Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Алябьева, Наталья Михайловна

• Алябьева, Наталья Михайловна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Алябьева, Наталья Михайловна

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 3

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Глава 1. Обзор литературы........................................................

1.1. История изучения и общая характеристика пневмококков.......... 27

1.2. Пневмококковые инфекции и серотиповое разнообразие

31

пневмококка...........................................................................

1.3. Антибиотикорезистентность пневмококка и генетические механизмы устойчивости к бета-лактамам и макролидам................ 36

1.4. Генетическое разнообразие пневмококков.............................. 42

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................

Глава 2. Спектр циркулирующих серотипов пневмококка............ 46

Глава 3. Молекулярное типирование чистой культуры S. pneumoniae

с помощью мультиплексной ПЦР................................................ ^

Глава 4. Анализ антибиотикорезистентности пневмококка и изучение молекулярных механизмов устойчивости к макролидам и генотипов

полирезистентных штаммов........................................................ 56

Глава 5. Детекция ДНК бактериальных отопатогенов в жидкости среднего уха у детей с острым средним отитом с использованием

ПЦР в реальном времени.......................................................... 64

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................... 70

ВЫВОДЫ.............................................................................. 77

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ....................................... 78

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДАЛЬНЕЙШЕЙ

РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ........................................................................... 78

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................... 79

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................ оП

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Streptococcus pneumoniae (пневмококк) является ведущей причиной респираторных инфекций бактериальной этиологии, включая острый средний отит (ОСО), синусит и внебольничную пневмонию. Кроме того, пневмококк может вызывать такие тяжелые инвазивные инфекции, как менингит, бактериемия и бактериемическая пневмония, которые связаны с высокой летальностью. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, от пневмококковых инфекций ежегодно умирают около 1 млн. детей в возрасте до 5 лет [3].

В РФ заболеваемость внебольничной пневмонией в детской популяции оценивается в 5-12 случаев на 1000, и она наиболее высока у детей в возрасте младше 5 лет. При этом у 80% пациентов из указанной возрастной группы болезнь связана с пневмококком [1]. При бактериальном менингите у детей до 5 лет пневмококк обнаруживают в 2-20% этиологически расшифрованных случаев, что соответствует заболеваемости 4-8 случаев на 100 000 детей этого возраста [14].

Самой частой клинической формой пневмококковой инфекции у детей является ОСО. К возрасту трех лет 80% детей переносят хотя бы один эпизод ОСО, а к семи годам 40% переносят шесть и более рецидивов этой инфекции [105]. В большинстве случаев нетяжелая инфекция, ОСО может стать причиной снижения слуха и повлиять на когнитивное и интеллектуальное развитие ребенка. Более того, во всем мире ОСО служит самым частым поводом для обращения за медицинской помощью и назначения антибиотиков в педиатрической практике, налагая серьезное бремя на ресурсы здравоохранения [82].

Широкое и нередко необоснованное назначение антибиотиков при респираторных инфекциях у детей без учета их этиологии служит одним из основных факторов, определяющих рост антибиотикорезистентности пневмококка. За последние 30 лет распространенность устойчивых к

антибиотикам штаммов пневмококка выросла во всем мире. В зависимости от региона доля нечувствительных к пенициллину изолятов колеблется от 5 до 50%, к макролидам - от 5 до 80% [95; 121]. Вызывает обеспокоенность появление пневмококков с множественной устойчивостью (т.е. полирезистентностью — нечувствительностью к 3 и более группам антибиотиков), доля которых в некоторых странах достигает 30-50%. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Выраженная региональная вариабельность резистентности S. pneumoniae диктует необходимость получения данных о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России [12; 25].

В последние годы для профилактики пневмококковых инфекций широко используют пневмококковые полисахаридные конъюгированные вакцины (ПКВ), эффективность которых была показана во многих странах, внедривших ПКВ в Национальные календари иммунизации [21; 103; 125]. В состав ПКВ входят капсульные полисахариды от 7 до 13 серотипов S. pneumoniae, которые обеспечивают серотип-специфический иммунный ответ. К настоящему времени описано более 90 серотипов пневмококков, однако вирулентность их неодинакова, и большинство инвазивных пневмококковых инфекций связано с ограниченным набором (не более 15-20) клинически значимых серотипов [8; 16; 21; 125]. При создании ПКВ учитывалась распространенность серотипов, с которыми было связано основное число тяжелых пневмококковых инфекций в США и странах Европы, и именно эти серотипы были включены в состав ПКВ7 (вакцинные серотипы). Однако спектр циркулирующих серотипов S. pneumoniae может варьировать в разных странах, поэтому требуются региональные данные о наиболее актуальных серотипах пневмококка для создания новых вакцин и изучения их эпидемиологической эффективности [2; 24; 125]. В связи с

этим изучение серотипового пейзажа S. pneumoniae на конкретной территории является важным методом эпидемиологического контроля, который позволит оценить эффективность вакцинации и ее влияние на эволюцию пневмококка.

Таким образом, пневмококковые инфекции являются серьезной клинико-микробиологической проблемой, заслуживающей особого внимания. Это объективно обосновывает необходимость дальнейшего слежения за серотипами пневмококка, распространенности его резистентных штаммов, преобладающими генетическими механизмами лекарственной устойчивости, клональными характеристик циркулирующей популяции бактерий в целях улучшения профилактики и лечения заболеваний, связанных с этим возбудителем.

Степень разработки темы исследования Одни из первых работ по серотипированию пневмококков при помощи специфических сывороток принадлежат немецкому бактериологу Фреду Нейфельду [53]. К настоящему времени в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка, разделенных на серотипы и серогруппы по антигенной структуре [96, 101].

В последние годы наиболее актуальной представляется проблема резистентности пневмококков. Резистентность ассоциирована с глобально распространенными генетическими линиями (клональными комплексами) пневмококка. Литературные данные о региональных особенностях резистентности S. pneumoniae свидетельствует о необходимости получения сведений о его чувствительности к используемым антибиотикам и в России [12, 25], поскольку именно региональные данные крайне важны для понимания тенденций распространения серотипов и резистентности пневмококков на конкретной территории. Первичная селекция и распространение резистентных штаммов микроорганизмов происходит в отдельных популяциях, затем устойчивые клоны могут распространиться на

значительные территории, преодолевая границы государств и континентов. Идентификация устойчивости к антибиотикам, описание географии и динамики распространения резистентных штаммов имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку будут способствовать совершенствованию существующих антибактериальных препаратов и снижению вероятности возникновения резистентности.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: Охарактеризовать спектр серотипов и распространенность устойчивости к антибиотикам клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве.

Задачи исследования:

1. Описать актуальный серотиповой пейзаж изучаемых клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве за 2009-2013гг.

2. Модифицировать схему типирования, основанную на мультиплексной полимеразной цепной реакции, в соответствии с данными об актуальных серотипах S. pneumoniae и сравнить результаты серологического и молекулярного метода типирования.

3. Определить распространенность устойчивых штаммов штаммов S. pneumoniae к основным антибактериальным препаратам.

4. Охарактеризовать клональную структуру полирезистентных штаммов S. pneumoniae. Определить молекулярные механизмы резистентности к макролидам у выделенных штаммов S. pneumoniae.

5. Оценить диагностическую значимость выявления специфической ДНК при остром среднем отите у детей и определить структуру его бактериальных возбудителей.

Научная новизна работы

На основании исследования 863 клинических штаммов, выделенных от детей с респираторными инфекциями в г. Москве в период 2009-2013гг., охарактеризован современный серотиповой пейзаж пневмококков и установлено, что 69,4% из них относится к 6 доминирующим серотипам: 3, 6А, 6В, 14, 19F и 23F. Оценка полноты охвата циркулирующих серотипов имеющимися пневмококковыми конъюгированными вакцинами показала целесообразность использования вакцин с расширенным спектром серотипов (13-валентная пневмококковая конъюгированная вакцина).

Получены новые данные о распространенности устойчивости к антибиотикам актуальных штаммов пневмококка, циркулирующих у детей в Москве в настоящее время. Показано, что 27% штаммов нечувствительны к пенициллину, 26% резистентны к макролидам, а 22% обладают полирезистентностью.

Показано, что ведущим молекулярным механизмом резистентности изучаемых штаммов S. pneumoniae к макролидам является рибосомальное метилирование с участием гена егтВ который определяется у 85% макролид-резистентных штаммов, причем у 31% штаммов он сочетается с эффлюксным механизмом.

С помощью метода мультилокусного сиквенс-типирования впервые охарактеризована популяционная генетическая структура полирезистентных штаммов S. pneumoniae в Москве и показано, что большинство из них (57%) относится к четырем клональным комплексам (СС63, СС156, СС230 и СС320), которые распространены во всем мире.

Модифицирована схема мультиплексного молекулярного типирования пневмококков на основе полимеразной цепной реакции, которая позволяет типировать 90,5% штаммов за первые три реакции.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Сведения о современном серотиповом пейзаже клинических штаммов пневмококков дают представление о полноте их охвата существующими пневмококковыми конъюгированными вакцинами на конкретной территории.

Полученные данные о сиквенс-типах S. pneumoniae, указывающие на генетическую гетерогенность штаммов, создают основу для мониторинга генетической структуры полирезистентных штаммов пневмококка в нашей стране. Информация о полученных сиквенс-типах размещена в международной базе данных PMEN.

Проведен сравнительный анализ серологического и молекулярного метода типирования пневмококка. Подтверждена надежность молекулярного метода и возможность его использования в рутинной практике.

