Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Деженков, Андрей Владимирович

• Деженков, Андрей Владимирович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Деженков, Андрей Владимирович

Оглавление

Список сокращений

Введение

Литературный обзор

Метилфосфонаты

Общая характеристика

Синтез метилфосфонатов

Свойства и применение метилфосфонатов

Фосфотиоаты

Общая характеристика

Синтез фосфотиоатов

Свойства и применение фосфотиоатов

«Замкнутые» нуклеиновые кислоты

Общая характеристика

Синтез «замкнутых» нуклеиновых кислот

Свойства и применение «закрытые» нуклеиновых кислот

Миметики на основе морфолина

Общая характеристика

Синтез миметиков на основе морфолина

Свойства и применение миметиков на основе морфолина

Полиамидные миметики нуклеиновых кислот

Общая характеристика

Синтез полиамидных миметиков нуклеиновых кислот

Свойства и применение полиамидных миметиков нуклеиновых кислот

Заключение

Теоретическая часть

Синтез пуринсодержащих мономеров ПНК

Синтез защищенных гетероциклических оснований

Синтез мономеров ОЗ ПИК

Подтверждение региоселективности реакции алкилирования пуринсодержащих

гетероциклов

Определения оптической чистоты тиминсодержащих мономеров

Определение конформаций хиральных ПНК

Исследование биологической активности полученых гуанинсодержащих производных.

Экспериментальная часть

Синтез защищенных гетероциклических оснований

Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот

Синтез тиминсодержащих энантиомеров

Синтез димера на основе дейтерированного глицина

Биологические испытания

Выводы

Список литературы

Приложения

Список сокращений

АТФ - аденозинтрифосфат

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

ПIIIK - гуанидинсодержащие полиамидные миметики

ГЭБ - гемато-энцефалический барьер

S-ДНК - фосфотиоаты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНКсс - суперскрученная ДНК

ДМФА - диметилформамид

ЗНК — "замкнутые" нуклеиновые кислоты

КД — круговой дихроизм

МО - "морфолино" олигомеры

МИД - минимальная инактивирующая длина

НК - нуклеиновые кислоты

03 ПНК - отрицательно-заряженные ПН К

ОН - олигонуклеотиды

ОДН - олигодезоксинуклеотиды

ПАТ — природные антисмысловые транскрипты

ПНК — полиамидные миметики нуклеиновых кислот ("пептидно-нуклеиновые кислоты")

рПНК — фосфонатные ПНК

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЭГ — полиэтштенгликоль

РНК — рибонуклеиновая кислота

РНКаза - рибонуклеаза

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ТГФ - тетрагидрофуран

Tono I - топоизомераза I

ТФС - твердофазный синтез

ЯМР — ядерный магнитный резонанс

A(Ade) - аденин

Ас - ацетил-

aeg - аминоэтилглицин

АН - аллил-

B(Base) - гетероциклическое основание

Вое - тиреиг-бутилоксикарбонил-

Bn(Bzl) - бензил-

ВТ — бензотриазолил-

Bz - бензоил-

C(Cyt) - цитозин

Cbz - карбобензоксикарбонил-

СЕ - цианоэтил-

COSY - гомоядерная корреляционная спектроскопия

dba — (Е, Е)-дибензилиденацетон

DEAD - диэтилазодикарбоксилат

DCC — дициклогексилкарбодиимид

DCE - дихлорэтан

DCM — дихлорметан

DhbtOH — 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(ЗН)-он

DIEA — диизопропилэтиламин

DMTr — димегокситритил-

DPC — дифенилкарбамоил-

DQF — двухквантовая фильтрация

G(Gua) - гуанин

GFP - зелёный флуоресцентный белок Gly - глицин

НМВС - гетероядерная многосвязная корреляция

HRMS - масс-спетрометрия высокого разрешения

HSQC — гетероядерная одноквантовая корреляция

HSV - вирус простого герпеса

НурНК - гидроксипролиновые ПНК

IBCF - изо-бутилхлорформиат

Me - метил-

Mmt - монометокситритил-

МОЕ — метоксиэтил-

Ms - мезил- (метилсульфонил-)

NMM — #-метилморфолин

Ns - о/шо-нитробензолсульфонил-

IBCF — изо-бутилхлорформиат

iBu - изо-бутирил-

1т - 1Ч-метилимидазол ¡Рг — изопропил-Pg — защитная группа

5ЫР — полиморфизм единичного нуклеотида

Т(ТЪу) - тимин

1Ви - трет-бутип-

ТЕА - триэтиламин

ТЕОТ - тетраэтилтиурам дисульфид

ТБА - трифторуксусная кислота

ТМ5СГП'- триметилсилилтрифторсульфонат

ТРР - трифенилфосфин

и(Уга) - урацил

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств»

Введение

Современные биохимические и биомедицинские технологии направлены на поиск молекулярных инструментов для диагностики и лечения различных заболеваний. В связи с этим актуальным направлением является исследование взаимодействий различных синтетических молекул с нуклеиновыми кислотами для управления процессами транскрипции РНК (антиген стратегия) и экспрессии белка (антисмысловая стратегия). Одними из таких молекул, которые показали хорошие результаты in vitro, являются полиамидные миметики нуклеиновых кислот. Данный тип миметиков сочетает в своей структуре полиамидный скелет (с чередованием амидной связи и её восстановленной формой) и нуклеиновые основания, присоединенные к скелету через карбоксиметильный линкер [I].

°о

aeg-ПНК

В

О

И ^ Y2

п(Н2С)

сс-ПНК

В

X(CH2V° О

Н ¿ Р « у-ПНК

B=T,C,A,G

X=-OH;-COO;-SH;-NH3+;-

HN^NH NH2

Рисунок I. Структура ПНК.

«Классические» aeg-ПНК {рис. 1), состоящие из повторяющихся N-2-аминоэтильных единиц (aeg) показывали низкую растворимость и слабую проникающая способность таких соединений в in vivo экспериментах. Улучшение данных свойств было достигнута за счет работы с различными модификациями ПНК. Недавние разработки показали, что наличие хирального центра, его конфигурация (R или S) и его местоположение в структуре мономера (а(2)- или у(5)-положение) (рис. I) влияют на аффинность олигомеров ПНК к ОН (ОДН) через преорганизацию их вторичной структуры [2]. В то же время введение различных функциональных групп, в составе боковых радикалов, может улучшать биодоступность таких соединений, например, положительно-заряженные ПНК на основе аргинина [3, 4] могут взаимодействовать с мембраной эукариотических клеток, посредством эндоцитоза проходить через нее и локализоваться в ядре эукариотических клеток, что является благоприятным фактором для антиген терапии.

В целом, модификации ПНК способны стать новым объектом исследования как медицинской химии, так и молекулярной биологии, и занять значимое место на рынке

высоких технологий, в случае разработки эффективной методологии получения модифицированных мономеров и олигомеризации их на полимерном носителе, обеспечивающей высокую синтетическую доступность этих соединений.

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова проводятся фундаментальные исследования по созданию хиральных ПИК на основе Ь-А1а и дикарбоновых аминокислот. Исследование последних предполагает наличие отрицательного заряда, представленного карбоксильной группой, что позволит улучшить растворимость и использовать катионные носители для доставки ПНК через мембрану в цитоплазму, что разрешает главные сложности использования ПНК. Ранее были получены пиримидинсодержащие мономеры а- и у-ОЗ ПНК (рис. 1) и аденинсодержащий мономер а-ОЗ ПНК на основе Х-С1и [5, 6]. Была продемонстрирована гибридизационная способность гомотиминовых 03 ПНК к образованию комплексов с комплементарной ДНК-мишенью [5], а также предложены методы по определению оптической чистоты мономеров на основе 1-А1а [7]. В связи с этим актуальной является задача препаративного получения пуриновых мономеров 03 ПНК (гуанинсодержащих, в случае а-ПНК и аденин-, гуанинсодержащих, в случае у-ПНК) для возможности разработки протокола синтеза олигомеров, содержащих все четыре нуклеиновых основания в своей структуре, с целью дальнейшего определения эффективности ОЗ ПНК при взаимодействии с ОН (ОДН).

