Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Зайцева, Юлия Анатольевна

• Зайцева, Юлия Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зайцева, Юлия Анатольевна

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Научные аспекты клонирования млекопитающих.

1.1.1 История клонирования.

1.1.2 Особенности клонирования крысы.

1.2 Энуклеация.

1.3 Активация ооцита-реципиента.

1.4 Процессы метилирования и деметилирования во время раннего эмбриогенеза.

1.4.1 Геномный импринтинг.

1.4.2 Метилирование.

1.4.3 ДНК-метилирование во время раннего эмбриогенеза.

1.4.4 Ненормальныйный рисунок метилирования при клонировании. 25 1.5 Заключение.

2. Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.2 Метод суперовуляции.

2.3 Получение зигот у мышей и крыс.

2.4 Метод датированной беременности.

2.5 Культивирование эмбрионов крыс и мышей.

2.6 Партеногенетическая активация ооцитов крыс.

2.6.1 Спонтанная активация.

2.6.2 Активация электроимпульсом.

2.6.3 Химическая активация.

2.7 Анализ партеногенетической активации ооцитов крыс.

2.8 Диплоидизация.

2.9 Механическая энуклеация ооцитов крыс.

2.10 Химическая энуклеация ооцитов крыс.

2.11 Введение кумулюсной клетки под блестящую оболочку.!.

2.12 Слияние цитоплазм энуклеированного эмбриона и кумулюсной клетки.

2.13 Активация генетического материала реконструированного эмбриона.

2.14 Имуннофлуоресцентный анализ метилирования.

2.15 Численный анализ интенсивности флуоресценции.

2.16 Микроскопирование.

2.17 Статистический анализ.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Оптимизация активационных параметров.

3.1.1 Выяснение зависимости эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3.1.2 Химическая активация крысиных эмбрионов.

3.1.2.1 Активация ооцитов крыс этиловым спиртом.

3.1.2.2 Активация ооцитов крыс электроимпульсом.

3.1.2.3 Активация ооцитов крыс стронцием.

3.1.3 Спонтанная партеногенетическая активация.

3.1. 4 Развитие in vitro активированных ооцитов крысы.

3.2 Исследование возможности применения химической энуклеации при соматическом клонировании.

3.2.1 Влияние этопозида на развитие эмбрионов крыс.

3.2.2 Клонирование с применением механической и химической энуклеации

3.3 Исследование динамики деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов мышей и крыс.

3.3.1 Деметилирование мужского пронуклеуса мыши.

3.3.2 ДНК-метилирование в 2-клеточных эмбрионах мыши, развивавшихся в системах in vivo и in vitro.

3.3.3 Динамика деметилирования ДНК крысы в системах in vitro и in vivo.

3.3.4 Ненормальный рисунок метилирования в системе in vitro.

3.3.5 Сравнение динамики деметилирования у крысиных и мышиных предимплантационных эмбрионов, развивавшихся in vivo.

3.3.6 Уровень метилирования в эмбрионах, развивавшихся in vivo и in vitro.

3.3.7 Метилирование у партеногенетических и клонированых эмбрионов крысы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Партеногенетическая активация и химическая энуклеация ооцитов крыс. Процессы деметилирования ДНК у ранних предимплантационных эмбрионов крыс и мышей»

Актуальность проблемы

Одной из форм полового размножения является партеногенез. У некоторых организмов естественный партеногенез — нормальный способ размножения в природе. У других организмов искусственный партеногенез вызывается экспериментально действием разных факторов на неоплодотворённую яйцеклетку, причём факторы, активирующие ооцит, в основном видоспецифичны. Лучшим критерием успешной активации ооцитов является способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному и постимплантационному развитию. Как известно, активация ооцита-реципиента является важнейшим этапом клонирования млекопитающих. Ко времени проведения данного исследования попытки получить предимплантационное развитие до стадии бластоцисты у активированных ооцитов крыс оказались неудачными, развитие партеногенетического эмбриона останавливалось на 4-клеточной стадии (Zernicka-Goetz, 1991). На данный момент зафиксирован единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003); повторить успех французских учёных пока никому не удалось.

