2 в условиях окислительного стресса.

2. Исследовать зависимость цитопротективной активности ряда синтетических глипролинов от их структуры.

3. Исследовать связывание радиоактивномеченых пептидов Pro-Gly-Pro и семакса с культивируемыми клетками PC 12.

4. Получить и охарактеризовать фотоактивные арилазидные и диазириновыс производные Pro-Gly-Pro и семакса.

5. Сравнить биологические активности Pro-Gly-Pro, семакса и их фотоактивных производных на клеточной модели окислительного стресса и глутаматной экзайтотоксичности.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метод фотоаффинного мечения часто используется для изучения взаимодействий биологически активных лигандов с их рецепторами. Так, в предметном указателе (General Index) базы данных Chemical Abstracts этот термин был ранее расположен под заголовком «Аффинность» вместе с родственными терминами, такими как аффинное мечение и аффинная колонка. Однако впоследствии (начиная с 1992 г.) с увеличением числа публикаций, связанных с использованием метода фотоаффинного мечения, этот подход был выделен в самостоятельный раздел.

Использование метода фотоаффинного мечения позволяет получить не только общие характеристики мест специфического связывания лигандов (константу диссоциации, количество мест специфического связывания и др.), но и идентифицировать белок-мишень. В основе данного метода лежит получение ковалентных сшивок между рецептором и присоединенным к нему фотоактивным лигандом под действием облучения, и последующая идентификация меченых продуктов. Для получения фотоактивного лиганда (так называемого зонда) необходимо введение в пептид фотолабильной группы, которая активируется под действием облучения с образованием высокореакционноспособного интермедиата, способного атаковать различные группы атомов.

Зонды, используемые в фотоаффинном мечении, состоят из распознающей части (радиоактивномеченого пептида), взаимодействующей с лиганд-связывающим участком белка и фотоактивной (фотолабильной) группы, которая при облучении УФ светом образует химически активный интермедиат, формирующий ковалентные связи внутри или вблизи этого участка. Предполагается, что при модификации природного лиганда фотоактивной группой сохраняются основные структурные элементы, определяющие сродство лиганда к рецептору [19].

В ходе развития метода фотоаффинного мечения были предложены различные фотоактивные группы, наиболее распространенными из которых являются арилазидные, фенилдиазириновые и кето-группы. Такое разнообразие фотоактивных групп позволяет проводить облучение при различных длинах волн и получать различную эффективность мечения [20-22], рнс. 1. фотоактивная группа I L hv ковалентная сшивка N3 азид о карбонил

N: нитрен О возбужденный карбонил

N N диазирин диаз о-группе карбен

Рис, 1. Основные фотоактивные группы и генерируемые ими активные интермедиаты [22].

Поскольку использование того или иного класса фотоаффинных групп имеет свои преимущества и недостатки, то их выбор должен осуществляться на основе поставленной задачи и с учетом свойств объекта исследования. Во многих случаях выбор исследователей останавливается на зондах на основе ари л азидов, являющихся самыми распространенными фотоактивными соединениями вследствие их стабильности в темноте, простоты синтеза и доступности предшественников.

X. Свойства пептидных фотоаффинных зондов

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Мартынова, Кристина Владимировна

выводы

1. Способность эндогенного пептида Pro-Gly-Pro и его //-замещенных производных увеличивать выживаемость клеток в условиях окислительного стресса не имеет выраженной нейроспецифичности.

2. Наличие С-концевой последовательности Gly-Pro является необходимым условием для проявления цитопротективного действия коротких пептидов, состоящих из остатков глицина и пролина (глипролинов) на культивируемых клетках феохромоцитомы PC 12 в условиях окислительного стресса.

3. Методом классического радиорецепторного анализа не выявлены места специфического связывания пептидов Pro-Gly-Pro и АКТГ (4-7)-Pro-Gly-Pro (семакса) с клетками PC 12.

4. Получены и охарактеризованы фотоаффинные арилазидные и диазириновые производные пептидов Pro-Gly-Pro и семакса, пригодные для использования в качестве фотоаффинных зондов при поиске мишеней глипролинов.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мартынова К.В., Кириллова Ю.Г., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И., Швец В.И. Синтез фотоаффинных арилазидных производных семакса // Вестник МИТХТ.

2007. - Т. 2. - №4. - С. 78-82.

