«Сравнительное фармакогностическое исследование корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.)» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Рыбалко Майя Викторовна

• Рыбалко Майя Викторовна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Рыбалко Майя Викторовна

2 Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИИ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ и марены СЕРДЦЕЛИСТНОЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Историческая справка

1.2. Ботаническая характеристика видов рода Марена

1.2.1. Ботаническое описание марены красильной

1.2.2. Ботаническое описание марены сердцелистной

1.3. Сравнительная характеристика основных видов, рода марена, применяемых в медицине

1.4. Ареал и условия произрастания видов марены

1.5. Ареал марены красильной и марены сердцелистной

1.6. Заготовка и первичная обработка корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной

1.7. Микроскопия корневищ с корнями марены красильной

1.8. Микроскопия корневищ и корней марены сердцелистной

1.9. Химический состав марены красильной

1.10. Химический состав марены сердцелистной

1.11. Стандартизация сырья и препаратов марены красильной и марены сердцелистной

1.11.1. Качественные реакции

1.11.2. Количественное определение

1.12. Числовые показатели корневищ и корней марены красильной

1.13. Числовые показатели корневищ и корней марены сердцелистной

1.14. Применение корневищ и корней марены красильной в научной и народной медицине

1.15. Применение корневищ и корней марены сердцелистной в научной и народной медицине

1.16. Ограничения и противопоказания к применению корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методика морфолого-анатомического анализа

2.2.2. Химические методы анализа

2.2.3. Хроматографические методы анализа

2.2.4. Физико-химические методы анализа

2.2.5. Методы получения экстракционных лекарственных препаратов

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНОЕ МОРФОЛОГО-АНАТОМИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ И МАРЕНЫ СЕРДЦЕЛИСТНОЙ

3.1. Сравнительное морфолого-анатомическое исследование

корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 4. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ МАРЕНЫ

КРАСИЛЬНОЙ (RUBIA TINCTORUML.) И МАРЕНЫ СЕРДЦЕЛИСТНОЙ

(RUBIA CORDIFOLIA L.)

4.1. Предварительное фитохимическое исследование сырья марены

красильной и марены сердцелистной

4.1.1. Метод тонкослойной хроматографии

4.1.2. Метод спектрофотометрии

4.2. Выделение индивидуальных веществ из корневищ и корней марены

красильной

4.3. Выделение индивидуальных веществ из корневищ и корней марены

сердцелистной

4.4. Исследование фракций, содержащих перспективные индивидуальные

вещества, выделенные из корневищ и корней марены красильной

4.5. Исследование фракций, содержащих перспективные индивидуальные

вещества, выделенные из корневищ и корней марены сердцелистной

4.6. Идентификация выделенных веществ и их характеристики

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КАЧЕСТВЕННОГО И

КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ МАРЕНЫ

КРАСИЛЬНОЙ И МАРЕНЫ СЕРДЦЕЛИСТНОЙ

5.1. Качественный анализ корневищ и корней марены красильной и марены

сердцелистной

5.1.1. Метод тонкослойной хроматографии

5.1.2. Метод спектросфотометрии

5.1.3. Метод ИК-спектроскопии

5.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в

корневищах и конях марены красильной

5.3. Количественное определение суммы антраценпроизводных в

корневищах и конях марены сердцелистной

5.4. Числовые показатели для корневищ и корней марены красильной,

марены сердцелистной

5.5. Валидационные характеристики методик количественного определения

антраценпроизводных марены красильной и марены сердцелистной

5.6. Количественное определение суммы антраценпроизводных в

лекарственном препарате «Марены красильной экстракт»

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ПОДБОР МЕТОДИКИ

ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОИ

6.1. Разработка способа получения и стандартизации лекарственного

препарата «Марены красильной экстракт в капсулах»

6.1.1. Подбор методики изготовления густого экстракта марены красильной

6.1.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в густом

экстракте марены красильной

6.1.3. Разработка состава лекарственного препарата «Марены красильной

экстракт в капсулах»

6.1.4. Количественное определение суммы антраценпроизводных в

лекарственном препарате «Марены красильной экстракт в капсулах»

6.2. Разработка способа получения и стандартизации лекарственного

препарата «Марены красильной сироп»

6.2.1. Подбор методики изготовления густого экстракта марены красильной

6.2.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в густом

экстракте марены красильной

6.2.3. Разработка состава лекарственного препарата «Марены красильной

сироп»

6.2.4. Количественное определение суммы антраценпроизводных в

лекарственном препарате «Марены красильной сироп»

6.3. Испытания лекарственных форм «Марены красильной экстракт в

капсулах», «Марены красильной сироп» по показателям качества

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1 - Проект ФС «Марены красильной корневища и корни»

Приложение 2 - Проект ФС «Марены сердцелистной корневища и корни»

Приложение 3 - Акт внедрения в ФГБОУ ВО ОрГМУ Минздрава России

Приложение 4 - Акт внедрения в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Приложение 5 - Акт внедрения в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Приложение 6 - Акт внедрения в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Приложение 7 - Акт внедрения в ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России

Приложение 8 - Акт внедрения ГАУЗ «Оренбургский информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения»

Приложение 9 - Акт внедрения ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области»

Приложение 10 - Акт внедрения ЗАО «Самаралектравы»

Приложение 11 - Патент на изобретение «Способ получения сиропа марены красильной»

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Сравнительное фармакогностическое исследование корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.)»»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) лекарственные средства растительного происхождения составляют значимую часть объема производства. Препараты фитотерапевтического профиля широко применяются как для лечения, так и для профилактики заболеваниях многих нозологических групп (Куркин В.А., 2014; Самылина И.А. и др., 2006; Martins Ekor, 2014). Значительная часть населения стран мира в рамках системы первичной медико-санитарной помощи использует традиционные препараты природного происхождения. Однако отсутствие четких критериев и методов оценки лекарственных растительных средств на основе сырья представителей рода Марены (Rubia L.) стало причиной минимального ассортимента как лекарственных препаратов, так и биологически активных добавок к пище. Род Марена включает в себя огромное количество видов (Куркин В.А.,2017; Киселева Т.Л.,2008). Марена красильная и марена сердцелистная являются близкородственными видами растений, отличительные морфолого -анатомические признаки которых незначительны. Ввиду близости анатомического строения представители рода Марена сложно дифференцируются, чем вызывает затрудненную диагностику сырья (Кузнецов П.В., 2016; Киселева Т.Л., 2010). Таким образом, очевидна необходимость проведения сравнительного морфолого-анатомического исследования для выявления отличительных диагностических признаков.

Марена красильная широко используется на территории Российской Федерации, Индии и Китая. Корневища и корни марены красильной в качестве доминирующей группы веществ содержат антрахиноны, которые способствуют профилактике образования камней, их разрушению в почках, а также выводят щавелевые, фосфорнокислые и другие соли (Киселева Т.Л. и др., 2007; Самылина И.А., 1990, 2007; Куркин В.А., 2016).

Марена сердцелистная используется в практической медицине Китайской Народной Республики (КНР), Индии, Африки, отвар корневищ и корней

применяется при лечении туберкулеза легких, желтухи, при женских болезнях, дисменорее, аменорее, эндометрите (Liu, 2009; Yang, 2011). Наличие столь ценных целебных свойств следует объяснять содержанием в составе растения различных активных групп химических соединений, в том числе антраценпроизводных. Подземные органы марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) вызывают интерес у исследователей, как перспективное сырье для получения лекарственных растительных препаратов (ЛРП), обладающих нефролитическим действием (ZhengY.N., 2009; SunG.Zh., 2009).

Все лекарственные препараты и субстанции, в том числе лекарственное растительное сырье, должны соответствовать стандартам нормативной документации. На сегодняшний день в Государственной фармакопее Российской Федерации XIV издания статья на сырье марены сердцелистной отсутствует. Что же касается сырья марены красильной, то в фармакопейной статье ГФ РФ XIV издания отсутствуют снимки люминесцентной микроскопии, а представленные методики количественного определения многостадийны, включают такие стадии, как кислотный гидролиз, неоднократную экстракцию сырья, обработку эфиром -легкокипящим пожароопасным растворителем, а расчет содержания антраценпроизводных осуществляется с использованием построения калибровочного графика с применением раствора кобальта хлорида. Из этого следует, что актуальными являются исследования, которые направлены на разработку проекта фармакопейной статьи «Марены сердцелистной корневища и корни», а также дополнения к ФС 2.5.0083.18 «Марены красильной корневища и корни» (раздел «Подлинность» и «Количественное определение»).

