Совершенствование основных этапов технологии реконструирования яйцеклеток млекопитающих при использовании кариопластов и цитопластов различного происхождения и состояния тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Леонтьев, Алексей Александрович

• Леонтьев, Алексей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Леонтьев, Алексей Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Источники донорских ядер.

1.2. Источники реципиентной цитоплазмы, факторы репрограммиро-вания.

1.3. Синхронизация клеточных циклов донорского ядра и реципиентной цитоплазмы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. Объекты и методы исследований.

2.1. Получение клеток источников цитопластов.

2.2. Получение клеток источников кариопластов.

2.3. Реконструирование клеток.

2.4. Слияние кариопластов с цитопластами.

2.5. Активация.

2.6. Культивирование.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка способа энуклеации яйцеклеток и трансплантации в них кариопластов.

3.2. Эффективность различных вариантов активации интактных ооци-тов мышей с целью получения цитопластов для реконструирования клеток.

3.3. Получение культур клеток сперматогоний и фибробластов взрослых животных для использования их в качестве источников кариопластов.

3.4. Электрослияние цитопластов с кариопластами разных размеров и различного происхождения.

3.5. Эффективность реконструирования яйцеклеток мышей в зависимости от состояния цитопластов.

3.6. Эффективность репрограммирования кариопластов, полученных из бластомеров 2-клеточныхЦу1ышиных эмбрионов, в зависимости от стадии их клеточного цикла.

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование основных этапов технологии реконструирования яйцеклеток млекопитающих при использовании кариопластов и цитопластов различного происхождения и состояния»

Актуальность исследований. Исследования по разработке технологии клонирования наиболее интенсивно стали развиваться с 1997 года - после получения овечки Долли, когда было показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные клетки, обладающие тотипо-тентными свойствами, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для реконструирования клеток с целью клонирования животных (Wilmut I. et al., 1997). В настоящее время в мире получено потомство нескольких видов животных из клеток, реконструированных при использовании в качестве кариопластов ядер клеток взрослых животных (Wakayama Т. et al., 1998; Wells D. et al., 1998,1999; Kubota K. et al., 2000). Однако, несмотря на то, что за последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, они пока в большей степени носят эмпирический характер, поэтому положительные результаты сильно варьируют от эксперимента к эксперименту. Основной причиной такой нестабильности результатов является недостаточность фундаментальных знаний о глубинных механизмах, обусловливающих процесс репрограммирования кариопластов цитопластами, и факторов, влияющих на этот процесс.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что в лучших экспериментах при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных у некоторых видов млекопитающих удается получить определенный процент бластоцист (20%- у овец: Schnieke А. et al., 1997; Wilmut I. et al., 1997; до 40%- у мышей: Wakayama Т. et al., 1998; до 20%- у крупного рогатого скота: Kato Y. et al., 1998), однако средние показатели получения живого потомства у этих видов варьируют от 1 до 3% от числа пересаженных эмбрионов (Wilmut I. et al.,1997; Wakayama Т. et al., 1998). Такие низкие показатели получения клонированного потомства большинство исследователей объясняет следствием ненадлежащего репрограммирования кариопласта цитопластом, что приводит ко многим аномалиям эмбрионального развития.

Успешное получение потомства в результате пересадки ядер достигается только при благоприятном взаимодействии сложнейших механизмов и регулирующих их факторов, многие из которых в настоящее время еще плохо изучены.

От момента получения клеток источников цитопластов и клеток- доноров кариопластов до получения живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и огромное количество еще не понятных механизмов, препятствующих развитию реконструированных клеток. Поэтому, в настоящее время ученые, занятые проблемой клонирования животных, вынуждены вернуться к постепенным, последовательным более глубоким исследованиям каждого этапа технологии клонирования. Начиная от исследований влияния полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов и кончая исследованиями о влиянии клеточного цикла кариопластов и действия электрического импульса на дальнейшее развитие реконструированных клеток.

Уже первые результаты этих исследований показали, что некоторые методические приемы, используемые ранее при реконструировании клеток, оказывают существенное отрицательное влияние на развитие как эмбриона, так и плода. Так выявлено, что использование коротковолновых флюорохромов (типа Hoechst 33342) для полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов, оказывает отрицательное влияние на поздних стадиях развития плода, которое не было отмечено на ранних стадиях развития реконструированных клеток (Dominko Т. et al., 1993).

В связи с начавшимся широким использованием ядер соматических клеток взрослых животных в качестве кариопластов при реконструировании клеток, возникли проблемы с электрослиянием из-за уменьшения площади контакта между цитопластом и мелкими кариопластами. Чтобы повысить процент слияния исследователи вынуждены повышать напряжение электрического импульса, что приводит к длительной дестабилизации цитоплазматической мембраны цитопласта и снижению жизнеспособности реконструированных клеток. Кроме того, из-за различий между типами клеток по биохимическим свойствам липидов клеточных мембран необходимо оптимизировать параметры и условия электрослияния для каждой клеточной линии.

Для того, чтобы происходило дальнейшее развитие реконструированных клеток необходимо активировать цитопласт, то есть индуцировать в нем программу развития первоначально контролируемую материнским организмом, освобождая его от мейотической задержки. После пересадки ядра нормальное развитие реконструированной клетки будет зависеть от способности цитопласта ремоделировать структуру хроматина и соответствующим образом репрограммировать характер экспрессии генов карио-пласта. Зрелый цитопласт содержит материнские транскрипты РНК и белки, которые направляют развитие дробящегося эмбриона до нормального времени активации собственного генома эмбриона, когда эмбриональные ядра начинают синтез своей собственной РНК, направляющей эмбриогенез.

