Разработка технологии лекарственного средства с фитосубстанцией из клевера лугового травы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, кандидат наук Нгуен Тхи Шен

• Нгуен Тхи Шен
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Нгуен Тхи Шен

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фитохимическая характеристика клевера лугового

1.2. Химический состав травы клевера лугового

1.3. Фармакологические свойства растительной субстанции клевера лугового

1.4. Обзор лекарственных средств на основе клевера лугового травы на фармацевтическом рынке

1.5. Методы идентификации и извлечения флавоноидов из лекарственного растительного сырья

1.6. Методы очищения и разделения флавоноидов из лекарственного растительного сырья

1.7. Таблетки как перспективная лекарственная форма на основе фитосубстанций

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Лекарственное растительное сырье

2.1.2. Вспомогательные вещества

2.2. Аппаратура, растворители и реактивы

2.2.1. Растворители и реактивы

2.2.2. Оборудование и средства измерения

2.3. Товароведческий анализ клевера лугового травы

2.4. Изучение макро- и микроэлементного состава клевера лугового травы

2.5. Определение технологических свойств измельченной клевера лугового травы

2.6. Качественые реакции на флавоноидов в клевера лугового траве

2.7. Количественое определение суммы флавоноидов и изофлавоноидов в клевера лугового траве

2.8. Методы анализа водно-спиртовых извлечений из клевера лугового травы

2.9. Анализ фитосубстанции клевера лугового травы

2.9.1. Методика получения фитосубстанции

2.9.2. Количественный анализ флавоноидов и изофлавоноидов в фитосубстанции

2.9.3. Анализ элементного состава фитосубстанции

2.9.4. Методики стандартизации фитосубстанции

2.9.5. Фармакологические методы исследования фитосубстанции травы клевера лугового

2.10. Анализ таблеток фитосубстанции клевера лугового травы

2.11. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ФИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И РАЗРАБОТКА УСЛОВИЙ ЭКСТРАГИРОВАНИЯ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО ТРАВЫ

3.1. Товароведческий анализ клевера лугового травы

3.2. Изучение макро- и микроэлементного состава клевера лугового травы

3.3. Оценка стабильности количественного содержания флавоноидов в природных популяциях клевера лугового травы, произрастающего на одной широте

3.4. Определение условий проведения реакции комплексообразования флавоноидов клевера лугового травы с 2 % раствором алюминия хлорида

3.5. Изучение влияния факторов на процесс извлечения БАВ флавоноидной природы клевера лугового травы

3.5.1. Выбор экстрагента для извлечения БАВ

3.5.2. Выбор метода экстракции для получения извлечения из клевера лугового травы

3.5.3. Оптимизация процесса экстрагирования БАВ флавоноидной природы методом ультразвуковой экстракции

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФИТОСУБСТАНЦИИ (ОЧИЩЕННОГО КОМПЛЕКСА ФЛАВОНОИДОВ) ИЗ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО ТРАВЫ

4.1. Разработка технологии фитосубстанции из клевера лугового травы

4.2. Изучение элементного состава фитосубстанции из клевера лугового травы

4.3. Стандартизация фитосубстанции клевера лугового травы

4.4. Изучение состава индивидуальных флавоноидов в фитосубстанции

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТАБЛЕТОК С ФИТОСУБСТАНЦИЕЙ ИЗ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО ТРАВЫ

5.1. Разработка состава и технологии таблеток с фитосубстанцией из клевера лугового травы с применением методов планирования эксперимента и инструментов QbD

5.2. Стандартизация таблеток с фитосубстанцией из клевера лугового травы

ГЛАВА 6. ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФИТОСУБСТАНЦИИ (КОМПЛЕКСА ФЛАВОНОИДОВ) ТРАВЫ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО

6.1. Изучение острой токсичности фитосубстанции травы клевера лугового

6.2. Изучение антигипоксической активности фитосубстанции травы клевера лугового

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии лекарственного средства с фитосубстанцией из клевера лугового травы»

Актуальность темы исследования.

Согласно данным экспертов ВОЗ, фитопрепараты применяются в лечении примерно 75% больных.

По сравнению с синтетическими препаратами фитопрепараты имеют некоторые преимущества: они обладают широким спектром действия, низкой токсичностью. Действие фитопрепаратов обусловлено составом биологически активных соединений, входящих в растения, на основе которых они созданы (флавоноиды, эфирные масла, полисахариды, дубильные вещества и т.д.).

Клевер луговой или клевер красный (Trifolmm pratense L.) является перспективным лекарственным растением рода клевера (Trifolmm L.). Он использовался в народной медицине для лечения различных заболеваниях и также широко применяется в официальной медицине. В практической медицине трава клевера все шире используется для получения лекарственных средств, обладающих гиполипидимическим, антисклеротическим, сосудоукрепляющим,

противовоспалительным, желчегонным, диуретическим, противоязвенным, регенирирующим функцию печени действиями.

Одним из направлений в создании продуктов природного происхождения является выделение индивидуальных активных веществ и их очищенных комплексов из растительного сырья. В качестве фитосубстанции в технологии фитопрератов применяют как индивидуальные активные вещества, так и очищенный копмлекс БАВ. В связи с этим перспективным представляется разработка технологии получения комплекса флавоноидов клевера лугового травы в виде очищенного экстракта с целью разработки лекарственных средств на основе данной фитосубстанции.

Степень разработанности темы исследования. Фитохимическийсостав и фармакологическая активность биологически активных соединений клевера лугового были широко изучены: Oleszek W., Jurzysta M. (1986); Cassady J. M., Zennie T. M., Chae Y. H. (1988); Blakesmith S. J., Lyons-Wall P. M., George C. е! al. (2003); Tice J. A., Ettinger B., Ensrud K. et al. (2003); Nestel P., Cehun M.,

Chronopoulos A. et al. (2004); Beck V., Rohr U., Jungbauer A. (2005); Booth N. L., Piersen C. E., Banuvar S. et al. (2006); Occhiuto F., De Pasquale R., Guglielmo G. et al. (2007); Chedraui P., San Miguel G., Hidalgo L. et al. (2008); Сорокин В. В. (2009); Kaurinovic B., Popovic M., Vlaisavljevic S. et al. (2012); Esmaeili A. K., Taha R. M., Banisalam B. et al. (2013).

В связи с содержанием широкого спектра биологически активных веществ клевера лугового актуальным является разработка фитопрепаратов на основе очищенного комплекса флавоноидов. Технологии получения фитосубстанции из клевера лугового травы и таблеток на ее основе предлагаются впервые.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась разработка состава и технологии лекарственного средства на основе фитосубстанции из клевера лугового травы.