Исходя из данных Государственного реестра, ассортимент лекарственных препаратов из сырья данных растений невелик. Это связано с недостаточной степенью изученности химического состава сырья данных растений, отсутствием современных методик качественного и количественного анализа. Данные обстоятельства говорят об актуальности исследований, которые направлены на изучение и разработку новых лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС), содержащего антрагликозиды.

Успешное решение этой проблемы будет способствовать реализации Стратегии развития фармацевтической отрасли Российской Федерации.

Степень разработанности темы. В настоящее время на сырьё марены красильной существует фармакопейная статья в Государственной фармакопее Российской Федерации XIV издания и в Государственной фармакопее Республики Беларусь. Статья на корневища и корни марены сердцелистной представлена исключительно в Индийской фармакопее и фармакопее КНР. Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания и фармакопея Республики Беларусь рекомендуют специфические реакции окрашивания, с использованием легкокипящего огнеопасного растворителя - эфира, а также хлороформа, щелочи и аммиака. В Государственной фармакопее Российской Федерации XIV издания для качественного определения марены красильной также предлагается метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), с обнаружением двух зон адсорбции с оранжевой или желтой флуоресценцией (антраценпроизводные), однако не приведен фактор удерживания, что затрудняет идентификацию веществ. В фармакопее КНР предложен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), для количественного определения действующих веществ в марене сердцелистной с использованием подвижной фазы смеси петролейного эфира и ацетона (4:1) и идентификации пятен с пятном эталонного раствора рубималина. В фармакопее Индии метод ВЭЖХ описан с использованием в качестве подвижной фазы толуола, этилацетата и ледяной уксусной кислоты (7:25:0,5), с проявлением пластины реактивом анисальдегида серной кислоты и анализом пятен с помощью эталонного раствора рубиадина.

В результате проведенного анализа фармакопейных статей зарубежных стран можно сделать вывод, что марена сердцелистная широко применяется в мировой практике наравне с мареной красильной, однако единообразия методологических подходов к стандартизации нет, что свидетельствует о перспективности данных видов растений для более глубокого изучения их химического состава и дальнейшей разработки нормативной документации.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью диссертационного исследования является сравнительное фармакогностическое исследование марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) в плане совершенствования методов стандартизации сырья и препаратов данных растений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Объединить и систематизировать литературные данные по изучению химического состава, вопросов стандартизации ЛРС и ЛРП, а также фармакологических свойств и опыт применения лекарственных препаратов, ЛРС марены красильной и марены сердцелистной.

2. Провести сравнительное морфолого-анатомическое исследование корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.).

3. Провести сравнительное исследование химического состава корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.).

4. Разработать методики качественного анализа для корневищ и корней марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.).

5. Разработать методики количественного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной (Rubia tinctorum L.), марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) и препаратов на их основе.

6. Разработать показатели качества для сырья марены красильной (Rubia tinctorum L.) и марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.).

7. Разработать составы, подобрать методики получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

8. На основе результатов фармакогностических исследований разработать проект фармакопейной статьи «Марены сердцелистной корневища и корни», а также дополнения к ФС 2.5.0083.18 «Марены красильной корневища и корни» (раздел «Подлинность» и «Количественное определение»).

Научная новизна. В сравнительном плане исследованы морфолого-анатомические признаки корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, что позволило выявить особенности свечения тканей и включений при проведении люминесцентной микроскопии, что актуально с точки зрения идентификации сырья. В ходе изучения химического состава корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной впервые выделено новое вещество -1-О-примверозид пурпуроксантина (ксантопурпозид), а также уже известные вещества, которые относятся к антраценпроизводным: ализарин, эмодин, руберитриновая кислота. На основе результатов химического исследования корневищ и корней марены красильной и сердцелистной разработаны методики качественного и количественного определения антраценпроизводных с использованием ИК-спектроскопии, спектрофотометрии, ТСХ.

Разработаны и представлены показатели качества, методики качественного и количественного анализа антраценпроизводных в препаратах «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

Научная новизна данного диссертационного исследования подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение № 2730463 «Способ получения сиропа марены красильной» (Бюл. № 24 от 24.08.2020 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы. В сравнительном плане исследованы морфолого-анатомические признаки корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, данное исследование подтвердило наличие классических структур и позволило выявить особенности свечения тканей и включений при проведении люминесцентной микроскопии. В результате сравнительного изучения химического состава сырья видов марены расширены представления о компонентном составе. Разработаны методики качественного и количественного анализа антраценпроизводных в корневищах и корнях марены

красильной и марены сердцелистной методами тонкослойной хроматографии, ИК-спектроскопии, спектрофотометрии, с использованием стандартного образца руберитриновой кислоты. Разработаны показатели качества корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, включая числовые (содержания суммы антраценпроизводных в пересчете на руберитриновую кислоту не менее 4,0% и 1,0% соответственно). Разработан проект фармакопейной статьи «Марены сердцелистной корневища и корни», а также дополнения к ФС 2.5.0083.18 «Марены красильной корневища и корни» (раздел «Подлинность» и «Количественное определение»). Разработаны составы, подобраны методики получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

Внедрение в практику. Фрагменты настоящего диссертационного исследования внедрены в научную и учебную работу кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, кафедры управления и экономики фармации, кафедры фармацевтической технологии, кафедры химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедры управления и экономики фармации, фармацевтической технологии и фармакогнозии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в производственный процесс ЗАО «Самаралектравы», в рабочий процесс ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ГАУЗ «Оренбургский информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения».

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования является поиск, анализ и систематизация литературных данных в области растений рода Марена. Степень изученности химического состава ЛРС и фармакологических свойств, подходы к стандартизации сырья, разработка нормативной документации на растительное сырье, обобщение материалов в виде выводов, определяющих теоретическое и практическое значение

диссертационной работы, оценки актуальности работы и степени разработки темы исследования. С учетом поставленной цели и задач был разработан план выполнения диссертационного исследования, были определены объекты и методы. Объектами диссертационной работы являлись промышленные виды сырья растений рода Марена (марена красильная и марена сердцелистная), собранные на территории Российской Федерации и Индии, водно-спиртовые извлечения, а также разработанные нами лекарственные растительные препараты на основе сырья марены красильной. Фармакогностические исследования проводили с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии, ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, колоночной хроматографии, пробирочных и микрохимических реакций. Математическую обработку осуществляли с применением программного обеспечения в соответствии с ГФ РФ XIV издания.

Основные положения, выносимые на защиту. 1 .Результаты сравнительного морфолого-анатомического исследования корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной.

2. Результаты исследования химического состава корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной.

3. Результаты исследований по разработке методик качественного и количественного анализа корневищ и корней марены красильной, марены сердцелистной и препаратов на их основе.

4. Данные по разработке показателей качества корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной.

5. Данные по разработке состава, методик получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

Степень достоверности. Достоверность диссертационной работы подтверждена экспериментальными данными, полученными с использованием цифровой и люминесцентной микроскопии, колоночной хроматографии, тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии, ИК-спектроскопии, масс-

спектрометрии, ЯМР-спектроскопии, химических методов, что подтверждается большим количеством таблиц, рисунков, схем, хроматограмм. Все результаты исследований обработаны статистически в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания, а также с помощью программы «MicrosoftExcel». Различия между группами считались статистически значимыми при Р<0,05. Разработанные методики количественного определения валидированы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на российских конференциях: IX Международной научно -практической конференции «Проблемы и перспективы развития науки в России и мире» (Екатеринбург, 2017); IX Международной научно-практической конференции «Научные исследования и разработки в эпоху глобализации» (Волгоград, 2017); Международной научно -практической конференции «Научные механизмы решения проблем инновационного развития» (Уфа, 2017); X Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2018); 41 -й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки» (Москва, 2018); 43 -й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки» (Москва, 2018); XXIII Международной научно-практической конференции «Современная медицина: новые подходы и актуальные исследования» (Москва, 2019); III Международной научно-практической конференции «Современная мировая экономика: проблемы и перспективы в эпоху развития цифровых технологий и биотехнологии» (Москва, 2019); IX Межвузовской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2019).

