Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Рагулин, Виталий Викторович

• Рагулин, Виталий Викторович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рагулин, Виталий Викторович

Оглавление.

Введение.

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Нитратредуктаза, ее структура и функции.

1.2. Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в растениях.

1.2.1. Регуляция нитратредуктазы нитратом.

1.2.2. Регуляция цитокинином.

1.2.3. Регуляция HP светом.

1.2.3.1. Участие фитохрома в регуляции HP.

1.2.3.2. Влияние фотоассимилятов на активность HP.

1.2.3.3. Регуляция HP на посттрансляционном уровне.

1.2.4. Регуляция HP продуктами ассимиляции нитрата.

1.3. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды.

1.3.1. Действие избыточного засоления на процесс восстановления нитрата

1.3.2. Действие Cd на процесс восстановления нитрата.

1.3.3 Действие теплового шока на активность HP.

Глава 2. Объект и методы исследования.

2.1 Объект исследования.

2.2. Методика постановки экспериментов.

2.3. Определение активности HP в зародышах куколя.

2.4. Выделение тотальной РНК.

2.5. Оценка относительного уровня мРНК HP методом Нозерн-гибридизации.

2.5.1. Денатурация РНК.

2.5.2. Электрофорез денатурированной тотальной РНК.

2.5.3. Перенос РНК с агарозного геля на мембрану.

2.5.4. Получение 32Р-меченого ДНК-зонда.

2.5.5. Подготовка нейлоновой мембраны с РНК.

2.6. Оценка относительного уровня мРНК HP методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

2.6.1 Очистка тотальной РНК от примесей ДНК.

2.6.2. Получение кДНК.Г.

2.6.3. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.6.4. Оценка результатов ПЦР.

2.7. Создание конструкции для оверэкспрессии фрагмента гена HP в E.coli и очистка этого белка.

2.7.1. Выделение тотальной ДНК из зародышей куколя.

2.7.2. Получение фрагмента гена Agnr2.

2.7.3. Получение плазмиды pQE30. со встроенным в нее фрагментом гена Agnr2.

2.7.4. Лигирование плазмиды pQE30 с фрагментом гена Agnr2.

2.7.5. Приготовление компетентных клеток штамма E.coli Ml 5.

2.7.6. Трансформация бактерий E.coli. плазмидой pQE30 с фрагментом гена HP куколя.

2.7.7. Проверка экспрессии фрагмента гена Agnr2 куколя и синтеза кодируемого им белка в E.coli.

2.7.8. Очистка рекомбинантного белка HP от других белков E.coli.

2.7.9. Перенос белка из полиакриламидного геля. на нитроцеллюлозную мембрану.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Индукция активности HP нитратом и цитокинином.

3.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК HP.

3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP зародышей куколя в ответ на действие нитрата и цитокинина.

3.3.1. Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки. транскриптов индивидуальных генов.

3.3.2 Подбор праймеров для ОТ-ПЦР.

3.3.2.1 Подбор праймеров для индивидуальных генов HP.

3.3.2.2. Подбор праймеров для контрольного гена.

3.3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP.

3.4. Влияние NaCl на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.5. Влияние CdC^ на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.6. Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов.

3.7 Создание конструкции для синтеза фрагмента белка HP куколя в E.coli и очистка этого белка.

Выводы.

Список используемой литературы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в зародышах куколя»

Азот - один из важнейших химических элементов, входящих в состав растительного организма. Несимбиотические растения получают азот из почвы, главным образом в виде его неорганических форм. При этом основной формой неорганического азота в большинстве почв и, следовательно, основным источником азота для растений является нитрат. Нитратредуктаза (HP) - ключевой фермент процесса восстановления нитрата. Ее активность определяет скорость ассимиляции растением неорганического азота и оказывает значительное влияние на весь азотный метаболизм.

В настоящее время в значительной степени остается открытым вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов HP у растений. Как известно, нитрат является не только субстратом, но и сигнальной молекулой, регулирующей экспрессию генов HP (Crawford 1995). На добавление нитрата растения, испытывающие недостаток азота, отвечают индукцией активности HP. В отсутствие нитрата активность данного фермента, как правило, поддерживается на крайне низком (стационарном) уровне. Помимо нитрата экспрессия генов HP регулируется еще и сигналами гормональной природы, прежде всего цитокининами, которые синтезируются главным образом в корнях растений.

Регуляция активности HP нитратом и цитокининами позволяет говорить о функционировании в растениях субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов нитратредуктазы (Campbell 1999). Характер взаимодействия цитокинина и нитрата в системе индукции HP является аддитивным (Кузнецов В.В. и др., 19796). Исходя из этого, можно сделать предположение, что гормон и субстрат независимо регулируют работу одних и тех же или различных генов, кодирующих HP. В ряде растений обнаружено два и даже три гена, кодирующие апобелок HP (Caboche et al., 1992; Sueyoshi etal., 1995; Yuetal., 1998).