2. Мартынова К.В., Нагаев И.Ю., Шрам С.И., Швец В.И., Мясоедов Н.Ф. Синтез и характеристика фотоактивных арилазидных производных пептидов семакса и Pro-Gly-Pro // Вестник МИТХТ. - 2008. - Т. 3. - №5. - С. 96-100.

3. Мартынова К.В., Нечаева А.В., Климова П.А., Андреева JI.A., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Исследование нейротропной активности синтетических глипролинов в культуре клеток феохромоцитомы крысы PC 12. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2006 г. - Т. 48. - №9. - С. 779.

4. Мартынова К.В., Кириллова Ю.Г., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Шрам С.И.// III Российский симпозиум «Белки и пептиды», г. Пущино. 2007 г. Синтез фотоаффинных арилазидных производных семакса. С. 28.

5. Шрам С.И., Мартынова К.В., Силачев Д.Н., Агниуллин Я.В., Мясоедов Н.Ф. // «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» г. Санкт-Петербург. 2008. Изучение нейропротективных свойств коротких глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов). С. 163-164.

6. Shram S., Martynova К., Klimova P., Andreeva L., Pinelis V., Myasoedov N. Synthesis and neuroprotective properties of short peptides consisting solely from glycine and proline residues. // 30 th European Peptide Symposium. Helsinki. Journal of Peptide Sciencc.

2008. - Suppl. to V. 14. - №8. - 2008. - P. 102.

7. Мартынова K.B., Ефремова JI.B., Шрам С.И., Мясоедов Н.Ф. Культура клеток PC 12 как объект для изучения нейропротекторного действия пептидов. // Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург. Цитология. - 2008 г. - Т. 50.-№9.-С. 815.

8. Данюкова Т.Н., Мартынова К.В., Шрам С.И. Сравнительное исследование цитопротективного действия пептидов Pro-Gly-Pro и ]М-ацетил-Рго-01у-Рго при окислительном стрессе. // 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», г. Пущино. 2008 г. С. 126.

9. Мартынова К.В., Андреева JI.A., Климова П.А., Кириллова Ю.Г., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шрам С.И., Швец В.И., Мясоедов Н.Ф. Структурно-функциональное исследование глицин- и пролинсодержащих пептидов (глипролинов) как потенциальных нейропротектров // Биоорганическая химия. В печати.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что пептид Pro-Gly-Pro и его производные оказывают цитопротективное действие при ОС не только на нейронально дифференцированные, но и на недифференцированные клетки PC 12, а также на культуру фибробластов эмбрионов крысы Rat-2.

На основании полученных результатов можно предположить, что мишень этих пептидов не является нейроспецифичной. И поскольку на клетках РС12 отсутствуют известные рецепторы глипролинов и семакса (интерлейкиновые и меланокортиновые рецепторы), то, очевидно, что цитопротективные эффекты этих пептидов реализуются через пока еще не охарактеризованные мишени.

Проведенные структурно- функциональные исследования коротких синтетических глицин- и пролинсодержащих пептидов позволили выявить зависимость их цитопротективной активности от наличия последовательности Gly-Pro на С-конце пептида. Этот вывод подтверждают и другие данные, полученные в работе, в частности данные по активности iV-замещенных производных Pro-Gly-Pro. Полученные результаты могут быть использованы для проведения компьютерного конформационного анализа и конструирования новых пептидов, обладающих цитопротективным действием.

Проведение классического радиорецепторного анализа не выявило мест специфического связывания Pro-Gly-Pro и семакса на нейронально дифференцированных и недифференцированных клетках PC 12. В этой связи использование метода фотоаффинного мечения фотоактивными радиоактивномеченными зондами представляется наиболее перспективным для поиска молекулярных мишеней. В работе был осуществлен синтез ряда фотоактивных производных Pro-Gly-Pro и семакса. Полученные соединения охарактеризованы, исследованы их фотохимические и биологические свойства. Полученные данные указывают на возможность их использования в качестве зондов для фотоаффинного мечения. Это было подтверждено в модельных экспериментах по фотоаффинному мечению бычьего сывороточного альбумина.

Таким образом в работе были получены принципиально новые сведения о биологических свойствах коротких глицин- и пролиисодержащих пептидов и о взаимосвязи их структуры и цитопротективной активности при ОС. Кроме того, в работе разработаны методологические подходы для обнаружения и характеристики молекулярных мишеней, обуславливающих нейропротективное действие глипролинов и семакса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Мартынова, Кристина Владимировна, 2008 год

1. И.П. Ашмарин / Элементы патологической физиологии и биохимии (Избранные разделы). Москва. Изд. МГУ. 1992. - 192 с.