Литературный обзор

Разработка антиген- и антисмысловых технологий для генной терапии и лечения опухолевых заболеваний открыло новую синтетическую область в медицинской химии -создание миметиков нуклеиновых кислот. Такие миметики связываются со специфичными последовательностями нуклеотидов в ДИК (РНК)-мишенях, препятствуя либо процессу транскрипции, либо процессу трансляции. К настоящему времени насчитывается уже три поколения миметиков нуклеиновых кислот, каждое из которых имеет свои преимущества и недостатки [8, 9].

Для препятствования экспрессии вредоносного гена, синтез РНК в клетках может быть подавлен при помощи следующих механизмов:

А) Связывание с ДНК и блокирование процесса транскрипции (антиген стратегия).

Б) Гибридизация с РНК и блокирование процесса трансляции (антисмысловая технология).

Причем при связывании с РНК антисмысловой олигомер может быть «преградой» для рибосомы или изменять процесс сплайсинга, либо вызывать деградацию РНК-мишени. Деградация РНК-мишени происходит при действии РНКаз на одно- и двухцепочечные РНК-мишени. Известно, что РНКазы Н - это ферменты, которые расщепляют РНК в составе РНК-ДНК дуплекса. Кроме того, малые интерферирующие РНК участвующие в процессе РНК-интерференции, образуя дуплекс с РНК-мишеныо, способны вызывать действие РНКаз III, которые приводят к деградации двухцепочечных РНК [10, 11].

На эффективность действия миметиков и аналогов нуклеиновых кислот в соматических клетках могут оказывать влияние природные антисмысловые транскрипты (ПАТ), которые были найдены в оукариотических клетках. Антисмысловые транскрип™ могут кодировать различные белки или оставаться некодирующими молекулами. Некодирующие антиеммеловые транскрипты регулируют генную экспрессию на различных этапах в процессе переноса информации от транскрипции до трансляции. Важным является образование двухцепочечной РНК через связывание антисмысловой последовательности со смысловой РНК. Антисмысловые транскрипты могут возникать при транскрипции обеих цепей гена. В другом случае, при транскрипции близкорасположенных генов, кодирующих разные белки, и, читающихся в антипараллельной ориентации, может образовываться антисмысловой транскрипт одного гена к другому. Около 5-10% генома человека могут иметь антисмысловые транскрипты. Таким образом, антисмысловые транскрипты могут быть результатом, по крайней мере, двух процессов и играть важную роль в регуляции генов и фенотипов организмов через

различные механизмы. Если антисмысловой транскрипт был гибридизован к части РНК-мишсни, то такой участок будет менее доступным для антисмысловой терапии. Также любое влияние антисмысловых гранскриптов на регуляцию промежуточного метаболизма РНК-мишеней может повлиять на механизмы действия антисмысловых препаратов, которые конструируются для того, чтобы связываться с РНК [10].

В зависимости от соотношения между мономерными звеньям» модифицированных олигонуклеотидов с природными мононуклеотидами, модифицированные олигомеры различают на 5 категорий: миксмеры (1), гэпмеры (2), хедмеры (3), тэйлмеры (4) и полностью модифицированные миметики (5) {рис. 2). В миксмерах видоизмененные остатки распределены по всей длине олигонуклеотида, в то время как в гэпмере два сегмента миметиков на концах олигомера разделены последовательностью других нуклеотидных аналогов. В хэдмере миметикоподобные мономеры позиционируются на 5'-конце, тогда как у тэйлмеров на З'-конце. Полностью модифицированные миметики и аналоги состоят только из синтетически модифицированных мономеров [12].

1 0~0-0-0-0 3 о-3

5' 3' 5'

2 о-о 4 -о

5 ооосхю

О мономеры аналогоз внтт риб0. или дезоксиоибонуклеотиды

нуклеиновых кислот

Рисунок 2. Виды аналогов и миметиков нуклеиновых кислот в зависимости от их

мономерного состава [12].

В качестве количественной характеристики миметиков нуклеиновых кислот часто используют минимальную инактивирующую длину (МИД). Данная величина может быть определена, как самая короткая длина олигонуклеотида заданной структуры, которая эффективно связывает комплементарную мишень при наименьших концентрациях в цитозоль-ядерном отделе обработанных клеток. Измеренные значения МИД для конкретных структурных типов миметиков позволяют составить функцию от длины последовательности, или содержания в+С и концентрации тестируемых олигонуклеотидов. Для высокой аффинности (определяемой значением температуры плавления комплекса модифицированного олигонуклеотида с ДНК (РНК)) и селективности связывания с ОН (ОДН) (определяемой как ДТт комплекса модифицированного олигонуклеотида с ДНК (РНК) и дуплекса содержащего мисматч) в

сложных системах значения МИД должны быть достаточно большие, такие чтобы олигомеры имели лишь небольшую возможность для инактивирующего воздействия с нецелевыми РНК. Также для достижения высокой эффективности, длина модифицированных олигонуклеотидов должна быть равной или быть чугь длиннее, чем ее МИД [13].

Для конструирования терапевтических препаратов на основе различных типов модифицированных олигомеров необходимо учитывать все преимущества и недостатки ранее разработанных ряда аналогов. Поэтому в данном обзоре представлена характеристика аналогов и миметиков нуклеиновых кислот различных поколений, модифицированных по сахаро-фосфатному остову, а также представлено сравнение их преимуществ и недостатков.

Метилфосфонаты Общая характеристика

Метилфосфонаты (рис. 3) являются одними из первых синтетических аналогов олигонуклеотидов, в данных молекулах неэтерифицированная фосфатная гидроксильная группа заменена на метальную группу [9]. Метилфосфонаты могут быть как аналогами ОДН (1?= -Н, рис. 3), так и аналогами 2'-0Ме-олигорибонуклеотидов (Я= -ОСНз, рис. 3), в этом случае метифосфонаты содержат остатки 2'-Ометилрибозы [14].

В

Р-Н, -ОСН3

Рисунок 3. Структура метилфосфопатов.

Метилфосфонаты являются хиральными молекулами по атому фосфора, таким образом, стандартная процедура твердофазного синтеза (ТФС) приводит к образованию смеси диастереомеров [15].

Синтез метилфосфонатов

Синтез метилфосфонатов заключается в олигомеризации модифицированных рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов, либо в растворе, либо на твердой фазе. Для получения метилфосфонатов в растворе (схема 1) часто используются диметокситритилзащищенные мононуклеотиды 6, в качестве агента для создания

метилфосфонатной связи используется метил-бмс-0,0-[1-бензотриазолил]фосфонат 7. Конденсацию между следующим нуклеотидом с защищенной З'-гидроксильной группой 9 и метилфосфонатом 8 проводят в присутствии А^-метилимидазола (М-МеИп). После удаления защитной группы с З'-гидроксильной группы конечного мономерного звена, происходит повторение предыдущих этапов до достижения заданной последовательности олигонуклеотида [16].

Схема 1. Синтез метилфосфонатов в растворе [15].

СН3 ОМТЮ в

I

ТВ0_Г0ВТ омтю в омтю ^

о

№Ме1т /

ОН | Л _ В О,

0=Р—СН

о=р-сн3

в

6 --1 ОПз \_7

8 0ВТ ¿71 >—' 10

Р=-С(0)СН2СН2С0СН3

Но чаще всего метилфосфонатные последовательности получают, используя твердофазный синтез на полимерном носителе. В твердофазном синтезе метилфосфонатов используют метилфосфоамидитные синтоны 11, 12 (рис. 4), которые являются аналогами нуклеозид фосфоамидитных производных.

Я=-Н, -ОСН3 О Р О Р

Л р .

11 12

Рисунок 4. Фосфоамидитные синтоны для твердофазного синтеза

метилфосфонатов [17].