Установлено, что у млекопитающих активация яйцеклеток индуцированная сперматозоидом в процессе оплодотворения сопровождается серией повторных временных повышений уровня внутриклеточного свободного кальция, которые продолжаются несколько часов. В последнее время предпринимаются многочисленные попытки искусственно активировать яйцеклетки с помощью физических и химических агентов, однако проблема остается еще далеко не решенной.

Некоторые успехи в получении живого потомства при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных достигнуты благодаря исследованиям влияния стадии клеточного цикла донорского ядра и цитопласта- реципиента на развитие реконструированных клеток (Campbell К. et al., 1996). Эти первые немногочисленные исследования показали, что для нормального развития реконструированных клеток необходима координация клеточных циклов кариопласта и цитопласта, чтобы обеспечить в реконструированной клетке диплоидный набор хромосом после первого деления дробления.

Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии клонирования, основанной на трансплантации ядер диплоидных клеток в энуклеированные яйцеклетки, исследования должны быть направлены на изучение процессов, происходящих при осуществлении каждого этапа технологии и на их совершенствование.

Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение факторов лимитирующих процесс реконструирования яйцеклеток и на основе полученных результатов усовершенствовать основные этапы технологии клонирования млекопитающих.

Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

- выявить факторы, лимитирующие полноту удаления ядерного материала из яйцеклеток при получении цитопластов, и разработать способы, . позволяющие более четко визуализировать хроматин в неоплодотворен-ных яйцеклетках;

- определить факторы, лимитирующие процесс удаления хроматина из яйцеклеток, и разработать более эффективный способ их энуклеации;

- изучить состояние популяций сперматогенных клеток в семенниках мышей и быков разных возрастов и разработать способы их получения и сохранения с целью использования в качестве кариопластов при реконструировании яйцеклеток;

- изучить эффективность реконструирования мышиных яйцеклеток в зависимости от состояния цитопластов, полученных из различных реци-пиентных клеток (неоплодотворенных яйцеклеток и зигот);

- изучить эффективность репрограммирования кариопластов, полученных из бластомеров 2-клеточных эмбрионов в зависимости от стадии их клеточного цикла.

Научная новизна исследований.

Впервые в исследованиях на мышах с точно фиксированным временем осеменения определены фазы клеточного цикла кариопластов, оптимальные для репрограммирования цитопластами, полученными из неоплодо-творенных яйцеклеток. Установлено, что кариопласты, выделенные из бластомеров 2-клеточных эмбрионов, находящихся в фазе G1 клеточного цикла лучше репрограммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с кариопластами, находящимися в фазах S и G2 клеточного цикла.

Впервые изучена возможность получения, сохранения в культуре и использования в качестве кариопластов, при реконструировании клеток, сперматогоний мышей и быков разного возраста. Выявлены факторы, лимитирующие процесс удаления хроматина из яйцеклеток млекопитающих и разработан эффективный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток.

Впервые определены оптимальные режимы комбинированной химической активации яйцеклеток, позволяющие более четко визуализировать хроматин и полностью удалять его при получении цитопластов.

Практическая значимость.

Разработанный способ энуклеации и реконструирования яйцеклеток с использованием разреза в прозрачной оболочке может быть использован в биотехнологии клонирования для повышения эффективности реконструирования эмбрионов, так как обладает преимуществами перед известными способами по простоте и скорости исполнения, обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток.

Комбинированные способы химической активации интактных ооцитов, включающие обработку цитохалазином Б, могут быть использованы с целью создания четкой картины расположения ядерного материала в ооци-тах, и тем самым обеспечить полное его извлечение при энуклеации.

Результаты исследований полученные при определении фаз клеточного цикла кариопластов, оптимальных для репрограммирования цитопла-стами, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих.

Модификации способа электрослияния комплекса сперматогония- ци-топласт могут быть с успехом использованы для электрослияния с цито-пластом кариопластов соматических клеток малых размеров (10-15 мкм).

Положения выносимые на защиту

1. Разработанный способ энуклеации яйцеклеток, путем вырезания фрагмента блестящей оболочки, позволяет упростить и ускорить процесс реконструирования клеток и обеспечивает высокую сохранность оперируемых клеток.

2. Разработанные комбинированные способы химической активации интактных яйцеклеток, позволяют четко визуализировать ядерный материал и обеспечивают его полное удаление из неоплодотворенных яйцеклеток при получении цитопластов.

3. Кариопласты, полученные из бластомеров 2-клеточных эмбрионов мышей, находящиеся в фазе G1 клеточного цикла, лучше репро-граммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с ядрами, находящимися в фазах S и G2 клеточного цикла.

4. Повышение контакта между кариопластом и цитопластом с помощью фитогемагглютинина и центрифугирования достоверно повышает эффективность электрослияния кариопластов малых размеров.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчётных сессиях ВНИИФБиП в период с 1999 по 2002г., а также на:

- второй международной научной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - ВНИИ сельхоз. биотехнологии, Москва, 18-19 октября 2000 г.

- международной научной конференции «ДНК - технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, Дубровицы, 12 ноября 2001г.

- международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, Дубровицы, 19-20 ноября 2002г.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Клонирование эмбрионов с помощью ядерной пересадки включает перенос генетического материала из донорской клетки (кариопласта) в цитоплазму ооцита или зиготы, из которых удален генетический материал (цитопласт).

В проблеме клонирования, кроме методических трудностей, связанных с удалением и переносом ядра в яйцеклетку, остается нерешенным важный вопрос об источнике донорских ядер, которые должны обладать то-типотентными свойствами.

В настоящее время известны многие факторы, влияющие на эффективность клонирования эмбрионов с помощью ядерной пересадки. Они включают: стадию развития и клеточный цикл донорских клеток, выбор ре-ципиентных клеток, методы активации ооцитов, координацию клеточного цикла между донорской клеткой и цитопластом реципиента и слияния ядра донора с цитопластом реципиента.