Знания об этиологической структуре возбудителей острого среднего отита и распространенности устойчивых к антибиотикам штаммов пневмококка будут способствовать оптимизации эмпирической антибактериальной терапии респираторных инфекций.

Молекулярное типирование с помощью модифицированной мультиплексной ПЦР является адекватным и надежным методом, который можно использовать для идентификации серотипа у 90,5% циркулирующих штаммов пневмококка на основании первых трех реакций.

Впервые показана высокая чувствительность молекулярно-генетического метода непосредственно в биопробе при этиологической диагностике острого среднего отита у детей вне зависимости от приема антибактериальных препаратов, предшествовавшего сбору биоматериала.

Результаты исследований и разработок внедрены в научно-исследовательскую работу лаборатории молекулярной генетики и клеточной биологии и лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД. , а также в материалы лекций по рациональной антибактериальной терапии при болезнях дыхательных путей у детей и используются в учебной программе на кафедре педиатрии в ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.

Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стали проблемы, связанные с серотипами и антибиотикоустойчивостью клинических штаммов S. pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях в г. Москве.. Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Описание исследованных образцов

В исследование включены все штаммы S. pneumoniae, выделенные в лаборатории микробиологии ФГБНУ НЦЗД в период с марта 2009 г. по апрель 2013 г. Пневмококк выделяли из образцов, полученных от детей из Москвы (медиана возраста 3,5 года, межквартильный интервал 1 месяц - 6,0 лет) с симптомами острой респираторной инфекции предположительно бактериальной этиологии, с ОСО, а также с хроническими болезнями легких. Часть образцов была получена в ходе реализации многоцентрового проекта «Определение роли пневмококковой инфекции в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационарные отделения лечебных учреждений г. Москвы в 2011-2012 годах в целях оптимизации терапии и профилактики заболевания» [4].

Исследовали несколько типов образцов, включая назофарингеальные мазки, материал из нижних дыхательных путей (мокрота, трахеальный аспират, бронхоальвеолярный лаваж), жидкость среднего уха (ЖСУ) от детей с ОСО, полученную с помощью тимпаноцентеза или после спонтанного прорыва барабанной перепонки. В связи с тем, что эти штаммы не были связаны с инвазивными пневмококковыми инфекциями, в нашей работе используется термин «неинвазивные штаммы». Образцы отбирали с помощью набора eSWAB Collection Kit (Copan Diagnostics, Италия), состоящего из зонда и контейнера с транспортной средой, и доставляли в течение 4-24 часов в лабораторию микробиологии ФГБНУ НЦЗД для исследования. У пациентов документировали возраст, тип материала, прием антибиотиков в течение последних 3 дней до взятия образца.

Культуральные микробиологические исследования

Для микробиологического анализа использовали расходные материалы и оборудование производства BioMerieux (Франция), если не указано иное. Посев биоматериала производили на питательный агар (Columbia, Bio-Rad, Франция) с добавлением 3% донорской эритроцитарной массы крови человека и 3% лошадиной сыворотки. Образцы ЖСУ наносили также на «шоколадный» агар, содержащий 10 мкг/мл НАД, который добавляли в предварительно охлажденную до 50-60°С среду. Посевы инкубировали в термостате с повышенным содержанием С02 (5%) при температуре 37°С в течение 24 - 48 ч. Идентификацию пневмококка проводили на основании морфологических и культуральных свойств, а также с помощью теста с оптохином и реакции латекс-агглютинации (Slidex Pneumo-Kit). Выделенные культуры Н. influenzae идентифицировали на основании изучения морфологии, культуральных свойств, потребности в факторах роста X и V в системе API NH. Бета-гемолитические стрептококки дифференцировали по чувствительности к бацитрацину (Bacitracin,

HiMedia, Индия) и методом латекс-агглютинации с реагентом Slidex Strepto Kit. Пневмококковые изоляты хранили в бульоне (Nutrient Broth, HiMedia, Индия) с добавлением 17% глицерина при -80°С.

У пациентов с ОСО положительным культуральным результатом считали выделение из ЖСУ этиологически значимых бактерий, к которым относили Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis [9; 66; 92; 139]. Отрицательным культуральным результатом считали отсутствие бактериального роста или рост другой (этиологически незначимой) микрофлоры. Случай микробиологически подтвержденного бактериального ОСО определяли как эпизод ОСО, при котором у пациента с одно- или двухсторонним процессом из одного или обоих образцов ЖСУ был выделен значимый возбудитель в виде монокультуры или в ассоциации. При наличии в ЖСУ у одного пациента 2 и более видов патогенов каждый патоген считали этиологически значимым и учитывали при расчете его доли в структуре этиологии ОСО. Серотипирование пневмококков с помощью антисывороток Серологическое типирование S. pneumoniae проводили в реакции латексной агглютинации (Рисунок 1) и/или реакции набухания капсулы по Нейфельду (Рисунок 4).

Рисунок 1. Реакция латекс-агглютинации.

Примечание: А - положительная реакция, Б - отрицательная реакция.

Этот метод основан на выявлении антигенных различий в строении капсульных полисахаридов S. pneumoniae с помощью специфических типовых (групповых) антисывороток [84]. Для этого использовали набор «ImmuLex™ Pneumotest kit» (Statens Serum Institut, Дания), состоящий из 14 пуловых, 21 групповой, 25 типовых, и 64 факторных сывороток. (SSI Diagnostica: Neufeld antisera. http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013) (Таблица 1). Реакцию набухания капсулы определяли с помощью фазовоконтрастной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Нетипируемыми считали изоляты пневмококка, которые не агглютинировались ни одной из пуловых сывороток (пулы A-I и Р-Т).

Таблица 1

Состав пуловых сывороток из набора «ImmuLex™»

Название пула Серогруппа Серотип

А 18 1,2, 4,5

В 6, 19 3, 8

С 7, 24 20,31,40

D 9, 11, 16 36, 37

Е 10, 12, 33 21,39

F 17, 22, 32,41 27

G 35, 47 29, 34, 42

H 15,23,28 13, 14

I 25 38, 43, 44, 45, 46, 48

P 7, 19 1,14

Q 6, 18, 23 -

R 9, 12 3,4

S 10, 15, 17 5,8

T 11,22,33 2, 20

Реакцию латекс-агглютинации проводили путем смешивания 10 мкл антисыворотки, конъюгированной с частицами латекса, и 10 мкл

физиологического раствора, в который помещали небольшое количество чистой культуры пневмококка, в течение 5-8 сек. Положительную реакция (появление хлопьев, т.е. агглютинация) определяли невооруженным глазом в течение 5-10 сек, но не более 30 сек. (Рисунок 1). Для проведения реакции Нейфельда на предметное стекло наносили 1 каплю физиологического раствора и смешивали с небольшим количеством чистой культуры пневмококка. Затем добавляли равное количество антисыворотки, тщательно перемешивали и накрывали покровным стеклом. Результат учитывали в течение 5 минут с помощью фазово-контрастного микроскопа при 1000-кратном увеличении (Рисунок 4).

Определение чувствительности к антимикробным препаратам

Для определения чувствительности пневмококка к оксациллину, эритромицину, клиндамицину и триметоприму/сульфаметоксазолу (ТМП/СМЗ) диско-диффузионным методом (диски Bio-Rad, США) использовали среду Мюллера-Хинтона с добавлением 5% крови человека. Результаты интерпретировали согласно рекомендациям МУК 4.2. 1890 - 04 [19]. Чувствительными считали штаммы с диаметром зоны подавления роста > 20 мм для диска с оксациллином, >21 мм для эритромицина, >19 для клиндамицина и триметоприма/ сульфаметоксазола.

Для штаммов S. pneumoniae, резистентных к оксациллину, определяли МПК пенициллина методом Е-теста. Чувствительными считали изоляты с МПК <0,06 мкг/мл, нечувствительными к пенициллину - штаммы с МПК >0,06 мкг/мл [88].

Молекулярное типирование пневмококков

Молекулярное серотипирование пневмококков проводили с помощью мультиплексной ПЦР (М-ПЦР) [114]. Выделение ДНК из чистой культуры S. pneumoniae проводили по следующей схеме: инкубировали в течение суток при 37°С с 5% СО2, инокулировали полученную субкультуру в 250 мкл ТЕ-буфера (состав: 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и доводили мутность бактериальной взвеси до 1 по стандарту МакФарланда. Затем суспензию

нагревали до 100°С в течение 5 мин и немедленно замораживали до -20°С. Полученные лизаты хранили до использования при -20°С.

Двадцать восемь пар праймеров группировали в 7 М-ПЦР (Таблица 2, 3) [114]. В каждой ПЦР в качестве ДНК-матрицы использовали полученный бактериальный экстракт.