Для реализации данной цели необходимо решить следующие основные задачи:

1. Изучить числовые и технологические показатели качества клевера лугового травы. Определить фитохимический состав и количественное содержание доминирующих групп биологически активных веществ изучаемого сырья.

2. Исследовать особенности и установить закономерности экстрагирования клевера лугового травы различными экстрагентами. Определить влияние параметров экстрагирования на выход соединений флавоноидной природы из лекарственного растительного сырья и определить режимы экстрагирования.

3. Разработать технологию получения комплекса флавоноидов клевера лугового травы. Изучить технологические свойства полученной фитосубстанции и провести стандартизацию по показателям качества.

4. Разработать состав и технологию таблеток с фитосубстанцией клевера лугового травы. Предложить для стандартизации основные показатели качества. Определить срок годности полученной лекарственной формы.

5. Предложить технологическую схему получения таблеток, содержащих комплекс флавоноидов клевера лугового травы.

6. Изучить фармакологическую активность фитосубстанции из клевера лугового травы.

Научная новизна исследования.

1. Впервые разработаны режимы экстрагирования суммы флавоноидов и изофлавоноидов из клевера лугового травы методом ультразвуковой экстракции.

2. Впервые проведена оценка качественного и количественного состава БАВ, а также минерального состава сырья и полученной фитосубстанции клевера лугового методом АЭС - ИСП. Изучен фитохимической состав фитосубстанции. В полученном комплексе БАВ из клевера лугового идентифицированы и количественно определены индивидуальные изофлавоны: дайдзеин (0,36±0,01 %) , генистеин (0,84±0,01 %), формононетин (3,02±0,05 %), прунетин (0,22±0,01 %) и биоханин А (1,62±0,03 %).

3. С применением статистического программного пакета JMP разработан оптимальный состав таблеток с фитосубстанцией клевера лугового травы. Изучено влияние вспомогательных веществ на технологические и физико-химические показатели качества таблеток.

4. Впервые проведено изучение биологической активности фитосубстанции травы клевера лугового.

Теоретическая и практическая значимость.

1. Исследованы особенности и установлены закономерности экстрагирования клевера лугового травы различными водно-спиртовыми экстрагентами. С использованием УФ-спектрометрии установлено, что наилучшим экстрагентом, позволяющим извлечь максимальную сумму флавоноидов и изофлавоноидов с минимальным выходом балластных веществ является этиловый спирт в концентрации 75%.

2. Опреден минеральный состав методом АЭС - ИСП в траве и в фитосубстанции из клевера лугового. Обнаружено 11 элементов с максимальным содержанием Са, Mg и К, которые можно рассматривать как основные минеральные элементы. В фитосубстанции травы клевера лугового были обнаружены эссенциальные элементы: К, Са, Fe, Mg, 7п. Общее содержание

тяжелых металлов и мышьяка в траве и в фитосубстанции удовлетворяет требованиям ГФ XIV ОФС.1.5.3.0009.15.

3. Разработана технология получения очищенного комплекса флавоноидов клевера лугового травы с содержанием не менее 25,3±1,3% флавоноидов в пересчете на рутин и 45,3±1,5% изофлавоноидов в пересчете на ононин

4. Разработана технология таблеток на основе фитосубстанции клевера лугового травы. Предложены основные показатели качества.

5. Предложена технологическая схема получения таблеток на основе фитосубстанции клевера лугового травы. Разработаны проекты НД (спецификации качества) на полупродукт - фитосубстанцию клевера лугового травы и лекарственное средство - таблетки.

6. Изучена острая токсичность фитосубстанции из клевера лугового травы методом фиксированной дозы. Определено, что исследуемый образец относится к 5-му классу токсичности и является нетоксичным веществом. Установлено, что фитосубстанция из клевера лугового травыобладает умеренно выраженным антигипоксическим эффектом.

Материалы по разработке технологии экстрагирования, получения и стандартизации фитосубстанции из клевера лугового травы используются в учебном процессе ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России в лекционном курсе и практических занятиях дисциплины «Технология фитопрепаратов» факультета промышленной технологии лекарств по направлению подготовки 18.03.01 «Химическая технология. Произвоство готовых лекарственных средств», квалификация - прикладной бакалавр (Акт внедрения от 15.06.2020 г.).

Технологии получения фитосубстанции - очищенного комплекса флавоноидов клевера лугового травы и таблеток на основе фитосубстанции были апробированы в лабораторных условиях ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации». Полученные опытные партии фитосубстанциии из клевера лугового травы и таблеток на ее основе по показателям качества соответствовали требованиям разработанных НД (спецификаций качества) (Акт апробации от 11.06.2020 г.).

Методология и методы исследования. Обоснованность результатов диссертационной работы подтверждается тем, что в ней использованы современные методы исследования, аппаратурное и приборное оснащение.

При выполнении работы использованы физико-химические, фитохимические, технологические, биофармацевтические и фармакологические методы исследований. Статистическую обработку результатов исследований проводили с применением программ JMP, а также стандартных компьютерных программ Excel в соответствии с требованиями ГФ XIV.

Степень достоверности и апробация результатов.

Достоверность полученных результатов определяется воспроизводимостью данных, использованием современных фитохимических, физико-химических, технологических и фармакологических методов исследования, большим объемом используемой информации. Обоснованность достоверность научных положений, выводов и рекомендаций основана на соответствующем литературном и экспериментальном материале.

Основные результаты работы диссертации доложены и обсуждены на VIII, IX и X Всероссийских научных конференциях студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего», Санкт-Петербург, 2018г., 2019г., 2020г.; XXIII Международном конгрессе "Фитофарм-2019", Санкт-Петербург, 2019г.; VI и VII Всероссийских научно-практических конференциях с международным участием «Инновации вздоровье нации», Санкт-Петербург, 2018г., 2019г.; II Международной нaучно-прaктичeской юбилейной конференции «Гармонизация подходов к фармацевтической разработке», Москва, 2019г.; VII научной конференции с международным участием «Современные тенденции развития технологий здоровьесбережения», Москва, 2019г.

Связь задач исследования с планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России по теме «Разработка технологий производства, методов анализа, стандартизации и

фармакологической оценки лекарственных растений, новых или модифицированных фармацевтических субстанций и препаратов» (государственная регистрация №01201252028).

Положения, выносимые на защиту:

1. Режимы экстрагирования суммы флавоноидов и изофлавоноидов из клевера

лугового травы методом ультразвуковой экстракции.