2. Нейрохимия. Под ред. И.П. Ашмарина и П.В. Стукалова. Москва. Изд. Института биомедицинской химии РАМН. 1996. - 470 С.

3. Е.И. Гусев, В.И. Скворцова / Ишемия головного мозга. Москва. Изд. Медицина. -2001.-327 С.

4. И.П. Ашмарин и др. / Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов. // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2002. - №. 1. — С. 24-27.

5. В.Е. Пасторова, JI.A. Ляпина, Т.Ю. Смолина, И.П. Ашмарин / Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов. // Известия АН. Серия биологическая. 1998. - Т. 3. - С. 390-394.

6. В.Е. Пасторова, Л.А. Ляпина, К.А. Черкасова, И.П. Ашмарин / Пептиды как ингибиторы коагуляции тромбина и агрегации тромбоцитов. //Успехи физиологических наук. 1999. - Т.30. - С. 80-91.

7. V.E. Pastorova, L.A. Liapina, I.P. Ashmarin / Prevention of thrombus formation with glyprolines on various models of prethrombotic state and thrombosis in rats. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2003. - V. 136. - Iss. 4. - P. 364-367.

8. A.V. Trufanova et al. / Histomorphological characteristics of accelerated healing of acetate ulcers under the effect of glyprolines. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2007. - V. 144. - Iss. 2. - C. 258-260.

9. И.П. Ашмарин, Г.Е. Самонина, Н.Я. Железняк, З.В. Бакаева / Протекторное действие пептида PGP на слизистую оболочку желудка. // Доклады академии наук. 1999. - Т. 368. - №5. - С. 709-710.

10. G. Samonina et al. / Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simple proline-containing peptides. // Pathophysiology. 2000. - V. 7. - Iss. 1. - P. 69-73.

11. C.E. Бадмаева и др. / Действие глипролинов на стрессогенные расстройства поведения у крыс. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. -2005. Т. 91. - №5. - С. 543-550.

12. Т.А. Gudasheva et al. /Novel endogenous dipeptide cycloprolyl-glycine is similar to pyracetam in selectivity of their mnemotropic effect. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1999.-V. 128.-Iss. 10.-P. 411-413.

13. И.П. Ашмарин, Н.Г Левицкая, A.A. Каменский, Н.Ф. Мясоедов / Семакс новое лекарственное средство для коррекции кровообращения мозга, гипоксических состояний и повышения умственной трудоспособности. // Фарматека. - 1997. -№. 4.-С. 32-33.

14. И.П. Ашмарин / Прогнозируемые и неожиданные физиологические эффекты олигопептидов (глипролинов, аналогов АКТГ4.10, тафцина и тиролиберина) //

15. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. — 2001. Т. 87. - №2. - С. 1471-1476.

16. М.В. Маслова и др. / Коррекция анте- и постнатальной гипоксии пептидными гормонами. // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2002. - Т. 88,-№2.-С. 184-190.

17. Э.Р. Сафарова / Фармакологическое исследование цитопротекторного действия нейротропных пептидов. / Дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва. ГУ НИИ Фармакологии им. Закусова РАМН. 2003. - С. 93.

18. A.N. Eberle / The melanotropins. Chemistry, physiology and mechanism of action. Karger, Basel. Switzerland. 1988. - P. 542.

19. H. Bayley, and J.R. Knowles / Photoaffinity labeling. // Methods of Enzymology 1977. -V. 46.-P. 69-114.

20. J. Brunner / Use of photocrosslinkers in cell biology. // Trends in Cell Biology. 1996. -6.-Iss. 4.-P. 154-157.

21. Y. Hatanaka, and Y.Sadakane / Photoaffinity labeling in drug discovery and developments: chemical gateway for entering proteomic frontier. // Current Topics of Medicinal Chemistry. 2002. - V. 2. - Iss. 3. - P. 271-288.

22. G. Dorman, and G.D. Prestwich / Using photolabile ligands in drug discovery and development. // Trends in Biotechnology. 2000. - V. 18. - Iss. 2. - P.64-77.

23. S.A. Fleming / Chemical Reagents in Photoaffinity Labelling. // Tetrahedron. 1995. -V. 51.-Iss. 46.-P. 12479-12520.

24. N. Soundararajan and M.S. Platz / Descriptive photochemistry of polyfluorinated azide derivatives of methyl benzoate. // Journal of Organic Chemistry. 1990. - V. 55. - P. 2034-2044.