Таблица 2

Состав и объем праймеров в М-ПЦР

№ Мультиплекса Состав Объем, мкл

6А/В-{6А/В-т 0.5

1 14-£ 14-г 1

19¥-{, \9F-r 1.5

23¥-{, 23Б-г 1.5

3-1 3-г 1.5

\\A-f, 11А-г 1

2 1.25

15В/С-^ 15В/С-Г 1.5

9У-£ 9У-г 1.5

3 15А< 15А-г 1.5

19А-{, 19А-г 1

34-£ 34-г 1.5

1-{, 1-г 1.5

4 7¥-г 2

10А-£ 10-г 1.5

33¥-{, ЗЗБ-г 1

4-^ 4-г 1.5

5 \2F-f, 12Б-г 1.5

\7F-f, 17Б-Г 1.5

38-Р, 38-г 1.5

7С-£ 7С-г 1.5

6 \6F-f, \6F-r 2

35В-{У 35В-г 1

35¥-Ь 35Р-г 1.5

8-г 1.5

7 20-£ 20-г 1.5

22¥-Г, 22-г 1.5

31-^31-г 2

Внутренний контроль cpsA-f срзА-г 0.5

Таблица 3

Праймеры для серотипирования S. pneumoniae [114]

№ Праймер Последовательность (5' - 3') Продукт (bp)

1 1-f 1-г CTC TAT AGA ATG GAG TAT ATA AAC TAT GGT TA CCA AAG AAA ATA СТА АСА TTA TCA CAA TAT TGG С 280

2 3-f 3-г ATG GTG TGA TTT CTC СТА GAT TGG AAA GTA G CTT CTC CAA TTG CTT ACC AAG TGC AAT AAC G 371

3 4-f 4-г CTG TTA CTT GTT CTG GAC TCT CGA TAA TTG G GCC CAC TCC TGT TAA AAT CCT ACC CGC ATT G 430

4 5-f 5-г ATA CCT ACA CAA CTT CTG ATT ATG CCT TTG TG GCT CGA TAA АСА TAA TCA ATA TTT GAA AAA GTA TG 362

5 6A/ß-f 6А/В-Г AAT TTG TAT TTT ATT CAT GCC TAT АТС TGG TTA GCG GAG ATA ATT TAA AAT GAT GAC TA 250

6 7F-f 7F-r CCT ACG GGA GGA TAT AAA ATT ATT TTT GAG CAA ATA CAC CAC TAT AGG CTG TTG AGA СТА AC 826

7 7C-f 7C-r СТА TCT CAG TCA TCT ATT GTT AAA GTT TAC GAC GGG A GAA CAT AGA TGT TGA GAC АТС TTT TGT AAT TTC 260

8 8-f 8-r GAT GCC ATG AAT CAA GCA GTG GCT ATA AAT С АТС CTC GTG TAT AAT TTC AGG TAT GCC ACC 294

9 9V-f 9V-r CTT CGT TAG TTA AAA TTC TAA ATT TTT СТА AG GTC CCA ATA CCA GTC CTT GCA ACA CAA G 753

10 lOA-f lOA-r GGT GTA GAT TTA CCA TTA GTG TCG GCA GAC GAA TTT CTT CTT TAA GAT TCG GAT ATT TCT С 628

11 HA-f llA-r GGA CAT GTT CAG GTG ATT TCC CAA TAT AGT G GAT TAT GAG TGT AAT TTA TTC CAA CTT CTC CC 463

12 12F-f 12F-r GCA АСА AAC GGC GTG AAA GTA GTT G CAA GAT GAA TAT CAC TAC CAA TAA CAA AAC 376

13 14-f 14-r CTT GGC GCA GGT GTC AGA ATT CCC TCT AC GCC AAA ATA CTG АСА AAG СТА GAA TAT AGC С 208

14 15A-f 15A-r ATT AGT АСА GCT GCT GGA ATA TCT CTT С GAT СТА GTG AAC GTA СТА TTC CAA AC 436

15 15B/C-f 15В/С-Г TTG GAA TTT TTT AAT TAG TGG CTT ACC TA CAT CCG CTT ATT AAT TGA AGT AAT CTG AAC С 496

Таблица 3 (Продолжение)

№ Праймер Последовательность (5' - 3') Продукт (bp)

16 16F-f 16F-r CTG TTC AGA TAG GCC ATT TAC AGC TTT AAA TC CAT TCC TTT TGT ATA TAG TGC TAG TTC АТС С 988

17 17F-f 17F-r TTC GTG ATG ATA ATT CCA ATG АТС AAA CAA GAG GAT GTA АСА AAT TTG TAG CGA СТА AGG TCT GC 693

18 Sgl8-f Sgl8-r СТТ AAT AGC TCT CAT TAT TCT TTT TTT AAG CC TTA TCT GTA AAC CAT АТС AGC АТС TGA AAC 573

19 19A-f 19A-r GTT AGT CCT GTT TTA GAT TTA TTT GGT GAT GT GAG CAG TCA ATA AGA TGA GAC GAT AGT TAG 478

20 19F-f 19F-r GTT AAG ATT GCT GAT CGA TTA ATT GAT АТС С GTA ATA TGT CTT TAG GGC GTT TAT GGC GAT AG 304

21 20-f 20-r GAG CAA GAG TTT TTC ACC TGA CAG CGA GAA G СТА AAT TCC TGT AAT TTA GCT AAA ACT CTT АТС 514

22 22F-f 22F-r GAG TAT AGC CAG ATT ATG G CA GTT TTA TTG TC CTC CAG CAC TTG CGC TGG AAA CAA CAG АСА AC 643

23 23F-f 23F-r GTA АСА GTT GCT GTA GAG GGA ATT GGC TTT TC CAC AAC ACC TAA CAC ACG ATG GCT ATA TGA TTC 384

24 31-f 31-r GGA AGT TTT CAA GGA TAT GAT AGT GGT GGT GC CCG AAT AAT ATA TTC AAT ATA TTC СТА CTC 701

25 33F-f 33F-r GAA GGC AAT CAA TGT GAT TGT GTC GCG CTT CAA AAT GAA GAT TAT AGT ACC CTT СТА С 338

26 34-f 34-r GCT TTT GTA AGA GGA GAT TAT TTT CAC CCA AC CAA TCC GAC TAA GTC TTC AGT AAA AAA CTT TAC 408

27 35B-f 35B-r GAT AAG TCT GTT GTG GAG ACT TAA AAA GAA TG CTT TCC AGA TAA TTA CAG GTA TTC CTG AAG CAA G 677

28 35F-f 35F-r GAA CAT AGT CGC TAT TGT ATT TTA TTT AAA GCA A GAC TAG GAG CAT TAT TCC TAG AGC GAG TAA ACC 517

29 38-f 38-r CGT TCT TTT АТС TCA CTG TAT AGT АТС TTT ATG ATG TTT GAA TTA AAG СТА ACG TAA CAA TCC 574

30 cpsA-f cpsA-r GCA GTA CAG CAG TTT GTT GGA CTG ACC GAA TAT TTT CAT TAT CAG TCC CAG TC 160

Кроме этого, реакционная смесь содержала четыре пары праймеров, нацеленных на серотип-специфичные регионы ДНК четырех разных серотипов пневмококка, а также включала внутренний положительный контроль - праймеры для локуса срзА, который есть у всех пневмококков. Состав реакционной смеси для амплификации фрагментов был стандартным: Тац буфера х10 (рН 8,6) - 2,5 мкл; Тщ полимеразы 5 Ед/мкл - 1 мкл; ]У^СЬ 25 мМ р-ра - 2,5 мкл; смеси дНТФ (5 мМ) —1,0 мкл; 0,5 ед Тац ДНК-полимеразы, геномной ДНК - 100 нг, вода стерильная деионизированная до конечного объема 25 мкл. Состав мультиплексов и объем праймеров в реакции представлены в Таблице 2.

Реакцию амплификации мультиплексов проводили по общей схеме:

1. Начальная денатурация 94°С - 4'

2. Денатурация 94°С - 45" Отжиг праймеров 54°С - 45" Элонгация 65°С - 2'30" Количество температурных циклов: 30

3. Пост ПЦР 72°С- 5'

Разделение и детекцию продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в ТВЕ-буфере при 120 В в течение 30 мин. В качестве интерколирующего красителя использовали раствор бромистого этидия. Визуализацию результатов электрофореза проводили в УФ-свете на приборе гель-документации. Размеры продуктов ПЦР определяли путем сравнения с молекулярным стандартом (100 Ьр). Пример электрофореграммы приведен на Рисуноке 2.

№ 1 № 2 № 3

6 А/В 23F 19F 14 3 IIA Sgl8 15В/С 19А 15А 9V 34

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рисунок 2. Результаты М-ПЦР-типирования S. pneumoniae

Примечание. Результаты мультиплексных ПЦР № I (линии 2-5), №11 (линии 7-10) и №111 (линии 12-15). Линии 1, 6, 11 - молекулярный стандарт. Стрелка указывает положение внутреннего положительного контроля cpsA.

ПЦР в режиме реального времени для выявления значимых отопатогенов в ЖСУ

В ЖСУ проводили поиск генетического материала четырех этиологически значимых отопатогенов (S. pneumoniae, S. pyogenes, Н. influenzae и М. catarrhalis) [9; 66; 92; 139] с помощью ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ).

В качестве молекулярного маркера S. pneumoniae был выбран ген lytA, поскольку данный ген кодирует пневмококковый белок аутолизин, который имеет ограниченное число аллельных изменений и, следовательно, является хорошей мишенью для видовой идентификации в клинических и эпидемиологических исследованиях. Секвенирование локуса lytA продемонстрировало, что ген высоко консервативен в пределах вида [137; 142] и способен отделять S. pneumoniae от генотипически близких видов стрептококков S. mitis и S. oralis [80; 145].

В качестве молекулярного маркера S. pyogenes был использован ген регулятора транскрипции (spy1258), выбранный из генома Ml штамма SF370 (GenBank регистрационный номер АЕ006565) [61]. Последовательность гена spyl258 отсутствует в других бактериальных геномах, которые можно получить в GenBank.

Для Н. influenzae в качестве маркера был выбран ген отрР2 (outer membrane protein), кодирующий белок наружной мембраны Р2. Данный белок содержит эпитоп, который присутствует во всех штаммах Н. influenzae, как типируемых, так и нетипируемых [107]. Идентификация Р2 в качестве мишени бактерицидных антител человека показывает, что этот белок является важным поверхностным антигеном и имеет потенциальную значимость для разработки вакцин [109]. Для идентификации М. catarrhalis был выбран белок наружной мембраны СорВ, который экспрессируется во всех штаммах [35; 38; 108].