Другой важный этап процедуры клонирования — энуклеация ооцита-реципиента. Механическая энуклеация обычно сопряжена с высоким повреждающим воздействием. Альтернативой механической энуклеации может быть химическая энуклеация веществами, надёжно блокирующими генетический материал клетки. Одним из них является этопозид - ингибитор ДНК-топоизомеразы 2, которая ответственна за скручивание и разделение цепей ДНК. Одной из задач работы было изучение возможности применения этопозида для химической энуклеациии ооцитов крыс.

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии (Reik, Dean, 2001). Проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, низкая эффективность клонирования, сложности партеногенетического развития хорошо коррелируют с ненормальным рисунком метилирования генома. Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих мокут служить маркёром дефектного развития эмбриона. В настоящее время имеются работы по изучению динамики деметилирования генома мыши, однако приводимые в них данные сильно различаются (Mayer et al., 2000; Santos et al., 2002). Для крыс такие данные вообще отсутствуют. Вместе с тем, изучение процессов деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач биологии развития.

Цель исследования

Цель работы заключалась в подборе оптимальных параметров активации ооцитов крыс (активирующие агенты, время воздействия) и получении жизнеспособных партеногенетических эмбрионов, в изучении возможности химической энуклеации ооцитов крыс с последующей пересадкой в них ядер соматических клеток и в исследовании динамики деметилирования ДНК зигот (крыса, мышь), развивающихся in vivo и in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации существенно варьирует от животного к животному и зависит от времени между инъекцией хорионического гонадотропина человека и моментом извлечения ооцитов.

2. Стронций (Si*+) является более эффективным активатором партеногенеза по сравнению с электроимпульсом и этанолом. Партеногенетические эмбрионы крысы способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

3. Этопозид не оказывает влияния на партеногенетическую активацию ооцитов крыс и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. Доля 2-клеточных эмбрионов после процедуры клонирования практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида так и после механической энуклеации.

4. Деметилирование ДНК у зигот крыс и мышей происходит с разной скоростью. Эмбрионы обоих видов, культивируемые in vitro демонстрируют более высокий уровень метилирования по сравнению с развивающимися in vivo.

Партеногенетические и клонированные 2-клеточные эмбрионы крысы сохраняют высокий уровень метилирования.

Конкретные задачи исследования

1. Изучить возможность партеногенетической активации ооцитов крысы различными агентами: этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом.

2. Выяснить зависимость эффективности партеногенетической активации от возраста ооцитов крыс.

3. Исследовать способность партеногенетически активированных ооцитов к развитию in vivo и in vitro.

4. Изучить возможность химической энуклеации ооцитов крыс с помощью этопозида. Сравнить эффективность клонирования при энуклеации химическим и механическим способами.

5. Исследовать динамику деметилирования ДНК у ранних крысиных эмбрионов in vivo и in vitro, сравнить её с динамикой деметилирования у ранних эмбрионов мышей.

6. Оценить уровень метилирования ДНК у партеногенетических и клонированных эмбрионов крысы.

Научная новизна работы

Впервые получены партеногенетические бластоцисты крысы после активации ооцитов этиловым спиртом, стронцием, электроимпульсом, а также после спонтанной активации. Воздействие стронция давало большую долю активированных ооцитов, активировались ооциты всех возрастов. Установлено, что активация ооцитов зависит от промежутка времени между процедурой суперовуляции и выделением ооцитов. Более старые ооциты крысы активировались успешнее, чем молодые. Впервые показано, что у ооцитов крыс аутбредной линии Wistar имеет место индивидуальная (от крысы к крысе) реакция на партеногенетическую активацию, не зависящая от активирующего агента. Установлено, что химическая энуклеация ооцитов крысы этопозидом может успешно использоваться при клонировании. Этопозид, являясь специфическим ингибитором фермента ДНК-топоизомеразы 2, не оказывал влияния на партеногенетическую активацию ооцитов и, тем не менее, необратимо блокировал их дальнейшее развитие.

Впервые исследована динамика деметилирования генома крысы на ранних этапах предимплантационного развития. Показано, что эмбрионы крыс и мышей, культивируемые со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии в системе in vitro имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы в системе in vivo. Впервые изучен уровень метилирования у партеногенетических эмбрионов крысы вплоть до 4-клеточной стадии развития, а также уровень метилирования у 2-клеточных клонированных эмбрионов. Обнаружен высокий уровень метилирования в обеих рассматриваемых группах по сравнению с нормальными эмбрионами.