Развитию метода трансплантации ядер и получения клонированных животных посвящено несколько обзоров (Васецкий С.Г.,1986; Ротт Н.Н., 1987; Конюхов Б.В.,1997; Струнников В.А.,1998; Wolf Е. et al.,1998; Лагутина И.С., Галат В.В.,2001).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Леонтьев, Алексей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Кариопласты, полученные из бластомеров 2-клеточных мышиных эмбрионов, находящихся в фазе G1 клеточного цикла, достоверно лучше репрограммируются цитопластами в реконструированных клетках, по сравнению с кариопластами, находящихся в фазах S и G2.

2. Разработан способ энуклеации яйцеклеток и зигот млекопитающих, позволяющий значительно упростить и ускорить процесс получения цито-пластов, и обеспечивающий высокую сохранность оперируемых клеток.

3. Разработаны способы комбинированной химической активации яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II, обеспечивающие более четкую визуализацию ядерного хроматина в виде пронулеусоподобного образования, с целью его полного удаления при энуклеации.

4. Модифицированы способы получения и сохранения сперматогоний типа А из семенников неполовозрелых и половозрелых быков и мышей с целью использования их в качестве источников кариопластов в работах по клонированию млекопитающих.

5. Повышение контакта между кариопластом и цитопластом с помощью фитогемагглютинина и центрифугирования достоверно повышает эффективность электрослияния кариопластов малых размеров (15-20 мкм) с цитопластами в модифицированной среде Циммермана.

6. Цитопласты, полученные из зигот, достоверно лучше сливаются с кариопластами, полученными из бластомеров 2-клеточных мышиных эмбрионов, под действием прямоугольного импульса постоянного электрического тока, по сравнению с цитопластами, полученными из неоплодотво-ренных яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II.

7. Заключение эксплантатов кожи уха взрослых животных в сгусток плазмы после семидневного "лаг-периода" обеспечивает интенсивный выход из них фибробластов, необходимых для использования в качестве кариопластов при клонировании животных с установленными положительными признаками.

8. Не выявлено существенных различий в эффективности электрослияния цитопластов с кариопластами и активации реконструированных клеток в зависимости от фазы клеточного цикла кариопластов, при использовании в качестве цитопластов энуклеированных яйцеклеток и в качестве кариопластов бластомеров 2-клеточных эмбрионов мышей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагаемый "способ энуклеации яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих" может широко использоваться в биотехнологии клонирования млекопитающих для повышения эффективности реконструирования эмбрионов, так как позволяет упростить и ускорить процесс микроманипулирования, обеспечивает высокую сохранность оперируемых яйцеклеток.

2. Комбинированные способы химической активации, включающие обработку цитохалазином Б, могут использоваться в ядерной пересадке как для активации ооцитов до энуклеации (интактные ооциты), так и после энуклеации (цитопласты) и после слияния кариопласта с цитопластом (реконструированные клетки).

3. При использовании в качестве цитопластов неактивированных энук-леированных МП ооцитов, для ядерной пересадки целесообразно использовать кариопласты находящиеся на G1 стадии клеточного цикла

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Леонтьев, Алексей Александрович, 2003 год

1. Васецкий С.Г. Пересадка ядер в яйцеклетки млекопитающих //Онтогенез 1986.Т. 17. № 3. С. 229-233.

2. Беликов В.Ю. Влияние условий созревания ооцитов мышей in vitro на их способность к партеногенетической активации под действием циклогексимида и этанола // Онтогенез 1986. Т. 17. № 1. С. 93-97.

3. Галат В.В., Лагутина И.С., Мезина М.Н., Прокофьев М.И. Влияние сывороточного голодания на эффективность репрограммирования ядер эмбриональных фибробластов кролика // Онтогенез 1999. Т. 30. № 6. С. 411416.

4. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М., Пичуги-на Е.М., Фрейдин М.И., Черников В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагностики наследственных болезней // Методы культивирования клеток. Л. Наука, 1987, с. 250-257.

5. Дыбан А.П., Нониашвили Е.М. Изучение факторов, определяющих частоту и пути партеногенетического развития яйцеклеток мыши, активированных этанолом // Онтогенез 1986. Т. 17. № 2. С. 165-175.

6. Захарченко В.И., Прокофьев М.И. О методах клеточной инженерии ранних зародышей с.-х. животных // Сельскохозяйственная Биология. 1990. №2. С. 51-53.

7. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Прокофьев М.И., Эрнст Л.К. Трансплантация ядер в созревшие ооциты крупного рогатого скота // Вестник РАСХН. 1993. № 4. С. 51-52.

8. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Захаров А.В., Прокофьев М.И. Исследование влияния некоторых факторов на развитие клонированных эмбрионов кролика // Доклады РАСХН. 1993. № 5. С. 26-29.

9. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Прокофьев М.И. Эмбрионы кролика с трансплантированными ядрами // Аграрная наука. 1994. № 1. С. 35.

10. Конюхов Б.В. Клонирование позвоночных: успех и проблемы//Генетика 1997. Т. 33. № 1. С. 1605-1620.

11. Лагутина И.С., Галат В.В. Клонирование млекопитающих // Онтогенез. 2001. Т. 32. № 3. С. 180-195.

12. Лагутина И.С., Мезина М.Н., Прокофьев М.И., Черных В.Я., Галат В.В. Влияние возраста клеток- доноров ядер на эффективность развития клонированных эмбрионов кролика // Онтогенез 2001. Т. 32. № 2. С. 130139.

13. Лагутина И.С., Мезина М.Н., Прокофьев М.И., Захарченко В.И., Галат В.В. Исследование факторов, влияющих на эффективность электрослияния энуклеированных яйцеклеток с клетками- донорами ядер // Онтогенез 2002. Т. 33. № 2. С. 100-106.