Экстракцию ДНК из 200 мкл образца ЖСУ с использованием QIAamp DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Izasa, Барселона, Испания) проводили в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Этот протокол сводит к минимуму присутствие ингибиторов ПЦР в конечном образце. Образцы ДНК хранили при -20°С.

Постановку ПЦР-РВ проводили с использованием праймеров и ДНК-зондов, приведенных в Таблице 4. В состав ДНК-зонда входит флуоресцентная метка и гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения. Измеряется интенсивность флуоресценции, и результат реакции учитывается в виде графика зависимости флуоресценции от количества циклов в реакции. Таким образом, за ходом реакции можно следить уже через несколько минут после её начала (Рисунок 3).

Условия ПЦР-РВ были следующими:

1. Начальная денатурация 95°С - 10'

2. Денатурация 95С - 15" Отжиг праймеров 60°С - Г Количество температурных циклов: 40

3. Пост ПЦР 72°С - 5'

Таблица 4

Праймеры для идентификации генов lytAf отрР2, spy, сорВ

№ Праймер Последовательность (5' - 3') Продукт (bp)

Streptococcus pneumoniae [99]

1 IytA - F ACGCAATCTAGCAGATGAAGC 101

2 lytA - R TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC

3 IytA - зонд FAM-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG- BHQ1

Streptococcus pyogenes [40]

4 spy1258 -F GCA СТС GCT ACT ATT ТСТ ТАС СТС АА 300

5 spy1258 -R GTC АСА ATG ТСТ TGG AAA CCA GTA AT

6 spy1258 -зонд FAM-CCG CAA СТС АТС AAG GAT TTC TGT TAC CA- BHQ1

Moraxella catarrhalis [65]

7 сорВ - F GTGAGTGCCGCTTTACAACC 71

8 сорВ - R TGTATCGCCTGCCAAGACAA

9 сорВ - зонд FAM-TGCTTTTGCAGCTGTTAGCCA-GCCTAA- BHQ1

Haemophilus influenzae (97)

10 отрР2-F GGTGCATTCGCAGCTTCAG 151

11 отрР2-R GATTGCGTAATGCACCGTGTT

12 отрР2-зонд FAM- TTGTTTATAACAACGAAGGGACTAACGT- BHQ1

* Флуоресцентные метка 6-FAM, 6-флуоресцеин; Тушитель флуоресценции BHQ-1, Black Hole Quencher-1.

Для определения чувствительности выбранного метода использовали серийные 10-кратные разведения очищенной ДНК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алябьева, Наталья Михайловна, 2014 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баранов, A.A. Пневмококковая инфекция и связанные с ней заболевания - серьезная проблема современного здравоохранения / A.A. Баранов, JI.C. Намазова, В.К. Таточенко // Педиатрическая фармакология. - 2008. - Т. 5. - № 2. - С. 7-12.

2. Баранов, A.A. Результаты фармакоэкономическоно анализа применения пневмококковой конъюгированной 7-валентной вакцины для профилактики пневмококковых инфекций у детей первых 5 лет жизни в Российской Федерации / A.A. Баранов, В.В. Омельяновский, Н.И. Брико, Ю.В. Лобзин, JI.C. Намазова-Баранова, В.К. Таточенко и др. //Педиатрическая фармакология. -2009. - Т. 6. -№ 6. - С. 6-10.

3. Баранов, A.A. Развитие научных исследований и инфраструктуры в рамках задач платформы «Педиатрия» / A.A. Баранов // Педиатрическая фармакология. — 2012. - Т. 9. - № 4. - С. 6-10.

4. Баранов, A.A. Роль Streptococcus pneumoniae в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы в 2011-2012 гг. / A.A. Баранов, Л.С. Намазова-Баранова, H.A. Маянский, Т.В. Куличенко, Т.А. Полунина, A.B. Лазарева, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, O.A. Пономаренко, И.Е. Колтунов, А.М. Иваненко, Е.А. Дегтярёва, Н.В. Кондратенко, A.A. Корсунский, К.В. Константинов, Д.А. Тулупов, М.А. Лазарева //Педиатрическая фармакология. - 2013. - Т. 10. - № 5. - С. 6-12.

5. Белошицкий, Г.В. Фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом / Г.В. Белошицкий, И.С. Королева, К.О. Миронов //Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. — 2011. -Т. 13. -№3.-С. 261-266.

6. Воронина, Л.Г. Эпидемические особенности Streptococcus pneumoniae, выделенного у детей, при неинвазивных пневмококковых инфекциях и носоглоточном бактероиносительстве / Л.Г. Воронина, Е.В. Саматова // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2013. - Т. 5. - № 1. - С. 22-26.

7. Катосова, Л.К. Серотипы S. pneumoniae у детей, больных хроническими воспалительными заболеваниями органов дыхания / Л.К. Катосова, Т.М. Сидорина, А.П. Батуро, Г.Д. Сотникова //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. — 1990. - №2. - С. 32-37.

8. Катосова, Л.К. Серотипы S. pneumoniae у детей, больных острой пневмонией и плевритом / Л.К. Катосова, В.К. Таточенко, А.А. Арова, А.А. Кешикбаева, А.П. Батуро, Т.А. Кузнецова, А.Б. Левин //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1990.-№5.-С. 23-28.

9. Катосова, Л.К. Этиология и рациональная терапия тяжелых форм острых средних гнойных отитов у детей / Л.К. Катосова, А. В. Очкасов, М.Р. Богомильский //Антибиотики и химиотерапия. — 2006. - № 2. - С. 23-29.

10. Катосова, Л.К. Этиологическая диагностика острых пневмоний у детей / Л.К. Катосова, Т.В. Спичак, С.С. Ким, С.Б. Яцышина, И.В. Зубкова, М.Н. Прадед //Вопросы диагностики в педиатрии. -2009. -№2. - С. 27-31.

11. Козлов, Р.С. Пути оптимизации мониторинга, профилактики и фармакотерапии пневмококковой инфекции / Козлов Р.С. //Текст.: автореф. дис. .докт. мед. наук / Смоленск. - 2004. - 45 с.

12. Козлов, Р.С. Динамика резистентности Streptococcus pneumoniae к антибиотикам в России за период 1999-2009 гг. / Р.С. Козлов, О.В. Сивая, О.И. Кречикова, Н.В. Иванчик, Группа исследователей проекта «ПеГАС» //КМАХ. - 2010. - Т. 12. - № 4. - С. 269-368.

13. Козлов, P.C. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации / P.C. Козлов, А.Н. Чагарян, JI.B. Козлова, A.A. Муравьев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -2011. — Т. 13. -С. 177-187.

14. Королева, И.С. Серотиповая характеристика пневмококков, выделенных от больных пневмококковым менингитом / И.С. Королева, Г.В. Белошицкий, К.О. Миронов //Вопросы современной педиатрии.— 2012.-Т. 11.- №4. -С. 122-127.

15. Костюкова, H.H. Факторы патогенности пневмококка и их протективные свойства / Н.Н, Костюкова, В.А, Бехало // Журнал микробиология. - 2014. - № 3. - С. - 67-77.

16. Маянский, А.Н. Стрептококки: микробиология и патология / А.Н. Маянский // Вопросы диагностики в педиатрии. - 2010. - Т. 2. - № 2.-С. 9-19.

17. Маянский, H.A., Определение капсульных серотипов пневмококка методом мультиплексной ПЦР / H.A. Маянский, Н.М. Алябьева, Л.К. Катосова, Т.А. Гречуха, В.Г. Пинелис, Л.С. Намазова-Баранова // Вопросы диагностики в педиатрии. — 2010. - Т. 2. - № 6. - С. 6-10.

18. Миронов, К.О. Идентификация и серотипирование российских штаммов Streptococcus pneumoniae с применением методик, основаныых на ПЦР / К.О. Миронов, А.Е. Платонов, P.C. Козлов //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2011. - Т. 13. - № 4. - С. 304-313.

19. Методические указания. (МУК) 4.2. 1890 - 04 - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. - 2004. - 91 с.

20. Покровский, В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровского, O.K. Поздеева // М.: ГЭОТАР, Медицина. - 1998.- С. 201-203.

21. Райнерт, P.P. Новые данные по эффективности 13-валентной пневмококковой конъюгированной вакцины в отношении инвазивных пневмококковых инфекций, пневмоний, острого среднего отита и назофарингеального носительства / P.P. Райнерт, Б. Тайши //Педиатрическая фармакология. - 2012. - № 3. - С. 1218.

22. Савинова, Т.А. Генетическое разнообразие пенициллинустойчивых Streptococcus pneumoniae / Т.А. Савинова, О.Ю. Филимонова, С.А. Грудинина, С.В. Сидоренко // Журнал инфектологии. - 2010. - Т. 1. -№ 4. - С. 66-71.

23. Савинова, Т. А. Перспективы применения антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности среди пневмококков / Т.А. Савинова, Е.Н. Ильина, С.В. Сидоренко //Антибиотики и химиотерапия. - 2011. - № 56. -С. 5-6.

24. Сидоренко, С.В. Пневмококковая инфекция и современные возможности ее профилактики — эпидемиологический обзор ситуации в мире и в России / С.В. Сидоренко, Ю.В. Лобзин, С.М. Харит, И.С. Королева, В.К. Таточенко //Вопросы современной педиатрии. - 2010. - Т. 9. - № 1. - С. 62-69.