Научно-практическое значение работы

Результаты тестирования различных активирующих агентов показали, что стронций является наиболее эффективным активационным агентом ооцитов крыс, что важно для технологии клонирования. При работе с аутбредной линией Wistar выявлено индивидуальное (от крысы к крысе) варьирование результатов, не зависящее от протокола эксперимента, что необходимо учитывать при проведении эмбриологических работ. Применение химической энуклеации вместо механической может существенно снизить трудоёмкость процесса клонирования крыс и повысить его эффективность. Разный уровень деметилирования мужского пронуклеуса зигот у крыс и мышей в системах in vivo и in vitro может служить индикатором качества используемых культивационных сред в том числе используемых для манипуляций с эмбрионами человека в программах экстракорпорального оплодотворения. В целом полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии для совершенствовании технологии клонирования млекопитающих, а также при изучении процессов их раннего эмбриогенеза.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Зайцева, Юлия Анатольевна

5. Выводы

1. Партеногенетическую активацию ооцитов крыс удаётся получить при действии различных активационных агентов: стронция, электроимпульса, этилового спирта. Воздействие ионов стронция (Sr2+) оказалось наиболее эффективным. Этот агент подходит для активации ооцитов крыс всех возрастов, даёт большую долю животных, ооциты которых активируются с высокой частотой (так называемые «активные» животные) и обеспечивает высокую эффективность активации. Старые ооциты крыс (22-27 ч после инъекции хорионического гонадотропина человека — ХГЧ) склонны к спонтанной партеногенетической активации.

2. Способность ооцитов крыс к партеногенетической активации зависит от времени между инъекцией ХГЧ и моментом извлечения ооцитов из животного; более старые ооциты активируются с большей частотой (у «активных» животных). Эффективность партеногенетической активации у «неактивных» крыс не изменяется с увеличением возраста ооцита.

3. У крыс после активации стронцием, электроимпульсом, этиловым спиртом, а также после спонтанной активации с последующей диплоидизацией при помощи цитохалазина Б ооциты способны развиваться до стадии бластоцисты in vitro и до имплантации in vivo.

4. Этопозид не влияет на партеногенетическую активацию ооцитов крыс (формирование видимого пронуклеуса) и, в то же время, необратимо блокирует их дальнейшее развитие. При пересадке в такие ооциты ядер кумулюсных клеток (клонирование) процент получающихся 2-клеточных эмбрионов практически одинаков как после химической энуклеации с использованием этопозида, так и после механической энуклеации.

5. Эмбрионы, культивируемые in vitro со стадии ранней зиготы до 2-клеточной стадии, имеют более высокий уровень метилирования чем эмбрионы in vivo (то же наблюдается и у мышей).

6. Динамика деметилирования ДНК в нормальных зиготах крыс и мышей различна. Впервые мужской и женский пронуклеусы можно наблюдать у крыс через 6 ч после копуляции и через 3 ч у мышей. Через 10 часов после копуляции мужской пронуклеус у мыши полностью деметилирован, в то время как у крысы при аналогичных условиях -частично. Эти особенности можно объяснить видовыми различиями. 7. У партеногенетических эмбрионов вплоть до 4-клеточной стадии наблюдается высокий уровень метилирования, деметилирование отсутствует. Клонированные 2-клеточные эмбрионы также отличаются высоким уровнем метилирования.

6. Список публикаций по теме диссертации

Krivokharchenko A., Popova Е., Zaitseva /., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Development of Parthenogenese rat embryos. Biol. Reprod. 68:829-36

Zaitseva /., ZaitsevS., Alenina N., Bader M., Krivokharchenko A. 2007. Dynamics of DNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro. Mol. Reprod. Dev.74:1255-61

Зайцева Ю.А., Бадер M., Кривохарченко A.C. 2008

Получение двухклеточных реконструированных эмбрионов крысы после химической инактивации этопозидом хромосом ооцитов на стадии метафазы II. Онтогенез. 38: 340-344

Krivokharchenko А., Popova Е., Zaitsewa I., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2002. Parthenogenetic activation of rat embryos Abstract Book, p. 196. 6-7 18-th Scientific Meeting of European Embryo Transfer Association, Rolduc, Niederlande.