Условия обитания растений существенно влияют на процесс усвоения азота. Во многом это определяется чрезвычайной лабильностью HP. Особенно сильно активность HP подавляется в условиях экстремальных температур, жесткого водного дефицита, засоления и ряда факторов антропогенного происхождения. Предполагается, что падение активности HP в ответ на то или иное повреждающее действие является адаптивной реакцией растений, направленной на экономию энергетических и структурных ресурсов, а также на предотвращение возможного "аммиачного отравления". Механизмы "отключения" процесса ассимиляции неорганического азота при стрессе в настоящее время изучены недостаточно. Еще меньше исследованы механизмы регуляции экспрессии генов HP в стрессорных условиях (Кузнецов и др. 19916).

Изучение субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов HP в нормальных условиях и при стрессе позволит не только понять механизмы ассимиляции нитратного азота у растений, но и выяснить взаимодействие различных систем регуляции клеточного метаболизма, что имеет важное общебиологическое значение.

Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение субстратной, гормональной и стрессорной регуляции экспрессии генов HP.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить индукцию активности HP в зародышах куколя в оптимальных условиях и на фоне действия различных стрессорных факторов.

2. Исследовать гормональную и субстратную регуляцию экспрессии различных генов HP на уровне мРНК в норме и при стрессе.

3. Создать генно-инженерную конструкцию для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя.

Научная новизна. Впервые разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов HP зародышей куколя с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на данном объекте, а также на других растительных системах для решения смежных научных проблем.

Впервые изучена регуляция экспрессии индивидуальных генов HP куколя на уровне мРНК. Продемонстрирована дифференциальная экспрессия трех различных генов HP под действием индукторов гормональной и субстратной природы, а также стрессорных факторов. Показано, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген Agnr3 регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.

Получено экспериментальное подтверждение высказанной гипотезы, согласно которой в основе аддитивного эффекта совместного действия субстрата и гормона при индукции HP, а также способности одного индуктора вызывать увеличение активности фермента даже в период «затухания» активности HP, индуцированной другим индуктором, лежит способность нитрата и цитокинина независимо друг от друга активировать экспрессию различных генов, кодирующих HP.

Показано дифференциальное действие стрессорных факторов на экспрессию различных генов HP. Обнаружено, что экспрессия гена Agnrl значительно в большей степени подавляется высокими концентрациями NaCl и CdCb, а также тепловым шоком, чем экспрессия гена Agnr3.

На примере теплового шока продемонстрировано, что падение активности HP в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии инактивация фермента сопровождается подавлением экспрессии генов HP на уровне мРНК.

Создана генно-инженерная конструкция для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя. Наработан необходимый объем данного фрагмента и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии с целью использования его для выработки специфических антител, необходимых в последствии для изучения экспрессии генов HP на уровне белка.

Практическая значимость. Полученные в работе данные о регуляции экспрессии генов HP в нормальных и стрессорных условиях имеют большое значение для изучения механизмов ассимиляции растениями нитрата и могут служить основой для создания трансгенных растений, обладающих способностью к более эффективному использованию почвенного азота. Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических вузов.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на семинарах Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2001, 2003, 2004), на семинаре Института биохимии растений (Галле, Германия, 2002), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на межлабораторном семинаре Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2004).

Основные публикации:

1. VI.V. Kuznetsov, A.G. Kruglova, O.I. Molodyuk, V.V. Karyagin, A.B. Mesheryakov, V.V. Ragulin, V.Yu. Rakitin, V.P. Kholodova. (2002) Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Edited by I.Machackova and G.A.Romanov. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London. P.l 95-203.

2. Рагулин B.B., Кузнецов Вл.В. (2003) Дифференциальная регуляция экспрессии генов нитратредуктазы нитратом и цитокинином. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.326.

3. Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Аккумуляция мРНК пирролин-5-карбоксилат-синтетазы в процессе онтогенетического и стрессиндуцируемого накопления пролина в растениях. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.336.

4. Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Активизируется ли ген фосфоенол-пируват-карбоксилазы на ранних стадиях онтогенеза растений хрустальной травки при засолении? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.337.

5. Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Сохраняется ли стресс-индуцированный САМ у растений хрустальной травки после прекращения экстремального воздействия? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.350.

6. Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2004) Обратимость стресс-индуцированного формирования САМ-типа фотосинтеза у растений. Доклады академии наук. Т.395, №3, С.133-135.

7. Шорина М.В., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (2005) Вовлекаются ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки? Доклады академии наук. Т.400. №1. С.139-141.

8. Рагулин В.В., Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В. (2005) Дифференциальная регуляция цитокинином и нитратом экспрессии генов нитратредуктазы куколя. Доклады академии наук. Т.402. (в печати)

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и приложений. Работа изложена на 146 страницах машинного текста, включает 12 таблиц, 14 рисунков; библиография содержит 166 названия, в т.ч. 151 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Рагулин, Виталий Викторович

Выводы

1. Динамика индукции активности HP в зародышах куколя в присутствии цитокинина и нитрата существенно различается. При действии цитокинина, в отличие от нитрата, имеет место продолжительный лаг-период в развитии активности фермента, несмотря на присутствие в среде индуктора. Обнаруженное различие, очевидно, реализуется на постранскрипционном уровне регуляции экспрессии генов HP.