25. Сидоренко, С.В. Популяционная структура пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину и перспективы антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности / С.В. Сидоренко, Т.А. Савинова, Е.Н. Ильина, М.А. Сырочкина // Антибиотики и химиотерапия. - 2011. - Т. 56. - № 5-6. - С. 11-18.

26. Харит, С.М. Распространенность пневмококковых пневмоний и отитов у детей младшего возраста (предварительные данные) / С.М. Харит, С.В. Сидоренко, A.A. Рулева, A.JL Перова, М.О. Волкова, В.В. Гостев, С.И. Алексеенко, A.B. Орлов. //Вопросы современной педиатрии. - 2011. - №6. - С. 103-107.

27. Страчунский, JI.C. Антибактериальная терапия / J1.C. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова // под ред. - М.: Полимаг. - 2000. - С. 190.

28. Таточенко, В.К. Периодические и географические различия серотипового спектра пневмококков у детей с респираторными заболеваниями у здоровых носителей / В.К. Таточенко, JI.K. Катосова, М.А. Уланова //ЖМЭИ. - 1994. - № 3. - С. 3-10.

29. Active Bacterial Core Surveillance (ABCs) Report; Emerging Infections Program Network; Streptococcus pneumoniae [database online]. Center for Disease Control website: CDC; 2010. Updated APRIL 2012.

30. Aguiar, S.I., Portuguese surveillance group for the study of respiratory pathogens. Changes in Streptococcus pneumoniae serotypes causing invasive disease with non-universal vaccination coverage of the seven-valent conjugate vaccine / S.I. Aguiar, I. Serrano, F.R. Pinto, J. Melo-Cristino, M. Ramirez // Clin. Microbiol. Infect. - 2008. - Vol.14. - P. 835-843.

31. Aguiar, S.I. Increase of Denmarkl4-230 clone as a cause of pneumococcal infection in Portugal within a background of diverse serotype 19A lineages / S.I. Aguiar, F.R. Pinto, S. Nunes, I. Serrano, J. Melo-Cristino, R. Sá-Leao, M. Ramirez, H. de Lencastre // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - N 1. - P. 101-108.

32. Ansaldi, F. Increasing incidence of Streptococcus pneumoniae Serotype 19A and emergence of two vaccine escape recombinant ST695 strains in Liguria, Italy, 7 Years after Implementation of the 7-Valent

Conjugated Vaccine / F. Ansaldi, P. Canepa, D. de Florentiis, R. Bandettini, P. Durando and G. Icardi // Clinical and vaccine immunology. - 2011. - Vol. 18. - P. 343-345.

33. Appelbaum, P. C. Streptococcus pneumoniae resistant to penicillin and chloramphenicol / P. C. Appelbaum, A. Bhamjee, J. N. Scragg, A. F. Hallet, A. A. Bowen and R. C. Cooper //Lancet. - 1977. - Vol. 2. - P. 995-997.

34. Ardanuy, C. Epidemiology of invasive pneumococcal disease among adult patients in Barcelona before and after pediatric 7-valent pneumococcal conjugate vaccine introduction, 1997-2007 / C. Ardanuy, F. Tubau, R. Pallares, L. Calatayud, M.A. Domínguez, D. Rolo, I. Grau, R. Martín, J. Liñares //Clin. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 48. - P. 57-64.

35. Bartos, L.C. Comparison of the outer membrane proteins of 50 strains of Branhamella catarrhalis / L.C. Bartos, T.F. Murphy // J. Infect. Dis. 1988. - Vol.158. - P. 761-765.

36. Beall, B. Pre- and postvaccination clonal compositions of invasive pneumococcal serotypes for isolates collected in the United States in 1999, 2001, and 2002 / B. Beall, M.C. McEUistrem, Jr.R.E. Gertz, S. Wedel, D.J. Boxrud, A.L. Gonzalez et al. // J. Clin. Microbiol. - 2006. -Vol. 44.-P. 999-1017.

37. Beall, B.W. Shifting genetic structure of invasive serotype 19A pneumococci in the United States / B.W. Beall, R.E. Gertz, R.L. Hulkower, C.G. Whitney, M.R. Moore, A.B. Brueggemann // J. Infect. Dis. - 2011. - Vol.203. - P. 1360-8.

38. Bhushan, R. Antigenic characterization and analysis of the human immune response to outer membrane protein E of Branhamella catarrhalis / R. Bhushan, C. Kirkham, S. Sethi, T.F. Murphy // Infect. Immun. - 1997. - Vol. 65. - P. 2668-2675.

39. Centers for Disease Control and Prevention. 2009. Active Bacterial CoreSurveillance Report. Emerging Infections Program Network, Streptococcus pneumoniae. 2008.

40. CDC, Streptococcus pyogenes Laboratory Protocolsd, http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocols.htm

41. Chiba, N. Serotype and antibiotic resistance of isolates from patients with invasive pneumococcal disease in Japan / N. Chiba, M. Morozumi, K. Sunaoshi, S. Takahashi, M. Takano, T. Komori, K. Sunakawa, K. Ubukata; IPD Surveillance Study Group //Epidemiol. Infect. - 2010. -Vol. 138.-P. 61-8.

42. Cohen, R. Risk factors for serotype 19A carriage after introduction of 7-valent pneumococcal vaccination / R. Cohen, C. Levy, E. Bonnet, F. Thollot, M. Boucherat, B. Fritzeil, V. Derkx, E. Bingen, E. Varon //BMC Infectious Diseases. - 2011. -Vol. 11. - P. 95.

43. Cohen, R. Impact of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine on pneumococcal nasopharyngeal carriage in children with acute otitis media / R. Cohen, C. Levy, E. Bingen, M. Koskas, I. Nave, E. Varon //Pediatr. Infect. Dis. J. - 2012. - Vol. 31. - P. 297-301.

44. Coker, T.R. Diagnosis, microbial epidemiology, and antibiotic treatment of acute otitis media in children. A systematic review / T.R. Coker, L.S. Chan, S.J. Newberry et al.// JAMA. - 2010. - Vol. 304. -P. 2161-2169.

45. Collee, J.G. Practical medical microbiology / J.G. Collee, A.G. Fraser, B.P. Marmion, A. Simons, Mackie and McCartney // 14th Edn., Churchill Livingston, NY, London. - 1996. - P. 279-280.

46. Cornick J.E. Streptococcus pneumoniae: the evolution of antimicrobial resistance to beta-lactams, fluoroquinolones and macrolides / J.E. Cornick , S.D. Bentley //Microbes Infect. - 2012. - Vol. 14(7-8). - P. 573-83.

47. Croucher, N.J. Rapid Pneumococcal evolution in response to clinical interventions / N.J. Croucher, S.R. Harris, C. Fräser, M.A. Quail, J. Burton, M. van der Linden, L. McGee, A. von Gottberg, J.H. Song, K.S. Ko, B. Pichon, S. Baker, C.M. Parry, L.M. Lambertsen, D. Shahinas, D.R. Pillai, T.J. Mitchell, G. Dougan, A. Tomasz, K.P. Klugman, J. Parkhill, W.P. Hanage, S.D. Bentley // Science. - 2011. - Vol. - 331. - № 6016. - P. 331-430.

48. Dagan, R. Impact of conjugate pneumococcal vaccines on antibiotic resistance / R. Dagan, K.P. Klugman //Lancet Infect. Dis. - 2008. -Vol. 8. - P. 785-95.

49. Dagan, R. Impact of pneumococcal conjugate vaccine on infections caused by antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae / R. Dagan //Clin. Microbiol. Infect. - 2009. - Vol. 15 (Suppl 3). - P. 16-20.

50. Dagan, R. Introduction and proliferation of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 19A clones that cause acute otitis media in an unvaccinated population / R. Dagan, N. Givon-Lavi, E. Leibovitz, D. Greenberg, N. Porat //J. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 199. -P. 776-85.

51. Del Beccaro, M.A. Bacteriology of acute otitis media: a new perspective / M.A. Del Beccaro, P.M. Mendelman, A.F. Inglis, M.A. Richardson, N.O. Duncan, C.R. Clausen, T.L. Stull // J. Pediatr. - 1992. -Vol. 120.-P.81-84.

52. Del Grosso, M. The macrolide resistance genes erm(B) and mef(E) are carried by Tn2010 in dual gene Streptococcus pneumoniae isolates belonging to clonal complex CC271/ M. Del Grosso, J.G. Northwood, D.J. Farrell, A. Pantosti // Antimicrob. Agents Chemother. - 2007. -Vol. 51. - P. 4184-4186.

53. Eichmann, K. Fred Neufeld and pneumococcal serotypes: foundations for the discovery of the transforming principle / K. Eichmann, R.M. Krause // Cell. Mol. Life Sei. - 2013. - Vol. 70. - P. 2225-2236.

54. Enright, M.C. Multilocus sequence typing / M.C. Enright, B.G. Spratt // Trends in Microbiology. - 1999. - Vol. 7. - P. 482-487.

55. Falup-Pecurariu, O. Pneumococcal acute otitis media in infants and children in central Romania, 2009-2011: microbiological characteristics and potential coverage by pneumococcal conjugate vaccines / O. Falup-Pecurariu, E. Leibovitz, A. Mercas, L. Bleotu, C. Zavarache, N. Porat, R. Dagan, D. Greenberg // Int. J. Infect. Dis. -2013. - Vol. 17. - № 9. - P. 702-706.