25. F. Kotzyba-Hibert, I. Kapfer, and M. Goeldner / Recent Trends in Photoaffinity Labelling. // Angew. Chem. Int. Engl. 1995. - V. 34. - P. 1296-1312.

26. M. McRobbie / Competitive cyclisations of singlet and triplet nitrenes. Part I.

27. Cyclisation of l-(2-nitrenophenyl)pyrazoles. // Tetrahedron Letters. 1976. - V. 17. - P. 925-928.

28. K. Kanakarajan et al. / Application of Low-Temperature Methods to Photoaffinity Labeling. // Journal of American Chemical Society. 1988. - V. 110. - P. 6536-6541.

29. К.А. Chehade, and H.P. Spielmann / Facile and efficient synthesis of 4-azidotetrafluoroaniline: a new photoaffinity reagent. // Journal of Organic Chemistry. -2000. V. 65. - Iss. 16. - P. 4949-4953.

30. M.J.T. Young and M.S. Platz / Mechanistic analysis of the reactions of (pentafluorophenyl)nitrene in alkanes. // Journal of Organic Chemistry. —1991. V. 56. -Iss. 22. - P. 6403-6406.

31. R. Рое et al. / Remarkable catalysis of intersystem crossing of singlet (pentafluorophenyl)nitrene. // Journal of American Chemical Society. -1991.-V. 113.-Iss. 8.-P. 3209-3211.

32. J. F.W. Keana and S.X. Cai / New Reagents for Photoaffinity Labeling: Synthesis and Photolysis of Functionalized Perfluorophenyl Azides. // Journal of Organic Chemistry.1990. V. 55. - P. 3640-3647.

33. S.X. Cai et al. / Chlorinated phenyl azides as photolabeling reagents. Synthesis of an ortho,ortho'-dichlorinated arylazido PCP receptor ligand. // Bioconjugate Chemistry. -1993. V. 4. - Iss. 6. - P. 545-548.

34. K. Nikolics, E. Szonyi, J. Ramachandran / Photoaffinity labeling of pituitary GnRH receptors: significance of the position of photolabel on the ligand. // Biochemistry. -1988. V. 27. - Iss. 5. - P. 1425-1432.

35. M.J. Torres and M.S. Platz / A formal CH insertion reaction of an aryl nitrene into an alkyl CH bond. Implications for photoaffinity labelling // Tetrahedron Letters. 1986. -V. 27.-P. 791-794.

36. Y. Watanabe et al. / Synthesis and characterization of a photoaffinity probe possessing biotinyl and azidobenzoyl moieties for IP-3.affiniated protein. // Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 1991. -V. 1. -P. 399-402.

37. D.M. Kolpashchikov / Superselective labelling of proteins: approaches and techniques. // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. 2003. - V. 21. - Iss. l.-P. 55-64.

38. A.N. Eberle, P.N. de Graan, J. Girard / Nitrene and carbene generating photolabels for photoaffinity labelling of MSH receptors on pigment cells. / In Peptides. Stockholm: Almqist and Wiksel. 1984. - P. 391-395.

39. J. Mazella, C.Y. Kwan, P. Kitabgi, J.P.Vincent / Covalent labeling of neurotensin receptors in rat gastric fundus plasma membranes. II Peptides. 1985. - V. 6. - Iss. 6. -P. 1137-1141.

40. P.N. de Graan, and A.N. Eberle / Irreversible stimulation of Xenopus melanophores by photoaffinity labelling with p-azidophenylaianinel3-alpha-melanotropin. // FEBS Letters. 1980,-V. 116.-Iss. l.-P. 111-115.

41. A.N. Eberle / Photoaffinity labelling of MSH receptors on Anolis melanophores: irradiation technique and MSH photolabels for irreversible stimulation. // Journal of Receptor Research. 1984.-V. 4.-Iss. 1-6.-P. 315-329.

42. B.S. Cooperman, and D.J. Brunswick / On the photoaffinity labeling of rabbit muscle phosphofructokinase with 02'-(ethyl-2-diazomalonyl)adenosine 3':5'-cyclic monophosphate. // Biochemistry. 1973. - V. 12. - Iss. 21. - P. 4079-4084.

43. A.E. Ruoho, H. Kiefer, P.E. Roeder, S.J. Singer / The mechanism of photoaffinity labeling. // Proceedings of National Academy of Science USA. 1973. - V. 70. - Iss.9. -P. 2567-2571.