Такие синтоны имеют защитные функции по 5'-гидроксильной (диметокситритильная) и амидофосфитной группам (изопропильные). В качестве защитных групп нуклеиновых оснований используют бензоильную защиту для аденина и изобутирильные группы для цитозина и гуанина. Для дезоксицитидина А^-изобутирил защитная группа используется вместо стандартной Л-бензоильной группы, для

препятствования побочному процессу трансаминирования во время удаления со смолы. Часто на 5'-конец олигонуклеотида вводят фосфодиэфирную межнуклеотиднуго связь, используя в качестве заключительного синтона 3'-0-//-цианоэтил-уУ,Л^сшс-диизопропиламинофсфорамидит 12 {рис. 4), что позволяет облегчить процедуру выделения конечного олигомера. Время конденсации мономеров аналогично синтезу олигонуклеотидов ОН (ОДН) фосфоамидитным способом. Так как метилфосфонатные связи подвержены гидролизу при длительной обработке с неорганическими основаниями, то для удаления защитных групп и отщепления олигомера со смолы используют этилендиамин. Вначале проводят 30 мин обработку смолы раствором гидроксида аммония при комнатной температуре. После чего добавляют равный объем этилендиамииа и продолжают обработку в течение 6 часов. Реакцию останавливают разбавлением водой и нейтрализацией либо HCl, либо уксусной кислотой. Олигомеры выделяют при помощи ОФ ВЭЖХ, либо ионообменной хроматографии при наличии 5'-фосфордиэфирной межнуклеотидной связи [17].

Свойства и применение метилфосфонатов

Метилфосфонаты стабилЕ>ны в водных растворах с pH 7 при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 1 недели (в зависимости от состава олигомера и его длины период хранения может достигать более длительного времени). Замороженные растворы олигомеров могут хранится в течение 6 месяцев без значительной деградации. Особенно стабильны олигомеры при хранении в виде лиофилизованных порошков или в растворах этанола с водой или ацетонитрила с водой. В этом случае, срок хранения олигомеров достигает 1 года при -20°С. Метилфосфонаты также стабильны при мягких кислотных условиях водного раствора. Однако обработка с 1н HCl приводит к депуринизации и последующему расщеплению цепей метифосфонатов. Скорость депурииизации, как оказалось, происходит медленнее, чем у олигодезоксирибонуклеотидов при тех же условиях. Метилфосфонаты, состоящие из Т-О-метилрибонуклеозидов, крайне устойчивы в кислых условиях. Так, инкубация 12-мера, содержащего как 2'-0-метилгуанинрибонуклеозид, так и 2'-0-метиладенинрибонуклеозид с 1н HCl в течение 12 ч при 37°С не приводили к гидролизу и депуринизации этих олигомеров [17].

Гидролиз обоих видов метилфосфонатов осуществляется в водш>тх растворах при основных pH. Некоторые вторичные амины, такие как пиперидин и морфолин, особенно эффективно гидролизуют метилфосфонатные связи. Гидролиз приводит к образованию олигомеров и мономеров, которые терминированы либо гидроксилыюй группой, либо

группой метилфосфоновой кислоты. Метилфосфонатные связи устойчивы к гидролизу экзонуклеазами, такими как фосфодиэстераза змеиного яда и фосфодиэстераза селезенки, и эндонуклеазами, такими как микрококковая нуклеаза и ДНКаза I. Растворимость метилфосфонатов зависит от длины олигомерной цепи и количества G и С нуклеотидов. Олигонуклеотиды длиной от 12 до 16 нуклеотидов могут быть растворены в водных буферах, давая растворы с максимальной концентрацией олигомеров в диапазоне от 500[iM до 1 шМ. Олигомеры, которые содержат большое количество G остатков имеют более низкую растворимость [17].

Метилфосфонаты образуют стабильные дуплексы с комплементарными последовательностями ОН (ОДН). Стабильность дуплексов увеличивается с увеличением длины последовательности метилфосфонатов. В отличие от ДНК, в случае метилфосфонатов, на связывание с ОН (ОДН) не оказывает влияние ионная сила раствора. Это свойство обусловоено отсутствием электростатического отталкивания между незаряженным метилфосфонатным остовом и отрицательно-заряженным фосфодиэфирным скелетом ОН (ОДН). Дуплексы, образованные между метифосфонатами и ОДН подобны аналогичным структурам, образованным

олигодезоксирибонуклеотидами. Политиминовые метилфосфонаты особенно чувствительны к конфигурации метилфосфонатной связи. Miller el al. [18] показали, что декамеры, содержащие стереорегулярный остов, состоящий либо из (/?)-, либо из (£)-мономеров, образовывали комплексы с комплементарными ДНК и РНК различной стабильности. Оказалось, что (/?)-метилфосфонаты более стабильны, температура плавления дуплексов, образованных (5)-изомерами была ниже на 2-4°С. Дуплексы, образованные олигомерами содержащими пуриновые основания менее чувствительны к конфигурации остова. Также гомопуриновые метилфосфнаты способны образовывать триплексы с дцДНК содержащими, либо гомопиримидиновую, либо гомонуриновую последовательность оцДНК, причем стабильность таких триплексов выше, чем у ДНК. Метилфосфонаты не показывают РНКазной активности. Фосфоруглеродные связи в метилфосфонатах обеспечивают более высокое сродство при взаимодействии с РНК, что благоприятно для антисмысловой терапии [17].

Метилфосфонаты из 2'-0-метилрибонуклеозидов показывают значительно более высокую аффинность связывания с РНК, так комплекс 12-мера с РНК имел температуру плавления выше на 15°С, чем в случае дезоксиметилфосфонат/РНК дуплекса [17]. Miller et al. использовали метилфосфонаты из 2'-Ометилрибонуклеозидов против РНК вируса иммунодефицита человека, которая отвечает за начало репликации вируса и представляет

собой петлеобразную структуру [19]. В ходе эксперимента были получены 7 олигомеров (13-19), принимающих структуру подобную ТАР РНК (табл. /).

Олигомеры, за исключением 16, имели в своем составе смесь диасгереомеров, тогда как олигомер 16, содержащий в своем составе только две метилфосфонатные связи, тем самым образовывал четыре диастереомера (/?/?, 88, №>, £/?), которые были разделены при помощи ОФ ВЭЖХ.

Таблица 1. Свойства метилфосфонатиых «петлей» (точками показаны метилфосфонатные связи) [19].

п. <ц

о 13 14 15 16 17 18 19

О

с-с 1 \ С А V? ОС / \ V? с-с 1 \ Ь А V? с-с • • С А V? с»с / \ У? С-С 1 * С А с-с / \ С А

Структура ^ А ' Л' \ Й ее ^ э с А' X \ А ■ •У Я С А А. \ р V Л ' Я Счл А А \ \ с<3 ^ А ' ел \ V 9 Р А ' Л' Я с А и с ГоЪ] ¡¿¿: :А61 ¡¿с: А

и о 74 57 55 80 77 60 54

р н

С 17± 1.0 55±15 5.3±1.1 284±9.2 285±7.3 42±3.0 -50.0

"О

В ходе исследования было показано, что наиболее высокой аффинностью связывания обладают олигомеры 16 и 17, содержащие метилфосфонатные связи в петле связывания с ТАР РНК. Связывание с ТАР РНК было оценено при помощи определения констант диссоциации с использованием гель-электрофореза, после инкубации 32Р-меченной ТАР РНК с каждым олгонуклеотидом при 37°С. Константа диссоциации (Ка) представляла собой отношение концентрации образованного комплекса (в процентах) к логарифму концентрации олигомеров 13-19. Присутствие метилфосфонатиых связей в начале «петли» (олигомер 15, табл. 1) увеличивает аффинность связывания с РНК примерно в 5 раз по сравнению с олигомером 13, не содержащим метифосфонатные связи. Влияние конфигурации метилфосфонатной связи на аффинность к ТАР РНК было оценено на олигомере 16 (табл. 2), так наиболее высокое сродство к ТАР РНК показывал

(/М?)-диастереомер, тогда как (55)-диастереомср показывал аффинность в 4 раза ниже. Таким образом, на аффинность связывание метилфосфонатов может оказывать не только конфигурации связи, но и ее местоположение в составе олигомера.

Таблица 2. Влияние конфигурации метилфосфонатных связей в олигомере 11 на связывание с ТАР РНК [19].