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнялась согласно тематическому плану научно -исследовательских работ ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России (№ Гос. регистрации 115042810034 до 14.05.2019, наименование НИОКР - «Комплексные исследования по разработке лекарственных средств природного и синтетического происхождения»; с

14.05.2019 № Гос. Регистрации АААА-А19-119051490148-7, наименование НИОКР - «Химико-фармацевтические, биотехнологические , фармакологические и организационно-экономические исследования по разработке, анализу и применению фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов»).

Публикации. По теме исследования опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, и 1 статьи в изданиях индексируемых в международных наукометрических базах (Scopus), патент РФ №2 2730463 «Способ получения сиропа марены красильной» .

Личный вклад автора. Все представленные в диссертационной работе результаты исследований получены автором. Автором проведено исследование морфолого-анатомического строения корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, выявлены особенности свечения тканей и включений при проведении люминесцентной микроскопии, что актуально с точки зрения идентификации сырья.

Проведена сравнительная оценка фитохимического состава корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной. Из корневищ и корней данных видов рода Марена выделено и идентифицировано 4 индивидуальных соединения, одно из которых является новым (1-О-примверозид пурпуроксантина), разработаны и обоснованы методики качественного и количественного анализа корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной. Для целей качественного и количественного определения антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной и марены сердцелистной рекомендованы методы тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии. Предложены составы, методики получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Основные положения, представленные в диссертационном исследовании, соответствуют паспорту научной специальности 14.04.02 - «Фармацевтическая химия,

фармакогнозия» (фармацевтические науки) по пунктам: 2 - «Формулирование и развитие принципов стандартизации и установление нормативов качества, обеспечивающих терапевтическую активность и безопасность лекарственных средств»; 3 - «Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующих методов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления»; 5 - «Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление активных химических соединений в сырье»; 6 - «Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 189 страницах машинописного текста, данные изложены в форме 36 таблиц и представлены на 50 рисунках. Данная работа включает в себя введение, литературный обзор, объекты и методы исследования, 6 глав, представляющих результаты исследований, выводы и заключение, список литературы, который состоит из 132 источников, из которых 25 - на иностранном языке, 11 приложений.

Во введении изложена актуальность, цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость, основные положения, выносимые на защиту, сведения о публикациях и апробации работы.

Глава 1 представляет собой обзор литературных источников отечественных и иностранных авторов в области фармакогностических исследований некоторых видов рода Марена. В главе подробно представлены данные, касающиеся ареала произрастания, химического состава, методик качественного и количественного анализа сырья марены красильной и марены сердцелистной. Кроме того, в главе представлена информация о применении вышеуказанных видов рода Марена в официальной и народной медицине России и других стран.

Глава 2 посвящена объектам и методам исследования. Изложены методики определения подлинности и количественного содержания биологически активных соединений в лекарственном растительном сырье марены красильной и марены сердцелистной.

Глава 3 посвящена результатам сравнительного морфолого-анатомического исследования корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной.

В главе 4 представлены результаты сравнительного химического исследования корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, приведены результаты выделения индивидуальных соединений из корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной, данные по их химическому строению.

Глава 5 посвящена разработанным методикам качественного и количественного анализа корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной.

В главе 6 приводятся результаты исследований по обоснованию состава, методик получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов «Марены красильной экстракт в капсулах», «Марены красильной сироп».

Диссертация завершается заключением, выводами, практическими рекомендациями, перспективами дальнейшей разработки и списком литературы.

В приложениях к работе представлены акты внедрения, уведомление о приеме и регистрации заявки на патент Российской Федерации на изобретение: № 2730463 «Способ получения сиропа марены красильной» (Бюл. № 24 от 24.08.2020 г.), проект ФС «Марены сердцелистной корневища и корни», дополнения к ФС 2.5.0083.18 «Марены красильной корневища и корни» (раздел «Подлинность» и «Количественное определение»).

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ КОРНЕВИЩ И КОРНЕЙ МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ И МАРЕНЫ СЕРДЦЕЛИСТНОЙ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Историческая справка

Достаточно большое количество лекарственных растений на сегодняшний день используется в фитотерапии, одним из них является марена красильная. Семейство мареновые (лат. Rubiáceae) - одно из самых крупных среди покрытосеменных растений. В него включено 450-500 родов и 6000-7000 видов растений, которые распространены по всему земному шару. Среди растений этого семейства встречаются разные жизненные формы: травы, полукустарники, кустарники, лианы и даже деревья [15,16,94]. Род Марена (лат. Rubia) насчитывает около 55 видов травянистых растений, а также полукустарников и кустарников. Растения рода Марена широко применялись в древности в текстильной промышленности [28,37]. Издавна представители Египта, Рима, Персии очень высоко ценили корень растения, который использовался для получения красителя красного цвета. Можно сказать, что марена красильная в те времена была единственным источником красной краски [58]. Высокая ценность растения была в средние века среди текстильной профессии, а русское вольное экономическое общество в своё время даже учредило золотую медаль и большую денежную премию тем селекционерам, которые выведут зимостойкие сорта растения, но сделать это не удалось. Сейчас же красящее вещество, ализарин синтезируют на химкомбинатах, поэтому промышленное значение марены красильной в этом отношении потеряно. Пурпурин, извлекаемый из марены рассматривается как потенциальный заменитель кобальта в литий-ионных батареях. Это поможет

избавиться в производстве от опасного материала, позволит производить батареи при комнатной температуре и снизит стоимость утилизации батарей [60,69].

Название «крапп» оно же марена, упоминается в труде Абу Али Ибн Сина (Авиценна) «Канон врачебной науки», где он обобщил опыт прошлого, дополнил его результатами личных наблюдений и сформулировал принципиальные основы фармации. Авиценна применял средства из марены как гепатопротекторы, а также назначал при лечении седалищного нерва, паралича, при потере чувствительности тканей, из сырья марены готовили отвар, мед использовали как подсластитель. Также из плодов марены, уксуса и мёда готовили напиток, употребляемый при увеличенной селезёнке [81].

В настоящее время марена красильная применяется при заболеваниях мочеполовой системы, так как оказывает спазмолитическое, уролитическое действие, влияет на перистальтику мускулатуры почечных лоханок и мочеточников. Лекарственное сырьё марены обладает способностью растворять соли почек и мочевого пузыря, такое свойство используется, для лечения не только взрослых, но и детей [40].

Марена сердцелистная находит широкое применение в медицине КНР, Индии, Африки, отвар корневищ применяется при заболеваниях дыхательных путей, женской репродуктивной системы, а также заболеваниях желудочно-кишечного тракта. В медицине сок (в составе мази) применяется при дерматологических заболеваниях, особенно лейкодермии, витилиго, псориазе, в послеродовом периоде, асците, при пaрaличах [40]. Широко используют отвар в Индии, употребляется при укусах ядовитых змей и членистоногих пауков. Кроме того, изучаемые растения находят широкое применение в промышленности для окрашивания фармацевтических фитопрепаратов (преимущественно масел) [56].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рыбалко Майя Викторовна, 2020 год

i /

D.5D У i / / N.

V Л / / V4

\ л Л- / \

1 Ч А л! л У \

..J ft \J г V L' ) \ sf

1 \ А _____ V__ —1

?

1DOO 2 DUO 3D0D «DO

[kl ■ L ШШ

Рисунок 5.3 - ИК - спектр водно-спиртового извлечения марены красильной.

Обозначения:1 - ИК - спектр водно-спиртового извлечения марены красильной;

2 - ИК - спектр руберитриновой кислоты.

и»

| , 1

\ 1 / 1 /

V \ / / V

\ 1, J \ Л ! ' 1 / \

/ L л * / л У \

ч VV я г V / / / — —

DJ» г «с

Рисунок 5.4 - ИК - спектр водно-спиртового извлечения марены сердцелистной.

Обозначения:1 - ИК - спектр водно-спиртового извлечения марены сердцелистной; 2 - ИК - спектр руберитриновой кислоты.

В результате проведенного исследования компонентного состава водно-спиртовых извлечений корневищ и корней марены красильной, марены сердцелистной методом ИК-спектроскопии установлено, что в сравниваемых спектрах полосы поглощения имеют схожие черты, это является дополнительным подтверждением того, что руберитриновая кислота присутствует в анализируемом сырье.