Zaitseva I., Krivokharchenko A., Popova E., Vil'ianovich L., Ganten D., Bader M. 2003. Chemical enucleation of rat oocytes. Proceed of XVII Working Meeting "Genetic Resource Conservation", 19-21 November, Pushchino, Russia.

4. Заключение

Подводя итог вышеизложенному, можно сказать, что в данной диссертационной работе была предпринята попытка оптимизации протокола клонирования крыс, которая включала в себя: а) выбор оптимальных активационных параметров

Активация ооцита-реципиента является важнейшим шагом клонированния. В представленном исследовании подробно рассматривались различные активирующие агенты, такие как этиловый спирт, стронций, электроимпульс, а также возможные факторы, влияющие на активацию ооцита (возраст ооцита, длительность обработки и т.д.). Воздействие стронция оказалось наиболее эффективным для активации ооцитов крыс всех возрастов. Изучалась также способность партеногенетических эмбрионов к предимплантационному развитию. Были получены партеногенетические бластоцисты после активации и последующей диплоидизации ооцитов крыс. б) применение химической энуклеации

Процедура клонирования представляет собой весьма трудоёмкую операцию, сопряжённую с высоким повреждающим воздействием при механической энуклеации ооцита-рецепиента. Альтернативой может служить химическая энуклеация при помощи веществ, надёжно блокирующих генетический материал ооцита. Одним из них является этопозид - ингибитор ДНК-топоизомеразы II, которая отвечает за скручивание и разделение цепей ДНК. Доля 2-клеточных клонированных эмбрионов крысы практически одинакова как после применения химической энуклеации с использованием этопозида так и после механической энуклеации. в) исследование динамики деметилирования у ранних предимплантационных эмбрионов мышей и крыс

Как известно, метилирование ДНК является эпигенетическим регулятором генной экспрессии. Низкая эффективность клонирования, проблемы культивирования ранних предимплантационных эмбрионов in vitro, сложности партеногенетического развития, как правило, коррелируют с нарушением рисунка метилирования. В представленной работе было показано, что у зигот мышей и крыс в процессе развития происходит изменение рисунка метилирования ДНК с разной скоростью, что объясняется видовыми различиями. Выявлены отличия в уровне метилирования ДНК у эмбрионов мышей и крыс, развивающихся в разных системах: in vivo и in vitro. У партеногенетических, а также у клонированных эмбрионов, наблюдается высокий уровень метилирования, динамика деметилирования отсутствует. Отклонения в динамике деметилирования у млекопитающих могут служить маркёром дефектного развития эмбриона.

Крыса является незаменимой экспериментальной моделью в медицине и физиологии. На данный момент зафиксирован лишь единичный случай получения клонированной крысы (Zhou et al., 2003), поэтому для разработки технологии клонирования необходимы дальнейшие исследования.

Особенностью ооцитов крысы является их спонтанная активация, что усложняет процедуру клонирования. Активированная цитоплазма не поддерживает в достаточной степени процессы репрограмирования внесённого ядра, поэтому остаётся актуальным вопрос устранения этого фактора. В представленной работе, в экспериментах по клонированию крысы, использовали кумулюсные клетки в качестве доноров генетической информации. Было бы интересно исследовать способность к репрограммированию ядра других типов клеток, таких, как, например, эмбриональных стволовых клеток, полученных в лаборатории профессора Бадера. В этом случае требуется синхронизация цитоплазмы ооцита-реципиента крысы и донорского ядра.

Остаётся открытым вопрос о сравнении эффективности клонирования при использовании химической (этопозид) или механической энуклеации для получения клонированных эмбрионов более поздних стадий развития.

Процессы деметилирования мужского пронуклеуса крысы в системах in vivo и in vitro, а также уровень метилирования в 2-клеточных эмбрионах были детально изучены в представленном исследовании, однако уровень метилирования поздних предимплантационных эмбрионов крысы остаётся пока невыясненным. Технология клонирования уже внесла огромный вклад в понимание ранних процессов развития, взаимодействия родительских геномов, репрограммирования ядер и геномного импринтинга. Клонирование крысы - одна из актуальных проблем современной биологии, однако попытки создания клонов нельзя назвать успешными, т. к. большая часть реконструированных зародышей не развивается далее ранних эмбриональных стадий. Тем не менее, попытки создания технологии клонирования крысы продолжаются, и хочется надеяться, что полученные в данной работе результаты и планируемые нами дальнейшие исследования помогут в решении этой проблемы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зайцева, Юлия Анатольевна, 2008 год

1. Гоголевский П. А., В.М.Здановский В. М., 1998. Клонирование. Проблемы репродукции 3.

