Механизмы действия пептида Семакс на центральную нервную систему: роль нейротрофинов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Долотов, Олег Валентинович

• Долотов, Олег Валентинович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Долотов, Олег Валентинович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Пептидное семейство меланокортинов

Меланокортины как нейропептиды

Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих

Общие трофические свойства меланокортинов

Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС

Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов

Ноотропные и нейропротекторные эффекты Семакса

Общая характеристика семейства нейротрофинов

Характеристика нейротрофина BDNF

Экспрессия BDNF в нервной системе

Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции

Рецепторы для BDNF

Суточные колебания уровня BDNF

Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса

Выделение плазматических мембран мозга

Определение концентрации белка

Радиолигандный анализ 47 Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур

Получение и ведение первичных клеточных культур

Оценка выживаемости нейронов in vitro

Оценка уровня пролиферации клеток

Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo 54 Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре нейроглии

Оценка уровня экспрессии BDNF мРНК и TrkB мРНК in vivo

Оценка уровня экспрессии TrkB мРНК в культуре нейроглии

Статистическая оценка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы

2. Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы

3. Влияние Семакса на пролиферацию нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro

4. Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов базальных ядер переднего мозга крысы

5. Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре клеток нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы

6. Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo

7. Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гиппокампе, мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in vivo

8. Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 91 ВЫВОДЫ 93 Список опубликованных работ по теме диссертации 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96 БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

6-OHDA - 6-гидроксидофамин

BDNF - brain derived neurotrophic factor, нейротрофический фактор мозга bp - пар нуклеотидов, п.н.

BSA - бычий сывороточный альбумин

CLIP - кортикотропиноподобный пептид промежуточной доли гипофиза EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота NGF - nerve growth factor, фактор роста нервов NMDA - М-метил-В-аспартат

РАСАР - активирующий аденилатциклау полипептид гипофиза, pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide

PBS - фосфатно-солевой буфер

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

POPOP - 1,4-бис[5-фенил-2-оксазолил]-бензен

PPO - 2,5-дифенилоксазол

SDS - додецилсульфат натрия

VIP - вазоактивный интестинальный пептид

АКТГ - адренокотрикотропный гормон, АСТН

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

МСГ - меланоцитстимулирующий гормон, MSH

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией, RT-PCR

ПОМК - проопиомеланокортин, РОМС

ЦНС - центральная нервная система

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы действия пептида Семакс на центральную нервную систему: роль нейротрофинов»

Одной из центральных проблем современной нейробиологии является изучение механизмов пластичности и регенерации нервной системы. Исследование молекулярных основ этих процессов необходимо как для понимания механизмов высших функций головного мозга, включая обучение и запоминание, так и для поиска способов воздействия на патологические состояния нервной системы. В связи с этим актуальным является поиск и изучение механизмов действия факторов, влияющих на эти процессы.

Изучение функций пептидов семейства меланокортинов (N-концевых фрагментов адренокортикотропного гормона, ряда фрагментов проопиомеланокортина и их синтетических аналогов), выявило наличие у них способности регулировать обучение, внимание и поведение [1]. Кроме того, данные пептиды проявляют нейропротекторные и нейрорегенератитвные активности как в центральной, так и в периферической нервной системе [2]. Таким образом, меланокортины проявляют интересный комплекс свойств, одновременно включающий ноотропные и нейротрофические активности. Наличие данных свойств в совокупности со способностью проникать через гемато-энцефалический барьер делает данное пептидное семейство перспективным с точки зрения медицинского применения. Единственный клинически применяемый представитель семейства меланокортинов, Семакс

Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), разработанный в Институте молекулярной генетики РАН [3], также проявляет аналогичный комплекс свойств. Более того, Семакс является в настоящее время единственным индивидуальным пептидом, применяемым в клинике как ноотропное и нейропротекторное средство.

При исследовании активности Семакса в экспериментах на животных была обнаружена его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, выявивших его способность влиять на эти процессы и у человека. Клиническое применение Семакса показало его эффективность при лечении мнестических расстройств, последствий инсультов, травм мозга и ряда других заболеваний центральной нервной системы [4], [5].

Несмотря на имеющиеся данные о нейротрофических и ноотропных свойствах меланокортинов и характеристиках их рецепторов, молекулярные механизмы их действия во многом остаются неясными [6], [7].

К настоящему времени охарактеризовано пять подтипов меланокортиновых (МС) рецепторов, три из которых экспрессируются в нервной системе [8]. Показано, что передача сигнала от этих рецепторов внутрь клетки производится через G-белки и регуляция аффинности рецепторов производится внеклеточными ионами кальция [9]. Вопрос о действии коротких N-терминальных фрагментов АКТГ через охарактеризованные меланокортиновые рецепторы не решен до настоящего времени, и предполагается существование для них еще одного, пока неизвестного, типа меланокортиновых рецепторов [10], [11]. Кроме того, практически неизвестны гены, экспрессия которых регулируется меланокортинами при осуществлении ими нейроактивных свойств.

В связи с этим представляется важным изучение молекулярных механизмов действия Семакса и как клинически применяемого ноотропного и нейропротекторного препарата, и как представителя пептидного семейства меланокортинов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы являлось изучение молекулярных механизмов ноотропного и нейропротекторного действия Семакса, включая поиск и характеризацию связывающих центров Семакса на плазматических мембранах мозга крысы и поиск ядерных мишеней действия данного пептида на клетки мозга крысы.

Основные задачи исследования состояли в следующем:

1. Получить данные относительно существования связывающих центров Семакса на плазматических мембранах мозга крысы. Изучить основные характеристики связывания Семакса: специфичность, зависимость от времени, обратимость, аффинность и концентрацию связывающих центров.

2. Изучить деградацию Семакса в присутствии плазматических мембран и культур клеток нейроглии и нейронов базальных ядер переднего мозга крысы.

3. Изучить влияние Семакса на выживаемость нейронов различной эргичности, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы.

4. Проверить гипотезу о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов или их рецепторов в клетках ЦНС как промежуточной стадии его нейропротекторного действия

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Пептидное семейство меланокортинов.

Меланокортины являются семейством нейропептидов, принадлежащим к группе так называемых стрессовых пептидов, продуцирующихся с помощью протеолиза из молекулы-предшественника проопиомеланокортина (ПОМК). Проопиомеланокортин является источником нескольких интересных семейств нейропептидов (рис. 1) среди которых выделяются эндогенные опиоиды (а (3-, у-эндорфины) и семейство пептидов, в которое входят а-, Р" и у-меланоцитстимулирующие гормоны, названное семейством меланотропинов в связи с их способностью стимулировать образование пигмента. В свою очередь, N-концевые фрагменты АКТГ, представляющие первые 13 аминокислот последовательности АКТГ, лишены способности стимулировать адренокортикальную секрецию. Последовательность АКТГ(1-13) соответствует а-меланоцитстимулирующему гормону (а-МСГ), структура которого идентична для всех позвоночных, в отличие от (3- и у-МСГ. Пептиды с аминокислотными последовательностями, входящими в последовательность а-МСГ, получили название меланокортины, или МСГ-пептиды. К меланокортинам часто относят [2], [11] и их аналоги, содержащие замены в природной аминокислотной последовательности, модифицированные и D-аминокислоты, в связи с чем представляется справедливым включение в это семейство и пептида Семакс.

Наиболее длинный представитель меланокортинов - а-МСГ -изначально был известен как соединение, стимулирующее синтез меланинов и увеличение размеров и количества пигментных клеток в кожных покровах. Следует отметить, что короткие представители меланокортинов, включая аналоги, лишены не только способности стимулировать адренокортикальную секрецию, но и пигментстимулирующей способности, то есть активности меланокортинов большей частью проявляются в отношении нервной системы. Тем не менее, исторически сложившееся название меланокортины будет употребляться и далее в смысле семейства пептидов с аминокислотными последовательностями, родственными фрагменту АКТГ(1-13) (рис. 2). Минимальным эндогенным меланокортином считается пептид АКТГ(4-10).

1 265

Сигнальный пептид р-липотропин)

МС1 Щ CLIP Др-МСГР-эндорфин ^^^^^^^^^^^^^НННННВЯу-энд орф и н

Рис. 1. Схема процессинга проопиомеланокортина.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 а-МСГ Ser Туг Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val

АКТГ(4-10) Met Glu His Phe Arg Trp Gly

АКТГ(4-7) Met Glu His Phe

Org 2766 02Met Glu His Phe l>Lys Phe

BIM-22015 D-Ala Gin Tyr Phe Arg Trp Gly

Семакс Met Glu His Phe Pro Gly Pro

Рис. 2. Структура меланокортинов и некоторых их аналогов.

Меланокортины как нейропептиды.

Начиная с 60-х годов благодаря работам Д. де Вида (D. de Wied) началось интенсивное изучение нейроактивных свойств меланокортинов [12]. В 1950-60-х годах было показано, что АКТГ обладает не только к тому времени хорошо изученными эндокринными эффектами, но и способностью влиять на поведение. Так, было продемонстрировано, что введение АКТГ может снимать чувство беспокойства [7], влияет на запоминание [13] и вызывает ряд других поведенческих реакций у животных. Влияние на поведение было затем показано и для а-МСГ [14] и для более коротких меланокортинов. С другой стороны, в дальнейшем было обнаружено, что и ПОМК, и АКТГ, и фрагменты АКТГ (в том числе и а-МСГ) иммунохимически детектируются в мозге [15]. Более того, было обнаружено присутствие мРНК для проопиомеланокортина в ряде отделов мозга [16]. Эти данные позволили придти к выводу, что АКТГ и меланокортины являются эндогенными по отношению к мозгу соединениями, и центральная нервная система не только служит мишенью для этих пептидов, но и может сама продуцировать их.

Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг.

Иммунохимическая локализация меланокортинов в основном проводилась с использованием антител к а-МСГ и АКТГ(4-10). Присутствие а-МСГ было обнаружено в мозге взрослой крысы, причем концентрация этого пептида для разных отделов мозга существенно различна [17]. Наибольшая концентрация а-МСГ обнаружена в гипоталамусе, а в пределах гипоталамуса - в аркуатном ядре. В остальных отделах мозга концентрация а-МСГ на 1 - 2 порядка ниже (Таблица 1). Эксперименты на тканевых культурах показали, что нейроны аркуатного ядра синтезируют ПОМК [18]. Учитывая, что отростки нейронов аркуатного ядра гипоталамуса проникают в другие отделы мозга, можно предположить, что источником а-МСГ для них служит именно аркуатное ядро. Действительно, разрушение аркуатного ядра приводит к существенному снижению уровня а-МСГ в остальных отделах мозга [19]. С другой стороны, при удалении гипофиза происходит снижение уровня а-МСГ в гипоталамусе [20].

Таблица 1. Уровень а-МСГ в различных отделах мозга крысы [18].

Отдел Уровень а-МСГ Уровень а-МСГ пг/мг ткани) (пг/отдел)

Arcuate area (аркуатная область) 218 639

Dorsal hypothalamus 96 1980 дорсальный гипоталамус)

Anterior hypothalamus/preoptic area 106 2068

Mesencephalon (средний мозг) 7 963

Amygdala (амигдала) 6 170

Thalamus (таламус) 6 530

Septum (септум) 32 589

Medulla oblongata 2 205

Pons (понс) 1 120

Cerebral cortex (кора) 1 361

Hippocampus (гиппокамп) 1 110

Striatum (стриатум) 0.5 31

Таким образом, по-видимому, источником части а-МСГ в мозге служит гипофиз; можно также предположить и влияние гипофиза на процессы синтеза а-МСГ в гипоталамусе. В пользу предположения о регуляции гипофизом синтеза в гипоталамусе предшественника меланокортинов недавно были получены дополнительные свидетельства -удаление части ПОМК-синтезирующих клеток гипофиза мыши приводило к увеличению уровня мРНК для ПОМК в гипоталамусе [21]. Другим источником служит аркуатное ядро, что не исключает возможности синтеза а-МСГ (и других меланокортинов) в остальных отделах мозга. Так мРНК для ПОМК была обнаружена в гиппокампе и миндалине [16], сам ПОМК был обнаружен не только в аркуатном ядре, но и в дорсолатеральном гипоталамусе и среднем мозге [22]. В ходе эмбрионального развития ПОМК детектируется в гипоталамических нейронах эмбриона крысы начиная со срока 12 дней, в то время как в гипофизе иммунореактивность к ПОМК регистрируется лишь начиная с 15 - 16-го дня эмбрионального развития.

Наибольший уровень иммунореактивности к ПОМК отмечается на 21 - 29 день постнатального развития [23]. Проводилось также исследование экспрессии ПОМК при развитии эмбрионов мыши [24]. Впервые ПОМК появляется в аркуатном ядре на сроке 10.5 дней развития эмбриона. В этот же срок ПОМК детектируется в нервных волокнах латерального и дорсального диэнцефалона. К сроку 11.5 дней развивается плотная сеть ПОМК-содержащих нейритов, проникающая в мезэнцефалон. К этому же сроку ПОМК-содержащие нейриты обнаруживаются в миелэнцефалоне. К 12.5 дням ПОМК-содержащие волокна появляются в спинном мозге. Между 13.5 и 15.5 днями формируется профиль ПОМК-содержащих волокон, распространяющихся в диэнцефалон, мезэнцефалон, метэнцефалон и миелэнцефалон, соответствующий взрослому состоянию. Следует отметить, что ПОМК-содержащие клетки в гипофизе появляются позже, чем в аркуатном ядре (к 12.5 дню в передней доле и к 14.5 дню в промежуточной доле). Имеются данные о том, что в мозге эмбрионов мыши процессинг ПОМК с образованием а-МСГ начинается со срока 11.5 дней [25].

В мозге человека наибольшая концентрация а-МСГ была также обнаружена в гипоталамусе, а в наибольшем количестве а-МСГ присутствует в черной субстанции [26]. Интересно, что у больных болезнью Альцгеймера концентрация этого пептида в черной субстанции существенно снижена. Объяснения этому феномену пока не предложено. АКТГ(4-10) был иммунохимически обнаружен в мозге взрослой крысы только в волокнах аркуатного ядра и средней септальной области. Совершенно иная ситуация с распределением АКТГ(4-10) возникает при исследовании неонатального (то есть развивающегося) мозга в нем АКТГ(4-10) обнаруживается как в аркуатном ядре и средней септальной области, так и в стриатуме, коре, гиппокампе, перивентрикулярной области. При повреждении черной субстанции взрослой крысы АКТГ(4-10) обнаруживался в стриатуме и ряде других отделов мозга [2]. Вопрос о происхождении АКТГ(4-10) практически не освещен в доступной литературе; по-видимому, постулируется его протеолитическое выщепление из а-МСГ, на что указывает и похожее распределение этих пептидов в мозге.

Таким образом, из данных по экспрессии АКТГ(4-10) в мозге крысы следует, что, по-видимому, значение этого меланокортина в функционировании взрослого мозга весьма ограничено. Значительно более широкое распространение АКТГ(4-10) в неонатальном мозге свидетельствует о его роли в развитии центральной нервной системы, а появление АКТГ(4-10) в отделах поврежденного мозга (по крайней мере, в рамках нигростриатной системы мозга) указывает на вероятное участие АКТГ(4-10) в процессах регенерации центральной нервной системы.

Общие трофические свойства меланокортинов.

Наряду с изучением поведенческих и мнестических (ноотропных) эффектов меланокортинов происходило накопление данных о трофических эффектах меланокортинов. Так, было показано, что а-МСГ увеличивает вес эмбрионов, в то же время введение антител к этому пептиду ингибирует рост эмбриона и его мозга [27]. Подобные эффекты не наблюдались в случае постнатального развития. Таким образом, а-МСГ проявляет общие трофические свойства лишь на стадии эмбрионального развития организма. Другие исследованные меланокортины АКТГ(4-10) и Org 2766 не обладают столь глобальными трофическими активностями.

Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС.

Большую ценность для изучения нейротрофических активностей представляют исследования на моделях in vitro. Существуют данные о влиянии меланокортинов на нейроны, полученные на этих моделях. Так, а-МСГ усиливает рост нейритов (около 2 раз) и выживание нейронов в культуре нейронов спинного мозга крысы (14-й день развития) [28].

Аналогичные исследования на культуре срезов спинного мозга выявили 3040-процентное дозозависимое влияние а-МСГ и АКТГ(4-10) на рост нейритов при концентрациях 10"12 - 10"11 М [29]. С использованием диссоциированных культур нейронов спинного мозга эмбрионов крысы было показано влияние а-МСГ (но не АКТГ(4-10) и Org 2776) на появление и рост неиритов при концентрациях выше Ю"10 М и максимальным эффектом при 10~4 М [30]. Отмечено влияние меланокортинов, в том числе и синтетических аналогов на дифференцировку серотонинергических нейронов [31]. Меланокортины (а-МСГ) способны влиять на дифференцировку дофаминергических нейронов и рост их нейритов [32].

Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов.

Открытие и клонирование пяти различных подтипов меланокортиновых рецепторов (МС1-МС5) открыло новые возможности для разработки лекарств, которые могли бы быть использованы для лечения процессов воспаления, ожирения, анорексии, наркотической зависимости, половых дисфункций и др. Большинство соединений, мишенями для которых служат МС-рецепторы, являются аналогами а-МСГ. Считается, что только некоторые из этих веществ могут найти применение в клинике, что связано с их низкой биодоступностью при периферических способах введения [33].

Механизмы ноотропных эффектов меланокортинов до настоящего времени окончательно не выяснены; вероятно, они не опосредованны через известные к настоящему времени типы МС-рецепторов. Возможно, эти эффекты меланокортинов связаны с их воздействием на МС-рецепторы неизвестного типа, либо с их модулирующим влиянием на различные медиаторные системы мозга [10].

Изучение нейротропной активности фрагментов АКТГ, проведенные как в нашей стране, так и за рубежом, позволили выявить зависимость эффектов пептидов от их структуры, дозы и времени введения. На основании проведенных экспериментов были сделаны следующие выводы:

- фрагменты АКТГ(4-7), (5-10) и (4-10) ускоряют выработку условных рефлексов у экспериментальных животных. АКТГ(5-7) не оказывает влияния на обучение животных. Наиболее активным из исследованных пептидов оказался АКТГ(4-10).