14. Мушкамбаров Н.Н., Волкова Н.П., Николаев А.Я. Стабильность и жизнеспособность сперматогенных клеток после их выделения и фракционирования // Цитология 1982. Т. XXIV. № 6. С. 719-722.

15. Мушкамбаров Н.Н. Специальные методы исследования изолированных сперматогенных клеток // Цитология 1983. Том XXV. № 3. С. 352-356.

16. Никитин В.А. Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом // Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1986. 123 с.

17. Ротт Н.Н. Новые данные о пересадках ядер у млекопитающих // Онтогенез 1987. Т. 18. № 4. С. 341-344.

18. Струнников В.А. Клонирование животных: теория и практика // Природа 1998. № 7. С. 3-9.

19. Фонбрюн П. Методы микроманипуляций // М. Издательство иностранной литературы. 1951. 175 с.

20. Хайман Д., Полдинг А. Культивирование фибробластов человека для исследования хромосом // Новые методы культуры животных тканей. 1976. с. 197-221.

21. Хамидов Д.Х., Коваль Т.Ю., Шаюнусова Д., Гончарова Е. Партеноге-нетическая активация созревших in vivo ооцитов мыши под действием циклогексимида // Онтогенез 1990. Т. 21. № 4. С. 432-434.

22. Barnes F.L., Robl J., First N. Nuclear transplantation in mouse embryos: assesment of nuclear function // J. Biol. Reprod. 1987. V. 36. № 5. P. 12671274.

23. Bellve A. Spermatogenic cells of the prepuberal mouse. Isolation and morphological characterization // J. Cell Biology. 1977. V. 74. № 1. P. 68-85.

24. Berardino M., Hoffner M. Development and chromosomal constitution of nuclear transplants derived from male germ cells // J. of Exp. Zoology 1971. V. 176. № 1. P. 61-72.

25. Blow J.J., Laskey R.A. A role for the nuclear envelope in controlling DNA replication within the cell cycle // J. Nature 1988. V. 332. P. 546-548.

26. Bondioli K.R., Weshusin M.E., Looney R. Production of identifical bovine offspring by nuclear transfer // J. Theriogenology 1990. V. 33. № 1. P. 165174.

27. Boquest A.C., Day B.N., Prather R.S. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells // J. Biol. Reprod. 1999. V. 60. № 4. P. 1013-1019.

28. Briggs R., King F. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs eggs // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1952. V. 38. P. 455-463.

29. Camous S., Kopechy V., Flechon J. Autoradiographic detection of theearliest stage of (3H)- uridine incorporation into the cow embryo 11 J. Biol. Cell. 1986. V. 58. P. 195-200.

30. Campbell K.H.S., Loi P., Cappai P., Wilmut I. Improved development to blastocyst of ovine nuclear transfer embryos reconstructed during the presumptive S- phase of enucleated activated oocyte // J. Biol. Reprod. 1994. V. 50. P. 1385-1393.

31. Campbell K.H.S., McWhir J., Ritchie W.A. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line // J. Nature 1996. V.380. P. 64-66.

32. Cheong H.T., Takahashi Y., Kanagawa H. Birth of mice after transplantation of early cell- cycle- stage embryonic nuclei into enucleated oocytes // J. Biol. Reprod. 1993. V. 48. P. 958-963.

33. Cheong H.T., Takahashi Y., Kanagawa H. Relationship between nuclear remodeling and subsequent development of mouse embryonic nuclei transferred to enucleated oocytes // J. Mol. Reprod. Dev. 1994. V.37. P. 138-145.

34. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts // J. Science 1998. V. 280. № 5367. P. 1256-1258.

35. Collas P., Balise J., Hofmann G., Robl J. Electrical activation of mouse oocytes // J. Theriogenology 1989, V. 32. № 5. P. 835-843.

36. Collas P., Robl J.M. Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo // J. Biol. Reprod. 1990. V. 43. P. 877-884.

37. Collas P., Robl J.M. Development of rabbit nuclear transplant embryos from morula and blastocyst stage donor nuclei // J. Theriogenology 1991a. V. 35. № l.P. 190.

38. Collas P., Robl J.M. Relationship between nuclear remodelling and development in nuclear transplant rabbit embryos // J. Biol. Reprod. 1991b. V. 45.1. P. 455-465.

39. Collas P., Balise J.J., Robl J.M. Influence of cell cycle stage of the donor nucleus on the development of nuclear transplant rabbit embryos // J. Ihib. 1992a. V. 46. P. 492-500.

40. Collas P., Pinto-Correia C., Ponce De Leon F.A., Robl J.M. Effect of donor cell cycle stage on chromatin and spindle morphology in nuclear transplan-tant rabbit embryos // J. Biol. Reprod. 1992b. V. 46. P. 501-511.

41. Crosby I., Gandolfl F., Moor R. Control of protein syntesis during early cleavage of sheep embryos // J. Reprod. Fertil. 1988. V. 82. P. 769-775.

42. Cuthbertson K. Parthenogenetic activation of mouse oocytes in vitro with ethanol and bensyl alcohol // J. of Experimental Zoology 1983. V. 226. P. 311314.

43. Czolowska R., Modlinski J., Tarkowski S. Behavior of thymocyte nuclei in non- activated and activated mouse oocytes // J. Cell Sci. 1984. V. 69. P. 1934.

44. Czolowska R., Szollosi D., Szollosi M. Changes in embryonic 8- cell nuclei transferred by means of cell fusion to mouse eggs // J. Dev. Biol. 1992. V. 36. P. 543-553.

45. Davis J.S., Schuetz F. Separation of germinal cells from immature rat testes by sedimentation at unit gravity // J. Experimental Cell Research 1975. V. 91. №1. P. 79-86.