2. Корочкин Л. И. 1999. Клонирование животных. Соросовский образовательный журнал 4, 10-16.

3. Шкуматов А. А. 2001. Клонирование: прошлое, настоящее. будущее? Проблемы репродукции №6

4. Aflalo Е. D., Sod-Moriah U. A., Potashnik G., Har-Vardi, I. 2005. Expression of plasminogen activators in preimplantation rat embryos developed in vivo and in vitro. Reprod Biol Endocrinol 3, 7.

5. Amano Т., Kato, Y., Tsunoda, Y. 2001. Full-term development of enucleated mouse oocytes fused with embryonic stem cells from different cell lines. Reproduction 121, 72933.

6. Baguisi A., Behboodi E., Melican D. Т., Pollock J. S., Destrempes M. M., Cammuso C., Williams J. L., Nims S. D., Porter C. A., Midura P. 1999. Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nat Biotechnol 17, 456-61.

7. Barton S. С., Arney K. L., Shi W., Niveleau A., Fundele R., Surani M. A., Haaf T. 2001. Genome-wide methylation patterns in normal and uniparental early mouse embryos. Hum Mol Genet 10, 2983-7.

8. Barton T. S., Robaire В., Hales B. F. 2005. Epigenetic programming in the preimplantation rat embryo is disrupted by chronic paternal cyclophosphamide exposure. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 7865-70.

9. Beaujean N., Hartshorne G., Cavilla J., Taylor J., Gardner J., Wilmut I., Meehan R., Young, L. 2004a. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics. Curr Biol 14, R266-7.

10. Beaujean N., Taylor J., Gardne, J., Wilmut I., Meehan R., Young, L. 2004b. Effect of limited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod 71,185-93.

11. Beaujean N., Taylor J. E., McGarry M., Gardner J. O., Wilmut I., Loi P., Ptak G., Galli C., Lazzari G., Bird A. 2004c. The effect of interspecific oocytes on demethylation of sperm DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 7636-40.

12. Bestor T. H. 2000. The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 9, 2395-402.

13. Bos-Mikich A., Whittingham D. G., Jones K. T. 1997. Meiotic and mitotic Ca2+ oscillations affect cell composition in resulting blastocysts. Dev Biol 182, 172-9.

14. Bos-Mikich A., Wood M. J., Candy C. J., Whittingham D. G. 1995. Cytogenetical analysis and developmental potential of vitrified mouse oocytes. Biol Reprod 53, 780-5.

15. Brandeis M., Kafri T., Ariel M., Chaillet J. R., McCarrey J., Razin A., Cedar H. 1993. The ontogeny of allele-specific methylation associated with imprinted genes in the mouse. Embo J 12, 3669-77.

16. Campbell K. H. 1999. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning 1, 3-15.

17. Campbell K. H., Loi P., Otaegui P. J., Wilmut I. 1996. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod 1, 40-6.

18. Cattanach B. M., Kirk, M. 1985. Differential activity of maternally and paternally derived chromosome regions in mice. Nature 315, 496-8.

19. Chan A. W., Dominko T., Luetjens C. M., Neuber E., Martinovich C., Hewitson L., Simerly C. R., Schatten G. P. 2000. Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science 287, 317-9.

20. Chen T., Zhang Y. L., Jiang Y., Liu S. Z, Schatten H., Chen D. Y., Sun Q. Y. 2004. The DNA methylation events in normal and cloned rabbit embryos. FEBS Lett 578, 69-72.

21. Dean W., Santos F., Stojkovic M., Zakhartchenko V., Walter J., Wolf E., Reik W. 2001. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrant reprogramming in cloned embryos. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 13734-8.

22. Elsheikh A. S., Takahashi Y., Hishinuma M., Kanagawa H. 1997. Developmental ability of mouse late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. J Vet Med Sci 59, 107-13.