- наименьшим фрагментом АКТГ, сохраняющим поведенческую активность, является АКТГ(4-7).

- ускорение обучения животных под действием фрагментов АКТГ зависит от дозы и эта зависимость имеет обратный U-образный характер.

- эффекты фрагментов АКТГ весьма кратковременны и их длительность ограничивается приблизительно 30 минутами.

- для пролонгирования действия фрагментов АКТГ бессмысленно увеличивать количество вводимого пептида, так как это приводит к исчезновению эффекта.

Исследования на добровольцах показали, что введение АКТГ(4-10) приводит к повышению селективного внимания [34]. Положительный эффект пептидов был более выражен в том случае, когда в опытах участвовали люди с исходно плохой памятью или пожилые люди с ослабленными познавательными способностями.

Таким образом, многочисленные эксперименты показали принципиальную возможность создания на базе фрагментов АКТГ ноотропных препаратов, однако для разработки лекарственного средства на их основе необходимо было найти способ пролонгации их эффектов.

Первые попытки создания лекарств на основе фрагментов АКТГ относятся к началу 1970-х годов. Путей для увеличения эффективности регуляторных пептидов существует несколько. Один из них - замена природных левовращающих L-аминокислот в молекуле пептида на правовращающие D-аминокислотные остатки или на остатки неприродных аминокислот с целью повышения устойчивости пептидов к действию протеаз.

Так, замена Met4 в последовательности АКТГ(4-9) на сульфоксид метионина, Arg8 на D-Lys, а Тгр9 на Phe привела к разработке нового пептида ORG 2766, который во много раз более активен, чем АКТГ(4-10), в тесте на угашение реакции избегания, причем направленность действия этого пептида на сохранение навыка зависит от дозы - введение малых доз (0.5 - 1.0 нг/кг) улучшает, а больших доз (от 5 нг/кг) ухудшает сохранение навыка [35]. Препарат ORG 2766 не проявляет меланоцитстимулирующей и стероидогенной активности, не приводит к мобилизации липидов из жирового депо и не обладает опиоидной активностью. Также показано мощное нейропротекторное действие ORG 2766 после токсического воздействия 6-OHDA на нигростриатум. ORG 2766 способен оказывать положительный эффект на регенерацию периферических нервных волокон у крыс [27].

Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой С ООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ -НОЕ 427 и ORG 31433, которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. В малых дозах эти пептиды облегчают выработку условных рефлексов, в больших - затормаживают процесс выработки навыка. ORG 31433 существенно ускоряет функциональное восстановление nucleus accumbens после его повреждения 6-OHDA [36]. НОЕ427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании памяти и способности к обучению. Этот пептид при подкожном введении ликвидирует у крыс амнезию, вызванную электрошоком, улучшает обучение и память в различных тестах и восстанавливает память, нарушенную скополамином [37]. Введение НОЕ 427 людям пожилого возраста с нарушением когнитивных функций, а также пациентам с болезнью Альцгеймера оказывало небольшое, но достоверное положительное влияние на внимание и настроение больных [38].

Был синтезирован и исследован еще один аналог АКТГ(4-10) -BIM-22015. Изучение влияния этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM-22015 в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложнооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты хронического введения BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. И в этом случае BIM-22015 оказывал нормализующее действие на оперированных животных [39].

Ноотропные и нейропротекторные эффекты Семакса.

В Институте молекулярной генетики РАН синтезирован пептид, имеющий структуру Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Эта последовательность была выбрана для создания лекарственного препарата и получила название "Семакс" (семь аминокислот). Были проведены подробные исследования влияния Семакса на функции центральной нервной системы животных, определены оптимальные дозы и сроки введения препарата, эффективность Семакса при различных способах введения, его влияние на обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя [40].

Проведено изучение влияния Семакса на выработку пищедобывательного рефлекса на место в Т-образном лабиринте и сравнение эффектов этого пептида с эффектами фрагмента АКТГ(4-10). Было показано, что внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 0.015 мг/кг за 5 минут до и сразу после сеанса обучения ускоряет выработку рефлекса так же, как и АКТГ(4-10). Ежедневное введение Семакса за 1 час до сеанса обучения также значимо ускоряло процесс выработки навыка, в то время как инъекция АКТГ(4-10) за 1 час до сеанса обучения была неэффективна. Более того, введение Семакса в дозе 0.05 мг/кг за 20 часов до сеанса обучения также достоверно ускоряла процесс формирования пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте [40]. Изучение влияния различных доз Семакса на обучение животных в Т-образном лабиринте показало, что введение препарата в дозах 0.015; 0.05 и 0.1 мг/кг за 5 минут до сеанса обучения значимо ускоряет обучение животных в этом тесте. Снижение дозы препарат до 0.005 мг/кг приводило к исчезновению эффекта. Введение Семакса в дозе 0.5 мг/кг не оказывало влияние на обучение крыс в использованном тесте. Следовательно, увеличение дозы препарата не приводит к реверсии его эффектов в отличие от таких аналогов фрагментов АКТГ, как ORG 31433 и НОЕ 427.

Изучено влияние Семакса на обучение животных в тесте с отрицательным подкреплением. В качестве модели такого обучения использовался тест выработки условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Исследование влияния Семакса на выработку УРПИ показало, что введение пептида в дозе 0.015 мг/кг как за 1, так и за 6 часов до сеанса обучения улучшает обучение животных в этом тесте. Следовательно, влияние Семакса на выработку условных рефлексов не зависит от знака подкрепляющего раздражителя [40].

Было исследовано влияние Семакса на сохранение навыка пассивного избегания у крыс после электрошока. Семакс вводили перед проверкой сохранения навыка в дозе 0.05 мг/кг. В группе животных, которым вводили Семакс и не подвергали электрошоку, наблюдается значимое снижение времени пребывания в затемненном отсеке экспериментальной камеры (в котором крысы получали болевое раздражение во время обучения) по сравнению с контрольной группой. Электрошок вызывает угасание ранее выработанного навыка пассивного избегания у контрольных животных. Инъекция Семакса перед проверкой сохранения рефлекса животным, перенесшим электрошок, приводит к частичному восстановлению навыка, т.е. ослабляет амнезию, вызванную электрошоком [40].

Было проведено изучение эффективности интраназального способа введения Семакса в организм. Показано, что ежедневное интраназальное введение пептида в дозе 0.015 мг/кг за 5 минут до сеанса обучения белых крыс в Т-образном лабиринте достоверно ускоряет выработку условного пищедобывательного рефлекса на место. Следовательно, при интраназальном введении Семакс был также эффективен, как и при внутрибрюшинном. Это послужило основанием для рекомендации интраназального способа введения Семакса людям [40].

Было изучено наличие у Семакса антигипоксических свойств. В первой серии опытов проводилось исследование влияния Семакса на устойчивость животных к условиям гипобарической гипоксии. Эксперименты показали, что однократное внутрибрюшинное введение Семакса в дозе 0.1 мкг/кг в 2.5 раза повышает время до остановки дыхания у животных в условиях гипоксии. При хроническом введении пептида (интраназально в течение 7 дней в дозе 0.1 мкг/кг) антигипоксические эффекты Семакса были более выражены - у животных опытной группы в условиях гипоксии наблюдалось увеличение времени до потери позы (в 1.5 раза) и времени до остановки дыхания (в 3 раза) по сравнению с контрольными животными [40].

Целью следующей серии экспериментов явилось исследование влияния Семакса на устойчивость крыс к циркуляторной гипоксии. В экспериментах была использована методика двусторонней окклюзии общих сонных артерий, которая является адекватной экспериментальной моделью тяжелого ишемического инсульта. Было показано, что инъекция Семакса (внутрибрюшинно в дозе 0.1 мг/кг) значимо увеличивает общую устойчивость крыс к циркуляторной гипоксии - процент животных с незначительными неврологическими нарушениями был значимо выше в опытной группе (27%), чем в контроле (6%) [41]. Таким образом, можно заключить, что введение Семакса способствует уменьшению тяжести клинических проявлений экспериментального ишемического инсульта, вызванного двусторонним закрытием обеих общих сонных артерий.

Проводилась оценка влияния Семакса на постреанимационные нарушения памяти в эксперименте на крысах. Моделью клинической смерти являлась внезапная остановка общего кровообращения при пережатии сосудистого пучка сердца. Эксперименты показали, что ежедневное интраназальное введение Семакса в дозе 0.05 мг/кг в течение 2 недель нормализовало параметры проведения реанимированных крыс, приближая их значение к контролю. Следовательно, Семакс при интраназальном введении оказывает нормализующее действие на восстановление мнестических функций мозга в постреанимационном периоде [40].

Сравнительное исследование устойчивости Семакса и нативного АКТГ(4-10) к действию протеаз сыворотки крови человека показало, что первичным актом деградации в обоих случаях является отщепление N-концевого метионина аминопептидазой [42]. Но если природный фрагмент довольно быстро деградирует далее до отдельных аминокислот, то Семакс образует достаточно стабильный интермедиат со структурой Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, который и сам проявляет нейротропную активность того же спектра, что и Семакс [42]. Было проведено сравнительное исследование ноотропной активности продуктов ферментативной деградации АКТГ(4-10) и Семакса - Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, His-Phe-Pro-Gly-Pro и Phe-Pro-Gly-Pro [43]. Проведенное исследование поведенческих эффектов аналогов АКТГ(4-10) и Семакса с отщепленным N-концевым метионином показало, что АКТГ(5-10) и Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro обладают нейротропной активностью. Однако, если в природном фрагменте отщепление метионина приводит к резкому падению активности, то образующийся при деградации Семакса гексапептид улучшает обучение животных эффективнее, чем Семакс. На основании проведенного исследования было сделано заключение о том, что продукты ферментативной деградации АКТГ(4-10) и Семакса обладают собственной нейротропной активностью и являются синергистами

АКТГ(4-10) в отношении воздействия на процессы обучения. Следовательно, наблюдаемые при введении этих пептидов эффекты могут быть результатом действия как исходного гептапептида, так и его производных. При этом высокая активность и относительная устойчивость гексапептида Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro может в значительной степени обеспечивать длительное действие Семакса.

Многочисленные исследования нейротропной активности Семакса, проведенные на животных, позволили сделать следующие выводы:

- введение Семакса ускоряет обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя.

- длительность эффектов Семакса значительно превышает длительность эффектов природного фрагмента АКТГ(4-10).

- увеличение дозы Семакса не приводит к реверсии его эффектов.

- интраназальное введение Семакса улучшает обучение животных также эффективно, как и внутрибрюшинное.

- введение Семакса повышает устойчивость животных к условиям гипобарической гипоксии.

- введение Семакса способствует уменьшению тяжести клинических проявлений экспериментального ишемического инсульта у животных.

- введение Семакса способствует восстановлению мнестических функций мозга в постреанимационном периоде.

Исследована эффективность использования Семакса в качестве нейропротекторного средства в остром периоде полушарного ишемического инсульта [5]. Семакс оказывает выраженное нейропротекторное действие, основными компонентами которого являются торможение глиальных реакций воспаления, улучшение трофического обеспечения мозга, торможение синтеза оксида азота, и других реакций оксидантного стресса, а также иммуномодуляция [44].

Сопоставление клинической динамики в группе с применением

Семакса и без нее обнаружило достоверное улучшение восстановительных процессов на фоне лечения Семаксом у больным со среднетяжелым и тяжелым инсультом. При ишемическом инсульте средней тяжести с преобладанием очаговых неврологических симптомов эффективность Семакса проявлялась с первых суток заболевания и выражалась в общей активизации больных и ускорении регресса очаговой симптоматики. У 88% больных, получавших Семакс, течение инсульта было регредиентным со стабильным регрессом неврологических нарушений, что значительно превышало аналогичный показатель в контрольной группе (55.2%). Под действием Семакса к концу острого периода инсульта у 84% больных констатировано хорошее восстановление функций, причем у 32% пациентов регресс очаговых симптомов был полным [45]. При тяжелом инсульте применение Семакса в первые часы и дни заболевания позволило достоверно ускорить регресс не только очаговых, но и общемозговых и вегетативных симптомов. У всех больных, поступивших в состоянии оглушения, к концу вторых суток вернулось ясное сознание. К пятым суткам инсульта у 80% больных расстройство сознания и менингеальные симптомы полностью исчезли. У 80% больных, получавших Семакс, определялось регредиентное течение заболевания против 62% в контроле. В группе с применением Семакса летальность при тяжелом инсульте составила 10%, тогда как в контрольной группе - 28.4% [45].

Применение Семакса наиболее эффективно при каротидном ишемическом инсульте, хотя положительные эффекты препарата проявляются и при вертебрально-базилярной локализации сосудистого поражения. Изучение эффективности Семакса в зависимости от сроков начала терапии (2 - 5 ч или 6 - 12 ч от момента развития инсульта) подтвердило преимущество раннего применения Семакса. При интраназальном применении в суточной дозе 12 - 18 мг препарат снижает 30-дневную летальность и улучшает клинический исход и степень функционального восстановления, особенно в случаях раннего начала терапии. Положительное клиническое действие Семакса коррелирует с его нормализующим влиянием на функциональную активность мозга, по данным полимодального нейрофизиологического мониторирования [45]. Таким образом, первый представитель пептидного семейства меланокортинов -Семакс прошел успешную аппробацию в клинических условиях, что позволило рекомендовать его к включению в комплекс интенсивной терапии ишемического инсульта [46].

В связи с выдвинутой нами гипотезой о возможном участии нейротрофинов в осуществлении действия меланокортинов, в частности Семакса, на ЦНС, и полученными нами свидетельствами о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов в головном мозге крысы, представляется необходимым в обзоре литературы отразить существующие в настоящее время данные об этом белковом семействе, и прежде всего о наиболее интенсивно изучаемом его представителе - нейротрофическом факторе мозга (BDNF).

Общая характеристика семейства нейротрофинов.

Нейротрофины - семейство регуляторных белков нервной ткани, которые синтезируются нейронами и клетками нейроглии, и способствуют дифференцировке и поддержанию жизнеспособности и функционирования периферических и центральных нейронов. При этом используется аутокринный и паракринный механизмы регуляции [47]. Во время эмбрионального развития нейротрофины способствуют выживанию периферических нейронов до и во время иннервации мишеней. Они функционируют также как физиологические сигналы выживания для центральных нейронов. При развитии нервной системы с помощью нейротрофинов регулируется выживаемость нейронов, то есть в зрелой нервной системе присутствуют те нейроны, которые в процессе развития нервной системы получили нейротрофины в надлежащем количестве от соответствующих клеток-мишеней. "Лишние" же нейроны удаляются по механизму программируемой клеточной гибели. Нейротрофины регулируют нейрональную дифференцировку, индуцируют ветвление дендритов (арборизацию) и рост аксонов (спрутинг) в направлении клеток-мишеней. В зрелой нервной системе нейротрофины регулируют как краткосрочную синаптическую передачу, так и долговременное потенцирование (LTP), участвуя, таким образом, в обеспечении пластичности нервной системы, необходимой для ее нормального функционирования.

Семейство нейротрофинов к настоящему времени состоит из следующих представителей:

• фактор роста нервов, nerve growth factor, NGF (впервые описан в 1953 г.) [48];

• нейротрофический фактор, полученный из мозга, brain-derived neurotrophic factor, BDNF [49];

• нейротрофин-3, neurotrophin-3, NT-3 [50], [51], [52], [53];

• нейротрофин-4/5, neurotrophin-4/5, NT-4/5 [54];

• нейротрофин-6, neurotrophin-6, NT-6 [55];

• нейротрофин-7, neurotrophin-7, NT-7 [56].

Гены, кодирующие нейротрофины, были охарактеризованы у рыб, амфибий, рептилий и млекопитающих [57], [58], [59]. Последовательность зрелой формы человеческого BDNF (hBDNF) аналогична последовательностям найденным у свиньи, крысы и мыши [60], [61]. Зрелая форма hBDNF имеет около 50% гомологии со зрелыми человеческими NGF, NT-3 и NT-4/5.

Трехмерная структура нейротрофинов содержит две пары антипараллельных р-слоев и три дисульфидных мостика [62], [63].

Вариабельные домены определяют специфичность отдельных членов семейства. Зрелые активные формы нейротрофинов представляют собой стабильные нековалентно связанные гомодимеры с молекулярной массой около 28кД [64], [65]. Гидрофобные взаимодействия между мономерами через высококонсервативные остатки во всех нейротрофинах предполагают возможность формирования гетеродимеров [65].

Основными мишенями для NGF, первого обнаруженного нейротрофина, являются холинергические нейроны переднего мозга, играющие значительную роль в таких функциях центральной нервной системы, как внимание, обучение, память; холинергические нейроны стриатума, вовлеченные в контроль движения [66], [67], [68]; большинство нейронов симпатической нервной системы [69], [48].

Выявленными мишенями для BDNF являются дофаминергические нейроны черной субстанции, холинергические нейроны переднего мозга, серотонинергические нейроны коры, ГАМК-ергические нейроны стриатума, гранулярные нейроны мозжечка; мотонейроны, нейроны ресничного ганглия; нейроны спинномозговых узлов (DRG, dorsal root ganglion); периферические чувствительные нейроны [70], [71], [72], [73], [74], [75], [76], [77], [78].

Мишенями для NT-3 являются холинергические нейроны лобной доли, холинергические нейроны гипоталамуса, нейроны коры головного мозга, система проприорецепторов, мышечные веретена, нейроны слуховых ядер, клетки нейроглии, для NT-4/5 - а-мотонейроны, нейроны ресничного ганглия, чувствительные нейроны [79].