Диастереомеры олигомера 16 Ка (пМ)

ЯЯ 117±15

57? 232±57

ЯБ 301±26

520±75

Метилфосфонаты способны проникать через клеточные мембраны клеток млекопитающих. Так проникновение тиминовых (3Н-меченный по 5-положению метальной группы тимина) метилфосфонатов (длиной два, пять и девять нуклеотидов) в фибробласты сирийского хомяка осуществлялось в течение 3 ч. После лизиса клеток 94% олигонуклеотида было обнаружено в виде интактного соединения. Но также были обнаружены тритий-меченные нуклеотиды в составе клеточной ДНК, что, по-видимому, указывает на возможность отщепления тимина при помощи гликозилазы [14, 20]. Метилфосфонаты длиннее 4-х нуклеотидов не были способны проникать в Е. соП, по-видимому, клеточная стенка непроницаема для низкомолекулярных олигомеров, что также наблюдается для коротких пептидов и полисахаридов [17].

После инъекции тритий-меченныго по 5-положению метальной группы тимина метилфосфонатного олигомера ТССТССГСССС в хвостовую вену мыши, было определенно биораспределение по различным тканям. Полупериод распределения по тканям составил 6 мин., тогда как время удаления из кровотока 17 мин. Около 70% олигомера было обнаружено в моче спустя 60-120 мин после введения. Олигомер быстро распределялся к почкам, печени, легким, мышцам, селезенке и плазме, наиболее низкий уровень был обнаружен в мозге [21].

Используя различные гэпмеры метилфосфонатов с фосфотиоатами в качестве центра олигонуклеотида, метилфосфонаты были использованы для очистки аутотрансплантатов при хронической лейкемии костного мозга [15]. Ряд работ посвящен изучению влияния данного вида миметиков на различные биологические объекты, такие как рекомбиназы, топоизомеразы и др. [22, 23], также большое внимание уделено изучению аналогов метилфосфонатов, таких как: метилфосфонотиоаты [24], 5'-О-метилфосфонаты [25] и фенилфосфонаты [26, 27].

Фосфотиоаты Общая характеристика

Фосфотиоаты - широко используемые в молекулярной биологии аналоги олигонуклеотидов (часто используется название - 8-олигонуклеотиды). Фосфотиоаты нашли широкое применение из-за своей нуклеазной устойчивости и достаточно простого синтеза. Структура их подобна ОДН, в которых не участвующий в образовании эфирных связей гидроксил фосфата заменен на серу [28] {рис. 5).

В

Рисунок 5. Структура фосфотиоатов [27].

Наличие асимметричного атома в молекуле фосфотиоатов приводит к возможности образования двух диастереомеров (/? и 5" для каждого мономерного звена), обладающих различными свойствами [29]. Как правило наличие рацемата при взаимодействии с ОН (ОДН) понижает аффинность связывания. Разделение же диастереомеров является затруднительным, что является особенно проблематичным при высокой токсичности одного из диастереомеров или значительного понижения температуры плавления комплекса с ОН (ОДН) [28].

Проблема хиральности часто решается при помощи замещения второго неэтерифицированного атома кислорода фосфатной группы ОДН на еще один атом серы, образуя тем самым фосфодитиоаты {рис. б). Фосфодитиоаты имеют схожие свойства с фосфотиоатами: высокая растворимость из-за симметричного отрицательного заряда и устойчивость к нуклеазному воздействию [30].

В

Рисунок 6. Структура фосфодитиоатов.

Среди аналогов фосфотиоатов следует также выделить Т-О-метоксиэтилфосфоротиоаты {рис. 7). Такая модификация показывала меньшую токсичность по сравнению с классическими фосфотиоатами и более высокую устойчивость к действию нуклеаз [31].

(5'-)

(3'-)

Рисунок 7. Структура 2-ОМОЕ фосфотиоатов. Синтез фосфотиоатов

Синтез фосфотиоатов и фосфодитиоатов аналогичен синтезу метилфосфонатов, за некоторыми исключениями.

О

Б 20

-Б. О и

ЗН-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид (реагент Beacauge) , Б Б |

тетраэтилтиурам дисульфид (ТЕЭТ) Рисунок 8. Реагенты для сульфуризации.

Для синтеза фосфотиоатов используются мононуклеотиды ОДН, получение олигомеров возможно в растворе [32, 33] или с использованием твердофазного носителя. Отличительным этапом в твердофазном синтезе фосфотиоатов является стадия сульфуризации. В качестве реагентов для проведения сульфуризации чаще всего используют: серу [34], реагент Веасаще 20 (рис. 8А) [35] или тетраэтилтиурам дисульфид 21 (рис. 8Б) [36] (рис. 8). Сульфуризация - это образование фосфотиоагной связи из триэфирфосфита 22, полученного на стадии конденсации (схема 2). Автоматический синтез не является стереоспецифичным, давая смесь изомеров, в случае фосфотиоатов [29].

Схема 2. Сульфуризация реагентом Веасаще в синтезе фосфотиоатов [35].

СЮМТг

СЮМТг

N0'

О"

; 22

-о-Р-о

о

с

О. .В

ъ

СЮМТг 0°

о. я

к£ ,

О О4

ъ

ыс-

20

о4'

^о-Р-о 23 з .в

О о4'

.О

Б'

\\ о

и 6

При синтезе фосфодитиоатов используют фосфотиоамидитные синтоны 24, конденсация с нуклеозидным звеном 25 и последующая сульфуризация приводят к образованию фосфодитиоатной связи в олигонуклеотиде 28 (схема 3) [37]. Схема 3. Синтез фосфодитиоатов [37].

С1

о

СЮМТг

\ I

24 ^М

С1

НО

Н ВР4

ОйМТг

Угв

С1

СЮМТг

и &

о

э-р-

о

26

оЧУ

о

Сульфуризация

_- 1Г О

25

О

О

0 т Б-Р-

28

О

о

О^ .в

о

о. .В

о

\

Ввиду разной токсичности диастереомерных форм фосфотиоатных олигонуклеотидов, несомненным достижением явился стереоспецифичный синтез таких молекул [38].

Схема 4. Стереоспецифичпый синтез мононуклеотидов фосфотиоатов [38].

но. т о-—^ о'—^

он ™ ^ъ-^^тт

29 30 31

йМТЮ

92% О с ®

р>3НМ(С2Н5)з

32 33 \ , 34

ОМТЮ

_ т

о. 1©

р^^НЫ(С2Н5)3

о' о

35

а. 1) 1 Н-тетразол, СН2СН^СН20Р[А'П-СзП?)2] 2, СНзСЫ, молекулярные сита ЗА, 25 °С; 2) 55"С, 36 ч; Ь. бис[3-(триэтоксисилил)пропш1]тетрасульфид, 25°С, 1 ч; с. СНзОЫа, СНЮН, 25 °С, 24 ч; с1 ОМТгС1, ДМФА/пиридии, 25 °С, 7 ч; е. 1) 1-С4Н9ЫН2, 35 °С, 24 ч; 2) (С2Н5)зШ НСО3/Н2О; 1) РсЫс1Ьа)з СНС11, (С6Н5)3Р, НСООН, ТГФ, 25 °С, 2

ч; 2) (С2П5)зМН'НС0з/Н20

Метод синтеза чистых (Я)- и (5)-монотимидинфосфотиоат нуклеотидов состоит в комбинировании стереоконтролируемых реакций (схема 4), которые включают: 1) 1II-тетразол-активированную конденсацию тимидина 29 с

(аллилокси)[бис(диизопропиламино)]фосфаном, за которой следует термическое равновесие полученных продуктов, приводя к образованию (^-тимидина 3',5'-циклического фосфата 30 в качестве главного компонента, 2) стереоспецифическую сульфоризацию этого компонента бис[3-(триэтоксисилил)пропил]тетрасульфидом, получая аллил (7?)-тимидин 3',5'-цикличсский фосфотиоат 31, 3) региоселективный и стереоселективный метанолиз соединения 31, приводящий к получению аллил (Я)-тимидин-З'-фосфоротиоат 32, как главного продукта, 4) после введения диметокситритильной защиты на свободную 5'-гидрокси группы аллилфосфотиоата 32, стереоспецифичное удаление метильной группы с фосфотиоатной группы обработкой с шренг-бутиламином, приводит к образованию аллил (7?)-5'-0-диметокситритилтимидин-3'-фосфортиоат диэфира 34, а стереоспецифичное удаление аллильной защиты с фосфатной

группы при катализе ди-палладиевым комплексом приводит к образованию (5)-5'-0-диметокситритилтимидин-З'-фосфортиоата 35.