23. Elsheikh A. S., Takahashi Y., Katagiri S., Kanagawa H. 1998. Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn J Vet Res 45, 217-20.

24. Feil R. 2001. Early-embryonic culture and manipulation could affect genomic imprinting. Trends Mol Med 7, 245-6.

25. Fulka H., Mrazek M., Tepla O., Fulka J., Jr. 2004. DNA methylation pattern in human zygotes and developing embryos. Reproduction 128, 703-8.

26. Fulka J., Jr., First N. L., Moor, R. M. 1996. Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor. Bioessays 18, 835-40.

27. Fulka J., Jr., Notarianni E., Passoni L., Moor R. M. 1993. Early changes in embryonic nuclei fused to chemically enucleated mouse oocytes. Int J Dev Biol 37, 433-9.

28. Grupen C. G., Verma P. J., Du Z. T., Mcllfatrick S. M., Ashman R. J., Nottle M. B. 1999. Activation of in vivo- and in vitro-derived porcine oocytes by using multiple electrical pulses. Reprod Fertil Dev 11, 457-62.

29. Gurdon J. B. 1968. Transplanted nuclei and cell differentiation. Sci Am 219, 24-35.

30. Gurdon J. B. 1986. Nuclear transplantation in eggs and oocytes. J Cell Sci Suppl 4, 287-318.

31. Gurdon J. B., Laskey, R. A. 1970. The transplantation of nuclei from single cultured cells into enucleate frogs' eggs. J Embryol Exp Morphol 24, 227-48.

32. Hajkova P., Erhardt S., Lane N., Haaf T., El-Maarri O., Reik W., Walter J., Surani, M. A. (2002). Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech Dev 117, 1523.

33. Hayes E., Galea S., Verkuylen A., Pera M., Morrison J., Lacham-Kaplan O., Trounson A. (2001). Nuclear transfer of adult and genetically modified fetal cells of the rat. Physiol Genomics 5,193-204.

34. Henery C. C., Kaufman M. H. 1992. Cleavage rate of haploid and diploid parthenogenetic mouse embryos during the preimplantation period. Mol Reprod Dev 31, 258-63.

35. Henery C. C., Kaufman M. H. 1993. The incidence of aneuploidy after single pulse electroactivation of mouse oocytes. Mol Reprod Dev 34, 299-307.

36. Hirabayashi M., Kato M., Takeuchi A., IshikawaA., Hochi S. 2003. Factors affecting premature chromosome condensation of cumulus cell nuclei injected into rat oocytes. J. Reprod. Dev. 49, 121-6.

37. Jiang J. V., Mizuno S., Mizutani E., Sasada H., Sato E. 2000. Parthenogenetic activation and subsequent development of rat oocytes in vitro. Mol Reprod Dev 61, 120-5.

38. Kato Y., Rideout W. M., Hilton K, Barton S. C., Tsunoda Y., Surani M. A. 1999. Developmental potential of mouse primordial germ cells. Development 126,1823-32.

39. Kaufman M. H. 1973. Parthenogenesis in the mouse. Nature 242, 475-6.

40. Keefer, C. L, Schuetz A. W. 1982. Spontaneous activation of ovulated rat oocytes during in vitro culture. J Exp Zool 224, 371-7.

41. Kim J. M., Ogura A., Nagata M., Aoki F. 2002. Analysis of the mechanism for chromatin remodeling in embryos reconstructed by somatic nuclear transfer. Biol Reprod 67, 760-6.

42. Kishikawa H., Wakayama T., Yanagimachi Ft. 1999. Comparison of oocyte-activating agents for mouse cloning. Cloning 1,153-9.

43. Kline D., Kline J. T. 1992. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg. Dev Biol 149, 80-9.

44. Kono T., Jones K. T., Bos-Mikich A., Whittingham D. G., Carroll J. 1996. A cell cycle-associated change in Ca2+ releasing activity leads to the generation of Ca2+ transients in mouse embryos during the first mitotic division. J Cell Biol 132, 915-23.

45. Marcus G. J. 1990. Activation of cumulus-free mouse oocytes. Mol Reprod Dev 26, 159-62.

46. Marshall V. S., Wilton L. J., Moore H. D. 1998. Parthenogenetic activation of marmoset (Callithrix jacchus) oocytes and the development of marmoset parthenogenones in vitro and in vivo. Biol Reprod 59,1491-7.