Нейротрофины связываются с двумя классами взаимодействующими друг с другом рецепторов - Trk-рецепторами (рецепторы сопряженные с тирозинкиназой) и Р75-рецепторами. В свою очередь, существуют подтипы Trk-рецепторов - TrkA (наибольшая аффинность к NGF), TrkB (наибольшая аффинность к BDNF и NT-4) и ТгкС (наибольшая аффинность к NT-3). При этом возможно связывание Trk-рецепторов и нейротрофинов в различных сочетаниях. В центральной нервной системе ТгкА экспрессируется в основном холинергическими нейронами базальных ядер переднего мозга. Наиболее распространенным в мозге является подтип TrkB [80]. Р75-рецепторы в наибольшей степени экспрессируется во время развития центральной нервной системы, затем уровень его экспрессии падает, но быстро возрастает при входе нейронов в апоптоз [81].

Связывание нейротрофинов с рецептором приводит к его димеризации и активации тирозинкиназного домена. Затем происходит автофосфорилирование цитоплазматического домена Trk-димера [82] и активация адапторных молекул, запускающих каскады, передающие сигнал в ядро.

Р75-рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью и принадлежат к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) [83], [84] и модулируют функции Trk-рецепторов, повышая аффинность ТгкА к NGF [85], снижая аффинность TrkB к BDNF и NT-4/5 и при этом существенно не влияя на связывание NT-3 с TrkC [86].

Кроме того, Р75 выполняет ряд функций без участия Trk. Это такие функции, как ретроградный транспорт нейротрофинов [87], влияние на миграцию шванновских клеток [88], активация транскрипционных факторов

89]. В присутствие NGF этот рецептор способен как запускать программированную клеточную гибель, так и защищать клетки от апоптоза

90], [91], [92]. В трансгенных мышах с повышенным уровнем экспрессии р75 наблюдается значительная гибель нейронов центральной нервной системы [93]. С другой стороны, активация Trk-рецепторов может предотвращать апоптоз, вызванный активацией нейротрофином Р75-рецепторов [94]. В настоящее время можно констатировать, что рецепторы нейротрофинов образуют сложную и во многом пока не изученную систему, активация элементов которой приводит к различным и зачастую противоположным эффектам.

К настоящему времени получены нокаутированные по генам всех нейротрофинов мыши, что дало дополнительные данные о роли нейротрофинов. Нокауты по генам ngf, hdnf и nt-З приводили к гибели животных в раннем постнатальном развитии [95]. В противоположность этому, нокаут по nt-4 не является летальным, приводит к минимальному дефициту нейронов (сенсорных), и нокаутированные животные нормально развивались до взрослого состояния [96], [97]. В отличие от оценки развития периферической нервной системы нокаутированных по генам нейротрофинов животных, оценка развития центральной нервной системы оказалась более сложна; тем не менее в качестве общего вывода отмечено уменьшение количества нейронов в ряде отделов мозга.

Характеристика нейротрофина BDNF.

Нейротрофин BDNF - это белок с молекулярной массой 27кД, исходно выделенный из мозга свиньи как трофический фактор для клеток спинномозговых узлов (DRG), а позже полученный и из человеческого мозга [98]. Он обладает высокой гомологией с NGF, NT-З и NT-4/5 [99] и влияет на разные типы нейронов ЦНС [100]. Было показано, что BDNF поддерживает рост спинальных сенсорных нейронов [98], а также выживание и рост мотонейронов, сенсорных, ганглионарных, дофаминергических, холинергических и ГАМК-ергических нейронов [100]. BDNF является сигналом к дифференцировке плюрипотентных клеток нервного гребня в сенсорные нейроны [101], но не влияет на NGF-чувствительные симпатические нейроны. Так, в период раннего развития тригеминальные нейроны отвечают на действие BDNF и NT-З, а потом они переключаются и становятся зависимыми только от NGF [102]. Имеются данные, что BDNF регулирует экспрессию нейропептидов, в частности, нейропептида У (NPY) и соматостатина [103].

Отсутствие нормально работающего гена BDNF вызывает потерю нейронов в различных отделах мозга и раннюю постнатальную гибель животных [96]. В гиппокампе нокаутных по bdnf мышей нарушено долговременное потенцирование (LTP) [104], при этом введение экзогенного BDNF полностью возмещает имеющийся дефицит в LTP [105], [106]. Делеция одного аллеля гена BDNF вызывает нарушения обучаемости у мышей [107].

Мыши с одним функционирующим аллелем гена BDNF проявляют склонность к ожирению и, вместе с тем, для них характерна повышенная двигательная активность [ 108] и агрессивность [109].

Экспрессия BDNF в нервной системе.

BDNF продуцируется прежде всего клетками нейроглии головного и спинного мозга [49], а также шванновскими клетками, ассоциированными с периферическими мотонейронами [110]. Методом гибридизации in situ было изучено распределение BDNF мРНК в мозге взрослых крыс и свиней [111]. В пределах гиппокампа интенсивно меченые нейроны были найдены в области пирамидного слоя, а также гранулярного слоя и ворот зубчатой извилины. Высокая экспрессия BDNF отмечена в нейронах коры мозга, ограде (claustrum) и других зонах. В значительно меньших количествах BDNF находят в сердце, легких и тромбоцитах [112], [61].

У крыс в возрасте одного месяца самый высокий уровень BDNF определяется в гиппокампе (5.41 нг/г ткани), затем следует гипоталамус (4.23 нг/г) и перегородка (1.68 нг/г). В других областях уровень BDNF колеблется от 0.9 до 1.7 нг/г. BDNF также в очень низких концентрациях обнаружен на периферии: 0.65 нг/г в селезенке, 0.21 нг/г в тимусе, 0.06 нг/г в печени [113]. По другим данным [114], в гиппокампе двухмесячных крыс определяется более 200 нг/г ткани BDNF.

Наличие BDNF показано как в цитоплазме тел нейронов, так и в дендритах [115]. Вообще в головном мозге BDNF обнаружен во многих структурах, включая кору, миндалевидный комплекс, гиппокамп, ограду, некоторые ядра таламуса и гипоталамуса, черную субстанцию и некоторые образования ствола мозга. Причем в отличие от мРНК белковый продукт также определяется в боковой перегородке, в ядре ложа терминальной полосы, медиальном преоптическом ядре, оливном предпокрышечном ядре, латеральном парагигантоклеточном ядре и задних рогах спинного мозга [116]. Эти данные указывают на наличие антероградного транспорта BDNF в определенных популяциях. В некоторых областях, наоборот, определяется только мРНК для BDNF. Так, в гиппокампе клеточные области, в которых определяется иммунореактивность BDNF, не совпадают с распределением мРНК. Как предполагается, это связано с тем, что количество белка слишком мало, чтобы зафиксировать его с помощью имуногистохимии или же он очень быстро используется или транспортируется в другие области.

Иммуногистохимическая локализация трансмембранного белка TrkB, служащего рецептором для BDNF, показала его широкое распространение в ЦНС крысы [117]. TrkB экспрессируется на телах нейронов, на аксонах и дендритах во многих структурах, включая кору, гиппокамп, зубчатую извилину, стриатум, ядра перегородки, черную субстанцию, клетки Пуркинье мозжечка, ствол мозга, спинальные мотонейроны и чувствительные ядра ствола. Кроме того, TrkB обнаружен на субпопуляции клеток эпендимы, выстилающей желудочки мозга. Белок TrkB экспрессируется и в астроцитах, однако в укороченной форме, лишенной каталитической субъединицы [118].

Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции.

Ген BDNF (рис. 3) [119] состоит из четырех коротких 5'-некодирующих экзонов (I-IV), каждый из которых содержит отдельный промотор, и одного З'-концевого экзона (экзон V), кодирующего белок

BDNF. Кроме того, каждый из четырех вариантов, полученных в результате альтернативного сплайсинга, подвергается полиаденилированию по одному из двух сайтов, расположенных в 3' области экзона V. Таким образом, получается 8 продуктов, кодирующих один и тот же белок. Смысл подобного разнообразия, по-видимому, состоит в том, что экспрессия BDNF таким образом может селективно регулироваться различными факторами и на нескольких уровнях, что обеспечивает большую гибкость в контроле скорости и величине ответа на то или иное воздействие, приводящее к усилению экспрессии белка BDNF.

1DNF gene i н

111 IV v

-Н-/ A-M—/3' У* I

BDNF ftiRNA I on! transcript cxon II transcript c*on III Iran script

BDNF pro

Ng, potential glvcobvlaiion site d is

131

249

Рис. 3. Строение гена bdnf [119].

Ген BDNF считается геном раннего ответа (IEG), то есть в ответ на стимул происходит быстрая инициация транскрипции этого гена, не требующая синтеза белка de novo, а в результате посттрансляционной модификации предсуществующих факторов транскрипции.

В нейронах рецепция нейротрансмиттера и деполяризация мембраны приводит к открытию лиганд- и потенциал-зависимых кальциевых каналов, что способствует входу кальция в клетку [120]. Кальций, быстро связываясь с соответствующими белками, запускает каскады передачи сигнала в ядро клетки. В ядре, в промоторе гена BDNF транскрипционный фактор CREB, связанный с последовательностью CRE, находится в неактивном состоянии. Кальций-зависимые протеинкиназы фосфорилируют CREB по остатку Ser-133, что запускает транскрипцию мРНК для BDNF.

Однако, мутационный анализ промотора BDNF выявил наличие дополнительных элементов, необходимых для кальций-зависимой транскрипции BDNF, отличных от CREB.

Регуляторные последовательности, контролирующие транскрипцию, находятся обычно в последовательности ДНК, фланкирующей 5'-конец начального экзона. Для гена BDNF таких экзонов четыре. Транскрипты, содержащие I, II и III экзоны, экспрессируютя в мозге, тогда как IV экзон обнаружен вне мозга. I и III экзоны индуцируются при судорожной активности во взрослом мозге [121]. Данные, полученные с помощью ОТ-ПЦР показали, что при деполяризации мембраны эмбриональных нейронов коры in vitro происходит транскрипция, главным образом, III экзона. Причем этот процесс не останавливается при добавлении в культуру циклогексемида, блокирующего синтез белка. Это говорит о том, что транскрипция экзона III запускается за счет посттранскрипционной модификации уже существующих факторов транскрипции [122].

Для определения роли регуляторных элементов в транскрипции гена BDNF осуществлялся делеционный анализ и направленный мутагенез промоторной области III экзона [123], [124]. Это позволило выявить наличие последовательности CRE за 35 bp до точки начала транскрипции. Дальнейший анализ промоторной области показал, что CREB является необходимым, но недостаточным фактором для запуска транскрипции. Найдены еще два элемента ДНК, регулирующие транскрипцию III экзона гена BDNF. Проксимальный элемент (-52- -43) содержит последовательность E-box и связывает белок, принадлежащий к семейству транскрипционных факторов типа спираль-петля-спираль (helix-loop-helix). Дистальный элемент (-73 - -64) (5-CTATTTCGAG-3') не принадлежит ни к одной из известных регуляторных последовательностей. С ним связывается белок, названный CaRF (calcium response factor).

CaRE1 CaRE2/E-box CaRE3/CRE

Ca2+

Рис. 4. Регуляция транскрипции гена bdnf [123].

Таким образом, III экзон гена BDNF находится под регуляцией трех различных последовательностей, зависящих от ионов кальция (CaRE). Причем, мутация любого из них практически полностью прекращает транскрипцию BDNF, зависящую от ионов кальция. То есть, для запуска транскрипции требуется несколько сигнальных событий, которые приведут к совместной активации всех трех факторов. Это, по-видимому, повышает порог сигнала, необходимого для запуска транскрипции BDNF, делая этот процесс более специфичным.

Рецепторы для BDNF.

Связывание нейротрофина с Trk-рецепторами вызывает их активацию путем лиганд-индуцированной димеризации рецептора и автофосфорилирования внутриклеточных остатков тирозина [125]. Активированный рецептор способен фосфорилировать несколько внутриклеточных мишеней [126]. К белкам, которые активируются автофосфорилированным Trk-рецептором, относятся фосфолипаза С1-у, адапторные белки She, rAPS и SH2-p, фосфатидилинозитол-3' киназа (PI3K), Fyn, протеинтирозинкиназа, вовлеченная в регуляцию клеточной адгезии и синаптической пластичности и некоторые другие молекулы. В свою очередь, активированные белки запускают Ras/MARK-каскад и фосфорилирование сигнал-регулируемых киназ (ERKs), что приводит к увеличению концентрации кальция внутри клетки и последующей активации кальций/кальмодулин-зависимых киназ и казеинкиназы 2, фосфорилированию CREB и дальнейшей активации фосфатидилинозитол-3'-киназы [127], [128], [129], [130], [131].

Кроме того, как и все нейротрофины, BDNF связывается с Р75-рецепторами и, действуя через этот рецептор, может запускать программированную гибель клетки. Предполагается также, что именно через Р75 осуществляется ретроградный аксональный транспорт BDNF и NT-4 [87].

Суточные колебания уровня BDNF.

В течение суток уровень BDNF в мозге крысы испытывает значительные изменения. Впервые наличие суточных колебаний в экспрессии BDNF мРНК и TrkB мРНК было обнаружено во фронтальной коре и гиппокампе [132]. Самые высокие концентрации BDNF мРНК отмечаются в ночные часы, и уровень в 20:00 выше уровня в 8:00 в 1.65 раза. В гиппокампе наблюдались еще большие колебания: уровень BDNF мРНК в

20:00 выше, чем в 12:00 в 3.46 раза. То есть самые высокие концентрации мРНК зафиксированы после выключения света (19:00), а самые низкие -после включения (7:00). Варьирует и экспрессия TrkB мРНК. Во фронтальной коре минимальный уровень наблюдался в 24:00, а максимальный - в 12:00 с разницей в 5.14 раза. В гиппокампе минимум экспрессии TrkB мРНК отмечен в 18:00, а максимум - в 8:00 с разницей в 17.44 раза. Авторы связывают эти вариации уровней мРНК с физиологическими колебаниями активности животных.

Методом гибридизации in situ на популяциях нейронов из разных областей гиппокампа крысы изучалась экспрессия BDNF мРНК во время активного периода (темный цикл) и пассивного периода (светлый цикл) [133]. Крыс декапитировали через временные промежутки в 6 часов (12:00, 18:00, 24:00, 6:00). Точки 12:00 и 18:00 соответствовали середине и концу неактивного периода, а точки 24:00 и 6:00 - середине и концу активного. Было показано, что уровень BDNF мРНК в гиппокампе минимален в 12:00, а затем повышается, достигая максимума в 6:00 (12:00<18:00<24:00<6:00). В результате были выявлены эндогенные колебания мРНК для BDNF в пирамидных клетках СА1 и САЗ областей гиппокампа, а также в воротных нейронах. Экспрессия BDNF мРНК низкая во время светлого цикла (пассивный период) и повышается во время темного цикла (активный период) на 180% в СА1, на 170% в САЗ, на 153% в воротах , на 145% в зубчатой извилине относительно уровней в 12:00.

Ранее было показано, что физическая активность увеличивает уровень BDNF мРНК [134], [135], [136]. Кроме того, стимуляция светом, а также стимуляция усов животного приводит к подъему уровня BDNF в коре [137], [138], а помещение животных в новую обстановку увеличивает уровень мРНК в гиппокампе [139]. Таким образом, регуляция экспрессии BDNF зависит от активности животного и реакции на средовые воздействия.

Микродиализное изучение уровней ацетилхолина в гиппокампе выявило высокую корреляцию между физической активностью и подъемом ацетилхолина, причем самые высокие уровни ацетилхолина в гиппокампе наблюдаются во время темного цикла [140], [141], [142], что совпадает с суточными колебаниями BDNF мРНК. В экспериментах in vivo и in vitro продемонстрирован подъем уровня BDNF мРНК в нейронах гиппокампа под действием ацетилхолина [143], [144], [145]. Таким образом, ночное увеличение уровня BDNF мРНК может быть связано с выбросом ацетилхолина.

Не исключено, что разные факторы вносят свой вклад в суточные колебания экспрессии BDNF. Если это так, то колебания BDNF в коре и гиппокампе не являются истинным суточным ритмом, а отражают внешние воздействия, зависящие от времени суток.

Существуют указания в пользу этой гипотезы [146] - в условиях постоянной темноты в гиппокампе не обнаружено ритмичных колебаний экспрессии мРНК для BDNF и его белкового продукта. Напротив, в гипоталамусе, структуре, тесно связанной с генерацией суточных ритмов у млекопитающих, BDNF (мРНК и белок) колеблются ритмично в отсутствии сигналов "свет-темнота".

Существуют указания в пользу того, что колебания уровня экспрессии BDNF могут вызываться колебаниями кортикостерона. Действительно, ранее было показано, что кортикостерон снижает экспрессию BDNF мРНК и уровень белка BDNF в гиппокампе крысы [137]. Кортикостерон синтезируется ритмично в течение суток, достигая максимума с наступлением темноты, когда у крыс начинается период активности. Установлены суточные колебания мРНК для BDNF в зубчатой извилине: подъем с 8:00 до 12:00, спад с 12:00 до 20:00, далее уровень до 8:00 остается неизменным [147]. В областях СА1 и САЗ колебаний экспрессии BDNF не обнаружено, в отличие от данных, описанных в вышеуказанных исследованиях. При этом пик концентрации кортикостерона в плазме крови зафиксирован в 20:00, а минимум - в 8:00. Возможно, суточный ритм экспрессии BDNF в зубчатой извилине может регулироваться кортикостероном.

Имеются данные о колебаниях экспрессии BDNF в коре больших полушарий мозга крысы [148]. После 3 часов сна, спонтанного бодрствования или лишения сна отличий в экспрессии BDNF мРНК в коре мозга обнаружено не было. Однако после 8 часов бодрствования экспрессия BDNF мРНК в коре была существенно больше, чем после 8 часов сна, независимо от того, было ли бодрствование спонтанным во время темного периода или же оно достигалось лишением сна в светлое время суток. Бодрствование вызывало увеличение экспрессии BDNF мРНК и в других областях мозга, а именно, в гиппокампе и таламусе. Уровень белка BDNF в коре бодрствующих крыс в 1.5 раза превышал уровень спящих крыс. Эти результаты дают основание предполагать, что поведение животного (бодрствование) в большей степени, чем время суток (темный период) отвечает за увеличение экспрессии BDNF мРНК.

Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС.