44. Чард Т. / Радиоиммунологические методы. Москва. Изд. Мир. 1981. -247 С.

45. JI.A. Остерман / Использование радиоактивных изотопов. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Москва. Изд. Мир. 1983. - С. 155-268.

46. B.A.Gilbert, R.R. Rando / Modular Design of Biotinylated Photoaffinity Probes: Synthesis and Utilization of a Biotinylated Pepstatin Photoprobe. // Journal of American Chemical Society. 1995. - V. 117.-P. 8061-8066.

47. P. Matsudaira / Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. // Journal of Biological Chemistry. 1987. - V.262.-Iss. 21.-P. 10035-10038.

48. H.H. Rasmussen et al. / Microsequencing of proteins recorded in human two-dimensional gel protein databases. // Electrophoresis. 1991. - V. 12. - Iss. 11. - P. 873882.

49. J.F. Resek, and A.E. Ruoho / Photoaffinity labeling the beta-adrenergic receptor with an iodoazido derivative of norepinephrine. // Journal of Biological Chemistry. 1988. - V.263. -Iss. 28. -P. 14410-14416.

50. G. Chen, B.N. Pramanik, U.A. Mirza / Applications of LC/MS in structure identifications of small molecules and proteins in drug discovery. // Journal of Mass Spectrometry. -2007 V. 42. - Iss. 3. - P. 279-287.

51. E.P. Lau, B.E. Haley, R.E. Barden / Photoaffinity labeling of acyl-coenzyme A:glycine N-acyltransferase with p-azidobenzoyl-coenzyme A. // Biochemistry. 1977. - V. 16. — Iss. 12.-P. 2581-2585.

52. C. Garbay-Jaureguiberry et al. / Highly selective photoaffinity labeling of mu and delta opioid receptors. // Proceedings of National Academy of Science USA. 1984. - V. 81.-Iss.24.-P. 7718-7722.

53. A.N. Eberle, R. Schwyzer/ Synthese von D-Alanin',4'-azido-3',5'-ditritio-L-phenylalanin2, norvalin4.-a-melanotropin als Photoaffinitatsprobe fur Hormon-Receptor-Wechselwirkungen. // Helvetica Chimica Acta. 1976. - V. 59. - P. 2421-2431.

54. J.M. Pezzuto, and S.M. Hecht / Amino acid substitutions in protein biosynthesis. Poly(A)-directed polyphenylalanine synthesis. // Journal of Biological Chemistry. -1980. V. 255. - Iss. 3. - P. 865-869.

55. W.T. Miller, and E.T. Kaiser / Probing the peptide binding site of the cAMP-dependent protein kinase by using a peptide-based photoaffinity label. // Proceedings of National. Academy of Science USA. -1988. V. 85. - Iss. 15. - P. 429-5433.

56. W. Fischli et al. / The synthesis of 4'-azido-3',5'-ditritio-l-phenylalanine peptides as "photo-affinity probes" for ligand-receptor interaction // Helvetica Chimica Acta. 1976. -V. 59. - Iss. 3.-P. 878-879.

57. E. Escher, and R. Schwyzer / p-Nitrophenylalanine, p-azidophenylalanine, m-azidophenylalanine, and o-nitro-p-azido-phenylalanine as photoaffinity labels. //FEBS Letters. 1974. - V. 46. - Iss. 1. - P. 347-350.

58. R. Aggeler, R.A. Capaldi / Cross-linking of the gamma subunit of the Escherichia coli ATPase (ECF1) via cysteines introduced by site-directed mutagenesis. // Journal of Biological Chemistiy. 1992. - V. 267. - Iss. 30. - P. 21355-21359.

59. A.N. Eberle / Photoaffinity labelling of peptide hormone receptors. // Journal of Receptor Research. 1983. - V. 3. - Iss. 1-2. - P. 313-326.

60. C.C. Yip, C.W. Yeung, M.L. Moule / Photoaffinity labeling of insulin receptor of rat adiopocyte plasma membrane. // Journal of Biological Chemistry. 1978. - V. 253. - Iss. 6.-P. 1743-1745.

61. K. Sutoh, and F. Matsuzaki / Millisecond photo-cross-linking of protein components in vertebrate striated muscle thin filaments. // Biochemistry. 1980. - V. 19. - Iss. 16. - P. 3878-3882.