2. Использование метода Нозерн-гибридизации позволило показать, что как гормон (цитокинин), так и субстрат (нитрат) регулируют экспрессию генов HP куколя на уровне аккумуляции мРНК.

3. Разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов HP с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Впервые продемонстрирована дифференциальная экспрессия различных генов HP. Установлено, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген Agnr3 регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.

4. Различные стрессоры, такие как засоление (NaCl), тяжелые металлы (CdCl2) и высокая температура в разной степени подавляют активность HP в зародышах куколя. Они оказывают дифференциальное воздействие на экспрессию индивидуальных генов HP, снижая уровень транскриптов гена Agnrl и практически не влияя на экспрессию гена Agnr3.

5. Сравнительный анализ влияния теплового шока на активность HP и на уровень ее мРНК показал, что стрессорное воздействие прежде всего инактивирует фермент и лишь затем снижает уровень его мРНК. Это означает, что падение активности HP в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии стрессора инактивация фермента сопровождается одновременным ингибированием синтеза мРНК HP или ускорением ее распада.

6. Создана генноинженерная конструкция (экспрессирующий вектор) для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя; наработан необходимый объем рекомбинантного белка и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии. Данный фрагмент будет использован для выработки специфических антител и для изучения экспрессии генов HP на уровне белка с помощью Вестерн-гибридизации.

7. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что три различных гена HP куколя находятся под дифференциальным онтогенетическим, гормональным, субстратным и стрессорным контролем. Это обеспечивает тонкую регуляцию уровня мРНК HP в нормальных и стрессорных условиях и позволяет объяснить аддитивный характер взаимодействия гормона и субстрата при индукции активности HP.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рагулин, Виталий Викторович, 2005 год

1. Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В., Кулаева О.Н. (1977) Влияние нитрата и цитокинина на стабильность нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Докл. акад. наук. Т.237. С.245-248

2. Кузнецов В.В. (1979а) Изолированные зародыши Agrostemma githago как система для изучения гормональной и субстратной индукции ферментов у растений. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук. Москва, 1979.

3. Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В., Кулаева О.Н. (19796) Влияние нитрата и цитокинина на активность нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Биохимия Т.44. вып.4. С.684-692.

4. Кузнецов Вл.В. (1979а) Гормональная регуляция синтеза нитратредуктазы в изолированных зародышах куколя. Физиол. растений. Т.26. вып.1. С.82-88.

5. Кузнецов Вл.В., Кузнецов В.В., Кулаева О.Н. (19796) Влияние цитокинина и нитрата на синтез РНК и нитратредуктазную активность в изолированных зародышах куколя. Физиол. растений. Т.26. Вып.2. С.309-317.

6. Кузнецов Вл.В., Овчаренко Г.А., Борисова Н.Н., Баскакова С.Ю., Измайлов С.Ф. (19916) Нитратредуктаза как мишень теплового шока. Докл. АН СССР. Т.321. №3. С.635-638.

7. Кузнецов Вл.В., Рощупкин Б.В., Борисова Н.Н., Яценко И.А. (1991а) Участвуют ли белки теплового шока в регуляции экспрессии гена нитратредуктазы Agrostemma githago L. при внезапном повышении температуры? Физиол. растений. Т.38. Вып.5. С.970-979.

8. Кузнецов Вл.В. (1992) Индуцибельные системы и их роль при адаптации растений к стрессорным факторам. Диссертация на соискание степени докт.биол.наук в форме научного доклада. Кишинев.

9. Кузнецов Вл.В., Рощупкин Б.В., Орлов О.П., Борисова Н.Н. (1991в) Гормональная регуляция экспрессии гена нитратредуктазы в зародышах куколя при тепловом шоке. ДАН СССР. Т.318. №1. С.252-255

10. Кулаева О.Н. (1973) Цитокинины, их структура и функции. М., "Наука", 264 с.

11. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В., Кузнецов В.В. (1976) Индукция цитокинином активности нитратредуктазы в изолированных зародышах Agrostemmagithago. Физиол. растений. Т.23. №6. С.1255-1263.

12. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2004) Новейшие достижения и перспективы изучения механизма действия фитогормонов и их участия в сигнальных системах целого растения. Вестник РФФИ. №2(36). С.12-36.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, 1984.

14. Пейве Я.В., Иванова Н.Н., Ширинская М.Г., Дуброво П.Н. (1968) Микроэлементы в сельском хозяйстве и медицине. Улан-Уде. С.417.

15. Серегин И.В., Иванов В.Б. (2001) Физиологические аспекты токсического действия кадмия и свинца на высшие растения. Физиол. растений. Т.48. Вып.4. С.283-300.

16. Abd-El Baki G.K., Siefritz F., Man H.M., Weiner H., Kaldenhoff R., Kaiser W.M. (2000) Nitrate reductase in Zea mays L. under salinity. Plant, Cell and Environment V.23. P.515-521.