Экспрессия белка и мРНК для BDNF регулируется многими факторами - уровень BDNF варьирует в ходе развития и роста организма, зависит от его активности, а также меняется в ответ на повреждение нервной ткани при ишемии, гипогликемии, эпилептической активности и травмах [52], [149], [150], [151]. Как при повреждении, так и в физиологических условиях регуляция экспрессии BDNF представляет собой сложное взаимодействие разных нейротрансмиттерных систем [152]. Краткие сведения о влиянии различных факторов на уровень BDNF в головном мозге представлены в Таблице 2 и следующих за ней комментариях.

Таблица 2. Влияние различных факторов на экспрессию BDNF в головном мозге.

ВОЗДЕЙСТВИЕ ОТДЕЛ МОЗГА ЭФФЕКТ мРНК Белок

1. Антагонисты ГАМК(Б) рецепторов Гиппокамп, спинной мозг т t [153]

2. ГАМК, агонист ГАМК(А) рецептора мусцимол Нейроны гипоталамуса, 5 дней in vitro t [154]

3. Агонисты глютаматных рецепторов Культура клеток мозжечка t [155]

4. Введение эстрогена после овариэктомии Кора, обонятельные луковицы t [156]

5. Физическая активность Гиппокамп,кора t [135] [1571

6. Адренэктомия Гиппокамп,кора 1 [158]

7. Иммобилизационный стресс 2ч/день Гиппокамп, зубчатая извилина i [151]

8. Кратковременный иммобилизационный стресс (15 минут) Гипоталамус t t [159]

9. Этанол, хроническое введение Гиппокамп 4 [160] [161] [162]

10. Этанол, однократное введение Зубчатая извилина, САЗ области гиппокампа, супраоптическое ядро гипоталамуса t [162]

11. Холинергическая деафферентация Гиппокамп, кора, обонятельные луковицы He влияет [163]

12. Агонисты холинергических рецепторов Гиппокамп t [164]

13. Никотин, однократное введение Зубчатая извилина, СА1 и САЗ области гиппокампа [165]

14. Норадреналин Культура клеток гиппокампа I [166]

15. Повреждение норадренергических нейронов крысы Гиппокамп t [166]

16. Ингибиторы обратного захвата серотонина Гиппокамп t [167] [168]

17. Дофамин Стриатум мыши t [169]

18. Ингибирование эндогенной продукции NO Культура нейронов коры и гиппокампа грызунов t t [170] [171]

19. AVP 4-8 Гиппокамп,кора t [172]

20. VIP и РАСАР Культуры нейронов и астроцитов коры t [173]

1. Известно, что уровни мРНК для BDNF и NGF зависят от активности нейронов. Увеличение экспрессии регулируется глютаматом (через NMDA и nonNMDA рецепторы), а снижение - в основном через систему ГАМК [174], [175]. Это показано в экспериментах как in vitro, так и in vivo на нейронах гиппокампа. В работе [153] изучалось действие антагонистов ГАМК(Б) рецепторов CGP 36742, CGP 56433А и CGP 56999А. Однократное введение физиологически активных, не вызывающих судороги доз этих препаратов вызвало увеличение уровней мРНК для BDNF и NGF на 200-400%, а уровней соответствующих белков на 200 - 250% в коре, гиппокампе и спинном мозге крыс. Во всех исследованных областях сначала повышалась концентрация белка NGF, а затем - BDNF. Максимальные концентрации обоих белков достигались через 24 - 72 часа, в зависимости от области. В отличие от этого, концентрация нейротрофина NT-3 в коре и гиппокампе снижалась на 50% относительно контрольных значений. Эти данные демонстрируют способность антагонистов ГАМК(Б)-рецепторов избирательно увеличивать уровни эндогенных нейротрофинов в ЦНС.

2. В период раннего нейронального развития ГАМК функционирует как возбуждающий нейротрансмиттер. Такое действие ГАМК ведет к ряду изменений в структуре и функции нейронов. Одним из предполагаемых механизмов этого действия является участие ГАМК в регуляции активности киназ и косвенном контроле транскрипции BDNF через регуляцию фосфорилирования CREB [154]. И ГАМК, и агонист ГАМК(А) рецептора мусцимол стимулируют экспрессию BDNF при раннем нейрональном развитии (нейроны гипоталамуса, 5 дней in vitro). Электрофизиологические исследования клеток показали, что BDNF значительно увеличивает частоту возбуждающих ГАМК-ергических постсинаптических токов. Эти данные говорят о взаимосвязи ГАМК и BDNF в период раннего развития: ГАМК увеличивает экспрессию BDNF, a BDNF в свою очередь облегчает синаптический выброс ГАМК.

3. Исследовано влияние глютамата и его аналогов на экспрессию BDNF в культуре клеток мозжечка [155]. После 4 часов инкубации нейронов с агонистами глютаматных рецепторов: квисквалат, каинат, AMP А (альфа-амино-Згидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионат и NMDA, увеличивался уровень BDNF мРНК. Причем комбинация глютамата с антагонистами его ионотропных рецепторов (CNQX, АР-5 и/или МК-801) тоже повышала уровень BDNF мРНК. Можно сделать вывод, что основной вклад в регуляцию экспрессии глютаматными рецепторами BDNF мРНК вносят именно метаботропные рецепторы.

4. Половые стероидные гормоны, эстрогены и андрогены, влияют на организацию развивающейся нервной системы и участвуют в регуляции поведения взрослых особей. Эстрогены, как и нейротрофины, в ряде случаев способствуют выживанию и дифференцировке клеток нервной ткани. Показано, что нейроны, экспрессирующие нейротрофины и/или рецепторы к ним, также экспрессируют и рецепторы для эстрогена [176], [177]. Уровни мРНК для BDNF в определенных областях гиппокампа колеблются во время эстрального цикла [178]. Как известно, эстрогеновый рецептор принадлежит к суперсемейству рецепторов, активирующих транскрипцию генов путем прямого связывания гормон-специфичных регуляторных элементов ДНК [179], [180]. Таким образом, эстроген регулирует транскрипцию широкого набора генов. Была определена последовательность в гене BDNF, соответствующая ERE (estrogene response element) [156]. Эта последовательность расположена в 5'-конце V экзона, то есть экзона, кодирующего белок BDNF.

Изучено участие эстрогена в регуляции уровня BDNF мРНК [156]. Овариэктомированным животным вводили эстроген и анализировали уровень мРНК в коре и обонятельных луковицах. Уже через 4 часа после однократного введения эстрогена наблюдалось 2-2.5-кратное увеличение экспрессии мРНК для BDNF относительно овариэктомированных контролей.

Показано, что дефицит эстрогена (двусторонняя овариэктомия) значительно снижает уровень BDNF мРНК, тогда как применение эстрогена в тех же условиях поддерживает уровень нейротрофина в некоторых областях коры и в гиппокампе [181].

Исследовано влияние раннего стероидного окружения на экспрессию гена BDNF [182]. Анализ уровня BDNF мРНК в гиппокампе после неонатальной гонадэктомиии и последующей заместительной терапией эстрогеном выявил значительное повышение уровня BDNF мРНК с 4 по 10 дни постнатального развития. Параллельно с этим наблюдалось снижение уровня белка BDNF. Возможно, BDNF, синтезируемый нейронами гиппокампа, транспортируется к определенным мишеням, таким, как базальные ядра, а эстроген каким-то образом влияет на этот транспорт.

5. Показано, что физическая активность увеличивает экспрессию мРНК для NGF и BDNF в гиппокампе и коре крыс [135], [157]. При этом наблюдалась прямая зависимость уровня мРНК для BDNF от расстояния, которое крысы пробегали в крутящемся колесе. Авторы полагают, что физическая активность способствует увеличению устойчивости мозга к повреждениям и защищает его от нейродегенерации, связанной со старением.

6. Изучено влияние глюкокортикоидов на экспрессию мРНК нейротрофинов в коре и гиппокампе крысы [158]. Через 3 дня после адренэктомии уровни мРНК для NGF, BDNF и NT-3 значительно снижались в обоих отделах. Заместительная терапия дексаметазоном восстановила уровни нейротрофинов до контрольных значений. Через 4 часа после введения дексаметазона в дозе 5мг/кг интактным животным уровень мРНК для NGF увеличивался в 2.5 раза, а для NT-3 увеличился в 1.4 раза. Через 24 часа и 48 часов после введения последовало снижение уровней до 50% от контрольных значений. Уровень BDNF мРНК в первые 10 часов после введения не изменялся, а через 48 часов снижался до 70% от контрольных значений. Эти данные указывают на то, что глюкокортикоиды регулируют

РОССИЙСКАЯ i ГОСУДАРСТВЕННАЯ j

БИБЛИОТЕКА 41 экспрессию мРНК нейротрофинов в коре и гиппокампе. Возможно, влияние глюкокортикоидов на выживаемость нейронов зависит от изменения уровней нейротрофинов в мозге [158].

7. Исследовано влияние иммобилизационного стресса (2 часа/день) на экспрессию нейротрофинов в мозге крысы [151]. В результате было показано, что единичная или повторная иммобилизация приводит к значительному снижению уровней BDNF мРНК в гиппокампе и зубчатой извилине. В то же время уровень NT-3 мРНК в тех же областях в условиях хронического стресса увеличивается, а экспрессия мРНК для NT-4 и TrkB не менялась.

8. В гипоталамусе крысы кратковременный иммобилизационный стресс (15 минут) вызывает быстрый подъем BDNF мРНК, а затем и белка [159].

9. Показано, что хроническое потребление этанола приводит к значительному снижению мРНК для BDNF в гиппокампе крыс, а уровень мРНК для NGF, NT-3, а также белка NGF остаются неизменными. Кроме того, при хронической алкоголизации увеличивается уровень TrkB [160], [161], [162].

10. Острое применение этанола приводит к значительному увеличению экспрессии BDNF мРНК через 12 часов в зубчатой извилине и САЗ области гиппокампа, а также в супраоптическом ядре гипоталамуса [162].

11. Существует топографическая корреляция между экспрессией нейротрофинов и распределением холинергических окончаний [163]. В связи с этим возникает вопрос, принимает ли холинергическая система участие в экспрессии нейротрофинов в ЦНС. Холинергическая деафферентация гиппокампа, коры и обонятельных луковиц с помощью инъекции в желудочки 192 IgG-сапорина не вызвала значительных изменений уровней мРНК для NGF, BDNF и NT-3 в этих областях от 1 недели до 5 месяцев после повреждения. Эти данные свидетельствуют о том, что, по крайней мере в физиологических условиях, холинергическая афферентация не играет особой роли в поддержании базальных уровней нейротрофинов в мозге взрослой крысы [163].

12. Введение в гиппокамп агонистов холинергических рецепторов -никотина (агонист nAChR), карбахола (агонист и nAChRs, и mAChRs) и пилокарпина (агонист mAChRs) [164] - привело к следующим результатам. Никотин вызвал длительно сохраняющийся (с 24 до 72 часов) подъем уровня NGF мРНК во всех областях гиппокампа. Этот подъем зависел от передачи возбуждающих нейротрансмиттеров и блокировался применением антагонистов АМРА или NMDA рецепторов. В отличие от этого, карбахол и пилокарпин приводили к увеличению NGF мРНК сохранявшемуся 4-8 часов после введения. Пилокарпин приводил к значительному увеличению уровня BDNF мРНК в гиппокампе; никотин и карбахол проявляли ту же тенденцию. Никотин и карбахол вызывали увеличение уровня NT-3 в зубчатой извилине и СА2. Через 8 часов после применения никотина происходил и подъем TrkB мРНК. Уровень TrkC мРНК не изменялся.

13. Показано, что острое применение никотина значительно снижает уровень BDNF мРНК в зубчатой извилине, СА1 и САЗ областях гиппокампа крысы через 2 и 24 ч. после введения. Однако после 7 дней введения никотина развивается толерантность и наблюдается подъем мРНК для BDNF в СА1 [108].

14. 15. Норадренергические нейроны locus coeruleus иннервируют несколько областей мозга, в том числе гиппокамп и кору. Как известно, в гиппокампе отмечается самая высокая концентрация нейротрофинов NGF, BDNF и NT-3. Чтобы установить, какую роль играет адренергическая система в регуляции экспрессии мРНК нейротрофинов, осуществлялось химическое (с помощью ^(2-хлорэтил)-К-этил-2-бромбензиламина) и механическое повреждение норадренергических нейронов крысы и оценивались уровни мРНК нейротрофинов через 14 и 35 дней [166]. Было показано, что химическое повреждение вызывало значительный подъем мРНК для NGF и BDNF в гиппокампе через 35 дней, не повлияв при этом на уровень мРНК для NT-3. Механическое же разрушение привело к значительно менее выраженным изменениям в уровнях нейротрофинов. При введении норадреналина в гиппокампальные органотипические культуры, в зубчатой извилине уровни мРНК для NGF и BDNF, но не для NT-3, значительно снижались [166].

16. Показано, что хроническое применение ингибиторов обратного захвата серотонина, используемых в клинике в качестве антидепрессантов, ведет к увеличению экспрессии BDNF мРНК в гиппокампе [ 167], [168].

17. Изучено влияние дофамина на экспрессию BDNF в стриатуме мыши [169]. Через 2 часа после введения предшественника дофамина, леводопа, возрастал уровень BDNF мРНК. Повышенный уровень сохранялся в течение 16 часов. Совместное введение галоперидола частично ингибировало этот эффект. Таким образом, дофаминергическая стимуляция напрямую влияет на экспрессию BDNF мРНК в стриатуме in vivo.

18. Ингибирование эндогенной продукции NO путем блокады NO-синтазы (NOS) поднимает уровень мРНК и белка BDNF в культуре нейронов коры грызунов [170]. Аналогичный результат был получен и на культуре нейронов гиппокампа крысы [171]. Экзогенное введение NO приводило к снижению уровня белка BDNF на 46% относительно контроля. С другой стороны, при добавлении BDNF в культуру нейронов коры действует как положительный регулятор синтеза NO. У нокаутированных по bdnf мышей нарушена экспрессия NOS в коре.

19. Пептид AVP(4-8) является поведенчески-активным метаболитом аргинин-вазопрессина (A VP), который способен влиять на процессы обучения и формирования памяти [183]. Изучено действие экзогенного AVP(4-8) на уровни мРНК для NGF, BDNF и NT-3 в мозге взрослой крысы [172]. Экспрессия NGF и BDNF значительно увеличивалась под действием

AVP(4-8) в коре и гиппокампе, а экспрессия NT-З не изменялась. Уровень NGF мРНК в коре увеличивался в 6.43 раза, а уровень BDNF мРНК - в 4.1 раза. В гиппокампе были обнаружены соответствующие изменения - в 3.05 раза для NGF и в 3.1 раза для BDNF. Применение в тех же условиях поведенчески активного AVP привело к незначительным изменениям уровня экспрессии BDNF, а его поведенчески неактивный аналог окситоцин вообще не вызвал изменений.

20. Пептиды VIP и родственный ему РАСАР, обладающие нейропротекторными свойствами [184], [185], [186], стимулируют экспрессию BDNF мРНК в первичных культурах нейронов и астроцитов коры [173]. При этом в культурах нейронов увеличение экспрессии BDNF мРНК, вызванная VIP и РАСАР, полностью отменяется под действием антагонистов NMDA-рецепторов - МК-801 и АР5, что указывает на то, что их действие связано с потенцированием действия глютамата.

Таким образом, обращает на себя внимание то, что нейротрофины и, в особенности BDNF, являются важнейшими факторами выживаемости нейронов и в то же время мощными регуляторами функций ЦНС. При этом уровень экспрессии BDNF достаточно лабилен - регулируется и эндогенными факторами, и внешними условиями, в которых находится организм. Следует отметить также, что пептидная регуляция экспрессии BDNF изучена недостаточно, и к настоящему времени имеется лишь три пептида, для которых показана способность усиливать экспрессию BDNF в клетках мозга - AVP(4-8), VIP и РАСАР, причем только на уровне транскрипции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использованные материалы и реагенты.

В работе использовались следующие реагенты: L-глютамин, MEM, F12, DMEM, эмбриональная сыворотка коровы (ICN), сахароза, BSA, SDS, EDTA, NaOH, Na2C03, Na2HP04, NaCl, PPO, POPOP, бензамидин, PMSF, BDNF, Трис, инсулин, трансферрин, прогестерон, путресцин, Na2Se03, трифторуксусная кислота, гептафтормасляная кислота, трихлоруксусная кислота, ацетонитрил, полиэтиленимин, D-глюкоза, L-глютамин, апротинин, лейпептин (Sigma, Sigma-Aldrich), CuS04, параформальдегид, Ca,Na-TapTpaT, соляная кислота, толуол (Реахим), СаС12, реактив Фолина (Merck), тритон Х-100 ("Ferak Berlin"). Использовалась пластиковая культуральная посуда фирм Nunc и Costar. Производители других использованных в работе материалов и реагентов указаны в соответствующих разделах.

Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса.

Синтез и мечение тритием гептапептида Семакс проводилось в ОХФАВ ИМГ РАН. Чистота препаратов проверялась методами тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ. Использовались препараты с чистотой не менее 98%. Меченный тритием Семакс имел удельную радиоактивность 45-120 Кюри/ммоль и хранился в 50% водно-этанольном растворе при -20°С. Немеченый Семакс хранился в виде 1 мМ раствора в воде стандарта чистоты MilliQ при -70°С. Стерильный раствор Семакса получали фильтрованием через 0.22 мкм ацетат-целлюлозные фильтры (Costar, USA). Растворы Семакса после размораживания хранили при 4°С и использовали в течение 6 часов. В качестве контролей использовали эквивалентный объем воды стандарта чистоты MilliQ.

Выделение плазматических мембран мозга.