2. Технология получения фитосубстанции - комплекса флавоноидов клевера лугового травы с содержанием не менее 25,3±1,3% флавоноидов в пересчете на рутин и 45,3±1,5% изофлавоноидов в пересчете на ононин и показатели качества фитосубстанции.

3. Результаты исследований по разработке состава таблеток с фитосубстанцией из клевера лугового травы с применением статистического программного пакета JMP.

4. Технологическая схема получения таблеток с фитосубстанцией клевера лугового травы. Разработанная НД (спецификация качества) на лекарственное средство - таблетки на основе фитосубстанции из клевера лугового травы.

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных результатов. Поиск, систематизация, обобщение и анализ литературных данных, осуществление экспериментальной работы, анализ полученных результатов, оформление их в виде научных публикаций выполнены автором самостоятельно. Личный вклад автора составил не менее 85 %

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационная работа соответствует паспорту специальности 14.04.01 -Технология получения лекарств, а именнопункту 3 - разработка технологии получения субстанции и готовых лекарственных форм, пункту 4 -исследования поизучению особенностей технологии получения готовых лекарственных форм из различных видов субстанций, сырья и вспомогательных веществ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки России».

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов иметодов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 150 страницах машинописноготекста, содержит 24 таблиц и 25 рисунок. Список литературы включает 126 источников, в том числе 75 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Использование растений в качестве лекарств имеет давнюю историю [111]. Согласно данным экспертов ВОЗ, фитопрепараты применяются в лечении примерно 75% больных [15]. По сравнению с синтетическими препаратами фитопрепараты имеют некоторые преимущества: они обладают широким спектром действия, низким токсичностью и, что очень важно, дешевле [51].

Действие фитопрепаратов обусловлено составом биологически активных соединений, входящих в растения, на основе которых они созданы (флавоноиды, эфирные масла, полисахариды, дубильные вещества и т.д.) [40]. При этом, 60% противоопухолевых и противоинфекционных препаратов, которые уже имеются на рынке или проходят клинические испытания, имеют природное происхождение [100].

Клевер (Trifolium L.) является одним из самых важных родов семейства бобовых (Leguminosae или Fabaceae), как с точки зрения его сельскохозяйственной ценности, так и распространенности. Клевер произрастает в умеренных и субтропических областях обоих полушарий [102].

Клевер луговой содержит значительные количества флавоноидов, особено четырех эстрогенных изофлавонов: формононетинов, биоханинов А, дайдзейнов и генистеинов. Кроме того, клевер луговой содержит тритерпеновые сапонины, водорастворимые полисахариды, кумарины, (+)-пинитол и другие вещества [17, 25, 96, 98].

Биологически активные добавки клевера лугового применяют для долгосрочного использования в качестве фитоэстрогена и «естественной» формы заместительной гормональной терапии; для профилактики и вспомогательного лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы [17, 58].

1.1. Фитохимическая характеристика клевера лугового

Рисунок 1.1. - Trifolium pratense L. Клевер луго вой или клевер красный (Trifolium pratense L.) - представитель

рода клевера (Trifolium), семейства Бобовые (Fabaceae).

Клевер луговой - многолетнее травянистое растение высотой до 40 см.

Главный стебель ветвистый. Листья тройчатые. Соцветия головки рыхлые,

шаровидные. Венчик от светло-розового до пурпурного цвета [13]. Плод -

яйцевидный, односемянный боб. Цветёт в июне - сентябре. Плоды созревают в

августе - октябре [18].

Клевер луговой распространен во многих регионах Европы, Азии. В России

встречается в европейской части, на Северном Кавказе, в Сибири. Растет на

суходольных и пойменных лугах, в светлых лесах, особенно на опушках и полянах,

среди кустарников [13].

В качестве ЛРС заготавливают траву клевера лугового.

1.2. Химический состав травы клевера лугового

1.2.1. Флавоноиды

Клевер луговой, богатый флавоноидами различных групп: изофлаваны, изофлавоны, изофлаваноны, флавонолы, птерокарпаны и их гликозиды. Многие

флавоноиды и изофлавоноиды, а также их гликозиды, их. гликозиды манонаты и их ацетилгликозиды были обнаружены. в траве клевера лугового.

В 1953 году был изолирован биоханин А из экстрактов красного клевера. В 1965 году показано, что и формононетин присутствует как гликозид в красном клевере [102].

В 2000г. из цветков и листьев клевера лугового идентифицировано восемь флавоноидов гликозидов малонатов: трифозид-6''-0-малонат (1), 3-метилкверцетин-7-0-Р-В-глюкозид-6"-0-малонат (2), ирилон-4'-0-Р-Б-глюкозид-6''-0-малонат (3), генистин-6''-0-малонат (4), биоханин А-7-0-Р-0-глюкозид-6"-0-малонат (5), изокверцитрин-6''-0-малонат (6), формононетин-7-0-Р-Б-глюкозид-6''-0-малонат (7), пратенсеин-7-0-Р-0-глюкозид-6'-0-малонат (8) и среди них 1, 2 и 3 являются новыми соединениями [33, 84].

В 2001г. из клевера лугового травыбыли идентифицироваы с помощью методов ВЭЖХ - масс-спектрометрии в сочетании с двухстадийной твердофазной экстракцией: дайдзин-6''-0-малонат, генистин-6''-0-малонат, оробол-7-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-малонат, 3-метилоробол-7-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-малонат, каликозин-7-0-Р-0-глюкозид-6"-0-малонат, пратенсеин-7-0-Р-0-глюкозид-6'-0-малонат, псевдобаптигтин-7-0-Р-0-глюкозид-6"-0-малонат,

формононетин-7-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-малонат, ирилон-4'-0-Р -Б-глюкозид-6"-0-малонат, афроморзин-7-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-малонат, биоханин А-7-0-Р-Б-глюкозид-6''-0-малонат, тексазин-7-0-Р-0-глюкозид-6"-0-малонат, 5,7,2'-тригидрокси-6-метоксиизофлавон-7-0-0-глюкозид-6"-0-малонат, прунетин-4'-0-Р-0-глюкозид-6"-0-малонат и дайдзин-6''-0-ацетат, формононетин-7-0-Р-0-глюкозид-6''-0-ацетат, псевдобаптигенин-7-0-Р-В-глюкозид-6"-0-ацетат, ирилон-4'-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-ацетат, биоханин А-7-0-Р-Б-глюкозид-6"-0-ацетат и прунтин-4'-0-Р-В-глюкозид-6"-0-ацетат. Из этих двадцати соединений шесть ацетилгликозидов и восемь изофлавонгликозидов малонатов были первые идентифицированы в луговом клевере [33, 81].