Схема 5. Стереоспецифичный синтез олигонуклеотидов фосфотиоатов [38/.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Деженков, Андрей Владимирович, 2015 год

Список литературы

1. Nielsen P. Е., Egholm М., Berg R. H., Buchardt О. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. // Science. - 1991. - V. 254. -P. 1497-1500.

2. Corradini R., Sforza S., Tedeschi T, Totsingan F., Manicardi A., Marchelli R. Peptide Nucleic Acids with a Structurally Biased Backbone. Updated Review and Emerging Challenges. // Curr. Top. Med. Chem. - 2011. - V. 11 (12). - P. 1535-1554.

3. Zhou P., Wang M., Du L., Fisher G. W., Waggoner A., Ly D. H. Novel Binding and Efficient Cellular Uptake of Guanidine-Based Peptide Nucleic Acids (GPNA). // J. Am. Chem. Soc. - 2003. - V. 125. - P. 6878-6879.

4. Sahu В., Chenna V., Lathrop K. L., Thomas S. M., Zon G., Livak K. J., Ly D. H. Synthesis of conformational^ preorganized and cell-permeable guanidine-based y-peptide nucleic acids (yGPNAs). // J. Org. Chem. - 2009. - V. 74(4). - P. 1509-1516.

5. Боярская H. П. Синтез тиминсодержащих отрицательно заряженных пептидно-нуклеиновых кислот различного строения и исследование их гибридизационных характеристик. // диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. — 02.00.10.-2007.-Москва.

6. Баранов А. В. Разработка методов синтеза псевдопептидов и мономеров пептидно-нуклеиновых кислот. // диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. - 02.00.10. - 2008. - Москва.

7. Льянов М. А. Синтез и изусение свойств хиральных пептидно-нуклеиновых кислот. // диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. - 02.00.10. -2011. - Москва.

8. Dias N., Stein С. A. Antisense Oligonucleotides: Basic Concepts and Mechanisms. // Mol. Can. Ther. - 2002. - V. 1. - P. 347-355.

9. Juliano R., Bauman J., Kang H., Ming X. Biological Barriers to Therapy with Antisense and siRNA Oligonucleotides. // Mol. Pharm. - 2009. - V. 6(3). - P. 686-695.

10. Crooke S. Т., Vickers Т., Lima W., Wu H. Mechanisms of Antisense Drug Action, an Introduction. In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. - 2008. - 2nd ed. - P. 3-46.

11. Resnier P., Montier Т., Mathieue V., Benoit J.-P., Passirani C. A review of the current status of siRNA nanomedicines in the treatment of cancer. // Biomaterials. - 2013. - V. 34. - 1. 27.-P. 6429-6443.

12. Koch T., Rosenbohm C., Hansen H.F., Hansen B., Straarup E.M., Kauppinen S. Locked Nucleic acids: Properties and therapeutic aspects. In Therapeutic Oligonucleotides. // ed. J. Kurreck, RSC Publishing. - 2008. - P. 103-141.

13. Summerton J. Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. //Biochim. et Bioph. Acta. - 1999.-V. 1489-P. 141-158.

14. Miller P. S. Development of antisense and antigene oligonucleotide analogs. In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. // eds. Cohn W. E., Moldave K., Academic press. - 1996. - V. 52. - P. 263-291.

15. Verma S., Eckstein F. Modified oligonucleotides: Synthesis and Strategy for Users. // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - V. 67. - P. 99-134.

16. Marugg J. E., de Vroom E., DreefC. E., Tromp M., van der Marel G. A., van Boom J. H. Synthesis of nucleic acid methylphosphonates via the 1-hydroxybenzotriazole phosphtriester approach. // Nucl. Acids Res. - 1986. - V. 14(5). - P. 2171 -2185.

17. Miller P. S., Ts'o P. O. P., Hogrefe R. I., Reynolds M. A., Arnold L. J. Jr. Anticode oligonucleoside methylphosphonates and their psoralen derivatives. In Antisense Research and Applications. // eds. S. T. Crooke, B. Lebleu, CRC Press. - 1993. - P. 189-204.

18. Miller P. S., Dreon N., Pulford S. M., McParland K. B. Oligothymidylate Analogues Having Stereoregular, Alternating Methylphosphonate/Phosphodiester Backbones. // J. Biol. Chem. - 1980. - V. 255(20). - P. 9659-9665.

19. Hamma T., Miller P. S. Interactions of Hairpin 01igo-2'-0-Methylribonucleotides Containing Methylphosphonate Linkages with HIV TAR RNA. // Antisense and Nucl. Acid Drug Development.-2003.-V. 13.-P. 19-30.

20. Miller P. S., McParland K. B., Jayaraman K., Ts'o P. O. P. Biochemical and Biological Effects of Nonionic Nucleic Acid Methylphosphonates. // Biochemistry. - 1981. - V. 20. - P. 1874-1880.

21. Chem T.-L., Miller P. S., Ts'o P. O. P., Colvin O. M. Disposition and metabolism of oligodeoxynucleoside methylphosphonate following a single in vivo injection in mice. // Drug Metab. Disposit. - 1990. - V. 18. - P. 815-818.

22. Ma C.-H., Kachroo A. H., Macieszak A., Chen T.-Y., Guga P., Jayaram M. // Reactions of Cre with Methylphosphonate DNA: Similarities and Contrasts with Flp and Vaccinia Topoisomerase. // PLoS ONE. - 2009. - V. 4(9). - e7248. - P. 1 -12.

23. Buck H. M. The Chemical and Biochemical Properties of Methylphosphotriester DNA and RNA in Comparison with Their Corresponding Methylphosphonates. A Dynamic Model Description. // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. - 2007. - V. 26(2). - P. 205-222.

24. Wozniak L. A., Gora M., Stcc W. J. Chemoselective Activation of Nucleoside 3'-0-Methylphosphonothioates with 1,3,5-Triazinyl Morpholinium Salts. // J. Org. Chem. - 2007. -V.72. - P. 8584-8587.

25. Sipova H., Springer T., Rejman D., Simak O., Petrova M., Novak P., Rosenbergova S., Pav O., Liboska R., Barvik I., Stepanek J., Rosenberg I., Homola J. 5-O-Methylphosphonate nucleic acids - new modified DNAs that increase the Escherichia coli RNase H cleavage rate of hybrid duplexes. // Nucl. Acids Res. - 2014. - V. 42(8). - P. 5378-5389.

26. Di W., Ferreira R. A. S„ Willinger M. C., Ren X., Pinna N. Enhanced Photoluminescence Features of Rare Earth Phenylphosphonate Hybrid Nanostructures Synthesized under Nonaqueous Conditions. // J. Phys. Chem. C. - 2010. - V. 114(14). - P. 6290-6297.

27. Sobczak M., Johansson T., Bulkowski M., Sochacki M., Laven G., Mikolaczyk B., Stawinski J., Nawrot B. DNA oligonucleotides with stereodefined phenylphosphonate and phosphonothioate internucleotide bonds: synthesis and physico-chemical properties. // ARKIVOC.-2012.- V. IV.-P. 63-79.

28. Cohen J. S. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides. In Antisense Research and Applications. // eds. S. T. Crooke, B. Lebleu, CRC Press. - 1993. - P. 205-222.

29. Tomaszewska A., Guga P., Stec W. J. Diastereomerically Pure Nucleoside-5'-0-(2-thio-4,4-pentamethylene-l,3,2-oxathiaphospholane)s - Substrates for Synthesis of P-Chiral Derivatives of Nucleoside-5'-0-phosphorothioates. // Chirality. - 2011. - V. 23. - P. 237-244.

30. De Mesmaeker A., Altmann K.-H., Waldner A., Wendeborn S. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. // Cur. Opinion in Struct. Biol. - 1995. - V. 5(3).-P. 343-355.

31. Bennett C. F. Pharmacological Properties of 2-O-Methoxyethyl-Modified Oligonucleotides. In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. - 2008. - 2nd ed. - P. 273-304.