5.2. Количественное определение суммы антраценпроизводных в корневищах и конях марены красильной

На кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ ранее было проведено исследование по выделению веществ из корневищ и корней марены красильной и установлено, что доминирующими компонентом является руберитриновая кислота.

Анализ электронных спектров, показал, что максимум поглощения щёлочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из корневищ и корней марены красильной находится в области спектра при 510±2 нм (рис. 5.5 - 5.6).

Щёлочно-аммиачный раствор руберитриновой кислоты, также показывает чёткий максимум поглощения при 510±2 нм (рис. 5.7).

Следовательно руберитриновая кислота определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из корневищ и корней марены красильной и может быть рекомендована в качестве стандарта при аналитической длине волны 510 нм, однако в случае отсутствия стандарта в расчетной формуле

может быть использовано теоретическое значение удельного показателя

1%

поглощения руберитриновой кислоты (Е1см ) - 520 [80].

WavelengШ(шn)

Рисунок 5.5 - Электронные спектры исходного раствора (1) и щёлочно-аммиачного раствора (2) водно -спиртового извлечения из корневищ и корней марены красильной.

0.5

^Уау^Ьп^ЛИШ!;

Рисунок 5.6 - Электронный спектр щёлочно-аммиачного раствора водно -спиртового извлечения из корневищ и корней марены красильной в условиях дифференциальной спектрофотометрии.

% 0.2 _

-О

о

-С <

0.1

0.0

200 300 400 500 600 700

Wavelength(nm)

Рисунок 5.7 - Электронный спектр раствора руберитриновой кислоты. Разрабатывая методику количественного определения, учитывали результаты ранее существующей методики, разработанной на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России под руководством зав. кафедрой Куркина В.А., в которой были

использованы следующие условия: экстрагент 80% спирт, соотношение сырья и экстрагента - 1:30, время экстракции - 90 минут на водяной бане [76].С целью модернизации методики количественного определения экстракцию проводили при различных соотношениях «сырье-экстрагент», а также варьировали время экстракции на водяной бане и время воздействия ультразвука (табл. 5.1) [84]. Во время подбора методики количественного определения суммы антраценпроизводных в корневищах с корнями марены красильной частично модифицированы оптимальные условия экстракции антраценпроизводных: экстрагент - 80% спирт; соотношение «сырье - экстрагент» - 1:30; время экстракции - 10 мин с применением водяной бани при температуре 80-90°С, 15 минут экстракция при воздействии ультразвука при температурном режиме 40°С, мощности ультразвука 60Вт и частоте 40кГц [84].

Таблица 5.1 - Влияние различных факторов на полноту извлечения антраценпроизводных из корневищ и корней марены красильной

(Rubia tinctórum L.)

Концентраци Соотношение Время Содержание суммы

я спирта, % «сырьё: экстрагент» экстракции антраценпроизводны х, %

80 1:30 5 мин воздействия ультразвука 2,28±0,14

80 1:30 10 мин воздействия ультразвука 2,62±0,17

80 1:30 15 мин воздействия ультразвука 3,26±0,21

80 1:30 30 мин воздействия ультразвука 3,36±0,21

80 1:30 10 м ин водяная баня,15 мин воздействия ультразвука 4,55±0,29

Концентраци я спирта, % Соотношение Время экстракции Концентрация спирта, %

80 1:50 10 мин водяная баня,15 мин воздействия ультразвука 4,2±0,27

80 1:30 90 мин водяная баня 3,92±0,25

С применением разработанной методики был проведён анализ ряда проб корневищ и корней марены красильной (табл. 5.2). Диапазон содержания антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной находится от 4,32±0,27% до 4,7±0,3%. Основываясь на полученный интервал концентраций антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной, можно предложить нижнюю границу содержания суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитриновую кислоту не менее 4,0% [84,125].

Таблица 5.2 - Содержание суммы антраценпроизводных в образцах корневищ и

корней марены красильной

Образцы сырья Содержание суммы антраценпроизводных в абсолютно сухом сырье в пересчёте на руберитриновую кислоту, %

ООО «Славянская здравница», Россия, г. Саранск, (2016г.) 4,32±0,28

ООО «Славянская здравница», Россия, г. Саранск, (2017г.) 4,55±0,29

ООО «Ортилия», Россия, г. Новосибирск, (2017г.) 4,50±0,29

ООО «Ортилия», Россия, г. Новосибирск, (2018г.) 4,70±0,29

Были рассчитаны метрологические характеристики предложенной методики количественного определения содержания суммы антраценпроизводных в сырье

марены красильной (таблица 5.3). Результаты статистической обработки проведённых опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы антраценпроизводных в сырье марены ±6,50% [84].

Таблица 5.3 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье марены красильной

f S P, % t (P,f) AX E, %

10 4,5 0,134 95 2,23 ±0,29 ±6,50

Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1 г (точная навеска) измельчённого сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, с добавлением 30 мл, 80% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой, взвешивают с точностью до ±0,01, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 10 мин. Затем в течение 15 мин, проводят экстракцию при воздействии ультразвука при нагревании до 40°С, мощности ультразвука 60Вт и частоте 40кГц, после чего взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная» полоса) (испытуемый раствор А).

1,0 мл раствора А погружают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки щелочно-аммиачным раствором, приготовленным в соответствии с требованиями ГФ РФ XIV издания (испытуемый раствор Б). [21,22,23,24]. У охлажденного извлечения измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 510 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объём раствора спиртом этиловым 80% до метки.

Примечание: Изготовление раствора руберитриновой кислоты стандартного

образца. Около 0,02 г (точная навеска) руберитриновой кислоты помещают в

мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% спирта при нагревании

на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной

температуры доводят объем раствора 70% спиртом до метки (раствор А

руберитриновая кислота). 1 мл раствора А руберитриновой кислоты помещают в

мерную колбу на 25 мл и доводят объём раствора до метки щёлочно-аммиачным

раствором (испытуемый раствор Б). Раствор Б помещают в колбу ёмкостью 50 мл

и нагревают в течение 15 мин на кипящей водяной бане с обратным

холодильником. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на

спектрофотометре при длине волны 510 нм. В качестве раствора сравнения

используют раствор, приготовленный следующим образом: 1 мл раствора А

руберитриновой кислоты помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем

раствора до метки спиртом 70% (раствор сравнения Б руберитриновой кислоты).

Содержание суммы антраценпроизводных рассчитывают по формуле (1) [124]:

^ Ехт X30х1х50x100x100

X =-0-, (1) где:

Е0 х т х 30 х 1 х 50 х (100 - Ж) 7

E- оптическая плотность испытуемого раствора;

Eo - оптическая плотность раствора стандартного образца руберитриновой кислоты;

m - масса сырья, г;

то - масса стандартного образца руберитриновой кислоты, г; W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

При отсутствии стандарта руберитриновой кислоты для расчёта целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения, равное 520:

Е х 30 х 50 х 100

X =-, (2) где:

т х 520 х (100 - Ж) х1Л '

520 - удельный показатель поглощения руберитриновой кислоты.

5.3. Количественное определение суммы антраценпроизводных в корневищах и конях марены сердцелистной

Ранее в ходе диссертационных исследований выявлен доминирующий компонент корневищ и корней марены сердцелистной, которым является руберитриновая кислота. Для подбора и предложения оптимальной методики количественного определения подробно анализировались электронные спектры щёлочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из корневищ и корней марены сердцелистной и руберитриновой кислоты (рис. 5.8-5.9). В результате установлено, что в анализируемых электронных спектрах наблюдается четкий пик в области 510±2 нм. Соответственно именно руберитриновая кислота является диагностически значимым компонентом и в большей части определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из корневищ и корней марены сердцелистной. При этом целесообразно является определение содержания суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитринувую кислоту при Х=510нм

(теоретическое значение удельного показателя поглощения руберитриновой

1%

кислоты (Е1см ) - 520) [124].

Рисунок 5.8 - Электронные спектры исходного раствора (1) и щёлочно-аммиачного раствора (2) водно -спиртового извлечения из корневищ и корней марены сердцелистной.

Рисунок 5.9 - Электронный спектр щёлочно-аммиачного раствора водно -спиртового извлечения из корневищ и корней марены сердцелистной в условиях дифференциальной спектрофотометрии.

<

0.1

0.0

200 300 400 500 600 700 Wavelength(nm)

Рисунок 5.10 - Электронный спектр раствора руберитриновой кислоты.