46. Ege Т., Ringertz N. Viability of cells reconstituted by virusinduced fusion of minicells with anucleate cells // J. Exp. Cell Res. 1975. V. 94. P. 469-473.

47. Flash G., Johnson M., Braude P. et al., The transition from maternal to embryonic control in the 2-cell mouse embryo // The EMBO Journal. 1982. V. l.P. 681-686.

48. Fulka J. Jr., Jung R.M., Moor R.M. The fall of biological Maturation Promoting Factor (MPF) and histore HI kinase activity during anaphase to telophase is mouse oocytes // J. Molec. Reprod. Devel. 1992. V. 32. P. 378-382.

49. Fulka J., Notarianni E., Passoni L., Moor R. Early changes in embryonicnuclei fused to chemically enucleated mouse oocytes 11 Int. J. Dev. Biol. 1993. V. 37. P. 433-439.

50. Fulka Jr.J., Moor R., Fulka J. Sister chromatid separation and the meta-phase to anaphase transition in mouse oocytes // J. Dev. Biol. 1994. V. 165. P. 410-417.

51. Fulka J.Jr., Ouhibi N., Fulka J. et al. Chromosome condensation activity (CCA) in bisected C57BL/6J*CBA mouse oocytes // J. Reprod. Fertil. Devel. 1995. V. 7. P. 1123-1127.

52. Fulka J.Jr., First N.L., Moor R.M. Nuclear transplantation in mammals: remodeling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor// J. BioEssays. 1996. V. 18. № 10. P. 835-840.

53. Fulka J., First N., Moor R. Oocyte specific modulation female pronu-clear development in mice // J. Dev. Biol. 1996. V. 25. № 178. P. 1-12.

54. Galat V.V., Lagutina I.S., Mesina M.N. et al. Development potential of rabbit nuclear transfer embryos derived from donor fetal fibroblasts // J. Therio-genology 1999. V. 51. № 1. P. 203.

55. Goto Y., Kaneyama K., Kobayashi S. Birth of cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of a dairy cow // J. Anim. Sci. 1999. V. 70. (4) P.243-245.

56. Gurdon J.B. The transplantation of living cell nuclei // Adv. Morphol. 1964. V. 4. P. 1-41.

57. Gurdon J.B. The control of gene expression in animal development // L.; N. Y. 1974. P. 183.

58. Hashimoto N., Kishimoto T. Regular meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation- promoting factor during mouse oocyte maturation // J. Devel. Biol. 1988. V. 126. P. 242-252.

59. Hocherean de Rivers M. Variation in the stock of testicular stem cells and the yield of spermatogonial divisions in rat and bull testes // Andrologia 1976. 8: 137.

60. Howlett S.K., Bolton V. Sequence and regulation of morphological andmolecular events during the first cell cycle of mouse embryogenesis // J. Em-bryol. Exp. Morphol. 1985. V. 87. P. 175-206.

61. Howlett S.K., Barton S.C., Surani M.A. Nuclear cytoplasmic interactions following nuclear transplantation in mouse embryos // J. Development. 1987. V. 101. P. 915-923.

62. Huckins C. Evolution of gonocyte in the rat testis // Arch. Anat. Histol. Embryol. 1968. V. 51. P. 341.

63. Ilmensee K., Hoppe PC. Nuclear transplantation in Mus musculus: Developmental potential of nuclei from preimplantation embryos // Cell. 1981. 23: 9-18.

64. Johnson R., Rao P. Mammalian cell fusion: induction of premature chromosome condensation in interphase nuclei // J. Nature 1970. V. 226. P. 717-722.

65. Jung Т., Moor R.M., Fulka J.Jr. Kinetics of MPF and histone HI kinase activity differ during the G2- to M-phase transition in mouse oocytes // Int. J. Devel. Biol. 1993. V. 37. P. 595-600.

66. Kane M. T. Energy substrates and culture of single cell rabbit ova to blastocysts // J. Nature (London) 1972. V. 238. P. 468-469.

67. Kanka J., Fulka J.Jr., Fulka J., Petr J. Nuclear transplantation in bovine embryo: Fine structure and autoradiographic studies // J. Mol. Reprod. Devel. 1991. V. 29. P. 110-116.

68. Kato Y., Tsunoda Y. Synchronous division of mouse two- cell embryos with nocodazole in vitro // J. Reprod. Fert. 1992. V. 95. P. 39-43.

69. Kato Y., Tani Т., Sotomaru Y. et al. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult // J. Science 1998. V. 282. P. 2095-2098.

70. Kaufman M., Sachs L. Complete preimplantation develompment in culture of parthenogenetic mouse embryos // J. Embryol. Exp. Morph. 1976. V. 35. P. 179-190.

71. Kaufman M. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryos following activation by ethanol treatment // J. Embryol. Exp. Morph. 1982. V. 71. P. 139-154.

72. Kaufman M. Early Mammalian development: Parthenogenetic studies I I Cambridge Univ. Press. Cambridge, London, 1983. P. 1-259.

73. Keefer C.L., Stice S.L., Matthews D.L. Bovine inner cell mass cells as donor nuclei in the production of nuclear transfer embryos and calves // J. Biol. Reprod. 1994. V. 50. № 4. P. 935-939.

74. Kimura Y., Yanagimachi R. Development of normal mice from oocytes injected with secondary spermatocyte nuclei // J. Biol. Reprod. 1995. V. 53. P. 855-862.

75. Kimura Y., Yanagimachi R. Mouse oocytes in injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring // J. Development 1995. V. 121. P. 2397-2405.

76. Kimura Y., Tateno H., et al. Factors affecting meiotic and developmental competence of primary spermatocyte nuclei into mouse oocytes // J. Biol. Reprod. 1998. V. 59. P. 871-877.