32. Olesiak M., Okruszek A. Studies of Asymmetric Induction in the Synthesis of Dinucleoside Phosphorothioates from 2-Oxo-l,3,2-dithiaphospholane Nucleoside Derivatives. // Phosphorus, Sulfur, and Silicon. -2009,- V. 184.-P. 1548-1560.

33. Amirkhanov N. V., Zarytova V. F. // Synthesis of the 3'-derivatives of phodphorothioate oligonucleotide analouges.//Nucleosides & Nucleotides. - 1995.-V. 14(3-5).-P. 935-937.

34. Stec W. J., Zon G., Egan W., Stec, B. Automated solid-phase synthesis, separation, and stereochemistry of phosphorothioate analogs of oligodeoxyribonucleotides. // J. Am. Chem. Soc. - 1984. - V. 106(20). - P. 6077-6079.

35. Iyer R. P.; Egan W.; Regan, J. B.; Beaucage, S. L. 3H-l,2-Benzodithiole-3-one 1,1-Dioxide as an Improved Sulfurizing Reagent in the Solid-Phase Synthesis of

Oligodcoxyribonucleide Phosphorothioates. // J. Am. Chem. Soc. - 1990. - V.l 12. - P. 12531254.

36. Chrisey L. A., Walz S. E., Pazirandeh M., Campbell J. R. Internalization of Oligodeoxyribonueleotides by Vibrio parahaemolyticus. // Antisense Research and Development. - 1993. - V. 3(4). - P. 367-381.

37. Brill W. K.-D., Nielsen J., Caruthers M. H. Synthesis of Dinucleoside Phosphorodithioates via Thioamidites. //Tetrahedron Letters. - 1988. - V. 29(43). - P. 55175520.

38. Ilayakawa Y., Hirabayashi Y., Hyodo M., Yamashita S., Matsunami T., Cui D.-M., Kawai R., Kodama H. A Strategy for the stereoselective preparation of thymidine phosphorothioates with the (R) or the (S) configuration at the stereogenic phosphorus atom and their application to the synthesis of oligodeoxyribonueleotides with stereochemically pure phosphate/phosphorothioate chimeric backbones. // Eur. J. Org. Chem. - 2006. - P. 3834-3844.

39. Pruzan R., Zielinska D., Rebovvska-Kocon B., Nawrot B., Gryaznov S. M. Stereopure oligonucleotide phosphorothioates as human telomerase substrates. // New J. Chem. - 2010. - V. 34. - P. 870-874.

40. Geary R. S., Yu R. Z., Siwkowski A., Levin A. A. Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Properties of Phosphorothioate 2'-0-(2-Methoxyethyl)-Modified Antisense Oligonucleotides in Animals and Man. In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. - 2008. - 2nd ed. - P. 305-326.

41. Karskela M., Virta P., Malinen M., Urtti A., Lonnberg H. Synthesis and Cellular Uptake of Fluorescently Labeled Multivalent Hyaluronan Disaccharide Conjugates of Oligonucleotide Phosphorothioates. // Bioconjugate Chem. - 2008. - V. 19(12). - P. 2549-2558.

42. Ushijima K., Shirakawa M., Kagoshima K., Park W.-S., Miyano-Kurosaki N., Takaku N. Anti-HIV-1 activity of an antisense phosphorothioate oligonucleotide bearing imidazole and primary amine groups. // Biorg. Med. Chem. - 2001. - V. 9(8). - P. 2165-2169.

43. Matsukura M., Koike K., Zon G. Antisense phosphorothioates as antivirals against human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis B virus (HBV). // Toxicology Letters. -1995. - V. 82-83 - P. 435-438.

44. Wengel J., Petersen M., Frieden M., Koch T. Chemistry of Locked Nucleic Acids (LNA): Design, Synthesis and Bio-Physical Properties. In Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules. // eds. C. G. Janson, M. J. During, Lands/Kluwer dual imprint/Landes series: Medical Intelligence Unit. -2006. - P. 114-132.

45. Karkare S., Bhatnagar D. Promising nucleic acid analogs and mimics: characteristic features and applications of PNA, LNA, and morpholino. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. -V. 71.-P. 575-586.

46. Kaur I I., Babu B. R., Maiti S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). // Chem. Rev. - 2007. - V. 107. - P. 4672-4697.

47. Veedu R. N., Vester B., Wengel J. Enzymatic Incorporation of LNA Nucleotides into DNA Strands. // ChemBioChem. - 2007. - V. 8. - P. 490-492.

48. Nagahama K., Veedu R. N., Wengel J. Nuclease resistant methylphosphonate-DNA/LNA chimeric oligonucleotides. // Bioorg. & Med. Chem. Lett. - 2009. - V. 19. - P. 2707-2709.

49. Koch T., 0rum II. Locked Nucleic Acid. In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. - 2008. -2nd ed. - P. 519-564.

50. Varallyay E., Burgyan J., Havelda Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. // Methods. - 2007. - V. 43. - P. 140-145.

51. Castoldi M., Benes V., Hentze M. W., Muckenthaler M. U. miChip: A microarray platform for expression profiling of microRNAs based on locked nucleic acid (LNA) oligonucleotide capture probes. // Methods. - 2007. - V. 43. - P. 146-152.

52. Elmen J., Lindow M., Schutz S., Lawrence M., Petri A., Obad S., Lindholm M., Hedtjarn M., Hansen H. F., Berger U., Gullans S., Kearney P., Sarnow P., Straarup E. M., Kauppinen S. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. // Nature. - 2008. - V. 452. — P. 896-900.

53. Kumar T. S., Wengel J., Hrdlicka P. J. 2'-N-(Pyren-l-yl)acetyl-2'-Amino-a-L-LNA: Synthesis and Detection of Single Nucleotide Mismatches in DNA and RNA Targets. // ChemBioChem.-2007.-V. 8.-P. 1122-1125.

54. Roberts J., Palma E., Sazani P., 0rum H., Cho M., Kole R. Efficient and Persistent Splice Switching by Systemically Delivered LNA Oligonucleotides in Mice. // Molecular therapy. -2006.-V. 14(4).-P. 471-475.

55. Summerton J. E. Morpholinos and PNAs Compared. // eds. C. G. Janson, M. J. During, Lands/Kluwer dual imprint/Landes series: Medical Intelligence Unit. - 2006. — P. 89-113.

56. Iversen P. L. Morpholinos. In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. - 2008. - 2nd ed. - P. 565-582.

57. Youngblood D. S., Hatlevig S. A., Hassinger J. N., Iversen P. L., Moulton H. M. Stability of Cell-Penetrating Peptide-Morpholino Oligomer Conjugates in Human Serum and in Cells. // Bioconjugate Chem. - 2007. - V. 18. - P. 50-60.

58. Amantana A., Moulton H. M., Cate M. L., Reddy M. T., Whitehead T., Hassinger J. N., Youngblood D. S., Iversen P. L. // Pharmacokinetics, Biodistribution, Stability and Toxicity of a

Cell-Penetrating Peptide-Morpholino Oligomer Conjugate. // Bioconjugate Chem. - 2007. - V. 18.- P. 1325-1331.

59. Li Y.-F., Morcos P. A. Design and Synthesis of Dendritic Molecular Transporter that Achieves Efficient in ViWo Delivery of Morpholino Antisense Oligo. // Bioconjugate Chem. -2008.-V. 19.-P. 1464-1470.

60. Fletcher S., Honeyman K., Fall A. M„ Harding P. L., Johnsen R. D., Wilton S. D. Dystrophin expression in the mdx mouse after localised and systemic administration of a morpholino antisense oligonucleotide. // J. Gene Med. - 2006. - V. 8. - P. 207-216.

61. Heemskerk H. A., de Winter C. L., de Kimpe S. J., van Kuik-Romeijn P., Heuvelmans N., Platenburg G. J., van Ommen G.-J. B., van Deutekom J. C. T., Aartsma-Rus A. In vivo comparison of 2'-0-methyl phosphorothioate and morpholino antisense oligonucleotides for Duchenne muscular dystrophy exon skipping. // J. Gene Med. - 2009. - V. 11. - P. 257-266.