Для выбора подходящей методики количественного определения экстракцию проводили при различных соотношениях "сырьё - экстрагент", а также варьировали время экстракции на водяной бане и время воздействия ультразвука (табл. 5.4) [2,11]. При подборе методики количественного определения антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной выявлены оптимальные условия экстракции: экстрагент - 70% спирт; соотношение "сырьё -экстрагент" - 1:100; экстракцию продолжали - 90 минут с использованием нагретой водяной бани при соблюдении температурного режима 80 - 90°С; 15 минут экстракция продолжалась с использованием ультразвука для более полного выхода действующих веществ при температурном режиме 40°С, мощности ультразвука 60Вт и частоте 40кГц [124].

Таблица 5.4 - Влияние различных факторов на полноту извлечения антраценпроизводных из корневищ и корней марены сердцелистной

(Rubia cordifólia L.)

Концентрация Соотноше- Время Время Содержание суммы

спирта, % ние экстрак- экстрак- антраценпроизвод-

«сырьё: ции на ции УЗ, ных, %

экстрагент» водяной бане, мин мин

40 1:50 90 15 0,85±0,05

50 1:50 90 15 0,98±0,06

60 1:50 90 15 0,70±0,04

Концентрация Соотноше- Время Время Содержание суммы

спирта, % ние экстрак- экстрак- антраценпроизвод-

«сырьё: ции на ции УЗ, ных, %

экстрагент» водяной мин

бане, мин

70 1 50 90 15 1,13±0,03

80 1 50 90 15 0,93±0,07

95 1 50 90 15 0,82±0,05

70 1 50 60 15 0,72±0,04

70 1 50 30 15 0,56±0,03

70 1:100 90 15 1,38±0,08

70 1:25 90 15 0,90±0,05

В результате применения разработанной методики был проведён анализ ряда образцов корневищ и корней марены сердцелистной (табл. 5.5). Содержание антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной колеблется от 1,23±0,08% до 1,32±0,08%. Основываясь на полученном интервале концентраций антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной можно предложить нижнюю границу содержания суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитриновую кислоту не менее чем 1,0% [124].

Таблица 5.5 - Содержание суммы антраценпроизводных в образцах корневищ и

корней марены сердцелистной

Образцы сырья Содержание суммы антраценпроизводных в абсолютно сухом сырье в пересчёте на руберитриновую кислоту, %

Тхане, Индия (2016 г.) 1,31±0,08

Тхане, Индия (2017 г.) 1,30±0,08

ООО «Ортилия», Россия, г. Новосибирск (2017 г.) 1,32±0,08

ООО «Ортилия», Россия, г. Новосибирск (2018 г.) 1,23±0,08

Рассчитаны метрологические характеристики предложенной методики количественного определения антраценпроизводных в корневищах и корнях

марены сердцелистной (Rubia cordifólia L.) (таблица 5.6). Результаты статистической обработки экспериментов говорят о том, что ошибка единичного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной составляет ±6,20% [79].

Таблица 5.6 - Метрологическая характеристика методики количественного

определения суммы антраценпроизводных в сырье марены сердцелистной

f S P, % t (Pf) AX E, %

10 1,3 0,036 95 2,23 ±0,08 ±6,20

Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1 г (точная навеска) измельчённого сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, с добавлением экстрагента 100 мл 70% спирта. Колбу закрывают пробкой, взвешивают с точностью до ±0,01, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 минут. Затем в течение 15 мин, проводят экстракцию при воздействии ультразвука при доведении температуры до 40°С, мощности ультразвука 60Вт и частоте 40кГц, после чего взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр («красная» полоса) (испытуемый раствор А).

2,0 мл раствора А погружают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки щелочно-аммиачным раствором, приготовленным в соответствии с требованиями ГФ РФ XIV издания (испытуемый раствор Б). [21,22,23,24]. У охлажденного извлечения измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 510 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 2 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и объем раствора доводят спиртом этиловым 70% до метки.

Примечание: Приготовление раствора руберитриновой кислоты стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) руберитриновой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% спиртом до метки (раствор А руберитриновая кислота). 1 мл раствора А руберитриновой кислоты помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объём раствора до метки щёлочно-аммиачным раствором (испытуемый раствор Б). Раствор Б помещают в колбу ёмкостью 50 мл и нагревают в течение 15 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 510 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, приготовленный следующим образом: 1 мл раствора А руберитриновой кислоты помещают в мерную колбу на 25 мл и восполняют объем раствора до метки спиртом 70% (раствор сравнения Б руберитриновой кислоты).

Содержание количества антраценпроизводных рассчитывают по формуле (3) [124]:

Ех т х100х1х 25х100х100

X =-0-, (3) где:

Е0 х т х100х 2 х 50 х (100 - Ж) 7

Е - оптическая плотность испытуемого раствора;

Е0 - оптическая плотность раствора стандартного образца руберитриновой кислоты;

т - масса сырья, г;

то - масса стандартного образца руберитриновой кислоты, г; Ж - потеря в массе при высушивании, в процентах.

При отсутствии стандарта руберитриновой кислоты для расчёта целесообразно

использовать теоретическое значение её удельного показателя поглощения, равное

520, для марены сердцелистной формула (4) выглядит следующим образом:

Е х 100 х 25 х 100

X =-, (4) где:

т х 520 х (100 - Ж) х 2 , v '

520 - удельный показатель поглощения руберитриновой кислоты.

5.4. Числовые показатели для корневищ и корней марены красильной,

марены сердцелистной

Раздел «Испытания» является неотъемлемой частью нормативной документации на лекарственное растительное сырье. Раздел освещает показатели качества, такие как количественное определение, влага, зола общая и не растворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, посторонние примеси, что подтолкнуло нас к их разработке. Согласно общепринятым методикам ГФ РФ XIV издания данные показатели были определены [22,23], объектами выступали пробы сырья корневищ и корней марены красильной. Полученные результаты приведены в таблице 5.7 - 5.8.

Таблица 5.7 - Результаты определения числовых показателей корневищ и корней

марены красильной (измельчённое сырье)

№ Поставщик Дата Дата Содерж Влаж- Зола, % Зола, Орга- Мине- Частиц, Частиц

сбора анализа а- ность, не- ни- ральной не прохо-

сырья ние суммы антраце н- произво д- ных, % % растворимая в 10% раствор е HCl, % ческой примеси, % примеси % проходящих с/ сито 7мм, % дящих с/ сито 0,5мм, %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Краснодарский край 03.2016 12. 2016 4,32 11,70 9,8 3,2 0,80 0,60 4,85 4,85

2 Краснодарский край 04.2016 11. 2016 4,55 12,90 7,6 3,5 0,95 0,55 4,60 4,90

3 Краснодарский край 03.2017 11. 2017 4,50 12,90 7,7 3,7 0,74 0,9 4,75 4,72

4 Краснодарский край 04.2017 12. 2017 4,40 12,50 9,0 3,45 0,82 0,82 4,70 4,83

5 Краснодарский край 03.2018 12.2018 4,70 11,80 9,9 3,9 0,87 0,77 4,90 4,60

Таблица 5.8 - Результаты определения числовых показателей корневищ и корней марены сердцелистной (измельчённое сырье)

№ Поставщик Дата Дата Содерж Влаж- Зола, % Зола, Орга- Мине- Частиц, Частиц

сбора анализа а- ность, не- ни- ральной не прохо-

сырья ние суммы антраце н- произво д- ных, % % растворимая в 10% раствор е HCl, % ческой примеси, % примеси % проходящих с/ сито 7мм, % дящих с/ сито 0,5мм, %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 Тхане, Индия 05.2016 12. 2016 1,31 11,70 8,0 0,42 2,0 2,58 4,82 4,81

2 Тхане, Индия 04.2016 11. 2016 1,30 11,90 8,55 0,44 1,87 2,52 4,57 4,88

3 Тхане, Индия 03.2017 11. 2017 1,27 12,0 9,0 0,48 1,97 2,87 4,71 4,70

4 Тхане, Индия 04.2018 12. 2017 1,23 11,50 9,2 0,49 1,99 2,80 4,69 4,81

5 Тхане, Индия 03.2018 12.2018 1,32 11,80 8,95 0,48 1,8 2,74 4,85 4,58

Рекомендуемый нами нижний предел содержания антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной составляет 4,0%, в корневищах и корнях марены сердцелистной составляет 1,0%, влажность не более 13%, зола не более 10%, зола не растворимая в хлористоводородной кислоте не более 4%, органические примеси не более 1%, минеральные примеси не более 1%. Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм, не более 5%. Измельченное сырьё: проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25мм не более 5%.