56. Farrell, D.J. Emergence and spread of Streptococcus pneumoniae with erm(B) and mef(A) resistance / D.J. Farrell, S.G. Jenkins, S.D. Brown, M. Patel, B.S. Lavin, K.P. Klugman //Emerg. Infect. Dis. - 2005. -Vol. 11.-P. 851-858.

57. Farrell, D.J. Increased antimicrobial resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae in the pediatric population after the introduction of 7-valent pneumococcal vaccine in the United States / D.J. Farrell, K.P. Klugman, M. Pichichero // Pediatr. Infect. Dis. J. -2007. - Vol. 26, № 2. - P. 123-8.

58. Feil, E.J. eBURST: Inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data / E.J. Feil, B.C. Li, D.M. Aanensen, W.P. Hanage, B.G. Spratt // Journal of Bacteriology. -2004.- Vol. 186.-P. 1518-1530.

59. Felmingham, D. Regional trends in beta-lactam, macrolide, fluoroquinolone and telithromycin resistance among Streptococcus pneumoniae isolates 2001-2004 / D. Felmingham, R. Canto'n, S.G. Jenkins // J. Infect. - 2007. - Vol. 55. - P. 111-118.

60. Fenoll, A. Temporal trends of invasive Streptococcus pneumoniae serotypes and antimicrobial resistance patterns in Spain from 1979 to 2007 / A. Fenoll, J.J. Granizo, L. Aguilar, M.J. Giménez, L. Aragoneses-Fenoll, G. Hanquet, J. Casal, D. Tarrago //J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47. - P. 1012-20.

61. Ferretti, J.J. Complete genome sequence of an Ml strain of Streptococcus pyogenes / J.J. Ferretti, W.M. McShan, D. Adjic, D. Savic, G. Savic, K. Lyon, C. Primeaux, S.S. Sezate, A.N. Surorov, S. Kenton, H. Lai, S. Lin, Y. Qian, H.G. Jia, F.Z. Najar, Q. Ren, H. Zhu, L. Song, J. White, X. Yuan, S.W. Clifton, B.A. Roe, R.E. McLaughlin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98, № 8. _ p. 4658-4663.

62. Gertz, R.E. Active bacterial core surveillance team. Increased penicillin nonsusceptibility of nonvaccine-serotype invasive pneumococci other than serotypes 19A and 6A in post-7-valent conjugate vaccine era / R.E. Jr Gertz, Z. Li, F.C. Pimenta, D. Jackson, B.A. Juni, R. Lynfield, J.H. Jorgensen, M. da G. Carvalho, B.W. Beall // J. Infect. Dis. - 2010. -Vol. 201, № 5.-P. 770-5.

63. Gok, U. Bacteriological and PCR analysis of clinical material aspirated from otitis media with effusions / U. Gok, Y. Bulut, E. Keles, S. Yalcin, M.Z. Doymaz // Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. - 2001. -Vol. 60. - P. 49-54.

64. Goossens, H. Outpatient antibiotic use in Europe and association with resistance: a cross-national database study / H. Goossens, M. Ferech, R. Vander Stichele, M. Elseviers, ESAC Project Group //Lancet. - 2005. -Vol. 365, № 9459. - P. 579-87.

65. Greiner, O. Quantitative detection of Moraxella catarrhalis in nasopharyngeal secretions by real-time PCR / O. Greiner, P.J.R. Day, M. Altwegg, D. Nadal // J. of Clinical. Microbiology. - 2003. - Vol. 41. -№ 4. - P. 1386-1390.

66. Grevers, G. Identification and characterization of the bacterial etiology of clinically problematic acute otitis media after tympanocentesis or spontaneous otorrhea in German children / G. Grevers, S. Wiedemann, J.C. Bohn, R.W. Blasius, T. Harder, W. Kroeniger, V. Vetter, J.Y. Pircon, C. Marano // BMC Infect. Dis. - 2012. - Vol. 20, № 12. - P. 312.

67. Hackel, M. Serotype prevalence and antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae clinical isolates among global populations / M. Hackel, C. Lascols, S. Bouchillon, B. Hilton, D. Morgenstern, J. Purdy//Vaccine.-2013.-Vol. 31, №42. -P. 4881-7.

68. Hakenbeck, R. Beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae: penicillin-binding proteins and nonpenicillin-binding proteins / R. Hakenbeck, T. Grebe, D. Zahner and J.B. Stock // Molecular Microbiology. - 1999. - Vol. 33. - P. 673-8.

69. Hakenbeck, R. Molecular mechanisms of ß-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae / R. Hakenbeck, R. Brückner, D. Denapaite, P. Maurer //Future Microbiol. - 2012. - Vol. 7, № 3. - P. 395-410.

70. Hansman, D. A resistant pneumococcus / D. Hansman, M.M. Bullen //Lancet. - 1967. - Vol. 2. - P. 264-5.

71. Hansman, D. Pneumococci relatively insensitive to penicillin in Australia and New Guinea / D. Hansman, L. Devitt, H. Miles, I. Riley //Med. J. - 1974. - Vol. 2. - P. 353-6.

72. Hausdorff, W.P., Feikin D.R., Klugman K.P.. Epidemiological differences among pneumococcal serotypes / W.P. Hausdorff, D.R. Feikin, K.P. Klugman // Lancet Infect. Dis. - 2005. - Vol. 5. - P. 8393.

73. Ho, P.L. Changes in nasopharyngeal carriage and serotype distribution of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae before and after the introduction of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in Hong Kong / P.L. Ho, S.S. Chiu, M.Y. Chan, I. Ang, K.H. Chow, Y.L. Lau // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 71. - P. 327-34.

74. Hsieh, Y.-C. Expansion and evolution of Streptococcus pneumoniae serotype 19A ST320 clone: with comparison to its ancestral Taiwan 19F-14(ST236) clone / Y.-C. Hsieh, T.-L. Lin, K.-Y. Chang, Y.-C. Huang, C.-J. Chen, T.-Y. Lin, J.-T. Wang //Journal of Infectious Diseases Advance Access published. - 2013. - Vol. 208. - № 2. - P. 203- 210.

75. Hyde, T. B. Macrolide resistance among invasive Streptococcus pneumoniae isolates / T.B. Hyde, K. Gay, D.S. Stephens, D.J. Vugia, M. Pass, S. Johnson, N.L. Barrett, W. Schaffner, P.R. Cieslak, P.S. Maupin, E.R. Zell, J.H. Jorgensen, R.R. Facklam and C. Whitney // Journal of the American Medical Association. - 2001. - Vol. 286. - P. 1857-1862.

76. Isaacman, D.J. Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe: impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines / D.J. Isaacman, E.D. Mcintosh, R.R. Reinert //Int. J. Infect. Dis. - 2010. -Vol. 14. - P. 197-209.

77. Jacobs, M.R. Emergence of multiply resistant pneumococci / M.R. Jacobs, H.J. Koornhof, R.M. Robins-Browne, C.M. Stevenson, Z.A. Vermaak, I. Freiman, G.B. Miller, M.A. Witcomb, M. Isaacson, J.I. Ward, R. Austrian// N. Engl. J. Med. - 1978. - Vol. 299. - P. 735-740.

78. Jefferies, J.M.C. Automated pneumococcal MLST using liquid-handling robotics and a capillary DNA sequencer / J.M.C. Jefferies, S.C. Clarke, A. Smith, C. Dowson, T.J. Mitchell //Molecular Biotechnology. - 2003. - Vol. 24. - P. 303-308.

79. Kaur, R. Simultaneous assay for four bacterial species including Alloiococcus otitidis using multiplex-PCR in children with culture negative acute otitis media / R. Kaur, D.G. Adlowitz, J.R. Casey, M. Zeng, M.E. Pichichero // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2010. - Vol. 29, № 8. -P. 741-745.

80. Kawamura, Y. Genetic approaches to the identification of the mitis group within the genus Streptococcus / Y. Kawamura, R.A. Whiley, S.E. Shu, T. Ezaki and J.M. Hardie. // Microbiology. - 1999. - Vol. 145.-P. 2605-2613.

81. Kilpi, T. Bacteriology of acute otitis media in a cohort of Finnish children followed for the first two years of life / T. Kilpi, E. Herva, T. Kaijalainen, R. Syrjänen, A.K. Takala// Pediatr. Infect. Dis. J. - 2001. -Vol. 20.-P. 654-662.

82. Klein, J.O. The burden of otitis media / J.O. Klein //Vaccine. - 2000. -Vol. 19(Suppl 1).-P. 2-8.

83. Klugman, K.P. Pneumococcal resistance to antibiotics / K.P. Klugman // Clin. Microbiol. Rev. - 1990. - Vol. 3. - P. 171-196.

84. Konradsen, H.B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe / H.B. Konradsen //Vaccine. - 2005. - Vol. 23. - P. 13681373.

85. Kyaw, M.H. Effect of introduction of the pneumococcal conjugate vaccine on drug-resistant Streptococcus pneumoniae / M.H. Kyaw, R. Lynfield, W. Schaffner, A.S. Craig, J. Hadler, A. Reingold, et al // N. Engl. J. Med. - 2006. - Vol. 354. - P. 1455-63.

86. Laible, G. Interspecies recombinational events during the evolution of altered PBP 2x genes in penicillin-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae / G. Laible, B.G. Spratt, R. Hakenbeck //Mol. Microbiol. - 1991.- Vol. 5. - P. 1993-2002.

87. Leclerq, R. Resistance to macrolides, azalides, and streptogramins / R. Leclerq, P. Courvalin // In: New Macrolides, Azalides, and Streptogramins in Clinical Practice. Neu H.C., Young L.S., Zinner S.H., Acar J.F. (Eds.). New York, etc. - 1995. - P. 31-40.