62. Yokota T., Lu Q.-L., Partridge T., Kobayashi M.. Nakamura A.. Takeda S., Hoffman E. Efficacy of Systemic Morpholino Exon-Skipping in Duchenne Dystrophy Dogs. // Ann. Neurol. - 2009. - V. 65. - P. 667-676.

63. Lupfer C., Stein D. A., Mourich D. V., Tepper S. E., Iversen P. L., Pastey M. Inhibition of influenza A H3N8 virus infections in mice by morpholino oligomers. // Arch. Virol. - 2008. -V. 153.-P. 929-937.

64. Achim C., Armitage B. A., Ly D. H., Schneider J. W. Peptide Nucleic Acids. // Wiley encyclopedia of chemical biology. -2008. - P. 1-10.

65. Kumar V. A., Structural Preorganization of Peptide Nucleic Acids: Chiral Cationic Analogues with Five- or Six-Membered Ring Structures. // Eur. J. Org. Chem. - 2002 - P. 2021 -2032.

66. Nielsen P. E. Peptide Nucleic Acids (PNA) in Chemical Biology and Drug Discovery. // Chemistry & Biodiversity. - 2010. - V. 7. - P. 786-804.

67. Dueholm K. L., Egholm M., Behrens C., Cristensen L., Hansen II. F., Vulpius T., Petersen K. H., Berg R. H., Nielsen P. E., Buchardt O. Synthesis of Peptide Nucleic Acid monomers containing the four natural nucleobases: thymine, cytosine, adenine, and guanine and their oligomerization. // J. Org. Chem. - 1994. - V. 59. - P. 5767-5773.

68. Kosynkina L., Wang W., Liang T. C. A Convenient Synthesis Of Chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) Monomers. // Tetrahedron Letters. - 1994. - V. 35(29). - P. 5173-5176.

69. Meltzer P. C., Liang A. Y., Matsudaira P. // Peptide Nucleic Acids (PNAs): Synthesis of Thymine, Adenine, Guanine, and Cytosine Nucleobase. // J. Org. Chem. - 1995. - V. 60. - P. 4305-4308.

70. Brcipohl G., Will D. W., Peyman A., Uhlmann E. Novel Synthetic Routes to PNA Monomers and PNA-DNA Linker Molecules. // Tetrahedron. - 1997. - V. 53(43). - P. 1467114686.

71. Falkiewicz B., Kolodziejczyk A. S., Liberek B., Wisniewski K. Synthesis of achiral and chiral Peptide Nucleic Acid (PNA) monomers using Mitsunobu reaction. // Tetrahedron Letters. - 2001. - V. 57. - P. 7909-7917.

72. Zengeya T., Li M., Rozners E. PNA containing isocytidine nucleobase: Synthesis and recognition of double helical RNA. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2011. - V. 21(7). - P. 21212124.

73. Mitra R., Ganesh K. N. Aminomethylene Peptide Nucleic Acid (am-PNA): Synthesis, Regio-/Stereospecific DNA Binding, And Differential Cell Uptake of (a/y,R/S)am-PNA Analogues. // J. Org. Chem. - 2012. - V. 77(13). - P. 5696-5704.

74. Banerjee A., Kumar V. A. C3'-endo-puckered pyrrolidine containing PNA has favorable geometry for RNA binding: Novel ethano locked PNA (ethano-PNA). // Bioorg. Med. Chem. -2013. - V. 21 (14). - P. 4092-4101.

75. Merino P., Matute R. Chemical Synthesis of Conformationally Constrained PNA Monomers. In Chemical Synthesis of Nucleoside Analogues. // ed. P. Merino, John Wiley & Sons, Inc. -2013,- 1st ed. - P. 847-880.

76. Porcheddu A., Giacomelli G., Piredda I., Carta M., Nieddu G. A Practical and Efficient Approach to PNA Monomers Compatible with Fmoc-Mediated Solid-Phase Synthesis Protocols. // Eur. J. Org. Chem. - 2008. - P. 5786-5797.

77. Christensen L., Fitzpatrick R., Gildea B., Petersen K. H., Hansen H. F., Koch T., Egholm M., Buchardt O., Nielsen P. E., Coull J., Berg, R. H. Solid-phase synthesis of peptide nucleic acids. //J. Pept. Sci. - 1995. - V. 1(3).-P. 175-183.

78. Joshi R., Jha D., Su W., Engelmann J. Facile synthesis of peptide nucleic acids and peptide nucleic acid-peptide conjugates on an automated peptide synthesizer. // J. Pept. Sci. -2011.-V. 17. — P. 8-13.

79. Dragulescu-Andrasi A., Rapireddy S., Frezza B. M., Gayathri C., Gil R. R., Ly D. H. A simple y-backbone modification preorganizes peptide nucleic acid into a helical structure. // J. Am. Chem.-2006,-V. 128.-P. 10258-10267.

80. Zhou P., Dragulescu-Andrasi A., Bhattacharya B., O'Keefe H., Vatta P., Hyldig-Nielsen J. J., Ly D. H. Synthesis of cell-permeable peptide nucleic acids and characterization of their hybridization and uptake properties. // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2006. - V. 16. - P. 49314935.

81. Haaima G., Lohse A., Buchardt O., Nielsen P. E. Peptide Nucleic Acids (PNAs) Containing Thymine Monomers Derived from Chiral Amino Acids: Hybridization and Solubility Properties of D-Lysine PNA. // Angevv. Chem. Int. Ed. - 1996. - V. 35(17). - P. 1939-1942.

82. Zarra R., Montesarchio D., Coppola C., Bifulco G., Di Micco S., Izzo I., De Riccardis F. Design, Synthesis, and Hybridisation of Water-Soluble, Peptoid Nucleic Acid Oligomers Tagged with Thymine. // Eur. J. Org. Chem. - 2009. - P. 6113-6120.

83. De Cola C., Manicardi A., Corradini R., Izzo I., De Riccardis F. Carboxyalkyl peptoid PNAs: synthesis and hybridization properties. // Tetrahedron. -2012. -V. 68. - P. 499-506.

84. Efimov V. A., Choob M. V., Buryakova A. A., Chakhmakhcheva O. G. Synthesis And Binding Study Of Phosphonate Analogues Of Pnas And Their Hybrids With Pnas. // Nucleosides & Nucleotides.- 1998,-V. 17(9-11).-P. 1671-1679.

85. Efimov V. A., Chakhmakhcheva O. G., Wickstrom E. Synthesis and Application of Negatively Charged PNA Analogues. //Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. - 2005. - V. 24.-P. 1853-1874.

86. Shiraishi T., Hamzavi R., Nielsen P. E. Subnanomolar antisense activity of phosphonate-peptide nucleic acid (PNA) conjugates delivered by cationic lipids to I-IeLa cells. // Nucleic Acids Research. - 2008. - V. 36( 13). - P. 4424-4432.

87. Avitabile C., Moggio L., Malgieri G., Capasso D., Di Gaetano S., Saviano M., Pcdone C., Romanelli A. y-sulphate PNA (PNA S): Highly Selective DNA Binding Molecule Showing Promising Antigene Activity. // PLoS ONE. - 2012. - V. 7(5). - e35774. - P. 1 -10.

88. Tilani N., De Costa S., Heemstra J. M. Evaluating the Effect of Ionic Strength on Duplex Stability for PNA Having Negatively or Positively Charged Side Chains. // PLoS ONE. - 2013. -V. 8(3).-e58670.-P. 1-8.

89. Nielsen P. E. Modulating Gene Function with Peptide Nucleic Acids (PNA). In Antisense drug technology: principles, strategies, and applications. // ed. S. T. Crooke, CRC Press. — 2008. -2nd ed. - P. 507-518.

90. Sazani P., Gemignani F., Kang S.-H., Maier M. A., Manoharan M., Persmark M., Bortner D., Kole R. Systemically delivered antisense oligomers upregulate gene expression in mouse tissues. // Nature Biotech. - 2002. - V. 20. - P. 1228-1233.