Содержание действующих веществ, а именно суммы антраценпроизводных при хранении в сухом проветриваемом помещении, при температуре 18 - 20°С в течение 3 лет не показало больших процентных отклонений, этот факт позволил нам рекомендовать срок годности сырья 3 года.

5.5. Валидационные характеристики методик количественного определения антраценпроизводных марены красильной и марены сердцелистной

Валидация аналитической методики - это экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для решения предполагаемых задач. Ранее нами были разработаны и изложены методики количественного определения антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной и марены сердцелистной [23,34]. Методики количественного определения были оценены нами по следующим показателям: линейности, прецизионности (повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, межлабораторной прецизионности), правильности, специфичности, а также аналитической области [92]. Определялась линейность на 5 уровнях концентраций от теоретического содержания суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитриновую кислоту в исследуемых объектах (табл. 5.9, рис. 5.11, 5.12). Растворы готовили путём разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитриновую кислоту в растворах, имеющих концентрацию 50, 75, 100, 125 и 150%. Коэффициент корреляции

выступал критерием приемлемости линейности. Близость значения к единице, говорит о том, что методика линейна. Величина коэффициента корреляции должна быть не ниже 0,99. Специфичность валидируемой методики может быть доказана также соответствующей статистической обработкой результатов анализов реальных объектов, которая представлена метрологическими характеристиками (табл. 5.11 - 5.12) [116]. Аналитическая область методики может быть установлена по диапазону экспериментальных данных, удовлетворяющих линейной модели (табл. 5.9 рис. 5.11 - 5.12).

Таблица 5.9 - Определение линейности методики.

Корневища и корни марены красильной

№ измерения Аликвота, % Аликвота, Мл Оптическая плотность, D Содержание антраценпроизводных в аликвоте, С, %

1 50 0.50 0.720 2.27

2 75 0.75 1.0 3.41

3 100 1.0 1.340 4.55

4 125 1.25 1.670 5.70

5 150 1.50 2.010 6.94

Корневища и корни марены сердцелистной

1 50 0.50 0.062 0.67

2 75 0.75 0.093 1.02

3 100 1.0 0.124 1.37

4 125 1.25 0.155 1.69

5 150 1.50 0.186 2.1

корневищ и корней марены красильной от концентрации.

Рисунок 5.12 - График зависимости оптической плотности извлечения из корневищ и корней марены сердцелистной от концентрации. Данные для расчета коэффициента корреляции представлены в таблицах

5.10 и 5.11.

Таблица 5.10 - Данные для расчета коэффициента корреляции

Б С БС Б2 С2

Корневища и корни марены красильной

0,72 2.27 1.63 0.52 5.15

1,0 3.41 3.41 1.0 11.62

1,34 4.55 6.09 1.79 20.70

1,67 5.70 9.51 2.78 32.49

2,01 6.94 13.94 4.04 48.16

^=6.74 £С=22.87 ^С=34.58 ^2=10.13 £С2=118.12

Б С БС Б2 С2

Корневища и корни марены сердцелистной

0.062 0.67 0.041 0.0038 0.44

0.093 1.02 0.094 0.0086 1.04

0.124 1.37 0.169 0.0153 1.87

0.155 1.69 0.261 0.0240 2.85

0.186 2.10 0.390 0.0345 4.41

£0=0.62 £С=6.85 XDC=0.955 £02=0.0862 £С2=10.61

Таблица 5.11- Расчёт коэффициента корреляции

Объекты исследования SSх = ЕО 2- (ЕО) 2 /5 SSy = ЕС 2 - (ЕС) 2 /5 SPху = ЕОС-(ЕО-ЕС)/5 г = SPху/ V SSх• SSy

Корневища и корни марены красильной 8.10 94.49 27.57 0.996

Корневища и корни марены сердцелистной 0.0689 8.488 0.764 0.999

£5!х - сумма квадратов отклонения баллов (О) испытуемых от среднего арифметического;

Жу - сумма квадратов отклонения баллов (С) испытуемых от среднего арифметического;

SPху - сумма попарных произведений; г - коэффициент корреляции.

Коэффициенты корреляции для исследуемых объектов составили более 0,99 (табл. 5.12). На основе полученных результатов нами сделано заключение о линейности методики. Для определения повторяемости методики брали один образец сырья и проводили исследование в 11 повторностях. Было определено относительное стандартное отклонение, которое не должно превышать 10%. Для корневищ и корней марены красильной эта величина составила 6,50% (таблица 5.11), для корневищ и корней марены сердцелистной - 6,20% (таблица 5.13) [83].

Таблица 5.12 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье марены красильной

Г 5 р, % t (Р,1) АХ Е, %

10 4,55 0,134 95 2,23 ±0,29 ±6,50

Таблица 5.13 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье марены сердцелистной

Г 5 Р, % t (Р,А АХ Е, %

10 1,32 0,036 95 2,23 ±0,08 ±6,20

Небольшое количество образцов, а именно три были использованы для определения внутрилабораторной прецизионности (таблица 5.14-5.15). Величина относительного стандартного отклонения не привысила 15% [83].

Таблица 5.14 - Результаты определения внутрилабораторной прецизионности разработанной методики для корневищ и корней марены красильной

Повторность Содержание антраценпроизводных в пересчете на руберитриновую кислоту в корневищах и корнях марены красильной, %

Аналитик 1 Сырье 1 Сырье 2 Сырье 3

1 4.52 4.42 4.52

2 4.54 4.30 4.40

3 4.52 4.31 4.37

4 Аналитик 2 4.57 4.32 4.35

5 4.56 4.34 4.37

6 4.58 4.33 4.38

Среднее значение 4.55 4.32 4.40

Относительное стандартное отклонение (%) 6.50 6.47 6.44

Таблица 5.15 - Результаты определения внутрилабораторной прецизионности разработанной методики для корневищ и корней марены сердцелистной

Повторность Содержание антраценпроизводных в пересчете на руберитриновую кислоту в корневищах и корнях марены

сердцелистной, %

Сырье 1 Сырье 2 Сырье 3

1 Аналитик 1 1.34 1.24 1.20

2 1.33 1.26 1.21

3 1.31 1.25 1.24

4 Аналитик 2 1.35 1.27 1.25

5 1.33 1.25 1.26

6 1.31 1.30 1.24

Среднее значение 1.32 1.27 1.23

Относительное стандартное 6.20 6.10 6.17

отклонение (%)

Воспроизводимость методики в предложенных условиях доказывает относительное стандартное отклонение, которое не превышает 15%. Для определения межлабораторной прецизионности методики исследовали количественное содержание образцов сырья на трёх спектрофотометрах Specord40 (Analytik Jena), СФ-2000, UNICO 2800 (таблица 5.16) [83]. Правильность определяли путём объединения исследуемых образцов и определённого количества 0,25 мл, 0,50мл, 0,75 мл рабочего стандартного раствора (руберитриновой кислоты) к полученному нами извлечению для получения различных концентраций. Критерием приемлемости методики является величина среднего процента восстановления при применении растворов определённых концентраций, скорректированная на 100%. Средняя величина критерия приемлемости определяется рамками 100±5% [83].