47. Mayer W., Niveleau A., Walter J., Fundele R., Haaf T. 2000. Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature 403, 501-2.

48. McGrath J., Solter D. 1984. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 37,179-83.

49. Meehan R. R. 2003. DNA methylation in animal development. Semin Cell Dev Biol 14, 53-65.

50. Miyoshi K., Kono T., Niwa, K. 1997. Stage-dependent development of rat 1 -cell embryos in a chemically defined medium after fertilization in vivo and in vitro. Biol Reprod 56, 180-5.

51. Niemann H., Wrenzycki C. 2000. Alterations of expression of developmental^ important genes in preimplantation bovine embryos by in vitro culture conditions: implications for subsequent development. Theriogenology 53, 21-34.

52. Niemann H., Wrenzycki C., Lucas-Hahn A., Brambrink T., Kues, W. A., Carnwath J. W. 2002. Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning Stem Cells 4, 29-38.

53. O'Neill G. T., Kaufman M. H. 1988. Influence of postovulatory aging on chromosome segregation during the second meiotic division in mouse oocytes: a parthenogenetic analysis. J Exp Zool 248, 125-31.

54. O'Neill G. T., Rolfe L. R., Kaufman M. H. 1991. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Mol Reprod Dev 30, 214-9.

55. Onishi A., Iwamoto M., Akita T., Mikawa S., Takeda K, Awata T., Hanada H., Perry A. C. 2000. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289, 1188-90.

56. Oswald J., Engemann S., Lane N., Mayer W., Olek A., Fundele R., Dean W., Reik W., Walter J. 2000. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr Biol 10, 475-8.

57. Otaegui P. J., O'Neill G T., Wilmut I. 1999. Parthenogenetic activation of mouse oocytes by exposure to strontium as a source of cytoplasts for nuclear transfer. Cloning 1, 111-7.

58. Ozil J. P., Huneau D. 2001. Activation of rabbit oocytes: the impact of the Ca2+ signal regime on development. Development 128, 917-28.

59. Patkin E. L, Suchkova I. O. 2006. Regulatory mechanisms of mammalian imprinting. Tsitologiia 48, 578-94.

60. Penkov L. I., Platonov E. S. 1992. The development of diploid parthenogenetic mouse embryos of the inbred C57BL and CBA strains. Ontogenez 23, 364-9.

61. Polejaeva I. A., Chen S. H., Vaught T. D., Page R. L., Mullins J., Ball S., Dai Y., Boone J., Walker S., Ayares D. L. 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407, 86-90.

62. Popova E., Bader M., Krivokharchenko A. 2006. Full-term development of rat after transfer of nuclei from two-cell stage embryos. Biol. Reprod. 75, 524-30.

63. Reik W., Santos F., Dean W. 2003. Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy. Theriogenology 59, 21-32.

64. Reik W., Walter J. 2001. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat Rev Genet 2, 21-32.

65. Rougier N., Bourc'his D., Gomes D. M., Niveleau A., Plachot M., Paldi A., Viegas-Pequignot E. 1998. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantation development. Genes Dev 12, 2108-13.

66. Russell D. F., Ibanez E., Albertini D. F., Overstrom E. W. 2005. Activated bovine cytoplasts prepared by demecolcine-induced enucleation support development of nuclear transfer embryos in vitro. Mol Reprod Dev 72,161-70.

67. Rybouchkin A., Dozortsev D., de Sutter P. D., Dhont, M. 1996. Factors affecting the role of the spindle during early response of mouse oocytes to ethanol stimulation. J Exp Zool 275, 469-75.

68. Santos F., Dean, W. 2004. Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction 127, 643-51.

69. Santos F., Hendrich B., Reik W., Dean W. 2002. Dynamic reprogramming of DNA methylation in the early mouse embryo. Dev Biol 241, 172-82.

70. Savard C., Novak S., Saint-Cyr A., Moreau M., Pothier F., Sirard M. A. 2004. Comparison of bulk enucleation methods for porcine oocytes. Mol Reprod Dev 67, 70-6.