Выделение плазматических мембран мозга проводили по методу Грэя-Виттакера с некоторыми модификациями [187]. Крыс линии Вистар (самцы) массой 200-250 г декапитировали, извлеченные базальные ядра переднего мозга промывали PBS (10 мМ Na2HP04, 150 мМ NaCI, рН 7.4) и гомогенизировали в 10 объемах 10 мМ Трис-HCl (рН 7.4), содержащего 0.32 М сахарозу, 1 мМ EDTA, 1 мМ бензамидин и 0.1 мМ PMSF (буфер А) в гомогенизаторе тефлон-стекло. Гомогенизацию и все последующие операции проводили при температуре 4°С. Гомогенат центрифугировали в течение 20 минут при 1000 g, осадок отбрасывали, а супернатант подвергали повторному центрифугированию при 40000 g в течение 30 минут. Плотный коричневый осадок на дне пробирки, обогащенный митохондриями, отбрасывали, а менее плотный светлый осадок суспендировали в буфере А, переносили в чистую пробирку и дважды промывали этим же буфером, осаждая мембраны центрифугированием, аналогичным предыдущему. По окончании промывок осадок суспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, содержащем 0.22 М сахарозу и 1 мг/мл BSA и хранили в жидком азоте. Концентрация белка в образцах мембран составляла 1-20 мг/мл.

Определение концентрации белка.

Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури [188]. Для каждой экспериментальной точки использовали по 8 параллелей. Калибровочные (концентрация белка 0 - 100 мг/мл) и определяемые пробы наносились на 96-луночные культуральные планшеты в объеме 80 мкл, после чего в каждую лунку добавлялось по 80 мкл четырехкомпонентной смеси (раствор 0.1% CuS04 х 5Н20, 0.2% Са,Ка-тартрат х 4 Н20, 10% Na2C03 (компонент 1), 10% SDS (компонент 2), 0.8 М NaOH (компонент 3), дистиллированная вода компонент 4), смешанные в равных объемах). После инкубации 20 минут при комнатной температуре добавлялось по 40 мкл реактива Фолина, разведенного в 5 раз дистиллированной водой. После каждой стадии пробы тщательно перемешивались. Не менее чем через 90 минут инкубации при комнатной температуре измерялась оптическая плотность при 490 нм. По полученным данным строили калибровочную кривую, в линейном интервале 20-80 мг/мл которой рассчитывалось количество белка в изучаемой пробе.

Радиолигандный анализ.

Эксперименты по связыванию гептапептида Семакс с плазматическими мембранами проводили в 3.5-мл полистирольных пробирках. Использовался меченный тритием пептид с удельной активностью 60 - 120 Кюри/ммоль, полученный методом твердофазного мечения в ОХФАВ ИМГ РАН. Реакционная смесь (конечный объем 1 мл) содержала 10 нМ [ Н] Семакс и 1 мМ СаСЬ (кроме экспериментов по изучению влияния ионов кальция на связывание Семакса) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.4 (буфер Б) и немеченый Семакс в соответствующих концентрациях. Реакцию начинали добавлением 0.2 мг мембранного белка в 0.2 мл того же буфера. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30°С при постоянном перемешивании. По окончании инкубации пробы фильтровали через стекловолоконные фильтры GF/B (Whatman), предварительно вымоченные в 0.3% растворе полиэтиленимина в течение 2 ч при 4°С. Каждую пробирку промывали один раз холодным 50 мМ Трис-НС1 рН 7.4 (3 мл) и затем три раза фильтр тем же объемом этого буфера. Фильтры сушили на воздухе и переносили в сцинтилляционные флаконы, содержащие 5 мл сцинтилляционной смеси (4 г РРО, 0.2 г РОРОР на 1 л толуола). Радиоактивность определяли на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" (Nuclear Chicago, США) с эффективностью около 30%. Неспецифическое связывание определяли как количество метки, не вытесняемое 10 мкМ немеченым пептидом. Обратимость связывания с мембранами выявляли путем вытеснения связавшейся метки избытком немеченого Семакса (в среду инкубации добавляли 10 мкл 1 мМ немеченого пептида до конечной концентрации 10 мкМ).

Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур. о

В инкубационную смесь вводили 440 нМ [ Н] Семакса с удельной активностью 45 Ки/ммоль.

В случае клеточных культур инкубационная смесь состояла из культуральной среды MEM/F12 (1:1) содержащей 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин и 30 нМ селенит натрия. Плотность посева клеток соответствовала указанному в разделе "Получение и ведение первичных клеточных культур". После инкубации указанное время в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг и 95% воздуха, инкубационную смесь отбирали, кипятили в течение 2 минут, охлаждали до 4°С и центрифугировали при 4°С 15 минут при 15000 g. Супернатанты хранили при -20°С.

В случае плазматических мембран реакционная смесь содержала 1 мМ СаС12 в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7.4. Реакцию начинали добавлением мембранного белка до концентрации 0.2 мг/мл. Пробирки переносили в шейкер-инкубатор и выдерживали соответствующее время при температуре 30°С при постоянном перемешивании. В указанные промежутки времени из инкубационной смеси отбирали аликвоты объемом 400 мкл в полипропиленовые микропробирки (Eppendorf), инкубировали 2 минуты при 100°С и центрифугировали при 4°С 15 минут при 15000 g. Супернатант отбирали и хранили при -20°С.

Для определения содержания Семакса и его фрагментов в биологических пробах проводили экстрагирование пептидной фракции образцов с помощью органических растворителей, с последующей ВЭЖХ полученных экстрактов. К образцу 200 мкл прибавляли 4-кратный объем ацетонитрила. Смесь центрифугировали при 4°С 15 минут при 12000 g. Отбирали супернатант и высушивали его в роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 1 мл метанола. Центрифугировали при тех же условиях, супернатант снова высушивали в роторном испарителе, сухой остаток растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.

Разделение меченных тритием Семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) и его фрагментов Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, His-Phe-Pro-Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro, Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly, Met-Glu-His-Phe-Pro и His-Pro-Gly-Pro из полученных образцов проводили методом ВЭЖХ со спектрофотометром Beckman при длинах волн 220 и 254 нм, колонкой "Kromasil" (4x150 мм), зернение 5 мкм при 20°С. Полученные образцы смешивали с внутренними контролями - немечеными Семаксом и его метаболитами (по 5 мкг каждого пептида) и подвергали градиентному элюированию в смеси А (0.082% трифторуксусная кислота и 0.018% гептафтормасляная кислота) и В (80% ацетонитрил в элюэнте А) с выделением пиков, соответствующих пептиду Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro и его фрагментам. Использовали градиент от 8 (0 минут), 15 (8 минут) до 25% элюэнта В за 30 минут, при скорости протока 1 мл/мин. С помощью жидкостного сцинтилляционного счета рассчитывали содержание радиоактивности в объеме элюэнта, соответствующем каждому из разделяемых пиков. Молярную радиоактивность пептидных фрагментов Семакса рассчитывали по данным распределения тритиевой метки в меченом Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, полученным с помощью тритиевого ядерно-магнитного резонанса, и количества радиоактивности в пептидной фракции [189].

Получение и ведение первичных клеточных культур.

Первичную культуру клеток нейроглии (рис. 5) получали согласно стандартной методике [190]. Крыс линии Sprague-Dowly возраста 1-3 дня забивали с помощью углекислотной асфиксии (15 минут) и помещали на 1 минуту в 80% раствор этанола в воде. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4-7°С. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержащую 20% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глютамина. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию один раз промывали средой того же состава с помощью центрифугирования при 200 g. Клетки считали в гемацитометре (камера Горяева) и засевали плотностью 200 тыс. клеток/см на обработанные поли-Ь-лизином культуральные флаконы площадью 75 см . Культивирование клеток проводили в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг и 95% воздуха в среде MEM/F12 содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы, 2 мМ L-глютамина, 100мкг/мл гентамицина. Культуральную среду меняли каждые 3-4 дня. Пересев клеток проводили после достижения монослоя в соотношении 1:3. Для экспериментов использовали полученные после третьего пересева клетки по достижении монослоя.

Первичные диссоциированные культуры нейронов базальных ядер переднего мозга крысы (рис. 6) получали из 16 - 18-дневных эмбрионов по стандартной методике [191]. Крыс линии Sprague-Dowly массой 200 - 300 г ссаживали в соотношении 1 самец - 3 самки после 18 часов вечера; следующий день после рассаживания считался первым днем беременности. Крыс умерщвляли методом углекислотной асфиксии (15 минут) и помещали на 1 минуту в 80% раствор этанола в воде. Далее все операции проводили в асептических условиях при температуре 4 - 7°С. Выделенный из эмбриона мозг помещали в раствор Хэнкса и далее выделяли базальные ядра переднего мозга, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в среду MEM/F12 (1:1), содержащую 20% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глютамина. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически с помощью пипетирования. Полученную клеточную суспензию два раза промывали средой с помощью центрифугирования. Клетки считали в гемацитометре (камера Горяева) и засевали плотностью 100 тыс. клеток/см на обработанные поли-Ь-лизином 12-луночные планшеты в среде MEM/F12 (1:1) содержащей 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин и 30 нМ селенит натрия. Культивирование клеток проводили в С02-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02 и 95% воздуха.

Оценка выживаемости нейронов in vitro.

Культивирование первичных культур нейронов проводили в 12-луночных планшетах в 6 параллелях для каждого варианта. Выживаемость культивируемых нейронов через 7 дней культивирования оценивали путем подсчета цитохимически или иммуноцитохимически окрашенных клеток в 18 случайных полях каждой лунки. Использовались реактивы Sigma, США.

Холинергические нейроны визуализировали с помощью окраски на ацетилхолинэстеразу. Культуры фиксировали 4% параформальдегидом 1 час при комнатной температуре, промывали PBS и инкубировали 48 часов в 50 мМ ацетатном буфере (рН 5.0), содержащем 4 мМ ацетилхолин-иодид, 2 мМ CuS04, 10 мМ глицин и 0.2 мМ этопропазин. Затем инкубационную среду отбирали, клетки промывали водой и на 1 - 2 минуты добавляли 1.25% раствор Na2S. Среду отбирали и на 1 - 2 минуты добавляли 1%

Рис. 5. Культивируемые клетки нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы (фазовый контраст, ув. х200). раствор AgNCb. Среду отбирали, и планшеты промывали водой.

Тотальную (общую) популяцию нейронов визуализировали с помощью антител к нейронспецифической энолазе (NSE). Клетки фиксировали 1 час при комнатной температуре 4% параформальдегидом, промывали PBS, инкубировали 15 минут в PBS, содержащем 33% овечьей сыворотки, и затем 1 час в PBS, содержащем 0.3% Тритон Х-100 и антитела кролика к NSE (разбавление 1:2000). Лунки промывали PBS и инкубировали 1 час с биотинилированными анти-кроличьими антителами (разбавление в PBS 1:500) и визулизировали клетки с помощью набора ABC reagent (Vectastain).

ГАМК-ергические нейроны визуализировали с помощью антител к ГАМК. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом 1 час при комнатной температуре, промывали PBS и инкубировали 1 час в PBS, содержащем 7% сахарозы. После инкубации раствор отбирали, добавляли раствор аналогичного состава, замораживали при -76°С и размораживали при комнатной температуре. Клетки затем инкубировали 10 минут в PBS и затем 10 минут в PBS, содержащем 5% овечьей сыворотки и 0.3% Тритон Х-100. Среду отбирали, и клетки инкубировали с кроличьими антителами к ГАМК (разбавление 1:1000 в PBS с 5% овечьей сыворотки). Лунки промывали PBS и инкубировали 1 час с биотинилированными анти-кроличьими вторыми антителами (разбавление в PBS 1:500) и визулизировали клетки с помощью набора ABC reagent (Vectastain) в соответствии с методикой и рекомендациями производителя.

Рис. 6. Культивируемые клетки нейронов базальных ядер переднего мозга крысы (иммуноцитохимическая окраска на NSE, ув. х400).

Оценка уровня пролиферации клеток.

Пролиферацию клеток оценивали методом измерения включения [3Н]тимидина в ДНК клеток [192]. Клетки высевали на 24-луночные планшеты (плотностью 100 тыс. клеток/см2), выдерживали 48 часов в среде DMEM, содержащей 1% эмбриональной сыворотки коровы и 2 мМ L-глютамин, в СОг-инкубаторе в атмосфере 5% СОг и 95% воздуха при 37 С, затем добавляли исследуемый пептид, эмбриональную сыворотку коровы (до концентрации в среде 15%) в качестве положительного контроля и [3Н]тимидин (ОХФАВ ИМГ РАН) до конечной концентрации 1 мкКюри/мл или только [3Н]тимидин (контроль). Инкубацию с добавленными соединениями и [3Н]тимидином проводили в течение 24 часов при аналогичных условиях. Затем культуральную среду отбирали, добавляли на 10 минут метанол, высушивали на воздухе, 2 раза промывали PBS (4°С) и 3 раза по 10 минут промывали 10% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Клетки лизировали в 200 мкл раствора 1% SDS и 0.3 М NaOH (30 минут при при комнатной температуре при перемешивании), затем добавляли 200 мкл 0.3 М соляной кислоты и определяли радиоактивность с помощью жидкостного сцинцилляционного счета.

Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo.

Использовали самцов крыс линии Вистар, массой 300-350г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение - в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стрессирования животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Семакс вводили интраназально в объеме 100 мкл/кг массы тела животного однократно с 10:00 до 12:00. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. В указанные промежутки времени крыс забивали декапитацией, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань замораживали в жидком азоте и затем хранили при -70°С.

Для получения белковых экстрактов ткань взвешивали, помещали в экстракционный буфер (рН 7.7), содержащий 100 мМ Трис-НС1, 400 мМ NaCl, 0.4% Тритон Х-100, 2% Block&Sample буфер из набора BDNF Emax® Immunoassay System ("Promega", США), 1 мМ PMSF, 10 мкг/мл апротинин, 10 мкг/мл лейпептин, 1 мМ бензамидин и диссоциировали пипетированием. Затем ткань гомогенизировали при 4°С с помощью политрона (Tissue Tearor™ Biospec products, Inc). Гомогенаты центрифугировали 30 минут при 4°С при 15000g, отбирали надосадочную жидкость и полученные экстракты хранили при -70°С. Концетрацию белка в экстрактах определяли с помощью модифицированного метода Лоури.

Определения концентрации BDNF в экстрактах проводили с использованием набора BDNF Emax® Immunoassay System ("Promega", США), следуя методике и рекомендациям производителя.

Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре нейроглии.

Клетки нейроглии после третьего пересева засевали на обработанные поли-Ь-лизином 4-луночные планшеты (диаметр лунки 6 см) в 5 мл среды DMEM, содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы, 2 мМ L-глютамин и 100 мкг/мл гентамицина, и после достижения клеточного монослоя меняли среду на DMEM с 1% сыворотки и 2 мМ L-глютамин и 100 мкг/мл гентамицина. Через 48 часов в среду вносили 50 мкл стерильного раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем стерильной воды. В указанные промежутки времени культуральную среду отбирали и клетки промывали PBS (4°С). Тотальную РНК выделяли фенол-хлороформной экстракцией с использованием набора Promega

RNAgents® Total RNA Isolation System (Promega), следуя методике и рекомендациям производителя. После этанольного осаждения осадок РНК дважды промывали 70% этанолом и хранили при -70°С. Для удаления возможной примеси геномной ДНК образцы РНК растворяли в обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC) воде и инкубировали 1 час при 37°С в присутствии свободной от РНКаз ДНКазы. После дополнительной фенол-хлороформной экстракции РНК осаждали, промывали 70% этанолом, растворяли в обработанной DEPC воде и хранили при -70°С.

Для проведения обратной транскрипции отбирали 2 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в 25 мкл среды, содержащей 1 мкг oligo(dT)i5 праймеров, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ (NH4)2S04, 5 мМ MgCl2, 0.01% желатины, 0.01% Tween-20, 0.2 мг/мл BSA, 5% глицерина, 2 мкМ dNTPs, 30 ед. ингибитора РНКазы (Fermetas) и 50 U Moloney Murine Leukemia Virus (М-МТУ)-обратной транскриптазы ("Синтол", Россия). После последующей инкубации 10 минут при 95°С, образцы кДНК хранили при -20°С. С полученными образцами кДНК амплификацию проводили с использованием следующих праймеров и условий:

3-актин 5 '-TTGTAACCACCTGGGACGATATGG-3' 5'-GATCTTGATCTTCATGG TGCTAG-3' 94°С - 1 минута, 61°С - 1 минута, 72°С - 1 минута

BDNF 5 '-СAGTGGACATGTCCGGTGGGACGGTC-31 5'-TTCTTGGCAACGGCAACAAACCACAAC-3' 94°С - 1 минута, 72°С - 1 минута

NGF 5-GGCGTACAGGCAGAACCGTACACAG-3'

5'-CCGTGGCTGTGGTCTTATCTCCAACCCACAC-3' 94°С - 1 минута, 72°С - 1 минута

Амплификацию проводили в среде объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца, 5 пмоль каждого праймера, причем один из каждой пары был мечен 32Р-уАТР с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (Силекс, Россия), 5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTPs, 50 мМ Трис-НС1, 15 мМ (NH4)2S04, 5 мМ MgCl2, 0.01% желатины, 0.01% Tween-20, 0.2 мг/мл BSA, 5% глицерина. После начальной денатурации 5 минут при 94 °С, 2.5 U Taq-полимеразы (Силекс, Россия) вводили в реакционную смесь и после 28 циклов (число циклов соответствовало линейной зависимости количества продукта от количества исходной кДНК), и последующей инкубации 10 минут при 72°С, продукты разделяли в 8% неденатурирующем полиакриламидном геле. Участки геля с визуализированными с помощью бромистого этидия продуктами амплификации вырезали, и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике "Mark-3" (Nuclear Chicago, США). Все образцы тестировались в трех параллелях. Полученные относительные количества продуктов для NGF и BDNF нормализовали по относительному количеству продукта для (3-актина.

Оценка уровня экспрессии BDNF мРНК и TrkB мРНК in vivo.

Использовали самцов крыс линии Вистар, массой 300-350 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-ти часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение - в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стрессирования животных. Животных содержали в клетках по 6 штук, таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Семакс вводили интраназально в объеме 100 мкл/кг массы тела животного однократно с 10:00 до 12:00. Контрольным животным вводили эквивалентный объем дистиллированной воды. В каждой группе было по 4 животных. В указанные промежутки времени крыс забивали декапитацией, и сразу после этого выделяли исследуемые отделы мозга. Ткань помещали в консервирующий раствор EverFresh SOLID (Клоноген, Россия) и хранили при 4°С в течение 1 недели. К ткани с консервирующим раствором добавляли равный объем стерильного PBS (рН 7.4), центрифугировали при 15000g и 2 раза промывали тем же буфером с помощью аналогичного центрифугирования.