Таблица 5.16 - Результаты определения межлабораторной прецизионности разработанной методики для корневищ и корней марены красильной и марены

сердцелистной

Анализируемое Содержание антраценпроизводных в пересчёте Относительное

лекарственное на руберитриновую кислоту (корневища и стандартноеот

растительное корни марены красильной сердцелистной), % клонение

сырьё Спектрофот Спектрофото Спектрофотометр (%)

ометр метр цмга 2800

Specord 40 СФ-2000

Jena)

Корневища и 4.44 4.40 4.55 6.50

корни марены

красильной

Корневища и 1.29 1.27 1.32 6.21

корни марены

сердцелистной

Таблица 5.17 - Результаты определения правильности методики (эксперименты с добавками руберитриновой кислоты) для марены красильной и марены сердцелистной

№ Содержание антраценпрои зводных мг, в пересчетена руберитринов ую кислоту Добавлено РСО рубе-ритри-новую кислоту, мг Ожидаемое содержан ие , мг Полученное содержа ние , мг Получен ная ошибка, % Статистические характеристики

1 4.55 0.125 4.675 4.668 99.85 Х=100,04%

2 4.55 0.125 4.675 4.670 99.86 S =0,132

3 4.55 0.125 4.675 4.679 100.10 ^Х =±0,295

4 4.55 0.250 4.801 4.82 100.40 Е =±6,50%

5 4.55 0.250 4.802 4.831 100.60

6 4.55 0.250 4.801 4.791 99.80

7 4.55 0.375 4.925 4.923 99.90

8 4.55 0.375 4.925 4.928 100.10

9 4.55 0.375 4.925 4.915 99.80

Средняя ошибка 100.04%

№ Содержан ие антрацен производ ных мг, в пересчете на руберитр иновую кислоту Добавлено РСО Рубе-ритри-новую кисло-ту, мг Ожидаемое содержан ие , мг Полученное содержан ие , мг Полученн ая ошибка, % Статисти ческие характери стики

Корневища и корни марены сердцелистной

1 1.32 0.125 1.445 1.444 99.90 х=100,1% S =0,036 ¿X =±0,0819 Е =±6,21%

2 1.32 0.125 1.445 1.439 99.60

3 1.32 0.125 1.445 1.440 99.65

4 1.32 0.250 1.57 1.560 99.40

5 1.32 0.250 1.57 1.590 101.20

6 1.32 0.250 1.57 1.581 100.70

7 1.32 0.375 1.695 1.699 100.20

8 1.32 0.375 1.695 1.694 99.90

9 1.32 0.375 1.695 1.701 100.30

Средняя ошибка 100.1%

Процент восстановления в разработанной методике для марены красильной и сердцелистной варьировал от 99,8% до 100,6%, и от99,4% до 100,7%

соответственно, при этом средняя величина его составила 100,04% для марены красильной и 100,1% для сердцелистной. Как видно из данных, приведенных в таблице, в разработанной методике отсутствует систематическая ошибка, относительная ошибка при доверительной вероятности 95% не превышает ±6,50% для марены красильной и ±6,20% для марены сердцелистной (табл. 5.17). Результаты проведённых исследований позволили установить, что разработанные спектрофотометрические методики определения суммы антраценпроизводных в исследуемых лекарственных растениях достаточно воспроизводимы, линейны в исследуемом диапазоне концентраций, непродолжительны по времени выполнения, доступны, реактивы находятся в недорогом ценовом сегменте.

По средствам указанной методики проанализирован ряд промышленных образцов корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной и показано, что содержание суммы антраценпроизводных в образцах сырья варьирует в пределах от 4,32% до 4,55% в марене красильной и от 1,23% до 1,32% в марене сердцелистной (в пересчёте на руберитриновую кислоту) (табл. 5.18) [83].

Таблица 5.18 - Содержание суммы антраценпроизводных в различных образцах корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной

№ п/п. Характеристика образца сырья Содержание антраценпроизводных в пересчете на абсолютно сухое сырье и руберитриновую кислоту, %

1 Корневища и корни марены красильной (Rubia tinctórum L.), заготовленные в марте2016 г. в Краснодарском крае. 4.32±0,28

2 Корневища и корни марены красильной (Rubia tinctórum L.), заготовленные в марте2017 г. в Краснодарском крае. 4.40±0,28

3 Корневища и корни марены красильной (Rubia tinctórum L.), заготовленные в марте2018г. в Краснодарском крае. 4.55±0,29

1 Корневища и корни марены сердцелистной (Rubia cordifólia L.), заготовленные в марте2016г. в Индии. 1.23±0,07

2 Корневища и корни марены сердцелистной(Rubia cordifólia L.), заготовленные в марте2017г. в Индии. 1.27±0,07

3 Корневища и корни марены сердцелистной(Rubia cordifólia L.), заготовленные в марте2018г. в Индии. 1.32±0,08

5.6. Количественное определение суммы антраценпроизводных в лекарственном препарате «Марены красильной экстракт»

Марена красильная является основным компонентом препарата «Марены красильной экстракт», выпускаемый в таблетках по 250 мг № 20 фирмой ЗАО «ВИФИТЕХ» [27]. Стандартизацию данных таблеток необходимо проводить по доминирующему антрагликозиду - руберитриновой кислоте. В ходе изучения полученных спектров водно-спиртового извлечения из корневищ и корней марены красильной, в щёлочно-аммиачной среде, в том числе спектров в условиях дифференциальной спектрофотометрии, было выявлено что водно-спиртовое извлечение препарата «Марены красильной экстракт» в таблетках имеет максимум поглощения, такой же как и извлечение из корневищ и корней марены красильной 510 нм, что обусловлено наличием антраценпроизводных (рис. 5.13 - 5.14) [85].

Соответственно сумма антраценпроизводных может быть рассчитана при аналитической длине волны 510 нм. За стандарт можно принимать доминирующее вещество руберитриновую кислоту (рис. 5.10) [85].

600 700

Рис. 5.13 - Электронные спектры исходного раствора (1) и щёлочно -

аммиачного раствора (2) водно-спиртового извлечения из препарата «Марены красильной экстракт» в таблетках.

Рис. 5.14 - Электронный спектр щёлочно-аммиачного раствора водно-спиртового извлечения из препарата «Марены красильной экстракт» в таблетках в условиях дифференциальной спектрофотометрии.

Нами была проведена экстракция при различных условиях (табл. 5.19). В результате были предложены максимально простые и эффективные в плане выхода веществ условия извлечения антраценпроизводных из таблеток экстракта марены красильной, экстрагентом выступал 80% спирт, соотношение сырья с экстрагентом 1:15, время экстракции - 15 минут при использовании нагревания на бане [7,77].

Таблица 5.19 - Влияние экстрагента на полноту извлечения антраценпроизводных препарата «Марены красильной экстракт» в таблетках

Экстрагент Соотношение Время Содержание

«сырье: экстракции на антраценпроиз-

экстрагент» водяной бане, мин водных в пересчете на руберитриновую кислоту в мг

96% спирт 1:15 15 11,0

80% спирт 1:15 15 11,30

60% спирт 1:15 15 10,80

40% спирт 1:15 15 10,20

Методика количественного определения антраценпроизводных в препарате «Марены красильной экстракт» в таблетках.

Навеску растолчённых таблеток препарата «Марены красильной экстракт» весом 0,5 г (точную навеску) переносят в колбу с притертым шлифом вместимостью 100 мл, добавляют 15 мл 80% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Охлажденный и отфильтрованный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, затем раствор доводят до метки 80% спиртом тщательно перемешивают (испытуемый раствор А). 1,0 мл раствора А погружают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки щелочно-аммиачным раствором, приготовленным в соответствии с требованиями ГФ РФ XIV издания (испытуемый раствор Б). После охлаждения измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 510 нм (рис. 5.13 - 5.14) [85].

В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 80% до метки. Содержание суммы антраценпроизводных рассчитывают по формуле (5) [85].

Х_Е х 50 х 25 х Pc х 1000

= m х 520 х 1 х 100 , :

Е- оптическая плотность испытуемого раствора;

m - масса навески растертых таблеток экстракта марены красильной;

Рср- средняя масса одной таблетки, г;

520 - удельный показатель поглощения руберитриновой кислоты.

Для предложенной методики были рассчитаны метрологические характеристики, результаты представлены в таблице ниже (табл. 5.20). Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения суммы антраценпроизводных «Марены красильной экстракт» в таблетках имеет значение ±6,60% [85].

Таблица 5.20 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы антраценпроизводных в препарате «Марены красильной экстракт» в таблетках

f S P, % t (Pf AX E, %

10 11,31 0,336 95 2,23 ±0,74 ±6,60

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5

1. На основе результатов химического исследования корневищ и корней марены красильной, марены сердцелистной разработаны новые методические и методологические подходы к стандартизации сырья.

2. Разработаны методики качественного анализа корневищ и корней марены красильной и марены сердцелистной с использованием методов тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии с целью обнаружения доминирующего диагностически значимого антраценпроизводного - руберитриновой кислоты.

3. Разработана методика количественного анализа суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной в пересчёте на руберитриновую кислоту. Содержание суммы антраценпроизводных варьирует от 4,32±0,28% до 4,70±0,3%. Соответственно, в качестве нижнего предела содержания суммы антраценпроизводных в сырье марены красильной рекомендовано значение не менее 4,0%. Данные статистической обработки исследований указывают на то, что ошибка единичного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены красильной ±6,50%.