62. T.T. Ngo, C.F. Yam, H.M. Lenhoff, J. Ivy / p-Azidophenylglyoxal. A heterobifunctional photoactivable cross-linking reagent selective for arginyl residues. // Journal of Biological Chemistry. 1981. - V. 256. - Iss. 21. - P. 11313-11318.

63. E.H. Escher, and G. Guillemette / Photoaffinity labeling of the angiotensin II receptor. 3. Receptor inactivation with photolabile hormone analogues. // Journal of Medicinal Chemistry.-1979.-V. 22.-Iss. 9.-P. 1047-1050.

64. C.C. Yip, C.W. Yeung, M.L. Moule / Photoaffinity labeling of insulin receptor proteins of liver plasma membrane preparations.//Biochemistry. — 1980.-V. 19.-Iss. I.-P. 70-76.

65. C.L. Hew, J. et al. / Affinity-labeled peptides obtained from the combining region of protein 460. Light chain labeling patterns using dinitrophenyl based photoaffinity labels. // Biochemistry. 1973. - V. 12. - Iss. 23. - P. 4685-4689.

66. C.S. Kuhn, J. Lehmann, and J. Steck/ Syntheses and properties of some photolabile в-thioglycosides. Potential photoaffinity reagents for в-glycoside hydrolases. // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - Iss. 9. - P. 3129-3134.

67. E. Escher, E. Laczko, G. Guillemette, D. Regoli / Biological activities of photoaffinity labeling analogues of kinins and their irreversible effects on kinin receptors. // Journal of Medicinal Chemistry. 1981.-V. 24.-Iss. 12.-P. 1409-1413.

68. C.S. Swindell et al. / Characterization of two taxol photoaffinity analogues bearing azide and benzophenone-related photoreactive substituents in the A-ring side chain. // Journal of Medicinal Chemistry. 1994. - V. 37. - Iss. 10. - P. 1446-1449.

69. J.N. Pitts, H.W. Johnson, T. Kuwana/ Structural effects in the photochemical processes of ketones in solution. // Journal of Physical Chemistry. 1962. V. 66. - P. 2456-2461.

70. P.R. Buckland, R.D. Howells, C.R. Rickards, S.B. Rees / Affinity-labelling of the thyrotropin receptor. Characterization of the photoactive ligand. // Biochemical Journal. -1985. V. 225. - Iss. 3. - P. 753-760.

71. T. Abe, Y. et al. / Interaction of atrial natriuretic peptide with its receptors in bovine lung membranes. // Journal of Biological Chemistry. 1995. - V. 270. - Iss. 13. - P. 7672-7678.

72. B. Chatrenet et al. / Topography of toxin-acetylcholine receptor complexes by using photoactivatable toxin derivatives. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. -1990. V. 87. Iss. 9. - P. 3378-3382.

73. R.E. Galardy, L.C. Craig, J.D. Jamieson, M.P. Printz / Photoaffinity labeling of peptide hormone binding sites. // Journal of Biological Chemistry. 1974. — V. 249. - Iss. 11.-P. 3510-3518.

74. C. Icard-Liepkalns, and P. Bochet / Photoaffinity labeling of a 33 kDa protein subunit of the delta-opioid receptor in neuroblastoma and hybrid cell lines. // FEBS Letters. 1988. - V. 233. - Iss. 1. - P. 167-172.

75. J.E. Gerst, J. Sole, E. Hazum, Y. Salomon / Identification and characterization of melanotropin binding proteins from M2R melanoma cells by covalent photoaffinity labeling. // Endocrinology. 1988. - V. 123. - P. 1792-1797.

76. C. Shigeno et al. / Interaction of human parathyroid hormone-related peptide with parathyroid hormone receptors in clonal rat osteosarcoma cells. //. Journal of Biological Chemistry. 1988. - V. 263. - Iss. 34. - P. 18369-18377.

77. R.G. Jr. Hammonds, M. Westphal, C.H. Li / Beta-endorphin: photoaffinity labelling of a non-opioid binding site in a human neuroblastoma. // Biochemical and Biophisical Research Communications. 1985. - V. 128. - P. 1310-1314.

78. P. Berhanu. / Internalized insulin-receptor complexes are unidirectionally translocated to chloroquine-sensitive degradative sites. Dependence on metabolic energy. // Journal of Biological Chemistry. 1988. - V. 263. - Iss. 12. - P. 5961-5969.

79. E. Carnazzi et al. / Efficient photoaffinity labeling of the rat Via vasopressin receptor using a linear azidopeptidic antagonist. // European Journal of Biochemistry. 1997. - V. 247.-P. 906-913.