88. Leclercq, R. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing / R. Leclercq, R. Canto'n, D.F.J. Brown, C.G. Giske, P. Heisig, A.P. MacGowan, J.W. Mouton, P. Nordmann, A.C. Rodloff, G.M. Rossolini, C.-J. Soussy, M. Steinbakk, T.G. Winstanley, G. Kahlmeter //Clin. Microbiol. Infect. - 2013. - Vol. 19. - P. 141-160.

89. Lee, S. Prevalence of serotype and multidrug-resistance of Streptococcus pneumoniae respiratory tract isolates in 265 adults and

36 children in Korea, 2002-2005 / S. Lee, K. Lee, Y. Kang, S. Bae //Microb. Drug. Resist. - 2010. - Vol. 16. - P. 135-42.

90. Lieberthal, A.S. The diagnosis and management of acute otitis media (clinical practice guideline) / A.S. Lieberthal, A.E. Carroll, M.D. Joffe, et al. //Pediatrics. -2013. -Vol. 131.-P. 964.

91. Leibovitz, E, Resistance pattern of middle ear fluid isolates in acute otitis media recently treated with antibiotics / E. Leibovitz, S. Raiz, L. Piglansky, et al. // Pediatr. Infect. Dis. J. - 1998. - Vol. 17. - P. 463469.

92. Leibovitz, E. Epidemiologic and microbiologic characteristics of culture-positive spontaneous otorrhea in children with acute otitis media / E. Leibovitz, M. Serebro, N. Givon-Lavi, D. Greenberg, A. Broides, A. Leiberman, R. Dagan // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2009. - Vol. 28.-P. 381-384.

93. Lepoutre, A. Impact of infant pneumococcal vaccination on invasive pneumococcal diseases in France, 2001-2006 / A. Lepoutre, E. Varon, Georges S., L. Guttman, D. Levy-Bruhl // Euro Surveill. - 2008. - Vol. 13.-P. 18962.

94. Linares, J. Antibiotic resistance and serotypes of Streptococcus pneumoniae from patients with communityacquired pneumococcal disease / J. Linares, J. Garau, C. Dommguez, J.L. Perez // Antimicrob. Agents Chemother. - 1983. - Vol. 23. - P. 545-547.

95. Linares, J. Changes in antimicrobial resistance, serotypes and genotypes in Streptococcus pneumoniae over a 30-year period / J. Linares, C. Ardanuy, R. Pallares, A. Fenoll // Clin. Microbiol. Infect. -2010. - Vol. 16. - P. 402-10.

96. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections / E. Lund // http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2555298/ Bull World Health Organ. - 1960. - Vol. 23, № 1. - P. 5-13.

97. Maaroufi, Y. Real-time PCR for determining capsular serotypes of Haemophilus influenzae / Y. Maaroufi, J.-M. De Bruyne, C. Heymans,

F. Crokaert //J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol. 45. - № 7. - P. 23052308.

98. Maiden, M.C. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms / M.C. Maiden, J.A. Bygraves, E. Feil, G. Morelli, J.E. Russell, R. Urwin, Q. Zhang, J. Zhou, K. Zurth, D.A. Caugant, I.M. Feavers, M. Achtman, B.G. Spratt // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1998. - Vol. 95, № 6. - P. 3140-3145.

99. McAvin, J.C. Sensitive and specific method for rapid identification of Streptococcus pneumoniae using real-time fluorescence PCR / J.C. McAvin, P.A. Reiily, R.M. Roudabush, W.J. Barnes, A. SalmenN,

G.W. Jackson, K.K. Beninga, A. Astorga, F.K. McCleskey, W.B. Huff, D. Niemeyer, K.L. Lohman // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol. 39. - № 10. - P. 3446-3451.

100.McEllistrem, M.C. Erythromycin-nonsusceptible Streptococcus pneumoniae in children, 1999-2001 / M.C. McEllistrem, J.M. Adams, K. Shutt, L.T. Sanza, R.R. Facklam, C.G. Whitney, J.H. Jorgensen, L.H. Harrison //Emerg. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 11. - P. 969-972.

101.McEllistrem, M.C. Novel pneumococcal serotypes 6C and 6D: anomaly or Harbinger / M.C. McEllistrem, M.H. Nahm // Clin. Infect. Dis. -2012. - Vol. 55, № 10. - P. 1379-1386.

102.McGee, L. Nomenclature of major antimicrobial-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined by the pneumococcal molecular epidemiology network / L. McGee, L. Mcdougal, J. Zhou, B.G. Spratt, F.C. Tenover, R. George, R. Hakenbeck, W. Hryniewicz, J.C. Lefevre, A. Tomasz, K.P. Klugman // Journal of Clinical Microbiology. - 2001. -Vol. 39. - P. 2565-2571.

103.Mcintosh, E.D. Global prevailing and emerging pediatric pneumococcal serotypes / E.D. Mcintosh, R.R. Reinert // Expert Rev. Vaccines. - 2011. - Vol. 10, № 1. - P. 109-29.

104.Miernyk, K. Serotyping of Streptococcus pneumoniae isolates from nasopharyngeal samples: use of algorithm combining microbiologic, serologic and seguential multiplex PCR techniques / K. Miernyk, C. Debyle, M. Harker-Jones, K.B. Hummel, T. Hennessy, J. Wenger, K. Rudolph // J. Clin. Microbiol.- 2011. - Vol. 49. - № 9. - P. 3209-3214.

105.Monasta, L. Burden of disease caused by otitis media: systematic review and global estimates / L. Monasta, L. Ronfani, F. Marchetti, M. Montico, L. Vecchi Brumatti, A. Bavcar, D. Grasso, C. Barbiero, G. Tamburlini // PLoS ONE. - 2012. - Vol. 7, № 4. - P. 36226.

106.Moore, M.R. Population snapshot of emergent Streptococcus pneumoniae serotype 19A in the United States, 2005 / M.R. Moore, R.E. Jr. Gertz, R.L. Woodbury, G.A. Barkocy-Gallagher, W. Schaffner, C. Lexau et al. // J. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 197. - P. 1016-27.

107.Murphy, T.F. Identification of a specific epitope of Haemophilus influenzae on a 16,600-Dalton outer membrane protein / T.F. Murphy, M.B. Nelson, K.C. Dudas, J.M. Mylotte, M.A. Apicella // J. Infect. Dis. - 1985. - Vol. 152, № 6. - P. 1300-1307.

108. Murphy, T.F. Surface-exposed and antigenically conserved determinants of outer membrane proteins of Branhamella catarrhalis / T.F. Murphy, L.C. Bartos. // Infect. Immun. - 1989. - Vol. 57. - P. 2938-2941.

109.Murphy, T.F. The P6 outer membrane protein of nontypeable Haemophilus influenzae as a vaccine antigen / T.F. Murphy, M.B. Nelson, M.A. Apicella // J. Infect. Dis. - 1992. - Vol. 165 (Suppl. 1). -P. 203-205.

110.Musher, D.M. Streptococcus pneumoniae. In: Mandell, Douglas and Bennett's Principles and practice of infectious diseases / D.M. Musher

// 6th ed. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors Philadelphia, Elsevier Churchill Livingstone. - 2005. - P. 2392-2411.

111. Croucher, N.J. Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions / N. J. Croucher, S.R. Harris, Ch. Fräser, M.A. Quail, J. Burton, M. van der Linden, L. McGee, A. von Gottberg, J. Hoon Song, K. Soo Ko, B. Pichon et. AI. //Science. - 2011. - Vol. 331, № 6016. -P. 430-434.

112.Nilsson, P. A 10-year follow-up study of penicillin-non-susceptible S. pneumoniae during an intervention programme in Malmo, Sweden / P. Nilsson, M.H. Laurell // Scand. J. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 38. - P. 838-44.

113.0bert, C.A. Assessment of molecular typing methods to determine invasiveness and to differentiate clones of Streptococcus pneumoniae / C.A. Obert, G. Gao, J. Sublett, E.I. Tuomanen, C.J. Orihuela // Infection, Genetics and Evolution. - 2007. - Vol. 7. - P. 708-716.

114.Pai, R. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of streptococcus pneumoniae isolates / R. Pai, R.E. Gertz, B. Beall // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 124-131.

115.Pelton, S.I., Emergence of 19A as virulent and multidrug resistant pneumococcus in Massachusetts following universal immunization of infants with pneumococcal conjugate vaccine / S.I. Pelton, H. Huot, J.A. Finkelstein, C.J. Bishop, K.K. Hsu, J. Kellenberg, S.S. Huang, R. Goldstein, W.P. Hanage // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2007. - Vol. 26. - P. 468-72.

116.Pilishvili, T. Sustained reductions in invasive pneumococcal disease in the era of conjugate vaccine / T. Pilishvili, C. Lexau, M.M. Farley et al. //J. Infect. Dis.-2010. - Vol. 201.-P. 32-41.

117.Porat N. Increasing importance of multidrug-resistant serotype 6A Streptococcus pneumoniae clones in acute otitis media in southern

Israel / N. Porat, U. Amit, N. Givon-Lavi, E. Leibovitz, R. Dagan // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2010. - Vol. 29. - P. 126-30.

118.Post, J.C. Molecular analysis of bacterial pathogens in otitis media with effusion / J.C. Post, R.A. Preston, J.J. Aul, M. Larkins-Pettigrew, J. Rydquist-White, K.W. Anderson, R.M. Wadowsky, D.R. Reagan, E.S. Walker, L.A. Kingsley // JAMA. - 1995. - Vol. 273. - P. 1598-1604.