4. Разработана методика количественного анализа суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной в пересчёте на руберитриновую кислоту. Содержание суммы антраценпроизводных варьирует от 1,23±0,08% до 1,32±0,08%. Соответственно, в качестве нижнего предела содержания суммы антраценпроизводных в сырье марены сердцелистной рекомендовано значение не менее 1,0%. Данные статистической обработки исследований указывают на то, что ошибка единичного определения суммы антраценпроизводных в корневищах и корнях марены сердцелистной ±6,20%.

5. Разработана методика количественного анализа суммы антраценпроизводных в лекарственном растительном препарате «Марены красильной экстракт» в таблетках. Содержание суммы антраценпроизводных варьирует от 10,2 мг до 11,3 мг.

6. Рассчитаны числовые показатели для корневищ и корней марены красильной, марены сердцелистной, такие как количественное содержание, влажность, зола, органические и минеральные примеси.

7.Рассчитаны валидационные характеристики методик количественного определения для корневищ и корней марены красильной, марены сердцелистной по показателям линейность, правильность, прецизионность.

8. Предложенные методики качественного и количественного анализа, а также числовые показатели включены в проект фармакопейной статьи «Марены сердцелистной корневища и корни», а также в дополнения к ФС 2.5.0083.18 «Марены красильной корневища и корни» (раздел «Подлинность» и «Количественное определение»).

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ПОДБОР МЕТОДИК ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ МАРЕНЫ КРАСИЛЬНОЙ

В настоящее время фармацевтический рынок располагает достаточно большим ассортиментом различных лекарственных форм из лекарственного растительного сырья. Промышленность производит сиропы, таблетки, капсулы и многие другие формы [134]. Известно, что твёрдые лекарственные формы (таблетки, капсулы) пользуются большей популярностью у населения. Заболевания почек, в том числе, мочекаменная болезнь занимает не последнее место в списке распространенных патологических состояний мочеполовой системы. Это связанно с неправильным образом жизни, в частности, с питанием и нарушением питьевого режима, экологией и другими факторами [13]. Наряду с химическими лекарственными препаратами, не меньшей популярностью пользуются и растительные лекарственные препараты, например, средства из сырья марены красильной. Марена красильная известна своим действием за счёт содержания антраценпроизводных ализаринового ряда [55]. В Российской Федерации зарегистрированы и используются следующие лекарственные препараты, на основе сырья марены: «Марены красильной экстракт в таблетках», «Марелин» [59]. Таким образом, перспективной является разработка состава, подбор методики получения и стандартизации лекарственных растительных препаратов на основе марены красильной (Rubia tinctórum L.).

6.1. Разработка способа получения и стандартизации лекарственного препарата «Марены красильной экстракт в капсулах»

В настоящее время в РФ марена красильная применяется в виде препарата «Марены красильной экстракт» в таблетках [63]. Несмотря на распространённость и доступность этих таблеток, они имеют ряд недостатков: отсутствие на

поверхности таблетки плёночной оболочки снижает её биодоступность, так как вещества подвергаются действию соляной кислоты, следствием этого является увеличение кратности приёма препарата, а также ограничение питьевого режима, для достижения в плазме крови концентрации антраценпроизводных достаточной, для желаемого фармакологического эффекта [35,36]. В связи с этим нами был разработан состав и подобрана методика получения экстракта для новой лекарственной формы «Марены красильной экстракт в капсулах», с содержанием действующих веществ больше, чем в таблетках, в сочетании со вспомогательными веществами, снижающими уровень аллергенности.

Разработанная нами лекарственная форма удобна в применении, обладает высокой биодоступностью, что даёт возможность снизить кратность приёма капсул, за счёт кишечнорастворимой оболочки [86].

Ранее нами была обоснована целесообразность стандартизации сырья марены по содержанию доминирующей группы биологически активных соединений - антраценпроизводных.

Чтобы привести методы анализа сырья и разработанных лекарственных препаратов к единому знаменателю, за прототип были взяты методики анализа, изложенные при разработке стандартизации, корневищ и корней марены красильной (глава 5) [84].

6.1.1. Подбор методики изготовления густого экстракта марены красильной

Изготовление капсул марены красильной в лабораторных условиях начинали с получения густого экстракта. Получение экстракта марены возможно несколькими известными способами: методом перколяции (от лат. регсоЫю -процеживание), т.е. процеживание экстрагента через растительный материал, для повышения выхода конечного продукта, используется многократная и повторная перколяция сырья (реперколяция), а также методом мацерации [66,67,91].

В результате проведения исследований, наиболее эффективным способом получения экстракта оказался подобранный нами метод дробной мацерации с

ультразвуком. Экстракт марены красильной для изготовления капсул был получен методом дробной мацерации с ультразвуком в соотношении «сырье - экстрагент» (1:10), экстрагент - 80% спирт.

Экстрагент делят на 3 части и последовательно настаивают сырьё с новой порцией экстрагента, что позволяет максимально истощить сырьё. Настаивание с первой порцией экстрагента составляет 24 ч, со второй 12 ч, с третьей 12 ч. Общее время настаивания - 48 ч, затем проводят 30 мин экстракцию на кипящей водяной бане, при температуре 90°С и 15 мин проводят экстракцию с помощью ультразвука, при температуре 40°С, мощности ультразвука 60Вт и частоте 40кГц, далее извлечение фильтруют [74,86]. Полученное водно-спиртовое извлечение корневищ и корней марены красильной упаривают до густого экстракта с содержанием влаги не более 25 %. Данный метод даёт наиболее полную экстракцию действующих веществ, по сравнению с другими способами получения экстракта: содержание суммы антраценпроизводных в густом экстракте марены красильной, полученном методом дробной мацерации с ультразвуком, в пересчёте на руберитриновую кислоту, составляет 12,6±0,03%, результаты количественного содержания антраценпроизводных в густом экстракте представлены в таблице 6.1 [86].

Таблица 6.1 - Результаты количественного содержания суммы антраценпроизводных в густом экстракте марены красильной корневищ и корней

на спирте 80% (1:10) в зависимости от способа получения

№ Метод экстрагирования Содержание суммы антраценпроизводных в пересчёте на руберитриновую кислоту, %

1 Мацерация 10,56±0,7

2 Дробная мацерация с ультразвуком 12,61±0,8

3 Перколяция 11,42±0,7

4 Реперколяция 11,72±0,7

экстракте марены красильной

Во время выполнения исследования нами была приведена методика количественного определения суммы антраценпроизводных в сырье марены красильной в пересчете на руберитриновую кислоту. Максимумы электронных спектров густого экстракта марены красильной и водно-спиртового извлечения из сырья марены совпадают и находятся при 510±2 нм (рис. 6.1), что также соответствует максимуму поглощения раствора руберитриновой кислоты (рис. 5.7). Следовательно, значение 510 нм может быть использовано в качестве аналитической длины волны, а в качестве стандарта можно использовать доминирующий антрагликозид - руберитриновую кислоту [86].

300 400 500 600 700

Wavelen.at]l(tшl)

Рисунок 6.1 - Электронный спектр щёлочно-аммиачного раствора густого экстракта, полученного методом дробной мацерации с ультразвуком из корневищ

и корней марены красильной. Методика количественного определения суммы антраценпроизводных в густом экстракте марены красильной. Навеску густого экстракта массой (0,2000 г) вводят в мерную колбу объемом 100 мл, добавляют 50 мл 80% спирта.

Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Охлажденный и отфильтрованный раствор

переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл. Процедуру повторяют дважды, каждый раз фильтруя извлечение в ту же мерную колбу через тот же фильтр. При потере массы её доводят 80% спиртом и тщательно перемешивают (раствор А) [86]. 1,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объём раствора до метки щёлочно-аммиачным раствором, приготовленным в соответствиями с требованиями Государственной фармакопеи РФ XIV издания, и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при аналитической длине волны 510 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом 80% до метки [12]. Количественное содержание действующих веществ рассчитывают в пересчёте на доминирующее вещество руберитриновую

кислоту в густом экстракте и вычисляют по формуле (6) [86]:

х = Ех50х50 (6), где: т х 520х1

Е - оптическая плотность испытуемого раствора; т - масса навески густого экстракта, г;

Е1%