Тотальную РНК из образцов выделяли с помощью фенол-хлороформной экстракции с использованием набора PeqGold RNAPure (PeqLab, Германия), следуя методике и рекомендациям производителя. Полученную РНК дважды промывали 80% этанолом (4°С) и растворяли в 40 мкл воды, свободной от РНКаз и хранили при -80°С. Содержание РНК измеряли спектрофотометрически, и далее использовали образцы, для которых соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм превышало 1.6.

Для проведения обратной транскрипции отбирали 1 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в среде, содержащей 8 ед/мл Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV)-o6paTHyio транскриптазу (Invitrogen), 10 мМ дитиотрейтол (Invitrogen), 800 мкМ dNTPs (Invitrogen), случайные гексапраймеры (20 мкг/мл) (Thermo Hybaid, Германия) и first-strand buffer (50 мМ Трис-HCl, 75 мМ КС1, 3 мМ MgCl2) (Invitrogen) в объеме 25 мкл. После последующей инкубации 10 минут при 95°С, образцы кДНК хранили при -20°С.

Для всех амплификаций использовали праймеры (Thermo Hybaid, Германия) со следующими последовательностями: ГФРТ 5'-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3'

5'-CCACAGGACTAGAACACCTGC-3' BDNF 5'-GGGAGCTGAGCGTGTGTGACA-3' 5'-CCTTATGAACCGCCAGCCAAT-3' TrkB 5'-CACCAACCATCACATTTCTC-3' 5'-ATCTGTCTCTCGTCCTTCCC-3' р-актин 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3' 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3'

Для выявления загрязнения полученных образцов кДНК геномной ДНК проводили амплификацию с использованием праймеров к ГФРТ (HPRT) [193] в следующем режиме: старт - 5 минут 95°С, 40 циклов, включающих 1 минута - 95°С, 1 минута - 62°С, 1 минута - 72°С, в среде объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца, 20 пмоль каждого праймера, 0.5U Taq-полимеразы (Invitrogen), 200 мкМ dNTPs, 2.5мМ MgCl2. После инкубации 7 минут при 72°С, продукты разделяли в 1% агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия. Качество образца определяли по наличию продукта величиной 249 bp при отсутствии продукта величиной 1100 bp, соответствующего геномной последовательности ГФРТ.

Оценку уровня экспрессии BDNF мРНК проводили с использованием количественной ПЦР в реальном времени (real-time quantitative PCR, система LightCycler, Roche Diagnostics). Применяли высокоспецифичный ёзДНК-связывающий краситель SYBR green I. Реакцию проводили в капиллярах из боросиликатного стекла в смеси объемом 10 мкл, содержащей 1 мкл кДНК образца или стандарта или 1 мкл воды (негативная проба), 5 мкл Quantitect SYBR Green PCR Kit, 2.5 мМ MgCl2 и no 10 пмоль смысловых и антисмысловых праймеров при следующих условиях: старт - 5 минут 95°С, затем 40 циклов, включающих плавление - 15 секунд при 95°С, отжиг - 15 секунд при 55°С, элонгация - 20 секунд при 72°С с детекцией флуоресценции при 530 нм в конце каждого шага элонгации. Для подтверждения специфичности продуктов амплификации после окончания амплификации образцы охлаждали до 65°С и через 15 секунд получали кривые плавления нагреванием до 95°С со скоростью 0.1°С/сек. с непрерывной детекцией флуоресценции. Все образцы тестировались в двух параллелях. Для получения калибровочных кривых продукты амплификации (BDNF и р-актин) очищали с помощью QIAquic (Qiagen) spin columns и последовательным разбавлением водой, свободной от ДНКаз, получали стандартные растворы с известной относительной концентрацией соответствующего продукта. С использованием программного обеспечения производителя определяли номер цикла, соответствующий максимальному ускорению процесса амплификации, получали калибровочную кривую числа данных циклов от относительной концентрации продукта, и определяли относительную концентрацию в неизвестном образце с последующей нормализацией по Р-актину.

Оценку уровня экспрессии TrkB мРНК проводили с использованием количественной ОТ-ПЦР с флуориметрической оценкой количества продукта амплификации. Проводили амплификацию с использованием праймеров к TrkB и р-актина в следующем режиме: старт - 5 минут 95°С, 22 цикла (р-актин) и 27 циклов (TrkB) включающих 30 секунд при 95°С, 45 секунд при 68°С, 45 секунд при 72°С, в среде объемом 20 мкл, содержащей 2 мкл кДНК образца, 20 пмоль каждого праймера, 0.5U Taq-полимеразы, 200 мкМ dNTPs, 2.5мМ MgCl2 (Invitrogen). Данные условия обеспечивали пропорциональность количества продукта амплификации от количества исходной кДНК. После инкубации 7 минут при 72°С, продукты разделяли в 1% агарозном геле с визуализацией с помощью бромистого этидия. Калибровочную кривую получали введением в реакцию кДНК известной относительной концентрации. С помощью системы Alphalmager2000 (Alpha Innotech Corporation) определяли интенсивность свечения соответствующего продукта в ультрафиолетовом свете, и с помощью программного обеспечения производителя получали значения исходных относительных количеств соответствующих кДНК и проводили их нормализацию относительно Р-актина.

Оценка уровня экспрессии TrkB мРНК в культуре нейроглии.

Клетки нейроглии гиппокампа двухдневной крысы после третьего пересева засевали на обработанные полиорнитином 6-луночные планшеты в 5 мл среды DMEM, содержащей 15% эмбриональной сыворотки коровы и 100 мкг/мл гентамицина, и после достижения клеточного монослоя меняли среду на DMEM с 1% сыворотки. Через 48 часов в среду вносили 50 мкл раствора Семакса до указанной конечной концентрации или эквивалентный объем воды. Через 24 часа культуральную среду отбирали и промывали PBS (4°С). Выделение РНК, обратную транскрипцию и определение уровня экспрессии TrkB мРНК проводили аналогично описанному в предыдущем разделе.

Статистистическая оценка результатов.

Результаты обрабатывались с помощью программ Jandel Scientific SigmaPlot и Statsoft Statisica. Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью дисперсионного анализа (one-way ANOVA и Kruskal-Wallis ANOVA). На графиках представлены средние значения групп с учетом стандартной ошибки среднего (Mean+SEM), п - объемы групп. Обозначения уровней значимости различий групповых средних: *-р<0.05; **-р<0.01; ***-р<0.001.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Долотов, Олег Валентинович

выводы

1. Деградация гептапептида Семакс в присутствии как плазматических мембран, так и культур клеток нейроглии и нейронов базальных ядер переднего мозга крысы происходит и с С-, и с N-конца молекулы с доминирующим образованием пентапептидов.

2. Обнаружено существование связывающих центров Семакса на плазматических мембранах базальных ядер переднего мозга крысы и получены их характеристики.

3. Обнаружено селективное влияние Семакса на выживаемость холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга крысы in vitro.

4. Обнаружено увеличение под действием Семакса экспрессии нейротрофина BDNF и его высокоаффинного рецептора в первичных культурах нейроглии и в головном мозге крысы.

5. Одним из механизмов нейропротекторного и ноотропного действия Семакса может являться регуляция экспрессии ряда нейротрофинов и их рецепторов в головном мозге.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. O.V. Dolotov and I.A. Grivennikov. Application of primary cultures of rat fetal neurons to the study of neurotrophic action of peptides. // In: New Developments and New Applications in Animal Cell Technology, (1998) Ed: O.-W. Merten, P. Perrin and B. Griffits, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, P. 725-727.

2. И.А. Гривенников, O.B. Долотов, Ю.И. Гольдина. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. // Мол. Биол.-1999, Т. 33, № 1, С. 120-126.

3. Shadrina M.I., O.V. Dolotov, I.A. Grivennikov, L.S. Inozemtseva, L.A. Andreeva, P.A. Slominsky, S.A. Limborska, N.F. Myasoedov. Rapid and efficient NGF and BDNF mRNA induction in the rat glial cell cultures upon АСТЩ4-10) analog "Semax" action. // Neurosci. Lett.-2001, V. 308, P. 115118.

4. O.B. Долотов, T.C. Середенина, Н.Г. Левицкая, А.А. Каменский, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, И.Ю. Нагаев, Ю.А. Золотарев, И.А. Гривенников, Ю. Энгеле, Н.Ф. Мясоедов. Гептапептид Семакс стимулирует экспрессию BDNF в различных отделах мозга крысы in vivo. 11 Доклады Академии Наук.-2003, Т. 391, № 1, С. 131-134.

5. О.В. Долотов, Ю.А. Золотарев, Е.М. Дорохова, Л.А. Андреева, Л.Ю. Алфеева, И.А. Гривенников, Н.Ф. Мясоедов. Связывание аналога АСТН-(4-10)-гептапептида семакс с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы и его биодеградация. // Биоорг. Хим.-2004, Т. 30, №3, С. 241-246.

6. Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Myasoedov N.F., Black I.B. and Dreyfus C.F. Effects of a new behaviorally active ACTH analogue, Semax on cholinergic basal forebrain neurons. // Society for Neuroscience: 27th Annual Meeting,

USA, 1997, V. 354, № 13, P. 891.

7. O.B. Долотов, JI.C. Иноземцева, П.А. Сломинский, JI.A. Андреева, Ю.А. Золотарев, И.А. Гривенников. Исследование механизмов нейропротективного действия аналога АСТН (4-10) Семакса. // Сб. тезисов Школы-конференции молодых ученых "Горизонты физико-химической биологии". Пущино, 2000, С. 236.

8. О. Dolotov, Т. Seredenina, Е. Karpenko, Yu. Zolotarev, P. Slominsky, I. Grivennikov, N. Myasoedov. АСТЩ4-10) analog Semax increases neurotrophin expression in vitro and in vivo. // Proceedings of International Symposium "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals", Moscow, Russia, 2003, P. 62-63.

9. O.B. Долотов, T.C. Середенина, E.A. Карпенко, Л.С. Иноземцева, П.А. Сломинский, Л.А. Андеева, Ю.А. Золотарев, Н.Г. Левицкая, А.А. Каменский, И.А. Гривенников. Аналог АКТГ (4-10) Семакс специфически связывается с плазматическими мембранами мозга крысы и увеличивает экспрессию нейротрофинов в клетках мозга in vitro и in vivo. // Сб. тезисов Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Москва, 2003, С. 67.

10.Dolotov O.V., Rozyczka J., Karpenko E.A., Seredenina T.S., Inozemtseva L.S., Levitskaya N.G., Kamensky A.A., Grivennikov I.A., Myasoedov N.F., Engele J. Semax - an analogue of АСТЩ4-10) - stimulates BDNF expression in different areas of the rat brain. // 1st ISN Special Neurochemistry Conference: Changes in Neuronal Gene Expression and CNS Drug Responce. Avignon, France, 2004, P. 52.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в результате проведенной работы впервые показано существование связывающих центров для Семакса на плазматических мембранах мозга крысы. Получены характеристики связывания Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы.

Изучена биодеградация Семакса в присутствии плазматических мембран и культур клеток нейронов и нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы. Ранее была изучена деградация Семакса в присутствии плазмы крови [222], однако оставалась неизученной деградация Семакса в присутствии мишеней его действия - клеток ЦНС. Обнаружено, что биодеградация Семакса происходит и с С-, и с N-конца с соизмеримой скоростью. Присутствие в Семаксе последовательности -Pro-Gly-Pro не приводит к преобладанию продуктов деградации с N-конца в присутствии исследованных объектов и основным процессом является образование пентапептидов.

Обнаружено влияние Семакса на выживаемость холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга крысы in vitro.

Показано влияние Семакса на экспрессию нейротрофинов BDNF и NGF в клетках нейроглии базальных ядер переднего мозга крысы.

Обнаружено влияние Семакса на экспрессию BDNF и его рецепторов в ряде отделов мозга крысы при интраназальном введении. Полученные результаты подтверждают выдвинутую нами гипотезу о том, что регуляция экспрессии нейротрофинов и/или их рецепторов в клетках мозга является одним из возможных этапов ноотропного и нейропротекторного действия меланокортинов. На основании этих данных и известных поведенческих эффектов нейротрофинов нами выдвинуто предположение о существовании у Семакса антидепрессантной активности.

В совокупности, полученные данные расширяют представление о механизмах действия членов пептидного семейства меланокортинов и их функциях в организме. Сформулирована гипотеза о возможной компенсаторной роли N-концевых фрагментов АКТГ (эндогенных меланокортинов) в поддержании функций гиппокампа при стрессовых воздействиях на организм.

Полученные данные представляют научно-практический интерес в связи с тем, что регуляция экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в мозге рассматривается как один из перспективный путей воздействия на ряд патологических состояний ЦНС, связанных с дегенерацией и гибелью нейронов. В то же время, известные к настоящему времени соединения, которые могут рассматриваться как кандидаты на роль регуляторов экспрессии нейротрофинов в мозге, например, антидепрессанты, обладают негативными побочными эффектами, что ограничивает их применение [223], [224], [225]. Данные о влиянии Семакса на экспрессию нейротрофинов в мозге крысы позволяют предложить возможный механизм наблюдаемых ноотропных и нейропротекторных эффектов этого клинически применяемого пептида, что может найти применение при разработке новых пептидных фармакологических средств. Кроме того, полученные данные о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов могут предоставить дополнительную информацию для дальнейших клинических исследований Семакса в целях расширения спектра показаний и противопоказаний его применения.

Вместе с тем, остается практически неисследованным вопрос о природе связывающих центров для Семакса на клеточных мембранах и механизмах передачи сигнала от них внутрь клетки. Однако, полученные нами данные о регуляции Семаксом экспрессии нейротрофинов и их рецепторов в клетках ЦНС могут быть использованы для изучения этой проблемы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Долотов, Олег Валентинович, 2004 год

1. De Wied D., Jolles J. Neuropeptides derived from pro-opiocortin: behavioral, physiological, and neurochemical effects // Physiol. Rev. 1982. - V. 62, № 3, P. 976 - 1059.

2. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Kramer H.K., Strand F.L. Specificity versus redundancy of melanocortins in nerve regeneration // Ann .N Acad. Sci. -1994. V. 739, P. 60 - 73.

3. Пономарева-Степная M.A., Незавибатько В., Антонова Л., Андреева Л., Алфеева Л., Потаман В., Каменский А., Ашмарин И. Аналог АКТГ(4-10) стимулятор обучения пролонгированного действия // Хим.-фарм. ж. 1984. - Т. 18, № 7, С. 790- 795.

4. Mirsky I., Miller C., Stein M. Relation of adrenocortical activity and adaptive behavior 11 Psychosom. Med. 1953. - V. 15, № 6, P. 584 - 84.

5. Hoi E.M., Gispen W.H., Bar P.R. ACTH-related peptides: receptors and signal transduction systems involved in their neurotrophic and neuroprotective actions // Peptides. 1995. - V. 16, № 5, P. 979 - 993.

6. Zohar M., Salomon Y. Mechanism of action of melanocortin peptides. Possible role in astrocyte regulation // J. Mol. Neurosci. 1993. - V. 4, № 1, P. 55 - 62.

7. Adan R.A., Cone R.D., Burbach J.P., Gispen W.H. Differential effects of melanocortin peptides on neural melanocortin receptors // Mol. Pharmacol. -1994. у. 46, № 6, P. 1182 1190.

8. Hoi E.M., Verhage M., Gispen W.H., Bar P.R. The role of calcium and с AMP in the mechanism of action of two melanocortins: alpha MSH and the ACTH4-9 analogue Org 2766 // Brain Res. 1994. - V. 662, № 1-2, P.109 -116.

9. De Wied D., Witter A., Greven H.M. Commentary: behaviourally active ACTH analogues // Biochem. Pharmacol. 1975. - V. 24, № 16, P. 1463 - 1468.

10. Murphy J., Miller R.E. The effect of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol. 1955. - V. 48, № 1,P. 47-49.

11. Beckwith B. and Kastin A. / In: Peptide Hormones: Effects and Mechanisms of Action. Eds.: A. Negro-Vilar and P. Conn. Boca Raton: CRC Press, 1987. -P. 196-218.

12. Oliver C., Porter J.C. Distribution and characterization of alpha-melanocyte-stimulating hormone in the rat brain // Endocrinology. 1978.-V. 102, №3, P. 697-705.

13. Givelli О., Birnberg N., Herbert E. Detection and quantitation of proopiomelanocortin mRNA in pituitary and brain tissues from different species // J. Biol. Chem. 1982. - V. 297, P. 6783 - 6787.

14. Liotta A.S., Gildersleeve D., Brownstein M.J., Krieger D.T. Biosynthesis in vitro of immunoreactive 31,000-dalton corticotropin/beta-endorphin-like material by bovine hypothalamus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979. V. 76, №3, P. 1448- 1452.

15. Brownstein M.J. Localizing peptides in the central nervous system: a progress report // Adv. Biochem. Psychopharmacol. 1980. - V. 21, P. 365 -371.

16. Tranchand-Bunel D., Delbende C., Guy J., Jegou S., Jenks B.J., Mocaer

17. E., Pelletier G., Vaudry H. Pro-opiomelanocortin neuronal systems 11 Rev. Neurol. (Paris). 1987. - V. 143, № 6-7, P. 471 - 489.

18. Khachaturian H., Alessi N.E., Munfakh N., Watson S.J. Ontogeny of opioid and related peptides in the rat ens and pituitary: an immunocytochemical study // Life Sci. 1983. - V. 33 Suppl 1, P. 61 - 64.

19. Rius R.A., Chikuma Т., Loh Y.P. Prenatal processing of pro-opiomelanocortin in the brain and pituitary of mouse embryos // Brain Res. Dev. Brain Res. 1991. - V. 60, № 2, P. 179 - 185.