Из надземной и подземной частей клевера лугового были выделены четыре известных изофлавона: прунетин, генистеин, формононетин и прунетин-4'-О-Р-О-глюкопиранозид, а также три новых галактозида изофлавоноидов: генистеин-7-О-в-О-галактопиранозид, инермин-3-О-в-О-галактопиранозид и формононетин-7-О-в-О-галактопиранозид методом колоничной хромматографии с силикагелем. Структура этих соединений установлена методами УФ-, ИК-, 1Н- и 1зС-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии [16, 17, 33].

С использованием методов УФ-спектрофотометрии и масс-спектрометрии были идентифицированы в цветках клевера лугового шесть соединений флавоноидов: кемпферол-3-гликозид, кверцетин, изорамнетин, генистеин, биоханин, формононетин [33, 36].

В 2014 г. впервые был разработан и утвержден высокоселективный и чувствительный метод жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии для одновременного определения трех изофлавонов ононина, формононетина и биоханина А в плазме крысы с использованием лизонотина в качестве внутреннего стандарта после внутрижелудочного введения экстракта клевера лугового [122].

Таблица 1.1. Структурные формулы флавоноидов клевера лугового

№ Название Структурная формула

1 Биоханин А он о И. ^^ ОСНз

2 Генистеин но^^ он о ^^ он

3 Дайдзеин

4 Формононетин но. о Ч Х^ОСНз

5 Ононин <3|с'/ " ^^________^_______________

6 Кверцетин он о

7 Рутин но^ он о 0-&с-0-К|1а

1.2.2. Водорастворимые полисахариды.

Изучен моносахаридный состав водорастворимых полисахаридов, выделенных из травы клевера красного и установлено, что они состоят из 5 основных компонентов (PS62-1 - PS62-5). Основными мономерными звеньями PS62-1 являются D-галактоза (20,08%) и D-глюкоза (75,68%); остатки D-рамнозы (0,35%), D-ксилозы (0,5%) и D-арабинозы (1,84%) присутствуют в минорных количествах. Основные мономерные единицы PS62-2 - остатки D-галактозы (27,97%) и D-глюкозы (72,04%). Основные мономерные звенья PS62-3 - остатки рамнозы (15,52%), галактозы (33,16%) и галактуроновой кислоты (38,75%); содержание арабинозы - 3,47%, глюкозы - 4,14% и ксилозы - 4,95%. Основные мономерные звенья полисахарида PS62-4 - остатки галактуроновой кислоты (25,57%), рамнозы (37,1%) и галактозы (37,32%). Основные мономерные единицы PS62-5 - остатки рамнозы (32,02%) и галактозы (67,98%) [25].

1.2.3. Тритерпеновые сапонины

Кристаллические сапонины были выделены из корней красного клевера. Они представляли собой смесь двух гликозидов, не проявляющих гемолитической или фунгистатической активности. Кислотный гидролиз этих сапонинов давал соясапогенолы B, C, D, E и F и рамнозу, ксилозу, арабинозу, глюкозу и глюкуроновую кислоту в качестве компонентов сахара. Они плохо или не растворимы в воде и хорошо растворимы в этаноле [96].

1.2.4. Летучие органические соединения

Летучие органические соединения изучены методами газовой хроматографии и газовой хроматографии / масс-спектроскопии. В результате обнаружено, что наиболее распространенными идентифицированными соединениями в зеленом образце красного клевера являются: 3-октанол (3,44%), 6,10,14-триметил-2-пентадеканон (3,46%), бензальдегид (3,74%), -Р-кариофиллен (4,05%), Р-фарнезин (4,86%), 3-метил-1-бутанол (5,73%) и 3-октанон (со-элюирование с 6-метил-5-гептен-2-оном) с 8,60%. В сене красного клевера фенилэтиловый спирт (2,28%), ^)-Р-кариофиллен (2,65%), Р-фарнезин (10,4%) и 6,10,14-триметилпентадеканон (11,8%) относятся к числу наиболее распространенные идентифицированные соединения. В силосе красного клевера наиболее распространенными соединениями являются: этилгексаноат (со -элюирование c 3-октанолом) с 3,51%, фенилэтиловый спирт (со-элюирование с линалоолом) с 3,69%, 3-метилбутилбутаноат (3,77%), 3-метил-1-бутанол (5,06%),

3-метилбутановую кислоту (со-элюирование с 3-метил-1-бутанолацетатом) с 6,73% и этил 2-метилпентаноат (со-элюирование с бензальдегидом) с 6,83% [69].

1.2.5. Липиды

Липиды в листьях клевера лугового фракционировали хроматографией на колонках диэтиламиноэтилцеллюлозы с получением предварительного разделения липидных смесей. В составе фракции были воски (23%), галактолипиды (25%) и фосфолипиды (52%). Состав фосфолипидов (молярные пропорции) составлял: фосфатидилхолин, 37%; фосфатидилглицерин, 23%; фосфатидилэтаноламин, 15%; фосфатидилинозитол, 2%; охарактеризованные кислотные соединения, 13%; другие неизвестные соединения, 10%. Показано, что ацетон-растворимые липиды в листьях красного клевера содержат незначительные количества сложных эфиров стеролов, триглицеридов, диглицеридов, свободных стеролов и углеводородов. Эти липиды присутствуют в пределах 0,57%, 1,50%, 0,60%, 0,80% и 0,38% от общего объема экстракта соответственно [114, 115].

1.2.6. Витамины

В зеленом массе содержатся следующие витамины: аскорбиновая кислота, тиамин, рибофлавин, каротин, токоферол [18].

1.2.7. Кумарины

Используя технологию ЖХ-МС, обнаружены куместрол, фраксидин, ксантотоксол, дафлоретин и скополетин в экстракте красного клевера [98].

Н3СО,

1.3.

Рисунок 1.3. - Структурные формулы куместрола и скополетина Фармакологические свойства растительной субстанции клевера лугового

1.3.1. Эстрогенная активность

Эстрогенная активность красного клевера в основном обусловлена изофлавонами. Изофлавоны (формононетин, биоханин А, генистеин и дайдзеин)

присутствуют в красном клевере в виде гликозидов и малонатов, которые гидролизуются в кишечнике кишечной флорой и слизистыми клетками [54].

Эстрогенная активность отдельных изофлавонов, содержащихся в красном клевере, различна. Определена эстрогенная активность отдельных изофлавонов (биоханинов А, генистеинов, дайдзеинов и формононетинов). Из четырех тестируемых изофлавонов, генистеин представляет собой соединение с наивысшей эстрогенной активностью на обоих рецепторах эстрогена [54].