77. Kluin P., Rooy D. A comparison between the morphology and cell kinetics of gonocytes and adult type undifferentiated spermatogonia in the mouse // J. of Andrology 1981. V. 4. № 4. P. 475-493.

78. Kono Т., Kwon O.Y., Nakahara T. Development of enucleated mouse oocytes reconstituted with embryonic nuclei // J. Reprod. Fert. 1991. V. 93. P. 165172.

79. Kono Т., Kwon O.Y., Watanaba Т., Nakahara T. Development of mouse enucleated oocytes receiving a nucleus from different stages of the second cell cycle // J. Reprod. Fert. 1992. V. 94. P. 481-487.

80. Kubiak J.Z., Weber M., de Pennart H. et al. The metaphase 2 arrest in mouse oocytes is controlled through microtubule dependent destruction of cy-clin В in the presence of CSF // EMBO J. 1993. V. 12. P. 3773-3778.

81. Kubota C., Yamakuchi H., Todoroki J. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long- term culture // Proc. Natl. Acad. Sci. (PNAS) 2000. V. 97. № з. p.990-995.

82. Kwon O.Y., Kono T. Production of identical sextuplet mice by transferring metaphase from four- cell embryos I I J. Devel. Biol. 1996. V. 93. P. 1301013013.

83. Lam D., Furrer R., Bruce W. The separation, physical characterization kinetics of spermatogonial cells of the mouse // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1970 V. 65. P. 192-199.

84. Landrum В., Shettles M. Diploid nuclear replacement in mature human ova with cleavage // Am. J. Obstet. gynecol. 1979. V. 133. P. 222-224.

85. Lavoir M., Rumph N., Moens A., King W., Plante Y., Johnson W., Ding J. Development of bovine nuclear transfer embryos made with oogonia // J. Biology of Reproduction 1997. V. 56. P. 194-199.

86. Liu L., Dai Y., Moor R.M. Nuclear transfer in sheep embryos: The effect of cell-cycle co-ordination between nucleus and cytoplasm and the use of in vitro matured oocytes // J. Mol. Reprod. Devel. 1997. V. 47. P. 255-264.

87. Masui Y., Markert K. Cytoplasmic control of nuclear behaviour during meiotic maturation of frog oocytes//J. Exp. Zool. 1971. V. 177. P. 129-146.

88. Masui Y., Clarke H.J. Oocyte maturation // Int. Rev. Cytol. 1979. V. 57. P. 185-282.

89. Meistrich M., Bruce W., Clermont Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velosity sedimentation separation // J. Exp. Cell Res. 1973. V. 79. P. 213-227.

90. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in the mouse by microsurgery and cell fusion // J. Science 1983. V. 220. P. 1300-1302.

91. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in the mouse embryos // J. Exp. Zool. 1983. V. 228. P. 355-362.

92. McGrath J., Solter D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro // J. Science 1984. V. 226. P.1317-1319.

93. McLaughlin R., Davis M., Seamark J. In vitro culture in the production of identifical Merino lambs by nuclear transplantation // J. Reprod. Fert. Devel. 1990. V. 2. № 6. P. 619-622.

94. Moens A., Chastant S., Chesne P. et al. Differential ability of male and female rabbit fetal germ cell nuclei to be reprogrammed by nuclear transfer // J. Differentiation. 1996a. V. 60. P. 339-345.

95. Moens A., Chesne P., Delhaise F. et al. Assessment of nuclear totipotency of fetal bovine diploid germ cells by nuclear transfer // J. Theriogenology 1996b. V. 46. № 5. P. 871-880.

96. Moor R., Sun F., Galli C. Reconstruction of ungulate embryos by nuclear transplantation // J. Anim. Reprod. Sci. 1992a. V. 28. P. 423-431.

97. Muller R., Phillips R. Separation of cells by velocity sedimentation // J. Cell Physiol. 1969. V. 73. P. 191-201.

98. Nagai T. Parthenogenetic activation of cattle follicular oocytes in vitro with ethanol // J. Gamete Research 1987. V. 16. P. 243-249.

99. Oikawa Т., Numabe Т., Kikuchi T. Production of somatic cell clone calves from cumulus cells of a 20 year old Japanese black cow // J. Theriogenology 2000. V.52. P.2102-2106.

100. Ogura A. et al. Morphological changes of hamster isolated spermatogenic cells after electrofusion with homologous ova // Zoological Science An Internat. Journal 1992. V.9. № 6. P.l 180.

101. Ogura A., Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes participate in syngamy // J. Biol. Reprod. 1993. V. 48. P. 219-225.

102. Ogura A., Matsuda J., Yanagimachi R. Birth of normal young after electrofusion of oocytes with round spermatids // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Developmental Biology 1994.V. 91. P. 7460-7462.

103. Ogura A., Suzuki O., Takemura K., Mochida K. Development of normal mice from metaphase I oocytes fertilized with primary spermatocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Developmental Biology 1998. V. 95. P. 5611-5615.

104. Ortavant R. Spermatogenesis and morphology of the spermatozoon // In Reproduction in Domestic animals. Edited by Cole H.H. and Cupps P.T. University of California. Davis California 1959. Academic Press New York and London. P. 1-50.

105. Ouhibi N., Fulka J., Kanka J., Moor R.M. A reversible block the Gl/S border during cell cycle progression of mouse embryos // Jnt. J. Dev. Biol. 1994. V. 38. P. 731-736.

106. Ouhibi N., Fulka J., Kanka J., Moor R.M. Nuclear transplantation of ectodermal cells in pig oocytes: ultrastructure and radiography // J. Molecular Reproduction and Development 1996. V. 44. P. 533-539.