17. Appenroth K.-J., Meco R., Jourdan V., Lillo C. (2000) Phytochrome and post-translational regulation of nitrate reductase in higher plants. Plant Sci. V.159 P.51-56.

18. Aslam M., Travis R.L., Huffaker R.C. (1994) Stimulation of nitrate and nitrite efflux by ammonium in barley (Hordeum vulgare L.) seedlings. Plant Physiol. V.106. P.1293-1301.

19. Aslam M., Huffaker R.C., Rains D.W. (1984) Early effects of salinity on nitrate assimilation in barley seedlings. Plant Physiol. V.76. P.321-325.

20. Aslam M., Travis R.L., Huffaker R.C. (1992) Comparative kinetics and reciprocal inhibition of nitrate and nitrite uptake in roots of uninduced and induced barley seedlings. Plant Physiol. V.99. P.l 124-1133.

21. Barcelo J., Poschenrieder C. (1990) Plant water relations as affected by heavy metal stress: a review. J. Plant Nutr. V.13. P.1-37.

22. Behl R., Tischner R., Raschke K. (1988) Induction of a high capacity nitrate uptake mechanism in barley roots prompted by nitrate uptake through a constitutive low capacity mechanism. Planta. V.176. P.235-240.

23. Binns A.N. (1994) Cytokinin accumulation and action: biochemical, genetic and molecular approaches. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.45. P.173-196.

24. Borriss H., Wiss Z. (1967) Untersuchungen uder die Steuerung der Enzymaktivitat in pflanzlichen Embryonen Cytokinine. Univ. Rostock. Math-naurwiss. V.16. №4. P.629-639.

25. Boston R.S.; Viitanen P.V.; Vierling E. (1996) Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol. Biol. V.32. P. 191-222.

26. Botrel A., Magne C., Kaiser W.M. (1996) Nitrate reduction, nitrine reduction and ammonium assimilation in barley roots in response to anoxia. Plant Physiol. Biochem. V.34. P.645-652.

27. Brandstater I., Kieber J.J. (1998) Two genes with similiarity to bacterial response regulators are rapidly and specifically induced by cytokinin in Arabidopsis. Plant Cell. V.10. P.1009-1019.

28. Brugnoli E., Bjorkman O. (1992) Growth of cotton under continuous salinity stress: influence on allocation pattern, stomatal and nonstomatal components of photosynthesis and dissipation of excess light energy. Planta. V.187. P.335-347.

29. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants. American society of plant physiologists. Rockville, Maryland.

30. Caboche M., Rouze P. (1992) Nitrate reductase: a target for molecular and cellular studes in Nicotiana plumbaginifolia. Trends Genet. V.6. P. 187-196.

31. Callaci J.J., Smarrelli J.J. (1991) Regulation of the inducible nitrate reductase isoform from soybeans. Biochim. Biophys. Acta. V.1088. P. 127-130.

32. Campbell W.H. (1999) Nitrate reductase structure, function and regulation: Bridging the gap between biochemistry and physiology. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.50. P.277-303.

33. Chang C., Stewart R.C. (1998) The two-component system: regulation of diverse signalling pathways in prokaryotes and eukaryotes. Plant Physiol. V.l 17. P.723-731.

34. Cheeseman J.M. (1988) Mechanisms of salinity tolerance in plants. Plant Physiol. V.87. P.547-550.

35. Cheng C., Dewdney J., Kleinhofs A., Goodman H.M. (1986) Cloning and nitrate induction of nitrate reductase mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83. P.6825-6828.

36. Cheng C.-L., Acedo G.N., Cristinsin M., Conkling M.A. (1992) Sucrose mimics the light induction of Arabidopsis nitrate reductase gene transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.89. P.l861-1864.

37. Clement C.R., Hopper M.J., Jones L.H., Leafe E.L. (1978) The uptake of nitrate by Lolium perenne from flowing nutrient solution. J. Exp. Bot. V.29. P.l 173-1178.

38. Coud K.V., Sharma R. (1994) Retention of photoinduction of cytosolic enzymes in aurea mutant of tomato {Lycopersicon esculentum). Plant Physiol. V.105. P.643-650.

39. Couia H., Chorbal M.H., Touraine B. (1994) Effects of NaCl on flows of N and mineral ions and on NO3' reduction rate within whole plants of salt-sensitive bean and salt-tolerant cotton. Plant Physiol. V.105. P.1409-1418.

40. Crawford N.M. (1995) Nitrate: nutrient and signal for plant growth. Plant Cell. V.7. P.859-868.

41. Crawford N.M., Arst H.N. (1993). The molecular genetics of nitrate assimilation in fungi and plants. Annu. Rev. Genet. V.27. P.l 15-146.

42. Crawford N.M., Campbell W.H., Davis R.W. (1986) Nitrate reductase from squash: cDNA cloning and nitrate regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.83. P.8073-8076.