1.3.2. Влияние на липидный и углеводный обмен

Диабет и ожирение являются самой большой проблемой общественного здравоохранения в XXI веке. Около 80% - 90% пациентов с диабетом типа II также диагностируются как ожирение. Показано, что диабет влияет на эффективность абсорбции холестерина. По этой причине диабетические пациенты часто страдают от высокого уровня холестерина в крови [110].

Было учтановлено, что эстрогены снижают общий уровень холестерина в плазме и ЛПНП-холестерин, возможно, из-за повышения регуляции активности ЛПНП-рецептора и повышения уровня холестерина ЛПВП, вероятно, печеночной липазы и увеличить синтез аполипопротеина Ai. Аналогично, изофлавоны также были связаны с повышающей регуляцией ЛПНП-рецепторов и увеличенным синтезом аполипопротеина Ai [57].

На эксперименты in vitro показано, что красный клевер, богатый источник флавоноидов, способен ингибировать ключевые ферменты, участвующие в переваривании углеводов, такие как а-амилаза и в-глюкозидаза[110].

Установлено, что добавка изофлавона, полученная из красного клевера, является альтернативным терапевтическим вариантом длягрупп высокого риска, таких как женщины впостменопаузе с повышенным индексом массы тела и аномальным профилем липидом [63].

Обширные исследования показали, что биоханин A обладает значительным гиполипидемическим эффектом [117].

1.3.3. Влияние на остеопороз

Остеопороз - это группа синдромов, характеризующаяся уменьшением массы и плотности костной ткани. Снижение эстрогенов у женщин в постменопаузе, по меньшей мере, частично связано с увеличением хрупкости костей и, следовательно, с частотой переломов скелета. Эпидемиологические данные показывают, что диета, богатая фитоэстрогенными изофлавонами, связана с низкой частотой менопаузальных симптомов, остеопорозом, деменцией от болезни Альцгеймера, сердечно-сосудистыми заболеваниями и раком у женщин [126].

1.3.4. Антиоксидантные и нейропротективные свойства

Показано, что водные и этилацетатные экстракты листьев клевера лугового проявляют сильную антиоксидантную активность по сравнению со стандартами (бутилированным гидроксианизолом и бутилированным гидрокситолуолом — известными синтетическими антиоксидантами). Поэтому представляется перспективным рассматривать эти экстракты как новый ценный источник для фармацевтических препаратов в продвижении здоровья в качестве коммерческих лекарств [78]. Было обнаружено, что клевер луговой и / или гинкго билоба показали сильную антиоксидантную активность и защитные эффекты против нейротоксичности, вызванной арсенитом натрия. Кроме того, отмечается, что присутствие комбинации гинкго билоба и клевера лугового показало лучшие защитные эффекты против его нейротоксичности по сравнению с каждым из них в отдельности [52].

1.3.5. Противомикробная активность

Растения являются богатым источником эффективных и безопасных лекарств, которые часто используются при лечении различных заболеваний. Есть много опубликованных отчетов из разных стран в мире о антимикробных свойствах лекарственных растений, и в результате растения по-прежнему признаны основой современной медицины для лечения инфекционных заболеваний [68].

Антимикробная эффективность экстрактов, полученных из клевера лугового была протестирована на четырех бактериальных патогенах ( Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Bacillus cereus) и три грибковых патогенов: Aspergillus niger, Candida albicans и Fusarium verticillioides. Результаты показали, что все экстракты являются мощными противомикробными средствами против трех штаммов бактерий и двух изученных грибковых [68].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Нгуен Тхи Шен, 2020 год

- С. 21.

12. Государственная фармакопея РФ XIV издание. Том 1-4. - Москва, 2018. Режим доступа: http://femb.ru/femb/pharmacopea.php

13. Губанов, И. А. Иллюстрированный определитель растений средней России / И. А. Губанов, К. В. Киселева, В. С. Новиков, В. Н. Тихомиров. - Москва, 2003. - Т. 2. - 668с

14. Гумеров, Ф. М. Суб- и сверхкритические флюидные среды в пищевой, парфюмерной и фармацевтической отраслях промышленности / Ф. М. Гумеров, Л. Ю. Яруллин, N. H. Truong и др. // Вестник технологического университета. - 2017. -Т. 20. - №. 8. - С. 30-35.

15. Джавахян, М. А. Теоретические и экспериментальные аспекты создания лекарственных препаратов с субстанциями растительного происхождения в мягких лекарственных формах : дис......докт. фарм. наук / М. А. Джавахян. - Москва, 2018.

- 322 c.

16. Дренин, А. А. Флавоноиды и изофлавоноиды трех видов растений

родов Trifolium L. И Vicia L.: дис......канд. хим. наук / А. А. Дренин . - Сургут,

2008. - 109 c.

17. Дренин, А. А. Новый гликозид изофлавона из Trifolium pratense L. / А. А. Дренин, Э. Х. Ботиров, Ю. П. Туров // Химия растительного сырья. - 2010.

- № 6. - C. 53-56.

18. Дудченко, Л. Г. Пряно-ароматические и пряно-вкусовые растения: Справочник / Л. Г. Дудченко, А. С. Козьяков, В. В. Кривенко // К.: Наук. думка, 1989. 304 с.: ил. Библиогр.: с. 259- 271.

19. Евсеева, О. С. Разработка и валидация методики количественного определения флавоноидов в некоторых видах рода Citrus / О. С. Евсеева, О. А. Андреева, Э. Т. Оганесян // Научные ведомости БелГУ. Серия: Медицина. Фармация. - 2013. - №. 25. - С. 168.

20. Емшанова, С. В. Методологические подходы к выбору вспомогательных веществ для получения таблетированных препаратов методом прямого прессования / С. В. Емшанова // Химико-фармацевтический журнал. -2008. - Т. 42. - №. 2. - С. 38-43.

21. Еремеева, Н. Б. Влияние технологии экстракции на антиоксидантную активность экстрактов плодов черноплодной рябины / Н. Б. Еремеева, Н. В. Макарова // Вестник МГТУ. - 2017. - Т. 20, - №. 3. - С. 600-608.

22. Зибарева, Л. Н. Влияние ультразвукового воздействия на экстракцию биологически активных соединений растений семейства Caryophyllaceae / Л. Н. Зибарева, Е. С. Филоненко // Химия растительного сырья. - 2018. - №. 2. - С. 145151.