107. Pratt H.P.M. Isolation, culture and manipulation of preimplantation mouse embryos // In Mammalian Development / A Practical Approach (ed. M. Monk) 1987. P. 13-42. IRL Press, Oxford, Washington, DC.

108. Prather R.S., Barnes F.L., Sims M. et al. Nuclear transplantation in bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte // J. Biol. Reprod. 1987. V. 37. P. 859-866.

109. Prather R.S., Sims M., First N. Nuclear transplantation in the porcine embryo // J. Theriogenology 1988. V. 29. P. 290.

110. Prather R.S., Sims M., First N. Nuclear transplantation in early pig embryos // J. Biol. Reprod. 1989. V. 41. P. 414-418.

111. Rao P., Johnson R. Mammalian cell fusion: studies on regulation of DNA syntesis and mitosis // J. Nature 1970. V. 225. P. 159-164.

112. Rao P. N., Wilson В., Puck T. Premature chromosome condensation for the cell cycle analysis // J. Cell. Physiol. 1977. V. 91. P. 131-142.

113. Robl J.M., Prather R.S., Eyestone W. Nuclear transplantation in bovine embryos // J. Theriogenology 1986. V. 25. N 1. P. 189.

114. Robl J.M., Gilligan В., Critser E.S., First N.L. Nuclear transplantation in mouse embryos: assessment of recipient cell stage // J. Biol. Reprod. 1986. V. 34. P. 733-739.

115. Robl J.M., Prather R.S. et al. Nuclear transplantation in mouse embryos: assessment of recipient cell stage // J. Biol. Reprod. 1986. V. 34. P. 733-739.

116. Robl J.M., Prather R., Barnes I. Nuclear transplantation in bovine embryos // J. Anim. Sci. 1987. V. 64. P. 642-647.

117. Romrell I., Anthony R., Fawcett D. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity A. Morphological characterization // J. Developmental Biology 1976. V. 49. P. 119-131.

118. Sapsford C. Changes in the size of germ cells nuclei during the development of the testis of the ram and rat // Austr. J. Zool. 1964. V. 12. P. 127.

119. Sasagawa I., Kuretake S., et al. Mouse primary spermatocytes can complete two meiotic divisions within the oocyte cytoplasm // J. Biol. Reprod. 1998. V. 58. P. 248-254.

120. Seidel G. Production of genetically identical sets of Mammals: Cloning // J. Exp. Zoology 1983. V. 228. № 2. P. 347-354.

121. Sims M., First N.L. Production of calves by transfer of nuclei from cultured inner cell mass cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. № 13. P. 6143-6147.

122. Schnieke A., King A., Ritchie W. et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts // J. Science 1997. V. 278. P. 2130-2133.

123. Smith L.C., Wilmut I., Hunter R.H.F. Influence of cell cycle stage at nuclear transplantation on the development in vitro of mouse embryos // J. Reprod. Fert. 1988. V. 84. P. 619-624.

124. Smith L.C., Wilmut I. Influence of nuclear and cytoplasmic activaty on the development in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation // J. Biol. Reprod. 1989. V. 40. P. 1027-1035.

125. Smith L.C., Wilmut I, West I. Control of first cleavage in single-cell reconstituted mouse embryos // J. Reprod. Fert. 1990. V. 88. P. 655-663.constituted mouse embryos I I J. Reprod. Fert. 1990. V. 88. P. 655-663.

126. Smith L.C., Wilmuth I. Factors affecting the viability of nuclear transplanted embryos // J. Theriogenology 1990. V. 30. № 1. P. 153-164.

127. Solter D. Lambing by nuclear transfer // J. Nature 1996. V. 380. P.24-25.

128. Solter D. Dolly is a clone and no longer alone // J. Nature 1998a. V. 394. P. 315-317.

129. Solter D. Adult cloning marches on//Ibid. 1998b. V. 394. P. 303-314.

130. Steiberger A., Steiberger E. In vitro culture rat testicular cells // J. Exp. Cell Research 1966. V. 44. P. 217-233.

131. Steiberger A., Steiberger E. Tissue culture of postnatal male mammalian gonads // In Method in Mammalian Embryology 1971. P. 496-510.

132. Stice S.L., Robl J.M. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos // J. Biol. Reprod. 1988. V. 39. P. 657-664.

133. Stice S.L., Keefer C.L. Multiple generation bovine embryo cloning // J. Biol. Reprod. 1993. V. 48. P. 715-719.

134. Stice S.L., Keefer C.L., Matthews L. Bovine nuclear transfer embryos: oocyte activation prior to blastomere fusion // J. Mol. Reprod. Devel. 1994. V. 38. P. 61-68.

135. Stice S.L., Strelchenko N., Keefer C.L., Matthews L. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer // J. Ibid. 1996. V. 54. № 1. P. 100-110.

136. Strelchenko N., Mitalipova M., Stice S. Further characterisation of bovine pluripotent stem cells // J. Theriogenology 1995. V. 43. P. 327.

137. Szollosi D., Czolowska R., Soltynska M.S., Tarkowski A.K. Remodeling of thymocyte nuclei in activated mouse oocytes: an ultrastructural study // Eur. J. Cell Biol. 1986. V. 42. P. 140-151.

138. Szollosi D., Czolowska R., Szollosi M ., Tarkowski A.K. Remodeling of mouse thymocyte nuclei depends on the time of their transfer into activated, homologous oocytes //J. Cell Sci. 1988. V. 91. P. 603-613.

139. Szollosi M.S., Szollosi D. Blebbing of the nuclear envelope of mouse zygotes, early embryos and hybrid cells // J. Ibid. 1988. V. 91. P. 257-267.