20. Gispen W.H., De Koning P., Kuiters R.R., Van der Z.e.C., Verhaagen J.

21. On the neurotrophic action of melanocortins // Prog. Brain Res. 1987. - V. 72, P. 319 - 331.

22. Peulve P., Laquerriere A., Hemet J., Tadie M. Comparative effect of alpha-MSH and b-FGF on neurite extension of fetal rat spinal cord neurons in culture // Brain Res. 1994. - V. 654, № 2, P. 319 - 323.

23. Van der Neut R., Bar P.R., Sodaar P., Gispen W.H. Trophic influences of alpha-MSH and ACTH4-10 on neuronal outgrowth in vitro // Peptides. 1988. -V. 9, №5, P. 1015- 1020.

24. Van der Neut R., Hoi E., Gispen W., Bar P. Stimulation by melanocortins of neurite outgrowth from spinal and sensory neurons in vitro // Peptides. 1992. -V. 13, №6, P. 1109- 1115.

25. Azmitia E.C., de Kloet E.R. ACTH neuropeptide stimulation of serotonergic neuronal maturation in tissue culture: modulation by hippocampal cells // Prog. Brain Res. 1987. - V. 72, P. 311 - 318.

26. Egles C., Rene F., Varon S., Louis J.C., Felix J.M., Schimchowitsch S.

27. Differentiation of rat hypothalamic dopaminergic neurons is stimulated in vitro by target cells: the melanotrophs // Eur. J. Neurosci. 1998. - V. 10, № 4, P. 1270- 1281.

28. Wikberg J.E.S. Melanocortin receptors: new opportunities in drug discovery // Exp. Opin. Ther. Patents. 2001. - V. 11, P. 1 - 16.

29. Sandman C.A., George J.M., Nolan J.D., van Riezen H., Kastin A.J.

30. Enhancement of attention in man with ACTH/MSH 4-10 // Physiol. Behav. -1975.-V. 15, №5, P. 427-431.

31. Fekete M., De Wied D. Dose-related facilitation and inhibition of passive avoidance behavior by the ACTH 4-9 analog (ORG 2766) // Pharmacol. Biochem. Behav. 1982. - V. 17, № 2, P. 177 - 182.

32. Wolterink G., van Ree J.M., van Nispen J.W., de Wied D. Structural modifications of the ACTH-(4-9) analog ORG 2766 yields peptides with high biological activity // Life Sci. 1991. - V. 48, № 2, P. 155 - 161.

33. Hock F.J., Gerhards H.J., Wiemer G., Usinger P., Geiger R. Learning and memory processes of an ACTH4-9 analog (ebiratide; Hoe 427) in mice and rats // Peptides. 1988. - V. 9, № 3, P. 575 - 581.

34. Siegfried K.R. First clinical impressions with an ACTH analog (HOE 427) inthe treatment of Alzheimer's disease // Ann. N Y Acad. Sci. 1991. - V. 640, P. 280 - 283.

35. Attella M.J., Hoffman S.W., Pilotte M.P., Stein D.G. Effects of BIM-22015, an analog of ACTH4-10, on functional recovery after frontal cortex injury // Behav. Neural. Biol. 1992. - V. 57, № 2, P. 157 - 166.

36. Ashmarin I.P., Nezavibat'ko V.N., Levitskaya N.G., Koshelev V.B., Kamensky A.A. Desing and investigation of АСТЩ4-10) analog deprived of D-aminoacids and hydrophobic radicals // Neuroscience Research Communications. 1995. - V. 16, P. 105 - 112.

37. Яковлева E.B., Кузенков B.C., Федоров B.H., Скворцова В.И., Кошелев В.Б., Гусев Е.И., Ашмарин И.П. Исследование эффективности семакса при глобальной ишемии мозга in vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. - Т. 127, С. 172 - 174.

38. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Nezavibatko V.N.

39. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study // Peptides. 1993. - V. 14, № 3, P. 491 - 495.

40. Левицкая Н.Г., Себенцова E.A., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф.

41. Исследование нейротропной активности продуктов ферментативной деградации семакса // Доклады Академии Наук. 2000. - Т. 372, С. 268 -271.

42. Скворцова В.И., Насонов Е.Л., Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И., Мясоедов Н.Ф., Гусев Е.И.

43. Клинико-иммунобиохимический мониторинг факторов локального воспаления в остром периоде полушарного ишемического инсульта // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1999. - Т. 99, С. 27

44. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Журавлева Е.Ю., Андреева JI.A., Незавибатько В.Н., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Способ лечения ишемического инсульта // Патент № 2124365. 1999. - Бюлл. 1.

45. Гусев Е.И. and Скворцова В.И. // Ишемия головного мозга. М.: Медицина. 2001. - 276 с.

46. Yuen Е.С., Howe C.L., Li Y., Holtzman D.M., Mobley W.C. Nerve growth factor and the neurotrophic factor hypothesis // Brain Dev. 1996. - V. 18, № 5, P. 362 - 368.

47. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later // Science. 1987. -V. 237, №4819, P. 1154- 1162.

48. Leibrock J., Lottspeich F., Hohn A., Hofer M., Hengerer В., Masiakowski P., Thoenen H., Barde Y.A. Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor//Nature. 1989. - V. 341, № 6238, P. 149 - 152.

49. Hohn A., Leibrock J., Bailey K., Barde Y.A. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family // Nature. 1990. - V. 344, № 6264, P. 339 - 341.

50. Maisonpierre P.C., Belluscio L., Squinto S., Ip N.Y., Furth M.E., Lindsay R.M., Yancopoulos G.D. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF // Science. 1990. - V. 247, № 4949 Pt 1, P. 1446 - 1451.

51. Rosenthal A., Goeddel D.V., Nguyen Т., Lewis M., Shih A., Laramee G.R.,

52. Nikolics К., Winslow J.W. Primary structure and biological activity of a novel human neurotrophic factor // Neuron. 1990. - V. 4, № 5, P. 767 - 773.

53. Hallbook F., Ibanez C.F., Persson H. Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary // Neuron. 1991. - V. 6, № 5, P. 845 - 858.

54. Gotz R., Koster R., Winkler C., Raulf F., Lottspeich F., Schartl M., Thoenen H. Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family // Nature. 1994. - V. 372, № 6503, P. 266 - 269.

55. Nilsson A.S., Fainzilber M., Falck P., Ibanez C.F. Neurotrophin-7: a novel member of the neurotrophin family from the zebrafish // FEBS Lett. 1998. - V. 424, № 3, P. 285 - 290.

56. Isackson P.J., Towner M.D., Huntsman M.M. Comparison of mammalian, chicken and Xenopus brain-derived neurotrophic factor coding sequences // FEBS Lett. 1991. - V. 285, № 2, P. 260 - 264.

57. Gotz R., Schartl M. The conservation of neurotrophic factors during vertebrate evolution // Сотр. Biochem. Physiol. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1994. - V. 108, № 1, P. 1 - 10.

58. Hofer M., Pagliusi S.R., Hohn A., Leibrock J., Barde Y.A. Regional distribution of brain-derived neurotrophic factor mRNA in the adult mouse brain // EMBO J. 1990. - V. 9, № 8, P. 2459 - 2464.

59. Rosenthal A., Goeddel D.V., Nguyen Т., Martin E., Burton L.E., Shih A.,1.ramee G.R., Wurm F., Mason A., Nikolics K. Primary structure and biological activity of human brain-derived neurotrophic factor // Endocrinology. 1991.-V. 129, №3, P. 1289- 1294.

60. Angeletti R.H., Bradshaw R.A. Nerve growth factor from mouse submaxillary gland: amino acid sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1971. -V. 68, № 10, P. 2417-2420.

61. McDonald N.Q., Hendrickson W.A. A structural superfamily of growth factors containing a cystine knot motif// Cell. 1993. - V. 73, № 3, P. 421 - 424.

62. Bothwell M.A., Shooter E.M. Dissociation equilibrium constant of beta nerve growth factor // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252, № 23, P. 8532 - 8536.

63. McDonald N.Q., Blundell T.L. Crystallization and characterization of the high molecular weight form of nerve growth factor (7 S NGF) // J. Mol. Biol. -1991. V. 219, № 4, P. 595 - 601.

64. Gnahn H., Hefti F., Heumann R., Schwab M.E., Thoenen H.

65. NGF-mediated increase of choline acetyltransferase (ChAT) in the neonatal rat forebrain: evidence for a physiological role of NGF in the brain? // Brain Res. -1983.-V. 285, № 1,P. 45 -52.

66. Martinez H.J., Dreyfus C.F., Jonakait G.M., Black I.B. Nerve growth factor promotes cholinergic development in brain striatal cultures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985. V. 82, № 22, P. 7777 - 7781.

67. Mobley W.C., Rutkowski J.L., Tennekoon G.I., Buchanan K., Johnston M.V. Choline acetyltransferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor // Science. 1985. - V. 229, № 4710, P. 284 - 287.

68. Johnson EM J.r., Gorin P.D., Brandeis L.D., Pearson J. Dorsal root ganglion neurons are destroyed by exposure in utero to maternal antibody tonerve growth factor // Science. 1980. - V. 210, № 4472, P. 916 - 918.

69. Alderson R.F., Alterman A.L., Barde Y.A., Lindsay R.M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture // Neuron. 1990. - V. 5, № 3, P. 297 - 306.

70. Hyman C., Hofer M., Barde Y.A., Juhasz M., Yancopoulos G.D., Squinto S.P., Lindsay R.M. BDNF is a neurotrophic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra//Nature. 1991. - V. 350, № 6315, P. 230 - 232.

71. Johnson J.E., Barde Y.A., Schwab M., Thoenen H. Brain-derived neurotrophic factor supports the survival of cultured rat retinal ganglion cells // J. Neurosci. 1986. - V. 6, № 10, P. 3031 - 3038.

72. Oppenheim R.W., Yin Q.W., Prevette D., Yan Q. Brain-derived neurotrophic factor rescues developing avian motoneurons from cell death // Nature. 1992. - V. 360, № 6406, P. 755 - 757.

73. Davies A.M. The survival and growth of embryonic proprioceptive neurons is promoted by a factor present in skeletal muscle // Dev. Biol. 1986. - V. 115, № 1,P. 56-67.

74. Yan Q., Elliott J.L., Matheson C., Sun J., Zhang, L., Ми X., Rex K.L., Snider W.D. Influences of neurotrophins on mammalian motoneurons in vivo // J. Neurobiol. 1993. - V. 24, № 12, P. 1555 - 1577.

75. Mamounas L.A., Blue M.E., Siuciak J.A., Altar C.A. Brain-derived neurotrophic factor promotes the survival and sprouting of serotonergic axons in rat brain // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 12, P. 7929 - 7939.

76. Ventimiglia R., Mather P.E., Jones B.E., Lindsay R.M. The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4/5 promote survival and morphological and biochemical differentiation of striatal neurons in vitro // Eur. J. Neurosci. 1995. - V. 7, № 2,1. P. 213 -222.

77. Segal R.A., Takahashi H., McKay R.D. Changes in neurotrophin responsiveness during the development of cerebellar granule neurons // Neuron. -1992. V. 9, № 6, P. 1041 - 1052.

78. Davies A.M., Horton A., Burton L.E., Schmelzer C., Vandlen R., Rosenthal A. Neurotrophin-4/5 is a mammalian-specific survival factor for distinct populations of sensory neurons // J. Neurosci. 1993. - V. 13, № 11, P. 4961 - 4967.

79. Bibel M., Barde Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system // Genes Dev. 2000. - V. 14, № 23, P. 2919 -2937.

80. Roux P.P., Colicos M.A., Barker P.A., Kennedy Т.Е. p75 neurotrophin receptor expression is induced in apoptotic neurons after seizure // J. Neurosci. -1999. V. 19, № 16, P. 6887 - 6896.

81. Jing S., Tapley P., Barbacid M. Nerve growth factor mediates signal transduction through trk homodimer receptors // Neuron. 1992. - V. 9, № 6, P. 1067- 1079.

82. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde Y.A. Binding of brain-derived neurotrophic factor to the nerve growth factor receptor // Neuron. 1990. - V. 4, № 4, P. 487 - 492.

83. Anton E.S., Weskamp G., Reichardt L.F., Matthew W.D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994. V. 91, № 7, P. 2795 - 2799.

84. Carter B.D., Kaltschmidt C., Kaltschmidt В., Offenhauser N., Bohm-Matthaei R., Baeuerle P.A., Barde Y.A. Selective activation of NF-kappa В by nerve growth factor through the neurotrophin receptor p75 // Science. 1996. - V. 272, № 5261, P. 542 - 545.

85. Rabizadeh S., Oh J., Zhong L.T., Yang J., Bitler C.M., Butcher L.L., Bredesen D.E. Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor // Science. 1993. - V. 261, № 5119, P. 345 - 348.

86. Casaccia-Bonnefil P., Carter B.D., Dobrowsky R.T., Chao M.V. Death of oligodendrocytes mediated by the interaction of nerve growth factor with its receptor p75 // Nature. 1996. - V. 383, № 6602, P. 716 - 719.

87. Frade J.M., Rodriguez-Tebar A., Barde Y.A. Induction of cell death by endogenous nerve growth factor through its p75 receptor // Nature. 1996. - V.383, №6596, P. 166- 168.

88. Davey F., Davies A.M. TrkB signalling inhibits p75-mediated apoptosis induced by nerve growth factor in embryonic proprioceptive neurons // Curr. Biol. 1998. - V. 8, № 16, P. 915 - 918.

89. Bibel M., Barde Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system // Genes Dev. 2000. - V. 14, № 23, P. 2919 -2937.

90. Conover J.C., Yancopoulos G.D. Neurotrophin regulation of the developing nervous system: analyses of knockout mice // Rev. Neurosci. 1997. - V. 8, № 1,P. 13-27.

91. Liu X., Ernfors P., Wu H., Jaenisch R. Sensory but not motor neuron deficits in mice lacking NT4 and BDNF // Nature. 1995. - V. 375, № 6528, P. 238-241.

92. Barde Y.A., Edgar D., Thoenen H. Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain // EMBO J. 1982. - V. 1, № 5, P. 549 - 553.

93. Robinson R.C., Radziejewski C., Stuart D.I., Jones E.Y. Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer // Biochemistry. -1995. V. 34, № 13, P. 4139 - 4146.

94. Henderson C.E. Role of neurotrophic factors in neuronal development // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. - V. 6, № 1, P. 64 - 70.

95. Collazo D., Takahashi H., McKay R.D. Cellular targets and trophicfunctions of neurotrophin-3 in the developing rat hippocampus // Neuron. -1992. V. 9, № 4, P. 643 - 656.

96. Buchman V.L., Davies A.M. Different neurotrophins are expressed and act in a developmental sequence to promote the survival of embryonic sensory neurons // Development. 1993. - V. 118, № 3, P. 989 - 1001.

97. Nawa H., Bessho Y., Carnahan J., Nakanishi S., Mizuno K. Regulation of neuropeptide expression in cultured cerebral cortical neurons by brain-derived neurotrophic factor // J. Neurochem. 1993. - V. 60, № 2, P. 772 - 775.

98. Korte M., Carroll P., Wolf E., Brem G., Thoenen H., Bonhoeffer T.

99. Hippocampal long-term potentiation is impaired in mice lacking brain-derived neurotrophic factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995. V. 92, № 19, P. 8856 - 8860.

100. Kernie S.G., Liebl D.J., Parada L.F. BDNF regulates eating behavior andlocomotor activity in mice // EMBO J. 2000. - V. 19, № 6, P. 1290 - 1300.

101. Acheson A., Barker P.A., Alderson R.F., Miller F.D., Murphy R.A.

102. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF // Neuron. 1991. - V. 7, № 2, P. 265 -275.

103. Wetmore C., Ernfors P., Persson H., Olson L. Localization of brain-derived neurotrophic factor mRNA to neurons in the brain by in situ hybridization // Exp. Neurol. 1990. - V. 109, № 2, P. 141 - 152.

104. Yamamoto H., Gurney M.E. Human platelets contain brain-derived neurotrophic factor // J. Neurosci. 1990. - V. 10, № 11, P. 3469 - 3478.

105. Katoh-Semba R., Takeuchi I.K., Semba R., Kato K. Distribution of brain-derived neurotrophic factor in rats and its changes with development in the brain // J. Neurochem. 1997. - V. 69, № 1, P. 34 - 42.

106. Narisawa-Saito M., Nawa H. Differential regulation of hippocampal neurotrophins during aging in rats // J. Neurochem. 1996. - V. 67, № 3, P. 1124- 1131.

107. Yan Q., Rosenfeld R.D., Matheson C.R., Hawkins N., Lopez O.T., Bennett L., Welcher A. A. Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system // Neuroscience. 1997. - V. 78, №2, P. 431 -448.

108. Yan Q., Radeke M.J., Matheson C.R., Talvenheimo J., Welcher A.A., Feinstein S.C. Immunocytochemical localization of TrkB in the central nervous system of the adult rat // J. Сотр. Neurol. 1997. - V. 378, № 1, P. 135 - 157.

109. Alderson R.F., Curtis R., Alterman A.L., Lindsay R.M., DiStefano P.S.

110. Truncated TrkB mediates the endocytosis and release of BDNF and neurotrophin-4/5 by rat astrocytes and Schwann cells in vitro // Brain Res. -2000. V. 871, № 2, P. 210 - 222.

111. Tao X., Finkbeiner S., Arnold D.B., Shaywitz A.J., Greenberg M.E. Ca2+ influx regulates BDNF transcription by a CREB family transcription factor-dependent mechanism // Neuron. 1998. - V. 20, № 4, P. 709 - 726.

112. Shaywitz A.J., Greenberg M.E. CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals // Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68, P. 821 - 861.

113. Timmusk Т., Palm K., Metsis M., Reintam Т., Paalme V., Saarma M., Persson H. Multiple promoters direct tissue-specific expression of the rat BDNF gene // Neuron. 1993. - V. 10, № 3, P. 475 - 489.

114. Tongiorgi E., Righi M., Cattaneo A. Activity-dependent dendritic targeting of BDNF and TrkB mRNAs in hippocampal neurons // J. Neurosci. 1997. - V. 17, №24, P. 9492-9505.