119.Radzikowski, A. Does nasopharyngeal bacterial flora predict etiology of acute otitis media in children? / A. Radzikowski, A. Skorka, W. Mikolajczyk, M. Wozniak, J. Wysocki // Pediatr. Pol. - 2011. - Vol. 86. -P. 620-623.

120.Reinert, R.R. Mechanisms of macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae isolates from Russia / R.R. Reinert, O.Y. Filimonova, A. Al-Lahham, S.A. Grudinina, E.N. Ilina, LM. Weigel, S.V. Sidorenko // Antimicrob Agents Chemother. - 2008. - Vol. 52. -P. 2260-2262.

121.Reinert, R.R. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumoniae / R.R. Reinert // Clin. Microbiol. Infect. - 2009. -Vol. 15 (Suppl. 3).-P. 7-11.

122.Reinert, R.R. Advances in pneumococcal vaccines: the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine received market authorization in Europe / R.R. Reinert, P. Paradiso, B. Fritzel // Vaccines. — 2010. — Vol. 9. - P. 229-236.

123.Retsema, J. Macrolides: structures and microbial targets / J. Retsema, W. FU // International Journal of Antimicrobial Agents. - 2001. - Vol. - 18.-Suppl. 1/-P. 3-10.

124.Richter, S.S. Pneumococcal Serotypes before and after Introduction of Conjugate Vaccines, United States, 1999-2011 / S.S. Richter, K.P. Heilmann, C.L. Dohrn, F. Riahi, D.J. Diekema, G.V. Doern //Emerg. Infect. Dis. - 2013. - Vol. 19. - P. 1074-83.

125.Rodgers, G.L. Global serotype distribution among S. pneumoniae isolates causing otitis media in children: potential implications for pneumococcal conjugate vaccines / G.L. Rodgers, A. Arguedas, R. Cohen, R. Dagan // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P. 3802-3810.

126.Riickinger, S. Further incidence trends of invasive pneumococcal disease more than 2 years after introduction of 7-valent pneumococcal conjugate vaccination in Germany / S. Riickinger, A. Siedler, R..von Kries, R. Reinert, M.Jmohl, M. van der Linden // The 28th annual meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases; 2010. http://www.kenes.com/espid2010/ posters/Abstract415.

127.Rusan, M. An overview of the microbiology of acute ear, nose and throat infections requiring hospitalization / M. Rusan, T.E. Klug, T. Ovesen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 28. - P. 243-251.

128.Sa-Leao, R. Changes in pneumococcal serotypes and antibiotypes carried by vaccinated and unvaccinated day-care centre attendees in Portugal, a country with widespread use of the seven-valent pneumococcal conjugate vaccine / R. Sa-Leao, S. Nunes, A. Brito-Avo, N. Frazao, A.S. Simoes, M.I. Crisostomo, A.C. Paulo, J. Saldanha, I. Santos-Sanches, H. de Lencastre // Clin. Microbiol. Infect. - 2009. -Vol. 15.-P. 1002-7.

129. Segal, N. Acute otitis media caused by Streptococcus pyogenes in children / N. Segal, N. Givon-Lavi, E. Leibovitz, P. Yagupsky, A. Leiberman, R. Dagan // Clin. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 41. - P. 35-414.

130. Scott, J.A.G. The preventable burden of pneumococcal disease in the developing world / J.A.G. Scott // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 2398-2405.

131.Sharma, D. Pneumococcal carriage and invasive disease in children before introduction of the 13-valent conjugate vaccine: comparison with the era before 7-valent conjugate vaccine / D. Sharma, W.

Baughman, A. Hoist, S. Thomas, D. Jackson, M. da Gloria Carvalho, B. Beall, S. Satola, R. Jerris, S. Jain, M.M. Farley, J.P. Nuorti // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2013. - Vol. 32. - P. 45-53. 132.Simell, B. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease / B. Simell, K. Auranen, H. Kayhty, D. Goldblatt, R. Dagan, K.L. O'Brien; Pneumococcal Carriage Group // Expert. Rev. Vaccines. - 2012. -Vol. 11.-P. 841-55. 133.Smith, A. M. Alterations in PBP 1A essential for high-level penicillinresistance in Streptococcus pneumoniae. / A. M. Smith, K. Klugman // Antimicrob Agents Chemother. - 1998. - Vol. 42. - P. 1329-1333. 134. Song, J.H. The relationship between pneumococcal serotypes and antibiotic resistance / J.H. Song, R. Dagan, K. Klugman, B. Fritzel // Vaccine. - 2012. - Vol. 30. - P. 2728-37. 135.Stratchounski, L.S. Antimicrobial resistance of Streptococcus pneumoniae isolated from healthy children in day-care centers: results of a multicenter study in Russia / L.S. Stratchounski, O.I. Kretchikova, R.S. Kozlov, G.K. Reshedko, O.U. Stetsiouk, G.D. Tarasova, B.M. Blochin, O.A. Egorova, L.M. Boyko // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2000. -Vol. 19. - P. 196-200.

136. Stratchounski, L.S. Antimicrobial resistance of nasopharyngeal pneumococci from children from day-care centres and orphanages in Russia: results of a unique prospective multicentre study / L.S. Stratchounski, R.S. Kozlov, P.C. Appelbaum, O.I. Kretchikova, K. Kosowska-Shick // Clin. Microbiol. Infect. - 2006. - Vol. 12. - P. 85366.

137.Van Belkum, A. Novel BOX repeat PCR assay for high-resolution typing of Streptococcus pneumoniae strains / A. Van Belkum, M. Sluijter, R. De Groot, H. Verbrugh, P.W.M. Hermans // J. Clin. Microbiol. - 1996. - Vol. 34. - P. 1176-1179.

138.Van der Linden, M. First effects of immunization with higher valent pneumococcal conjugate vaccines in German children on numbers of reported IPD cases. / M. van der Linden, R.M. von Kries, M. Imöhl, S. Rückinger // The 29th annual meeting of the European Society for Paediatric Infectious Diseases (ESPID); 2011.

139.Vergison, A. Microbiology of otitis media: a moving target / A. Vergison // Vaccine. - 2008. - Vol. 26. - P. G5-G10.

140.Vergison, A. Otitis media and its consequences: beyond the earache / A. Vergison, R. Dagan, A. Arguedas, J. Bonhoeffer, R. Cohen, I. Dhooge, A. Hoberman, J. Liese, P. Marchisio, A.A. Palmu, G.T. Ray, E.A. Sanders, E.A. Simöes, M. Uhari, J. van Eldere, S.I. Pelton // Lancet Infect. Dis. -

2010.-Vol. 10. - P. 195-203.

141. Walker, C.L. Global burden of childhood pneumonia and diarrhoea / C.L. Walker, I. Rudan, L. Liu, H. Nair, E. Theodoratou, Z.A. Bhutta, K.L. O'Brien, H. Campbell, R.E. Black // Lancet. - 2013. - Vol. 381. -P. 1405-16.

142. Watson, D.A. Identification, cloning, and sequencing of DNA essential for encapsulation of Streptococcus pneumoniae / D.A. Watson, V. Kapur, D.M. Musher, J.W. Jacobson, J.M. Musser //Current microbiology. - 1995. - Vol. 31, № 4. - P. 251-259.

143. Weil-Olivier, C. Prevention of pneumococcal diseases in the post-seven valent vaccine era: a European perspective / C. Weil-Olivier, M. van der Linden, I. de Schutter, R. Dagan, L. Mantovani // BMC Infect. Dis. - 2012.-Vol. 12.-P. 207.

144. Weinberger, D.M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination / D.M. Weinberger, R. Malley, M. Lipsitch // Lancet. -

2011.-Vol. 378.-P. 1962-73.

145.Whatmore, A.M. Molecular characterization of equine isolates of Streptococcus pneumoniae: natural disruption of genes encoding the virulence factors pneumolysin and autolysin / A.M. Whatmore, S.J.

King, N.C. Doherty, D. Sturgeon, N. Chanter and C.G. Dowson. // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67. - P. 2776-2782.

146.Whitney, C.G. Increasing prevalence of multidrug- resistant Streptococcus pneumoniae in the United States / C.G. Whitney, M.M. Farley, J. Hadler, L.H. Harrison, C. Lexau, A. Reingold, L. Lefkowitz, P.R. Cieslak, M. Cetron, E.R. Zell, J.H. Jorgensen, A. Schuchat // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343. - P. 1917-1924.

147.World Health Organization. Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization — WHO position paper // Weekly Epidemiol Ree. - 2007. - Vol. 82. - P. 93-104.

148.Wyres, K.L. Pneumococcal capsular switching: a historical perspective / K.L. Wyres, L.M. Lambertsen, N.J. Croucher, L. McGee, A. von Gottberg, J. Linares, M.R. Jacobs, K.G. Kristinsson, B.W. Beall, K.P. Klugman, J. Parkhill, R. Hakenbeck, S.D. Bentley, A.B. Brueggemann // J. Infect. Dis. - 2013. - Vol. 207, № 3. - P. 439-49.

149.Zapun, C. Penicillin-binding proteins and beta-lactam resistance, FEMS / C. Zapun, T. Contreras-Martel, E. Vernet// Microbiol. Rev. - 2008. -Vol. 32. - P. 361-385.

150.Zhou, J. Identification of the major Spanish clones of penicillin-resistant pneumococci via the Internet using multilocus sequence typing / J. Zhou, M.C. Enright, B.G. Spratt // J. Clin. Microbiol. -2000. - Vol. 38. - P. 977-86.