91. Hamzavi R., Dolle F., Tavitian B., Dahl O., Nielsen P. E. Modulation of the Pharmacokinetic Properties of PNA: Preparation of Galactosyl, Mannosyl, Fucosyl, N-Acetylgalactosaminyl, and N-Acetylglucosaminyl Derivatives of Aminoethylglycine Peptide Nucleic Acid Monomers and Their Incorporation into PNA Oligomers. // Bioconjugate Chem. -2003.-V. 14.-P. 941-954.

92. Upadhyay A., Ponzio N. M., Pandey V. N. Immunological Response to Peptide Nucleic Acid and its Peptide Conjugate Targeted to Transactivation Response (TAR) Region of IIIV-1 RNA Genome. // Oigonucleotides. - 2008. - V. 18. - P. 329-335.

93. Sheng L., Miao C., JinDu L, IlaoBo Z., JinQing W, ShengRong Y. Application of peptide nucleic acids containing azobenzene self-assembled electrochemical biosensors in detecting DNA sequences. // Sci. China Ser. B-Chem. - 2009. - V. 52(7). - P. 1009-1013.

94. Galbiati S., Foglieni B., Travi M., Curcio C., Restagno G., Sbaiz L., Smid M., Pasi F., Ferrari A., Ferrari M., Cremonesi L. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reaction as a key point for non-invasive prenatal diagnosis of p-thalassemia. // Haematologica. -2008.-V. 93(4). -P. 610-614.

95. Choi J.-J., Cho M., Oh M., Kim H., Kil M.-S., Park H. PNA-mediated Real-Time PCR Clamping for Detection of EGFR Mutations. // Bull. Korean Chem. Soc. - 2010. - V. 31(12). -P. 3525-3529.

96. Lusvarghi S., Murphy C. T., Roy S., Tanious F. A., Sacui I., Wilson W. D., Ly D. H., Armitage B. A. Loop and Backbone Modifications of Peptide Nucleic Acid Improve G-Quadruplex Binding Selectivity. // J. Am. Chem. Soc. - 2009. - 131. - P. 18415-18424.

97. Boyarskaya N. P., Prokhorov D. I., Kirillova Yu. G., Zvonkova E. N., Shvets V. I. Synthesis of protected pseudopeptides from dicarboxylic amino acids by Mitsunobu condensation. // Tetrahedron Letters. -2005. - V. 46. - P. 7359-7362.

98. Thomson S. A., Josey J. A., Cadilla R., Gaul M. D., Hassman C. F., Luzzio M. J., Pipe A. J., Reed K. L., Ricca D. J., Wiethe R. W., Noble S. A. Fmoc Mediated Synthesis of Peptide Nucleic Acids. // Tetrahedron. - 1995. - V. 51 (22). - P. 6179-6194.

99. Will D. W., Breipohl G., Langner D., Knolle J., Uhlmann E. The Synthesis of Polyamide Nucleic Acids using a Novel Monomethoxytrityl Protecting-Group Strategy. // Tetrahedron. -1995.-V. 51(44).-P. 12069-12082.

100. Timar Z., Kovacs L., Kovacs G., Schmel Z. Fmoc/Acyl protecting groups in the synthesis of polyamide (peptide) nucleic acid monomers. // J. Chem. Soc. Perkin Trans. - 2000. - V. 1. -P. 19-26.

101. Perrin D. D., Armarego W. L. F. Purification of organic chemicals. In purification of laboratory chemicals. // Pergamon Press. - 1988. - 3rd ed. - P. 65-310.

102. Liu X., Zheng, Q.-H., Hutchins G. D„ Fei X., Erickson L. C., Miller K. D., Mock B. II., Glick-Wilson B. E., Winkle W. L., Stone K. L., Carlson K. A. A Convenient Procedure for the Synthesis of 06-Benzylguanine Derivatives by Phase Transfer Catalysis. // Synth. Comm. -2003.-V. 33(6).-P. 941-952.

103. Dolan M. E., Moschel R. С., Pegg A. E. Depletion of mammalian Of'-alkylguanine-DNA alkyltransferase activity by 06-benzylguanine provides a means to evaluate the role of this protein in protection against carcinogenic and therapeutic alkylating agents. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - V. 87. - P. 5368-5372.

104. Barth C., Seitz O., Kunz H. Synthese von 6-O-BenzyIguanin und seinen Anker-Konjugaten. // Z. Naturforsch. - 2004. - V. 59b. - P. 802-806.

105. Деженков А. В., Прохоров И. А., Лютик А. И., Швец В. И., Кириллова Ю. Г. Рациональный способ получения псевдопептидных фрагментов - ключевых интермедиатов синтеза полиамидных миметиков нуклеиновых кислот (ПАНКМ). // Вестник МИТХТ. - 2013. - Т. 8 № 6. - С. 108-110.

106. Chandrasekhar S., Reddy Ch. R., Rao R. J. Facile and selective cleavage of allyl ethers, amines and esters using polymethylhydrosiloxane-ZnCb/Pd(PPh3)4. // Tetrahedron. -2001. - V. 57. - P. 3435-3438.

107. Friedrich-Bochnitschek S., Waldmann H., Kunz H. Allyl esters as carboxy protecting groups in the synthesis of O-glycopeptides. // J. Org. Chem. - 1989. - V. 54(4). - P. 751 -756.

108. Dueholm K. L„ Petersen К. H., Jensen D. K., Egholm M., Nielsen P. E„ Buchardt O. Peptide nucleic acid (PNA) with a chiral backbone based on alanine. // Bioorg. & Med. Chem. Letters. -1994. - V. 4(8). - P. 1077-1080.

109. Sahu В., Sacui I., Rapireddy S., Zanotti K. J., Bahal R., Armitage B. A., Ly D. H. Synthesis and Characterization of Conformationally Preorganized, (R)-Diethylene Glycol-Containing y-Peptide Nucleic Acids with Superior Hybridization Properties and Water Solubility. // J. Org. Chem. - 2011. - V. 76. - P. 5614-5627.

110. Huang H., Joe G. H., Choi S. R., Kim S. N., Kim Y. Т., Pak C. S., Hong J. H„ Lee W. Synthesis of Enantiopure y-Glutamic Acid Functionalized Peptide Nucleic Acid Monomers. // Bull. Korean Chem. Soc. - 2010. - V. 31 (7). - P. 2054-2056.

111. I luang H„ Joe G. 11., Choi S. R., Kim S. N., Kim Y. Т., Pak H. S., Kim S. K„ Hong J. I L, Han H.-K., Kang J. S., Lee W. Preparation and Determination of Optical Purity of y-Lysine Modified Peptide Nucleic Acid Analogues. // Arch. Pharm. Res. - 2012. - V. 35(3). - P. 517522.

112. Kuznetsov M. A., Nesterenko P. N., Vasiyarov G. G., Staroverov S. M. Sorbents with immobilized glycopeptide antibiotics for separating optical isomers by high-performance liquid chromatography. // Appl. Biochemistry and Microbiology. - 2006. - V. 42(6). - P. 536-544.

113. Yeh J. I., Shivachev В., Rapireddy S., Crawford M. J., Gil R. R„ Du S., Madrid M., Ly D. H. Crystal Structure of Chiral yPNA with Complementary DNA Strand: Insights into the

Stability and Specificity of Recognition and Conformational Preorganization. // J. Am. Chem. Soc.-2010.-V. 132.-P. 10717-10727.

114. Dolan M. E., Pegg A. E. O^-Benzylguanine and Its Role in Chemotherapy. // Clinical Cancer Research. - 1997. - V. 3. - P. 837-847.

115. Gray N. S., Wodicka L., Thunnissen A.-M. W. H., Norman T. C., Kwon S., Espinoza F. H., Morgan D. O., Barnes G., LeClerc S., Meijer L., Kim S.-H., Lockhart D. J.,. Schultz P. G. Exploiting Chemical Libraries, Structure, and Genomics in the Search for Kinase Inhibitors. // Science. - 1998. - V. 281. - P. 533-538.

116. Jensen L. H., Thougaard A. V., Grauslund M., Sokilde B., Carstensen E. V., Dvinge H. K., Scudiero D. A., Jensen P. B., Shoemaker R. H., Sehested M. Substituted Purine Analogues Define a Novel Structural Class of Catalytic Topoisomerase II Inhibitors. // Cancer Res. - 2005. -V. 65(16).-P. 7470-7477.