71. Shi W., Dirim F., Wolf E., Zakhartchenko V., Haaf T. 2004. Methylation reprogramming and chromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos. Biol Reprod 71, 340-7.

72. Shi W., Haaf T. 2002. Aberrant methylation patterns at the two-cell stage as an indicator of early developmental failure. Mol Reprod Dev 63, 329-34.

73. Shi W., Zakhartchenko V., Wolf, E. 2003. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation 71, 91-113.

74. Solter D. 2000. Mammalian cloning: advances and limitations. Nat Rev Genet 1, 199-207.

75. Stice S. L., Strelchenko N. S., Keefer C. L., Matthews L. 1996. Pluripotent bovine embryonic cell lines direct embryonic development following nuclear transfer. Biol Reprod 54, 100-10.

76. Sturm K. S., Flannery M. L., Pedersen R. A. 1994. Abnormal development of embryonic and extraembryonic cell lineages in parthenogenetic mouse embryos. Dev Dyn 201, 11-28.

77. Surani M. A., Barton S. C. 1983. Development of gynogenetic eggs in the mouse: implications for parthenogenetic embryos. Science 222, 1034-6.

78. Tateno H., Kamiguchi Y. 1997. Parthenogenetic activation of Chinese hamster oocytes by chemical stimuli and its cytogenetic evaluation. Mol Reprod Dev 47, 72-8.

79. Tilghman S. M. 1999. The sins of the fathers and mothers: genomic imprinting in mammalian development. Cell 96, 185-93.

80. Tomioka I., Mizutani E., Yoshida T., Sugawara A., Inai K., Sasada H., Sato E. 2007. Spindle formation and microtubule organization during first division in reconstructed rat embryos produced by somatic cell nuclear transfer. J. Reprod. Dev. 53, 835-42.

81. Trembiay K. D., Saam J. R., Ingram R. S., Tilghman S. M., Bartolomei M. S. 1995. A paternal-specific methylation imprint marks the alleles of the mouse H19 gene. Nat Genet 9, 407-13.

82. Turker M. S. 1999. The establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mouse somatic cells. Semin Cancer Biol 9, 329-37.

83. Wakayama T., Perry A. C., Zuccotti M., Johnson K. R., Yanagimachi R. 1998. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-74.

84. Willadsen S. M. 1986. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 320, 63-5.

85. Wilmut I., Schnieke A. E„ McWhir J., Kind A. J., Campbell K. H. 1997. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-3.

86. Yanagimachi R. 2002. Cloning: experience from the mouse and other animals. Mol Cell Endocrinol 187, 241-8.

87. Yin X. J., Kato Y., Tsunoda, Y. 2002a. Effect of enucleation procedures and maturation conditions on the development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells. Reproduction 124, 41-7.

88. Yin X. J., Tani T., Yonemura I., Kawakami M., Miyamoto K., Hasegawa R., Kato Y., Tsunoda Y. 2002b. Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes. Biol Reprod 67, 442-6.

89. Yoo J. G., Demers S. P., Lian L., Smith L. C. 2007. Developmental arrest and cytoskeletal anomalies of rat embryos reconstructed by somatic cell nuclear transfer. Cloning Stem Cells 9, 382-93.

90. Young L. E., Beaujean N. 2004. DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing stories of the mouse and sheep. Anim Reprod Sci 82-83, 61-78.

91. Zaitseva I., Zaitsev S., Alenina N., Bader M., Krivokharchenko, A. 2007. Dynamics of DNA-demethylation in early mouse and rat embryos developed in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev.

92. Zernicka-Goetz M. 1991. Spontaneous and induced activation of rat oocytes. Mol Reprod Dev 28, 169-76.

93. Zernicka-Goetz M., KubiakJ. Z., Antony C., Maro B. 1993. Cytoskeletal organization of rat oocytes during metaphase II arrest and following abortive activation: a study by confocal laser scanning microscopy. Mol Reprod Dev 35, 165-75.

94. Zhou Q., Renard J. P., Le Friec G., Brochard V., Beaujean N., Cherifi Y., Fraichard A., CozziJ. 2003. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science 302, 1179.

95. Zhu J., Telfer E. £., Fletcher J., Springbett A., Dobrinsky J. R., De Sousa P. A., Wilmut I. 2002. Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes. Biol Reprod 66, 635-41.