43. Crawford N.M., Glass A.D.M. (1998) Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends Plant Sci. V.3 P.389-395.

44. Crawford N.M., Smith M., Bellissimo D., Davis R.W. (1988) Sequence and nitrate regulation of the Arabidopsis thaliana mRNA encoding nitrate reductase, a metalloflavoprotein with three functional domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.85. P.5006-5010.

45. D'Agrostino В., Deruere Y., Kieber Y.Y. (2000) Characterization of the response of the Arabidopsis response regulator gene family to cytokinin. Plant Physiol. V.124. P.1706-1717.

46. De Cires A., De la Torre A., Delgado В., Lara C. (1993) Role of light and CO2 fixation in the control of nitrate reductase activity in barley leaves. Planta. V.190. P.277-283.

47. Deruure Y., Kieber J. (2002) Molecular mechanisms of cytokinin signaling. J. Growth Regul. V.21. P.32-39.

48. Faure J-D., Jullien M., Caboche M. (1994) Zea3: a pleiotropic mutation affecting cotyledon development, cytokinin resistance and carbon-nitrogen metabolism. Plant J. V.5. №4. P.481-491.

49. Forde B.G., Clarkson D.T. (1999) Nitrate and ammonium nutrition of plants: physiological and molecular perspec-tives. Adv. Bot. Res. V.30. P. 1-90.

50. Forreiter C., Kirschner M., Nover L. (1997) Stable transformation of an Arabidopsis cell suspension culture with firefly luciferase providing a cellular system for analysis of chaperone activity in vivo. Plant Cell. V.9. P.2171-2181.

51. Fukuoka H., Ogawa Т., Minam H., Yano H., Ohkawa Y. (1996) Developmental stage-specific and nitrate-independent regulation of nitrate reductase gene expression in rapeseed. Plant Physiol. V.l 1. №1. P.39-47.

52. Fulton T.M., Chunwongse J., Tanksley S.D. (1995) Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants. Plant Mol. Biol. Rep. V.13. №3. P.207-209.

53. Glaab J., Kaiser W.M. (1993) Rapid modulation of nitrate reductase in pea roots. Planta V. 191. P. 173-179.

54. Glass A.D., Shaff J.E., Kochian L.V. (1992) Studies of the uptake of nitrate in barley. IV. Electrophysiology. Plant Physiol. V.99. P.456-463.

55. Glass A.D.M., Britto D.T., Kaiser B.N., Kinghorn J.R., Kronzucker H.J., Kumar A., Okamoto M., Rawat S., Siddiqi M.Y., Unkles S.E., Vidmar J.J. (2002) The regulation of nitrate and ammonium transport system in plants. J.Exp.Bot. V.53.NO.370. P. 855-864.

56. Gowri G., Campbell W.H. (1989) cDNA clones for corn leaf NADH:nitrate reductase and chloroplast NAD(P)+:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Plant Physiol. V.90. P.792-798.

57. Gowri G., Kenis J.D., Ingemarsson В., Redinbaugh G., Campbell W.H. (1992) Nitrate reductase transcript is expressed in the primary response of maize to environmental nitrate. Plant Mol.Biol. V.18. P.55-64.

58. Guyer D., Patton D., Ward E. (1995) Evidence for cross-pathway regulation of metabolic gene expression in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.92. P.4997-5000.

59. Haberer G., Kieber J.J. (2002) Cytokinins: new insights into classic phytohormone. Plant Physiol. V.128. P.359-362.

60. Hamat H.B., Kleinhofs A., Warner R.L. (1989) Nitrate reductase induction and molecular characterization in rice {Oryza sativa L.). Mol. Gen. Genet. V.218. P.93-98.

61. Hare P.D., Staden J. (1997) The molecular basis of cytokinin action. Plant Growth Regul. V.23. P.41-78.

62. Hernandez L.E., Carpenaruiz R., Garate A. (1996) Alternations in the mineral nutrition of pea seedlings exposed to cadmium. J. Plant Nutr. V.19. P.l 581-1598.

63. Hernandez L.E., Garate A., Carpenaruiz R. (1997) Effect of cadmium on the uptake, distribution and assimilation of nitrate in Pisum sativum. Plant Soil. V.189. P.97-106.

64. Hirschberg К., Huebner G., Borris H. (1972) Cytokinin-induced de novo synthesis of nitrate reductase in isolated embryos of Agrostemma githago. Planta. V.108. P.333.

65. Hoarau J., Barthes L., Bousser A., Deleens E., Prioul J.-L. (1996) Effect of nitrate on water transfer across roots of nitrogen prestarved maize seedlings. Planta V.200. P.405-415.

66. Hodges M. (2002) Enzime redundancy and the importance of 2-oxoglutarate in plant ammonium assimilation. J.Exp.Bot. V.53. №370. P.905-916.

67. Hollenbach В., Schreiber L., Hartung W., Dietz K.-J. (1997) Cadmium leads to stimulated expression of the lipid transfer protein genes in barley: implications for the involvement of lipid transfer proteins in wax assembly. Planta V.203 P.9-19.