80. C.R. Kemnitz, W.L. Karney, W.T. Borden / Why Are Nitrenes More Stable than Carbenes? // Journal of American Chemical Society. 1998. - V. 120. - P. 3499-3503.

81. U.K. Laemmli / Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - Iss. 5259. - P. 680-685.

82. J.M. Darbon, J. Userly, P. Leymarie / Correlation between protein phosphorylation and progesterone synthesis in bovine luteal cells stimulated by lutropin. // European Journal of Biochemistry. 1981. - V. 119. - P. 237-243.

83. Б.И.Ходоров и др.. / Митохондриальная деполяризация играет доминирующую роль в механизме нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом. // Биологические мембраны. Т. 18. - №6. - С. 419-430.

84. О.Ю. Реброва / Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. / Москва. Изд. МедиаСфера. 2002. - 312 С.

85. G.R. Jackson et al. / Nerve growth factor effects on pyridine nucleotides after oxidant injury of rat pheochromocytoma cells. // Brain Research. 1992. - V. 592. - Iss. 1-2. - P. 239-248.

86. D.B. Hinshaw, et al. / ATP depletion induces an increase in the assembly of a labile pool of polymerized actin in endothelial cells. // American Journal of Physiology. 1993. -V. 264.-Iss. 5.-P. 1171-1179.

87. D.B. Hinshaw et al. / ATP and microfilaments in cellular oxidant injury. // American Journal of Pathology. 1988. - V. 132. - Iss. 3. - P. 479-488.

88. D.B Hinshaw et al. / A cellular model of oxidant-mediated neuronal injury. // Brain Research. 1993,-V. 615.-Iss. l.-P. 13-26.

89. P.S. Kellerman / Exogenous adenosine triphosphate (ATP) preserves proximal tubule microfilament structure and function in vivo in a maleic acid model of ATP depletion. // Journal of Clinical Investigation. 1993. - V. 92. - Iss. 4. - P. 1940-1949.

90. Ф. Xyxo. / Нейрохимия. Основы и принципы. Москва. Изд. Мир. 1990. - 384 С.

91. D.G. Nicholls /Mitochondrial dysfunction and glutamate excitotoxicity studied in primary neuronal cultures. // Current Molecular Medicine. 2004. - V. 4. - Iss. 2. - P. 149-177.

92. B. Khodorov / Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurones. // Progress in Biophysics and Molecular Biology. 2004. - V. 86. - Iss. 2. - P. 279-351.

93. R.F. Castilho / Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. // Journal of Neuroscience. 1998. - V. 18. - Iss. 24. - P. 1027710286.

94. Б.И. Ходоров и др. / Митохондриальная деполяризация играет доминирующую роль в механизме нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом. // Биологические мембраны. 2001. - Т. 18. - №6. - Р. 419-430.

95. A.M. Surin et al. / Arachidonic acid enhances intracellular [Ca2+]i increase and mitochondrial depolarization induced by glutamate in cerebellar granule cells. // Biochemistry. 2006. - V. 71. - Iss. 8. - P. 864-870.

96. Haddox J.L. et al. / Bioactivity of peptide analogs of the neutrophil chemoattractant, N-acetyl-proline-glycine-proline. // 1999. V.40. - Iss. 10. - P. 2427-2429.

97. N.M. Weathington / A Novel Peptide CXCR Ligand Derived from Extracellular Matrix Degradation During Airway Inflammation. // Nature Medicine. 2006. - V.12. - Iss. 3. -P. 317-323.

98. N.M. Weathington / Reply to a Novel Peptide CXCR Ligand Derived from Extracellular Matrix Degradation During Airway Inflammation. // Nature Medicine. 2006. - V. 12. -Iss. 6.-P. 603-604.

99. E.R. Safarova, S.I. Shram, Y.A. Zolotarev, N.F. Myasoedov / Effect of Semax peptide on survival of cultured rat pheochromocytoma cells during oxidative stress. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2003. - V. 135. - Iss. 3. - P. 268-271.

100. F. Solca et al. / The receptor for alpha-melanotropin of mouse and human melanoma cells. Application of a potent alpha-melanotropin photoaffinity label. // Journal of Biological Chemistry. 1989.-V. 264. - Iss. 4. - P. 14277-14281.

101. S.A. Tishler and L.A. Green / Morphologic and Cytochemical Properties of a Clonal Line of Rat Adrenal Pheochromocytoma Cells Which Respond to Nerve Growth Factor. // Laboratory Investigation. 1978. - V. 39. - Iss. 2. - P. 77-89.