23. Зуев, А. П. Разработка совстава и технологии таблеток карведиола / А. П. Зуев, Н. П. Садчикова, И. И. Тюляев и др. // Химико-фармацевтический журнал. -2003. - Т. 37. - №. 11. - С. 29-33.

24. Коновалов, А. И. Способ получения рутина. Российская Федерация патент RU2041232C1 / А. И. Коновалов, Е. Н. Офицеров, А. Н. Карасева. Опуб. 09.08.1995. Available at: https://patents.google.com/patent/RU2041232C1/ //.

25. Корж, А. П. Химический состав водорастворимых полисахаридов из клевера лугового травы(Тп1Ышт Pratense L.) / А. П. Корж, А. М. Гурьев, М. В. Белоусов, М. С. Юсубов // Химия растительного сырья. - 2011. - № 1. - С. 47-50.

26. Корулькин, Д. Ю. Природные флавоноиды / Д. Ю. Корулькин, Ж. A. Абилов, Р. А. Музычкина, Г. А. Толстиков. - Новосибирск: Академическое изд-во "Тео", 2007. - 232 с.

27. Куркина, А. В. Флавоноиды фармакопейных растений: монография / А.В. Куркина // Самара: ООО "Офорт", ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. - с. 290.

28. Лекарь, А. В. Извлечение биофлавоноидов из шелухи лука в среде субкритической воды / А. В. Лекарь, О. В. Филонова, С. Н. Борисенко и др. // Сверхкритические флюиды: Теория и Практика. - 2012. - Т. 7. - №. 4. - С. 4-15.

29. Лефтерова, М. И. Влияние способа таблетирования на качество таблеток антигистаминного препарата последнего поколения. / М. И. Лефтерова, С. С. Камаева, А. Н. Анисимов и др. // Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения. - 2013. - №. 2. - Р. 642-643.

30. Ломако, Е. В. Экстракция флавоноидов из лекарственного растительного сырья водными растворами поверхностно-активных веществ / Е. В. Ломако, Н. А. Кузьмичева // Электронный сборник статей по материалам XV студенческой международной научно-практической конференции. - Новосибирск: Изд. «СибАК» [электронный ресурс]. - 2014. - T. 15. - № 1. - С. 97-101. - Режим доступа: https://sibac .info/archive/nature/ 1(15).pdf.

31. Лукьянова, Л. Д. Методические рекомендации к экспериментальному изучению препаратов, предназначенных для клинического изучения в качестве антигипоксических средств / Л. Д. Лукьянова. - М., -1990. - С. 18

32. Миназова, Г. И. Тонкослойная хроматография в анализе природного сырья / Г. И. Миназова // Башкирский химический журнал. - 2010. - Т. 17. - №. 3. - С. 105-107.

33. Нгуен, Т. Ш. Подходы к получению субстанций индивидуальных флавоноидов из клевера лугового травы (обзор) / Т. Ш. Нгуен, И. Е. Каухова, В. В. Сорокин // Сборник материалов VIII Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация -потенциал будущего», г. Санкт-Петербург, 23-24 апреля 2018 г. - СПБ: Изд-во СПХФУ, 2018. - С. 473-475.

34. Нгуен, Т. Ш. Определение элементного составаклевера лугового травы(Trifolшm pratense L.) / Т. Ш. Нгуен, З. Р. Дитковская, Ю. Э. Генералова и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2020. - Т. 23. - №. 2. - С. 3-8.

35. Нгуен, Т. Ш. Определение содержание изофлавонов в сухом экстракте клевера лугового травыметодом ВЭЖХ / Т. Ш. Нгуен, Г. М. Алексеева, Ю. Э. Генералова и др. // Вопросы обеспечения качества лекарственных средств. - 2020.

- Т. 27. - №. 1. - С. 48-53.

36. Новиков, О. О. Изучение флавоноидного состава цветков клевера лугового / О. О. Новиков, Д. И. Писарев, В. Н. Сорокопудов и др. // Серия Естественные науки. - 2010. - Vol. 92. -№. 21. - P. 113-117.

37. Новикова, Е. К. Разработка состава и технологии лекарственного средства на основе композиции сухих экстрактов череды трехраздельной

травы, золотарника канадского травы, репешка обыкновенного травы: дис......

канд. фарм. наук / Е. К. Новикова. - СПБ, 2019. - 163 с.

38. Оковитый, С. В. Антигипоксанты в современной клинической практике / С. В. Оковитый, Д. С. Суханов, В. А. Заплутанов, А. Н. Смагина // Клиническая медицина. - 2012. - №. 9. - С. 63-68.

39. Подолина, Е. А. Ультразвуковая экстракция и УФ-спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов и дубильных веществ в надземной части василька синего / Е. А. Подолина, М. А. Ханина, О. Б. Рудаков, А. Е. Небольсин // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2018. - №. 2.

- С. 28-35.

40. Русакова, О. А. Изучение аптечного ассортимента фитопрепаратов / О. А. Русакова, И. В. Ральченко, И. Я. Герберт, С. И. Вердиева // Фармация и фармакология. - 2015. - T. 13. - №. 6. - С. 54-59.

41. Свиридов, И. В. Антигипоксические свойства сухого экстракта из корней Serratula centauroides / И. В. Свиридов, Я. Г. Разуваева, Л. Н. Шантанова // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2014. - Т. 100. - №. 6. - С. 77-79.

42. Сорокин, В. В. Экстрагирование растительного сырья системами ограниченно смешивающихся растворителей в технологии сухих экстрактов на

примере зверобоя продырявленного и клевера лугового: дис......канд. фарм.

наук / В. В. Сорокин. - СПБ, 2009. - 198 с.

43. Сухих, А. С. Применение сорбента универсального назначения сефадекса LH-20 в современных медико- биологических исследованиях / А. С. Сухих, П.В. Кузнецов // Медицина в Кузбассе. - 2009. - №. 4. - P. 3-12.

44. Федосеева, Л. М. Состав флавоноидов щавеля кислого травы, заготовленной на территории Алтайского края [электронный ресурс] / Л. М. Федосеева, Г. Р. Кутателадзе // Молодой ученый. - 2019. - №. 34. - С. 33-36. -Режим доступа: https://moluch.ru/archive/272/62076/ (дата обращения: 26.03.2020).

45. Хабибулина, Н. В. Изучение процесса получения и очистки фракции соевых изофлавоноидов совместно с изолятом белка сои / Н. В. Хабибулина // Успехи в химии и химической технологии. - 2010. - T. 11. - №. 116. - P. 46-50.