68. Huber S.C., Huber J.L., Campbell W.H., Redinbaugh M.G. (1992) Comparative studies of the light modulation of nitrate reductase and sucrose-phosphate synthase activities in spinach leaves. Plant Physiol. V.100. P.706-712.

69. Hwang C.-F., Lin Y., D'Souza Т., Cheng C.-L. (1997) Sequences necessary for nitrate-dependent transcription of arabidopsis nitrate reductase genes. Plant Physiol. V.l 1. №3. P.853-862.

70. Jang J.-C., Sheen J. (1997) Sugar sensing in higher plants. Trends Plant Science. V.2. P.208-214.

71. Kaiser W.M. Huber S.C. (1994) Modulation of nitrate reductase in vivoл Iand in vitro: effects of phosphoprotein phosphatase inhibitors, free Mg and 5'-AMP. Planta. V.193 P.358-364.

72. Kaiser W.M. Huber S.C. (2001) Post-translational regulation of nitrate reductase: mechanism, physiological relevance and environmental triggers. J. Exp. Bot. V.52 №363 P.1981-1989.

73. Kaiser W.M., Brendle-Behnisch E. (1991) Rapid modulation of spinach leaf nitrate reductase activity by photosynthesis. I. Modulation in vivo by C02, availability. Plant Physiol. V.96. P.363-367.

74. Kaiser W.M., Forster J. (1989) Low C02, prevents nitrate reduction in leaves. Plant Physiol. V.91. P.970-974.

75. Kaiser W.M., Kandlbinder A., Stoimenova M., Glaab J. (2000) Discrepancy between nitrate reduction rates in intact leaves and nitrate reductase activity in leaf extracts: what limits nitrate reduction in situ? Planta. V.210. P.801-807.

76. Kaiser W.M., Weiner H., Kandlbinder A., Tsai C-B., Rockel P., Sonoda M., Planchet E. (2002) Modulation of nitrate reductase: some new insights, an unusual case and a potentially important side reaction. J. Exp. Bot. V.53. №370. P.875-882.

77. Kakimoto T. (1998) Cytokinin signalling. Curr. Opin. Plant Biol. V.l. P.399-403.

78. Kakimoto T. (2003) Perception and signal transduction of cytokinins. Annu. Rev. Plant Biol. V.54. P.605-627.

79. Kende H., Shen T.C. (1972) Nitrate reductase in Agrostemma githago. Comparison of the inductive effects of nitrate and cytokinin. Biochim. Biophys. Acta. V.286. P. 118-125.

80. Klobus G., Ward M.R., Huffaker R.C. (1988) Characteristics of injury and recovery of net NO3' transport of barley seedlings from treatments of NaCI. Plant Physiol. V.87. P.878-882.

81. Koch K.E. (1996) Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol., Plant Mol. Biol. V.47. P.509-540.

82. Kronzucker H.J., Glass A.D.M., Siddiqi M.Y. (1999) Inhibition of nitrate uptake by ammonium in barley. Analysis of component fluxes. Plant Physiol. V.120. P.283-291.

83. Man H.M., Abd-El Baki G.K., Stegmann P., Weiner H., Kaiser W.M. (1999) The activation state of nitrate reductase is not always correlated with total nitrate reductase activity in leaves. Planta. V. 209. P.462-468.

84. Meharg A.A., Blatt M.R. (1995) N03 transport across the plasma membrane of Arabidopsis thaliana root hairs: kinetic control by pH and membrane voltage. J. Membr. Biol. V.l45. P.49-66.

85. Melzer J.M., Kleinhofs A., Warner R.L. (1989) Nitrate reductase regulation: effects of nitrate and light on nitrate reductase messenger RNA accumulation. Mol. Gen. Genet. V.217. P.341-346.

86. Miller A.J., Smith S.J. (1996) Nitrate transport and compartmentation in cereal root cells. J. Exp. Bot. V.47 P.843-854.

87. Miyawaki K., Matsumoto-Kitano M., Kakimoto T. (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate. Plant J. V.37. №1. P.128-38.

88. Мок D.W., Мок M.C. (2001) Cytokinin metabolism and action. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.89. P.89-118.

89. Muller В., Touraine B. (1992) Inhibition of N03" uptake by various phloem-translocated amino acids in soybean seedlings. J Exp. Bot. V.43. P.617-623.

90. Oka A., Sakai H., Iwakoshi S. (2002) His-Asp phosphorelay signal transduction in higher plants: receptors and response regulators for cytokinin signaling in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst. V.77. P.383-391.

91. Orsel M., Filleur S., Fraiser V., Daniel-Vedele F. (2002) Nitrate transport in plants: which gene and which control? J.Exp.Bot. Vol. 53. №370. P.825-833.

92. Orsel M., Krapp A., Daniel-Vedele F (2002); Analysis of the NRT2 nitrate transporter family in Arabidopsis. Structure and gene expression. Plant Physiol. V.129. P.886-896.