102. D.N. Dixon / Comparative Studies of PC12 and Mouse Pheochromocytoma-Derived Cell Lines as Models for the Study of Neuroendocrine Systems. // In Vitro Cellular and Developmental. Biology. -Animal. 2005. - V. 41. - P. 197-206.

103. A.S. Tischler, J.F. Powers, J. Alroy / Animal models of pheochromocytoma. // Histology and Histopathology. 2004. - V. 19. - P. 883-895.

104. P.W. Mesner, T.R. Winters, S.H. Green / Nerve growth factor withdrawal-induced cell death in neuronal PC 12 cells resembles that in sympathetic neurons. // Journal of Cell Biology. 1992. - V. 119. - Iss. 6. - P. 1669-1680.

105. P.W. Mesner, C.L. Epting, J.L., Hegarty, S.H. Green / A timetable of events during programmed cell death induced by trophic factor withdrawal from neuronal PC 12 cells. // Journal of Neuroscience. 1995. - V. 15. - Iss. 11. - P. 7357-7366.

106. M.M. Halleck, J.H. Richburg, F.C. Kauffman / Reversible and irreversible oxidant injury to PC12 cells by hydrogen peroxide. // Free Radical Biology and Medicine. 1992. - V.12. - Iss. 2. - P. 137-44.

107. Z. Zhang et al. / Impairment of integrin-mediated cell-matrix adhesion in oxidant-stressed PC 12 cells. // Brain Research. 1994. - V. 662. - Iss. 1-2. - P. 189-97.

108. W.C. Topp / Normal rat cell lines deficient in nuclear thymidine kinase. // Virology. -1981.-V. 113.-Iss. l.-P. 408-411.

109. Dolotov O.V. et al. / The binding of Semax, ACTH 4-10 heptapeptide, to plasma membranes of the rat forebrain basal nuclei and its biodegradation. // Bioorganicheskaya Khimiia. 2004. - V. 30. - Iss. 3. - P. 241-246.

110. T.V. V'yunova et al. / Specific binding of semax in different regions of the rat brain. // Doklady Biological Sciences. 2006. -V. 410. - P. 376-377.

111. T.V. V'yunova et al. / Binding of tripeptide Pro-Gly-Pro labeled at the C-terminal proline residue to plasma membranes of the rat forebrain. // Doklady Biological Sciences. -2008.-V. 419.-P. 95-96.

112. S.-Y. Han and Y.-A. Kim / Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis. // Tetrahedron. 2004. - V. 60. - P. 2447-2467.

113. K.B. Мартынова и др. / Синтез фотоаффинного арилазидного производного семакса. // Вестник МИТХТ. 2007. Т. 2. - №4. - С. 78-82.

114. F. Thunecke et al. / Kinetic study of the cis-trans isomerisation of peptidyl-proline dipeptides. // Journal of Chromatography. A. 1996. - V. 744. - Iss. 1-2. - P. 259-272.

115. T. Munequmi, A. Shimoyama / Development of homochiral peptides in the chemical evolutionary process: Separation of homochiral and heterochiral oligopeptides. // Chirality. -2003. — V.15. — Suppl. SI.-P. S108-S115.

116. М.В. Тараненко, М.Т. Мчелидзе / Изучение кинетики фотолиза соединений, содержащих арил(трифторметил)диазириновую группу. // Вестник Московского Университета. Сер. 2. Химия. 2002. - Т. 43. - №1. - С. 47-50.

117. Y. Hatanaka, Н. Nakayama, Y. Kanaoka / Diazirine-bazed Photoaffinity Labelling: Chemical Approach to Biological Interfaces. // Rewies on Heteroatom Chemistry. 1996. -V. 14.-P. 213-243.1. БЛАГОДАРНОСТИ

118. Московская академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова:акад. РАМН, д.х.н. Швецу В.И. к.х.н. Кирилловой Ю.Г.

119. Институт молекулярной генетики РАН:акад. РАН, д.х.н. Мясоедову Н.Ф., к.х.н. Шраму С.И., д.х.н. Шевченко В.П., к.х.н. Нагаеву И.Ю.,

120. Андреевой Л.А., к.х.н. Шевченко К.В.

121. Институт педиатрии научного центра здоровья детей РАМН:д.м.н. Пинелису В.Г., к.х.н. Сурину A.M.