46. Хабибулина, Н. В. Получение фракций олигосахоридов и изофлавоноидов из соевой мелассы / Н. В. Хабибулина, А. А. Красноштанова, Т. М.Бикбов, В. В. Пономарев // Химия Растительного Сырья. - 2014. - T. 3. - P. 115124.

47. Хажибаев, T. A. Экстракция флавоноидов из травы Bidentis tripartite / T. A. Хажибаев, Р. М. Халилов // Химия и химическая технология. - 2018. - Т. 2018. - №. 3. - С. 72-75.

48. Цихмейстр, Е. В. Применение суб- и сверхкритических флюидов в экстракционных процессах / Е. В. Цихмейстр, Ф. М. Гумеров // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. -Т. 15. - №. 10. - С 98-99.

49. Шадрин, А.А. Разработка двухкомпонентных таблеток, содержащих

несовместимые фармацевтические субстанции: дис...... канд. фарм. наук / А.А.

Шадрин. - СПБ, 2019. - 217 c.

50. Шевлякова, О. А. ^временные способы определения и идентификации флавоноидов горянки (Epimedium) / О. А. Шевлякова, А. А. Ихалайнен, А. М. Антохин и др. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. - 2016. - Т. 57. - №. 3. -С.172-183.

51. Широкова, И. Рынок фитопрепаратов - тенденции, проблемы, прогнозы / И. Широкова // Ремедиум. - 2013. - №. 4. - С. 26-32.

52. Abdou, H. M. Prophylactic neuroprotective efficiency of co-administration of Ginkgo biloba and Trifolium pretense against sodium arsenite-induced neurotoxicity and dementia in different regions of brain and spinal cord of rats / H. M. Abdou, M. I. Yousef, D. A. El Mekkawy, A. S. Al-Shami // Food and Chemical Toxicology. - 2016. - Vol. 94. - P. 112-127.

53. Asif, U. Formulation development and optimization of febuxostat tablets by direct compression method / U. Asif, A. K. Sherwani, N. Akhtar et al. // Advances in Polymer Technology. - 2016. - Vol. 35. - №. 2. - P. 129-135.

54. Beck, V. Phytoestrogens derived from red clover: an alternative to estrogen replacement therapy?/ V. Beck , U. Rohr, A. Jungbauer // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. - 2005. - Vol. 94. - №. 5. - P. 499-518.

55. Beg, S. Pharmaceutical Quality by design Principles and applications / S. Beg, M. S. Hasnain (ed.) // Academic Press. - 2019. - 432 p. .

56. Bimakr, M. Optimization of supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid compounds from spearmint (Mentha spicata L.) leaves by using response surface methodology / M. Bimakr, R.A. Rahman, A. Ganjloo et al. // Food and Bioprocess Technology. - 2012. - Vol. 5. - №. 3. - P. 912-920.

57. Blakesmith, S. J. Effects of supplementation with purified red clover (Trifolium pratense) isoflavones on plasma lipids and insulin resistance in healthy premenopausal women / S. J. Blakesmith, P. M. Lyons-Wall, C. George et al. // British Journal of Nutrition. - 2003. - Vol. 89. - №. 4. - P. 467-474.

58. Booth, N. L. Clinical studies of red clover (Trifolium pratense) dietary supplements in menopause: a literature review / N. L. Booth, C. E. Piersen , S. Banuvar et al. // Menopause. - 2006. - Vol. 13. - №. 2. - P. 251-264.

59. Bravo, L. Analysis of flavonoids in functional foods and nutraceuticals / L. Bravo, R. Mateos // Methods of analysis for functional foods and nutraceuticals. - Boca Raton, FL : CRC Press, 2008. - C. 148-206.

60. Brodowska, K. M. . Natural flavonoids: classification, potential role, and application of flavonoid analogues / K. M. Brodowska // European Journal of Biological Research. - 2017. - Vol. 7. - №. 2. - P. 108-123.

61. Cassady, J. M. Use of a mammalian cell culture benzo (a) pyrene metabolism assay for the detection of potential anticarcinogens from natural products: inhibition of metabolism by biochanin A, an isoflavone from Trifolium pratense L. / J. M. Cassady, T. M. Zennie, Y. H. Chae et al. // Cancer research. - 1988. - Vol. 48. - №. 22. - P. 62576261.

62. Cheaib, D. Study of the selectivity and bioactivity of polyphenols using infrared assisted extraction from apricot pomace compared to conventional methods / D. Cheaib, N. El Darra, H. N. Rajha et al. // Antioxidants. - 2018. - Vol. 7. - №. 12. - P. 174.

63. Chedraui, P. Effect of Trifolium pratense-derived isoflavones on the lipid profile of postmenopausal women with increased body mass index / P. Chedraui, G. San Miguel, L. Hidalgo et al. // Gynecological Endocrinology. - 2008. - Vol. 24. - №. 11. -P. 620-624.

64. Chen, X. J. Simultaneous determination of 15 flavonoids in Epimedium using pressurized liquid extraction and high-performance liquid chromatography / X. J. Chen, B. L. Guo, S. P. Li et al. // Journal of Chromatography A. - 2007. - Vol. 1163. - №. 1-2.

- P. 96-104.

65. Chiu, K. L. Supercritical fluids extraction of Ginkgo ginkgolides and flavonoids / K. L. Chiu, Y. C. Cheng, J. H. Chen et al. // The Journal of Supercritical Fluids. - 2002. - Vol. 24. - №. 1. - P. 77-87.

66. Drenin, A. A. New genistein monogalactoside from the aerial part of Trifolium pratense / A. A. Drenin, E. Kh. Botirov, E. V. Petrulyak // Chemistry of Natural Compounds. - 2008. - Vol. 44. - №. 2. - P.178.

67. Duo-Long, D. I. Advances in application of high-speed countercurrent chromatography in separation and purification of flavonoids / D. I. Duo-Long, Y. Y. Zheng , C. H. E. N. Xiao-Fen et al. // Chinese Journal of Analytical Chemistry. - 2011.

- Vol. 39. - №. 2. - P. 269-275.

68. Esmaeili, A. K. Antimicrobial Activities of Extracts Derived from in vivo and in vitro Grown Trifolium pratense (Red clover) / A. K. Esmaeili, R. M. Taha, B. Banisalam et al. // International Journal of Environmental Science and Development. -2013. - Vol. 4. - №. 5. - P. 475-478.

69. Figueiredo, R. Volatile composition of red clover (Trifolium pratense L.) forages in Portugal: The influence of ripening stage and ensilage / R. Figueiredo, A. I. Rodrigues, M. do Céu Costa // Food chemistry. - 2007. - Vol. 104. - №. 4. - P. 14451453.