93. Ouariti O., Gouia H., Ghobal M.H. (1997) Responses of bean and tomato plants to cadmium growth, minerel nutrition, and nitrate reduction. Plant Physiol. Biochem. V.35 P.347-354.

94. O'Farrell (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of plants. J. Biol. Chem. V.250. №10. P.4007-4021.

95. Panchuk I., Volkov R., Schoffl F. (2002) Heat stress- and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis. Plant Physiol. V.129. P.838-853.

96. Petuke A.D., Jeschke W.D. (1999) The characterization of inhibition of net nitrate uptake by salt in salt-tolerant barley. J. Exp. Bot. V.50. №337. P.1365-1372.

97. Raab Т.К., Terry N. (1994) Nitrogen Source Regulation of Growth and hotosynthesis in Beta vulgaris L. Plant Physiol. V.105. P.l 159-1166.

98. Rashotte A.M., Carson S.D.B., To J.P.C., Kieber J.J. (2003) Expression profiling of cytokinin action in Arabidopsis. Plant Physiol. V.132 P. 1998-2011.

99. Redinbaugh M.G., Campbell W.H. (1993) Glutamine synthetase and ferredoxin-dependent glutamate synthase expression in the maize (Zea mays) root primary response to nitrate. Plant Physiol. V.101. P.1249-1255.

100. Rizhsky L., Liang H., Mittler R. (2002) The combined effect of drought stress and heat shock on gene expression in tobacco. Plant Physiol. V.130. P.l143-1151.

101. Sakai H., Honma Т., Aoyama Т., Sato S., Kato Т., Tabata S., Oka A. (2001) ARR1, a transcription factor for genes immediately responsive to cytokinins. Science. V.294. P. 1519-1521.

102. Sakakibara H. (2003) Nitrate-specific and cytokinin-mediated nitrogen signaling pathways in plants. J. Plant Res. V.l 16. P.253-257.

103. Sakakibara H., Suzuki M., Takei K., Deji A., Taniguchi M., Sugiyama T. (1998) A response-regulator homologue possibly involved in nitrogen signal transduction mediated by cytokinin in maize. Plant J. V.14 №3. P.337-344.

104. Sakakibara H., Taniguchi M., Sugiyama, T. (2000) His-Asp phosphorelay signaling: a communication avenue between plants and their environment. Plant Mol. Biol. V.42 P.273-278.

105. Samuelson M.E., Larsson C.-M. (1993) Nitrate regulation of zeatin riboside levels in barley root: effects of inhibitors of N assimilation and comparison with ammonium. Plant Sci. V.93. P.77-84.

106. Scheible W.-R., Lauerer M., Schulze E.-D., Caboche M., Stitt M. (1997) Nitrate acts as a signal to Induce organic acid metabolism and repress starch metabolism in tobacco. The Plant Cell. V. 9. P.783-798.

107. Schmulling Т., Schafer S., Romanov G. (1997) Cytokinins as regulator of gene expression. Physiol. Plant. V.l00. P.505-519.

108. Schoffl F., Prandl R., Reindl A. (1998) Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol. V.l 17 P.l 135-1141.

109. Sherameti I., Sopory S.K., Trebicka A. et al. (2002) Photosynthetic electron transport determines nitrate reductase gene expression and activity in higher plants. J. Biol. Chem. V. 277. P. 46594-46600.

110. Siddiqi M.Y. (1990) Studies of the uptake of nitrate in barley. Plant Physiol., 93:1426-1432.

111. Sivasankar S., Oaks A. (1995) Regulation of Nitrate Reductase during Early Seedling Growth. Plant Physiol. V.107. P. 1225-1231.

112. Sivasankar S., Rothstein S., Oaks A. (1997) Regulation of the accumulation and reduction of nitrate by nitrogen and carbon metabolites in maize seedlings. Plant Physiol. V.l 14. P.583-589.

113. Solomonson L.P., Barber M.J. (1990) Assimilatory nitrate reductase: Functional properties and regulation. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. V.41. P.225-253.

114. Soni R., Carmichael J.P., Shah Z.H., Murray J.A.H. (1995) A family of cyclin D homologs from plants differentially controlled by growth regulators and containing the conserved retinoblastoma protein interaction motif. Plant Cell. V.7. P.85-103.

115. Srivastava H.S. (1980) Regulation of nitrate reductase activity in higher plants. Phytohemistry. V.l9. P. 725-733.

116. Staswick P.E., Huang J.-F., Rhee Y. (1991) Nitrogen and methyl jasmonate induction of soybean vegetative storage protein genes. Plant Physiol. V.96. P.130-136.

117. Stitt M. (1999) Nitrate regulation of metabolism and growth. Curr. Opin. Plant Biol. V.2. P. 178-186.

118. Stitt M., Muller C., Matt P., Gibon Y., Carillo P., Morcuende R., Scheible W.-R., Krapp A. (2002) Step towards an integrated view of nitrogen metabolism. J. Exp. Bot. V.53 №370. P.959-970.