115. West A.E., Chen W.G., Dalva M.B., Dolmetsch R.E., Kornhauser J.M., Shaywitz A.J., Takasu M.A., Tao X., Greenberg M.E. Calcium regulation of neuronal gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001. V. 98, № 20,1. P. 11024- 11031.

116. Tao X., West A.E., Chen W.G., Corfas G., Greenberg M.E. Acalcium-responsive transcription factor, CaRF, that regulates neuronal activity-dependent expression of BDNF //Neuron. 2002. - V. 33, № 3, P. 383 -395.

117. Schlessinger J., Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases // Neuron. 1992. - V. 9, № 3, P. 383 - 391.

118. Segal R.A., Greenberg M.E. Intracellular signaling pathways activated by neurotrophic factors // Annu. Rev. Neurosci. 1996. - V. 19, P. 463 - 489.

119. Stephens R.M., Loeb D.M., Copeland T.D., Pawson Т., Greene L.A., Kaplan D.R. Trk receptors use redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC-gamma 1 to mediate NGF responses // Neuron. 1994. -V. 12, №3, P. 691 -705.

120. Qian X., Riccio A., Zhang Y., Ginty D.D. Identification and characterization of novel substrates of Trk receptors in developing neurons // Neuron. 1998. - V. 21, № 5, P. 1017 - 1029.

121. Iwasaki Y., Gay В., Wada K., Koizumi S. Association of the Src family tyrosine kinase Fyn with TrkB // J. Neurochem. 1998. - V. 71, № 1, P. 106 -111.

122. Finkbeiner S., Tavazoie S.F., Maloratsky A., Jacobs K.M., Harris K.M., Greenberg M.E. CREB: a major mediator of neuronal neurotrophin responses //

123. Neuron. 1997. - V. 19, № 5, P. 1031 - 1047.

124. Bova R., Micheli M.R., Qualadrucci P., Zucconi G.G. BDNF and trkB mRNAs oscillate in rat brain during the light-dark cycle // Brain Res. Mol. Brain Res. 1998. - V. 57, № 2, P. 321 - 324.

125. Berchtold N.C., Oliff H.S., Isackson P., Cotman C.W. Hippocampal BDNF mRNA shows a diurnal regulation, primarily in the exon III transcript // Brain Res. Mol. Brain Res. 1999. - V. 71, № 1, P. 11 - 22.

126. Neeper S.A., Gomez-Pinilla F., Choi J., Cotman C. Exercise and brain neurotrophins // Nature. 1995. - V. 373, № 6510, P. 109.

127. Neeper S.A., Gomez-Pinilla F., Choi J., Cotman C.W. Physical activity increases mRNA for brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor in rat brain // Brain Res. 1996. - V. 726, № 1-2, P. 49 - 56.

128. Castren E., Zafra F., Thoenen H., Lindholm D. Light regulates expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat visual cortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. V. 89, № 20, P. 9444 - 9448.

129. Rocamora N., Welker E., Pascual M., Soriano E. Upregulation of BDNF mRNA expression in the barrel cortex of adult mice after sensory stimulation // J. Neurosci. 1996. - V. 16, № 14, P. 4411 - 4419.

130. Dudar J.D., Whishaw I.Q., Szerb J.C. Release of acetylcholine from the hippocampus of freely moving rats during sensory stimulation and running // Neuropharmacology. 1979. - V. 18, № 8-9, P. 673 - 678.

131. Mizuno Т., Endo Y., Arita J., Kimura F. Acetylcholine release in the rat hippocampus as measured by the microdialysis method correlates with motor activity and exhibits a diurnal variation // Neuroscience. 1991. - V. 44, № 3, P. 607-612.

132. Mizuno Т., Arita J., Kimura F. Spontaneous acetylcholine release in the hippocampus exhibits a diurnal variation in both young and old rats // Neurosci. Lett. 1994. - V. 178, № 2, P. 271 - 274.

133. Boatell L.L., Lindefors N., Ballarin M., Ernfors P., Mahy N., Persson H.

134. Activation of basal forebrain cholinergic neurons differentially regulates brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in different projection areas // Neurosci. Lett. 1992. - V. 136, № 2, P. 203 - 208.

135. Lindefors N., Ernfors P., Falkenberg Т., Persson H. Septal cholinergic afferents regulate expression of brain-derived neurotrophic factor and beta-nerve growth factor mRNA in rat hippocampus // Exp. Brain Res. 1992. - V. 88, № 1,P. 78-90.

136. Lapchak P.A., Araujo D.M., Hefti F. Cholinergic regulation of hippocampal brain-derived neurotrophic factor mRNA expression: evidence from lesion and chronic cholinergic drug treatment studies // Neuroscience. -1993.-V. 52, №3, P. 575 585.

137. Liang F.Q., Walline R., Earnest D.J. Circadian rhythm of brain-derived neurotrophic factor in the rat suprachiasmatic nucleus // Neurosci. Lett. 1998. -V. 242, № 2, P. 89 - 92.

138. Schaaf M.J., Duurland R., de Kloet E.R., Vreugdenhil E. Circadian variation in BDNF mRNA expression in the rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. 2000. - V. 75, № 2, P. 342 - 344.

139. Cirelli C., Tononi G. Differential expression of plasticity-related genes in waking and sleep and their regulation by the noradrenergic system // J Neurosci. 2000. - V. 20, № 24, P. 9187 - 9194.

140. Ernfors P., Persson H. Developmentally Regulated Expression of HDNF/NT-3 mRNA in Rat Spinal Cord Motoneurons and Expression of BDNF mRNA in Embryonic Dorsal Root Ganglion // Eur. J. Neurosci. 1991. - V. 3, №10, P. 953 -961.

141. Lindvall O., Kokaia Z., Bengzon J., Elmer E., Kokaia M. Neurotrophic and brain insults // Trends Neurosci. 1994. - V. 17, № 11, P. 490 - 496.

142. Smith M.A., Makino S., Kvetnansky R., Post R.M. Stress and glucocorticoids affect the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in the hippocampus // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 3 Pt 1,P. 1768 - 1777.

143. Thoenen H., Zafra F., Hengerer В., Lindholm D. The synthesis of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in hippocampal and cortical neurons is regulated by specific transmitter systems // Ann. N Y Acad. Sci. -1991.-V. 640, P. 86-90.

144. Heese K., Otten U., Mathivet P., Raiteri M., Marescaux C., Bernasconi R.

145. Obrietan K., Gao X.B., Van Den P.o.A. Excitatory actions of GAB Aincrease BDNF expression via a MAPK-CREB-dependent mechanism—a positive feedback circuit in developing neurons // J. Neurophysiol. 2002. - V. 88, №2, P. 1005- 1015.

146. Bessho Y., Nakanishi S., Nawa H. Glutamate receptor agonists enhance the expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule cells // Brain Res. Mol. Brain Res. 1993. - V. 18, № 3, P. 201 - 208.

147. Sohrabji Г., Miranda R.C., Toran-Allerand C.D. Identification of a putative estrogen response element in the gene encoding brain-derived neurotrophic factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995. V. 92, № 24, P. 11110-11114.

148. Oliff H.S., Berchtold N.C., Isackson P., Cotman C.W. Exercise-induced regulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) transcripts in the rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. 1998. - V. 61, № 1-2, P. 147 - 153.

149. Barbany G., Persson H. Regulation of Neurotrophin mRNA Expression in the Rat Brain by Glucocorticoids // Eur. J. Neurosci. 1992. - V. 4, № 5, P. 396 -403.

150. Rage F., Givalois L., Marmigere F., Tapia-Arancibia L., Arancibia S.1.mobilization stress rapidly modulates BDNF mRNA expression in the hypothalamus of adult male rats // Neuroscience. 2002. - V. 112, № 2, P. 309 -318.

151. MacLennan A.J., Lee N., Walker D.W. Chronic ethanol administration decreases brain-derived neurotrophic factor gene expression in the rat hippocampus //Neurosci. Lett. 1995. - V. 197, № 2, P. 105 - 108.

152. Baek J.K., Heaton M.B., Walker D.W. Chronic alcohol ingestion: nerve growth factor gene expression and neurotrophic activity in rat hippocampus // Alcohol Clin. Exp. Res. 1994. - V. 18, № 6, P. 1368 - 1376.

153. Yu J., Pizzo D.P., Hutton L.A., Perez-Polo J.R. Role of the cholinergic system in the regulation of neurotrophin synthesis // Brain Res. 1995. - V. 705, № 1-2, P. 247 - 252.

154. French S.J., Humby Т., Horner C.H., Sofroniew M.Y., Rattray M.

155. Hippocampal neurotrophin and trk receptor mRNA levels are altered by local administration of nicotine, carbachol and pilocarpine // Brain Res. Mol. Brain Res. 1999. - V. 67, № 1, P. 124 - 136.

156. Kenny P. J., File S.E., Rattray M. Acute nicotine decreases, and chronic nicotine increases the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. 2000. - V. 85, № 1-2, P. 234 -238.

157. Hutter P., Johansson M., Saria A., Humpel C. Acute and chronic noradrenergic regulation of neurotrophin messenger RNA expression in rat hippocampus: evidence from lesions and organotypic cultures //Neuroscience. -1996.-V. 70, № 1,P. 15-29.

158. Nibuya M., Morinobu S., Duman R.S. Regulation of BDNF and trkB mRNA in rat brain by chronic electroconvulsive seizure and antidepressant drug treatments // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 11, P. 7539 - 7547.

159. Nibuya M., Nestler E.J., Duman R.S. Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rat hippocampus // J. Neurosci. 1996. - V. 16, № 7, P. 2365 - 2372.

160. Okazawa H., Murata M., Watanabe M., Kamei M., Kanazawa I.

161. Dopaminergic stimulation up-regulates the in vivo expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the striatum // FEBS Lett. 1992. - V. 313, № 2, P. 138- 142.

162. Zhou A.W., Li W.X., Guo J., Du Y.C. Facilitation of AVP(4-8) on gene expression of BDNF and NGF in rat brain // Peptides. 1997. - V. 18, № 8, P. 1179- 1187.

163. Pellegri G., Magistretti P. J., Martin J.L. VIP and PACAP potentiate the action of glutamate on BDNF expression in mouse cortical neurones // Eur. J. Neurosci. 1998. - V. 10, № 1, P. 272 - 280.

164. Zafra F., Hengerer В., Leibrock J., Thoenen H., Lindholm D. Activity dependent regulation of BDNF and NGF mRNAs in the rat hippocampus is mediated by non-NMDA glutamate receptors // EMBO J. 1990. - V. 9, № 11, P. 3545 - 3550.

165. Miranda R.C., Sohrabji F., Toran-Allerand D. Interactions of estrogen with the neurotrophins and their receptors during neural development // Horm. Behav. 1994. - V. 28, № 4, P. 367 - 375.

166. Gibbs R.B. Levels of trkA and BDNF mRNA, but not NGF mRNA, fluctuate across the estrous cycle and increase in response to acute hormone replacement // Brain Res. 1998. - V. 787, № 2, P. 259 - 268.

167. Evans R.M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily // Science. 1988. - V. 240, № 4854, P. 889 - 895.

168. O'Malley B. The steroid receptor superfamily: more excitement predicted for the future // Mol. Endocrinol. 1990. - V. 4, № 3, P. 363 - 369.

169. Solum D.T., Handa R.J. Estrogen regulates the development of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the rat hippocampus // J. Neurosci. 2002. - V. 22, № 7, P. 2650 - 2659.

170. Du Y.C., Yan Q.W., Qiao L.Y. Function and molecular basis of action of vasopressin 4-8 and its analogues in rat brain // Prog Brain Res. 1998. - V. 119, P. 163 - 175.

171. Brenneman D.E., Westbrook G.L., Fitzgerald S.P., Ennist D.L., Elkins K.L., Ruff M.R., Pert C.B. Neuronal cell killing by the envelope protein of HIV and its prevention by vasoactive intestinal peptide // Nature. 1988. - V. 335, №6191, P. 639-642.

172. Said S.I. Molecules that protect: the defense of neurons and other cells // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97, № 10, P. 2163 - 2164.

173. Gray E.G., Whittaker V.P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation // J. Anat. 1962. - V. 96, P. 79 - 88.

174. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable // Anal. Biochem. 1977. - V. 83, № 2, P. 346 - 356.

175. Cole R. and de Vellis J. / In: A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System. Eds.: A. Shahar and J. de Vellis. New-York: Wiley-Liss, 1989.-P. 121 -133.

176. Hefti F., Hartikka J. and J. S.-R. / In: A Dissection and Tissue Culture

177. Manual of the Nervous System. Eds.: A. Shahar and J. de Vellis. New-York: Wiley-Liss, 1989. - P. 172 -182.

178. Freshney R. // Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique. New-York: Wiley-Liss, 1994. 486 p.

179. Perry R.J., Hodges J.R. Attention and executive deficits in Alzheimer's disease. A critical review // Brain. 1999. - V. 122, P. 383 - 404.

180. Кост H.B., Соколов О.Ю., Габаева M.B., Гривенников И.A., Андреева JI.A., Мясоедов Н.Ф., Зозуля А.А. Ингибирующее действие семакса и селаика на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека // Биоорг. хим. 2001. - Т. 27, № 3, С. 180- 183.

181. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibat'ko V.N. Entry of the synthetic АСТЩ4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection // Neurosci. Lett. -1991.-V. 127, P. 133 136.

182. Доклады Академии Наук. 2003. - Т. 391, № 1, С. 131 - 134.

183. Altar С.A., Cai N., Bliven Т., Juhasz М., Conner J.M., Acheson A.L., Lindsay R.M., Wiegand S.J. Anterograde transport of brain-derived neurotrophic factor and its role in the brain // Nature. 1997. - V. 389, № 6653, P. 856 - 860.

184. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats // Stroke. 1993. - V. 24, № 12, P. 2002 - 8; discussion 2008-9.

185. Lindsay R.M. Neurotrophic growth factors and neurodegenerative diseases: therapeutic potential of the neurotrophins and ciliary neurotrophic factor // Neurobiol. Aging. 1994. - V. 15, № 2, P. 249 - 251.

186. Felling R.J., Levison S.W. Enhanced neurogenesis following stroke // J. Neurosci. Res. 2003. - V. 73, № 3, P. 277 - 283.

187. Minichiello L., Korte M., Wolfer D., Kuhn R., Unsicker K., Cestari V., Rossi-Arnaud C., Lipp H.P., Bonhoeffer Т., Klein R. Essential role for TrkB receptors in hippocampus-mediated learning // Neuron. 1999. - V. 24, № 2, P. 401-414.

188. Kovalchuk Y., Hanse E., Kafitz K.W., Konnerth A. Postsynaptic Induction of BDNF-Mediated Long-Term Potentiation // Science. 2002. - V. 295, №5560, P. 1729- 1734.

189. Hall J., Thomas K.L., Everitt B.J. Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning // Nat. Neurosci. -2000. V. 3, № 6, P. 533 - 535.

190. Mizuno M., Yamada K., Olariu A., Nawa H., Nabeshima T. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats // J. Neurosci. 2000. - V. 20, № 18,P. 7116-7121.

191. Mu J.S., Li W.P., Yao Z.B., Zhou X.F. Deprivation of endogenous brain-derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats // Brain Res. 1999. - V. 835, № 2, P. 259 - 265.

192. Knapp R.J., Goldenberg R., Shuck C., Cecil A., Watkins J., Miller C., Crites G., Malatynska E. Antidepressant activity of memory-enhancing drugs in the reduction of submissive behavior model // Eur. J. Pharmacol. 2002. - V. 440, № 1,P. 27-35.

193. Nowakowska E., Chodera A., Kus K. Anxiolytic and memory improvingactivity of fluoxetine // Pol. J. Pharmacol. 1996. - V. 48, № 3, P. 255 - 260.

194. Shirayama Y., Chen A.C., Nakagawa S., Russell D.S., Duman R.S.

195. Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression // J. Neurosci. 2002. - V. 22, № 8, P. 3251 - 3261.

196. Duman R.S., Heninger G.R., Nestler E.J. A molecular and cellular theory of depression // Arch. Gen. Psychiatry. 1997. - V. 54, № 7, P. 597 - 606.

197. Jorge R.E., Robinson R.G., Arndt S., Starkstein S. Mortality and poststroke depression: a placebo-controlled trial of antidepressants // Am. J. Psychiatry. 2003. - V. 160, № 10, P. 1823 - 1829.

198. Ткачук B.A. // Введение в молекулярную эндокринологию. М.: Изд-во МГУ.- 1983. 256 с.

199. Marmigere F., Givalois L., Rage F., Arancibia S., Tapia-Arancibia L.

200. Rapid induction of BDNF expression in the hippocampus during immobilization stress challenge in adult rats // Hippocampus. 2003. - V. 13, № 5, P. 646 - 655.

201. Ferrer I., Ballabriga J., Marti E., Perez E., Alberch J., Arenas E. BDNF up-regulates TrkB protein and prevents the death of CA1 neurons following transient forebrain ischemia // Brain Pathol. 1998. - V. 8, № 2, P. 253 - 261.

202. Rose C.R., Blum R., Pichler В., Lepier A., Kafitz K.W., Konnerth A.

203. Truncated TrkB-Tl mediates neurotrophin-evoked calcium signalling in glia cells // Nature. 2003. - V. 426, № 6962, P. 74 - 78.

204. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitskaya N.G.,

205. Nezavibat'ko V.N. N-terminal degradation of АСТЩ4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1991.-V. 176, P. 741 -746.

206. Jick H., Kaye J.A., Jick S.S. Antidepressants and the risk of suicidal behaviors // JAMA. 2004. - V. 292, № 3, P. 338 - 343.

207. Rothschild A.J. Sexual side effects of antidepressants // J. Clin. Psychiatry. -2000. -V. 61 Suppl 11, P. 28-36.

208. Bourin M., Briley M. Sedation, an unpleasant, undesirable and potentially dangerous side-effect of many psychotropic drugs // Hum. Psychopharmacol. -2004. V. 19, № 2, P. 135 - 139.