140. Tsunoda Y., Yashi Т., Nakamura K., Uchida U., Sugie T. Effect of cutting the zona pellucida on the pronuclear transplantation in the mouse // J. of Experimental Zoology 1986. V. 240. P. 119-125.

141. Tsunoda Y., Uchida U. et al. Full term development of mouse blastomere nuclei transplanted into enucleated two- cell embryos // J. Exp. Zool. 1987. V. 242. №2. P. 147-151.

142. Tsunoda Y., Tokunaga T. et al. Nuclear transplantation of male primordial germ cells in the mouse // Development 1989. V. 107. № 2. P. 407-411.

143. Tsunoda Y., Kato Y., Oneill G. Cytogenetic analysis of reconstituted one-cell mouse embryos derived from nuclear transfer of fetal male germ cells // J. Reprod. Fert. 1992. V. 96. P. 275-281.

144. Tsunoda Y., Kato Y. Nuclear transplantation of embryonic stem cells in mice // J. Reprod. Fertil. 1993. V. 98. № 2. P. 537-540.

145. Tsunoda Y., Kato Y. Not only inner cell mass cell nuclei but also trophec-toderm nuclei of mouse blastocysts have a developmental totipotency // J. Reprod. Fertil. 1998. V. 113. № 2. P. 181-184.

146. Vignon X., Chesne P., Le Bourhis D. et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells // C. R. Acad. Sci. III. 1998. V. 321. № 9. P. 735-745.

147. Wakayama Т., Perry A.C.F., Zucotti M. et al. Full -term development ofmice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei // J. Nature1998. V. 394. P. 369-374.

148. Ware C.B., Barnes F., Maiki-Laurina M., First N. Age dependence of bovine oocyte activation // J. Gamete Research 1989. V. 22. P. 265-275.

149. Wells D.N., Misica P.M., McMillan W.H., Tervit H.R. Production of cloned bovine fetuses following nuclear transfer using cells from a fetal fibroblasts cell line // J. Theriogenology 1998a. V. 49. № 1. P. 330.

150. Wells D.N., Misica P.M., Tervit H.R. Vivanco W. Adult somatic cell nuclear transfer is used to preserve the best surviving cow of the Enderby Island cattle breed // J. Reprod. Fertil. Dev. 1998. V. 10. P. 369-378.

151. Wells D.N., Misica P.M., Tervit H.R. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulosa cells // J. Biol. Reprod.1999. V. 60. P. 996-1005.

152. Westhusin M.E., Levanduski M.L., Scarborougt R., Looney C.R., Bondi-ali K.R. Viable embryos and normal calves after nuclear into Hoechst stained ^nucleated demi-oocytes of cows // J. Reprod. Fertil. 1992. V. 95. P. 475-480.

153. Willadsen S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos // J. Nature. Lond. 1986. V. 302. P. 63-65.

154. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells // J. Nature 1997. V. 385. P. 810-813.

155. Winston N., McGuinnes O., Johnson M., et al. The exit of mouse oocytes from meiotic M- phase requires an intact spindle during intracellular calcium release//J. Cell Sci. 1995. V. 108. P. 143-151.

156. Whittingham D.G. Culture of mouse ova // J. Reprod. Fert. Suppl. 1971. N° 14. P. 7-21.

157. Whittingham D. Parthenogenesis in mammals // In: Oxford Reviews of

158. Reproductive Biology / Ed.C.A. Finn. Oxford: Clarendon Press. 1980. V. 2. P. 205-231.

159. Wolf E., Zakhartchenko V., Brem G.J. Nuclear transfer mammals: recent developments and future perspectives // J. Biotechnology 1998. V. 65. № 2. P. 99-110.

160. Yang X., Jiang S., Foote R.H. Nuclear transfer in rabbit and cattle by electric pulse induced fusion on blastomeres to enucleated oocytes // J. Theriogenology 1991. V. 35, № 1. P. 298.

161. Yang X., Jiang S., Farrell P. et al. Nuclear transfer in cattle: Effect of nuclear donor cells, cytoplast age, со- culture, and embryo transfer // J. Molecular Reproduction and Development 1993. V. 35. P. 29-36.

162. Yin X.J., Choi C.Y., Kong I.K. et al. Production of second generation rabbit embryos by nuclear transfer // Theriogenology 1998. V. 49. № 1. P. 331.

163. Yong Z., Yuqiang L. Nuclear transplantation in goats // J. Theriogenology 1991. V. 35. №1. P. 299.

164. Yong Z., Yuqiang L. Nuclear- cytoplasmic interaction and development of goat embryos reconstructed by nuclear transplantation: production of goats by serially cloning embryos // J. Biol. Reprod. 1998. V. 58. P. 266-269.

165. Zakhartchenko V., Wolf E., Palma G.A., Brem G. Effect of donor embryo cell number and cell size on efficiency of bovine embryo cloning // J. Molecular Reproduction and Development 1995. V. 42. P. 53-57.

166. Zakhartchenko V., Reichenach H.D., Reidl J. et al. Nuclear transfer in cattle using in vivo- derived vs. in vitro- produced donor embryos: effect of developmental stage // J. Ibid. 1996. V. 44. № 4. P. 493-498.

167. Zakhartchenko V., Schernthaner W., Stojkovic M. et al. Cultured bovine mammary gland cells as donors for nuclear transfer // J. Theriogenology 1998. V. 49. № 1. P. 332.

168. Zakhartchenko V., Durcova- Hills G. et al. Potential of fetal germ cells for nuclear transfer in cattle // J. Mol. Reprod. Dev. 1999. V. 52 (4) P. 421-426.

169. Zimmerman V. et al. Electric frild induced cell to cell fusion // J. Membrane Biol. 1982. V. 67. P. 165-182.1. Pgj; . ■су*:," ■■■wr!1. ZnSJih'j^SJ .