119. Sueyoshi K., Kleinhofs A., Warner R. (1995) Expression of NADH-specific and NAD(P)H-bispecific nitrate reductase genes in response to nitrate in barley. Plant Physiol. V.l07. P.1303-1311.

120. Sugiharto В., Sugiyama T. (1992) Effect of nitrate and ammonium on gene expression of phosphoenolpyruvate carboxylase and nitrogen metabolism in maize leaf tissue during recovery from nitrogen stress. Plant Physiol. V.98. P. 1403-1408.

121. Suzuki, I., Cretin, C., Omata, Т., Sugiyama, T. (1994) Transcriptional and posttranscriptional regulation of nitrogen-responding expression of phosphoenolpyruvate carboxylase gene in maize. Plant Physiol. V.105. P. 12231229.

122. Suzuku Т., Miwa K., Ishikawa K., Yamada H., Aiba H., Mizuno T. (2001) The Arabidopsis sensor His-kinase, AHK, can respond to cytokinins. Plant Cell Physiol. V.42. P.107-113.

123. Takei K., Takahashi Т., Sugiyama Т., Yamaya T. (2002) Multiple routes communicating nitrogen availability from roots to shoots: a signal transduction pathway mediated by cytokinin. J.Exp.Bot. Vol. 53. №370. P.971-977.

124. Ueguchi C., Koizumi H., Suzuki Т., Mizuno T. (2001) Novel family of sensor histidine kinase genes in Arabidopsis thaliana. Nature V.42. P.231-235.

125. Vassilev A., Yordanov I., Tsonev T. (1997) Effect of Cd2+ on the physiological state and photosynthetic activity of young barley plants. Photosynthetica. V.34. P.293-302.

126. Vencentz M., Moureaux Т., Leydecker M-T., Vaucheret H., Caboche M. (1993) Regulation of nitrate and nitrite reductase expression in Nicotianaplumbaginifolia leaves by nitrogen and carbon metabolites. Plant J. V.3. V.315-324.

127. Vidmar J.J., Zhuo D., Siddiqi M.Y., Schjoerring J.K., Touraine В., Glass A.D. (2000) Regulation of high-affinity nitrate transporter genes and high-affinity nitrate influx by nitrogen pools in roots ofbarley. Plant Physiol. V.123. P.307-318.

128. Vincentz M., Caboche M. (1991) Constitutive expression of nitrate reductase allows normal growth and development of Nicotiana plumbqinifolia plants. EMBO J. V.10. №5. 1027-1035

129. Walch-Liu P., Neumann G., Bangerth F., Engels C. (2000) Repid effects of nitrogen form on leaf morphogenesis in tobacco. J. Exp.Bot. V.51 №343 P.227-237.

130. Wang M.Y., Glass A., Shaff J.E., Kochian L.V. (1994) Ammonium uptake by rice roots. Electrophysiology. Plant Physiol. V.104. P.899-906.

131. Wang R., Guegler K., LaBrie S.T., Crawford N.M. (2000) Genomic analysis of a nutrient response in Arabidopsis reveals diverse expression patterns and novel metabolic and potential regulatory genes induced by nitrate. The Plant Cell. V.12. P.1491-1509.

132. Weiner H., Kaiser W.M. (1999) 14-3-3 proteins control proteolysis of nitrate reductase in spinach leaves. FEBS Letters. V.455 P.75-78.

133. Weiner H., McMichael R.W., Huber S.C. (1992) Identification of the factors regulating the phosphorylation status of sucrose-phosphate synthase in vivo. Plant Physiol. V.99. V.1435-1442.

134. Westhoff P., Nelson N., Bunemann H., Herrmann R.C. (1981). Curr. Genet. V.4. P.109-120.

135. Wiren N., Gazzarrinni S., Frommer W.B. (1997) Regulation of mineral nitrogen uptake in plants. Plant Soil. V.196. P.191-199.

136. Yang X., Baligar V.C., Martens D.C., Clark R.B. (1996) Cadmium effect on influx and transport of mineral nutrients in plant species. J. Plant Nutr. V.l9. P.643-656.

137. Yu X., Sukumaran S., Marton L. (1998) Differential expression of the Arabidopsis Nial and Nia2 genes. Cytokinin-induced nitrate reductase activity is correlated with increased Nial transcription and mRNA levels. Plant Physiol. V.l 16. P.1091-1096.

138. Zhang H., Forde B.G. (1998) An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science V.279. P.407-409.

139. Zhao J., Williams C.C., Last R.L. (1998) Induction of Arabidopsis tryptophan pathway enzymes and camalexin by amino acid starvation, oxidative stress, and an abiotic elicitor. The Plant Cell. V.10. P.359-370.

140. Zhuo D., Okamoto M., Vidmar J.J., Glass ADM. (1999) Regulation of putative high-affinity nitrate transporter (NRT2;lAt) in roots of Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. V.l7. P.563-568.

141. Zielke H.R., Fliner P. (1971) Sinthesis and turnover of nitrate reductase induced by nitrate in cultured tobacco cells. J.Biol.Cem. V.246 P. 1772-1779.