70. Gullon, B. Rutin: A review on extraction, identification and purification methods, biological activities and approaches to enhance its bioavailability / B. Gullon, T. A. Lu-Chau, M. T. Moreira et al. // Trends in food science & technology. - 2017. -Vol. 67. - P. 220-235.

71. Guo-qing, H. E. Optimization of conditions for supercritical fluid extraction of flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) / H. E. Guo-qing, X. Hao-ping, C. Qi-he et al. // Journal of Zhejiang University Science B. - 2005. - Vol. 6. - №. 10. - P. 999.

72. Huang, P. Optimization of integrated extraction-adsorption process for the extraction and purification of total flavonoids from Scutellariae barbatae herba / P. Huang , Q. Zhang , H. Pan et al. // Separation and Purification Technology. - 2017. - Vol. 175. - P. 203-212.

73. Jaisankar, P. Flavonoid natural products: chemistry and biological benefits on human health: a review / P. Jaisankar, R. L. Gajbhiye, S. K. Mahato, D. Nandi // Asian J. of Adv. Basic Sci. - 2014. - Vol. 3. - №. 1. - P. 164-178.

74. Jiang, D. Potential Anticancer Properties and Mechanisms of Action of Formononetin / D. Jiang, A. Rasul , R. Batool et al. // BioMed research international. -2019. - Vol. 2019. - 11 p.

75. Jing, C. L. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoid compounds and antioxidants from alfalfa using response surface method / C. L. Jing, X .F. Dong, J. M. Tong // Molecules. - 2015. - Vol. 20. - №. 9. - P. 15550-15571.

76. Jivraj, M. An overview of the different excipients useful for the direct compression of tablets / M. Jivraj, L. G. Martini, C. M. Thomson // Pharmaceutical science & technology today. - 2000. - Vol. 3. - №. 2. - P. 58-63.

77. José, M. S. Chromatography with Sephadex Gels / M. S. José // Analytical chemistry. - 1980. - Vol. 52. - №. 6. - P. 910-912.

78. Kaurinovic, B. Antioxidant profile of Trifolium pratense L. / B. Kaurinovic, M. Popovic, S. Vlaisavljevic et al. // Molecules. - 2012. - Vol. 17. - №. 9. - P. 1115611172.

79. Kim, K. H. Optimal recovery of high-purity rutin crystals from the whole plant of Fagopyrum esculentum Moench (buckwheat) by extraction, fractionation, and recrystallization / K. H. Kim, K. W. Lee, D. Y. Kim et al. // Bioresource technology. -2005. - Vol. 96. - №. 15. - P. 1709-1712.

80. Kishore, K. Reliability analysis with Minitab / K. Kishore, M. Surendra // CRC Press. - 2016. - P. 90-101.

81. Klejdus, B. Identification of isoflavone conjugates in red clover (Trifolium pratense) by liquid chromatography-mass spectrometry after two-dimensional solid-phase extraction / B. Klejdus, D. Vitamvasova-Sterbova, V. Kuban // Analytica Chimica Acta. - 2001. - Vol. 450. - №. 1-2. - P. 81-97.

82. Krenn, L. Inhibition of angiogenesis and inflammation by an extract of red clover (Trifolium pratense L.) / L. Krenn, D. H. Paper // Phytomedicine. - 2009. - Vol. 16. - №. 12. - P. 1083-1088.

83. Li, G. Hybrid molecularly imprinted polymers modified by deep eutectic solvents and ionic liquids with three templates for the rapid simultaneous purification of rutin, scoparone, and quercetin from Herba Artemisiae Scopariae / G. Li, W. S. Ahn, K. H. Row // Journal of separation science. - 2016. - Vol. 39. - №. 23. - P. 4465-4473.

84. Lin, L. Z. LC-ESI-MS study of the flavonoid glycoside malonates of red clover (Trifolium pratense) / L. Z. Lin, X. G. He, M. Lindenmaier et al. // Journal of agricultural and food chemistry. - 2000. - Vol. 48. - №. 2. - P. 354-365.

85. Lin, M. C. Supercritical fluid extraction of flavonoids from Scutellariae Radix / M. C. Lin, M. J. Tsai, K. C. Wen // Journal of Chromatography A. - 1999. - Vol. 830. - №. 2. - P. 387-395.

86. Lipovac, M. Effect of red clover isoflavones over skin, appendages, and mucosal status in postmenopausal women / M. Lipovac, P. Chedraui, C. Gruenhut et al. // Obstetrics and gynecology international. - 2011. - Vol. 2011. - P. 1-6.

87. Liu, J. Supercritical fluid extraction of flavonoids from Maydis stigma and its nitrite-scavenging ability / J. Liu, S. Lin, Z. Wang et al. // Food and bioproducts processing. - 2011. - Vol. 89. - №. 4. - P. 333-339.

88. Liu, Z. Analysis of chemical composition of Acanthopanax senticosus leaves applying high-pressure microwave-assisted extraction / Z. Liu, G. Yan, F. Bu et al. // Chemia analityczna. - 2005. - Vol. 50. - №. 5. - P. 851-861.

89. Liza, M. S. Supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid from Strobilanthes crispus (Pecah Kaca) / M. S. Liza, R. A. Rahman, B. Mandana et al. // Food and Bioproducts Processing. - 2010. - Vol. 88. - №. 2-3. - P. 319-326.

90. Ma, F. Y. Microwave-assisted aqueous two-phase extraction of isoflavonoids from Dalbergia odorifera T. Chen leaves / F. Y. Ma , C. B. Gu , C. Y. Li et al. // Separation and Purification Technology. - 2013. - Vol. 115. - P. 136-144.

91. Mabry, T. The systematic identification of flavonoids / T. Mabry, K. R. Markham, M. B. Thomas // Springer Science & Business Media. - 2012.

92. Maran, J. P. Box-Behnken design based multi-response analysis and optimization of supercritical carbon dioxide extraction of bioactive flavonoid compounds from tea (Camellia sinensis L.) leaves / J. P. Maran, S. Manikandan, B. Priya, P. Gurumoorthi // Journal of Food Science and Technology. - 2015. - Vol. 52. - №. 1. - P. 92-104.

93. Moraes, M. L. L. Supercritical fluid extraction of glycosylated flavonoids from Passiflora leaves / M. D. L. L. Moraes, J. H. Vilegas, F. M. Lanças // Phytochemical Analysis: An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques. -1997. - Vol. 8. - №. 5. - P. 257-260.

94. Mou, Q. Response surface optimized infrared-assisted extraction and UHPLC determination of flavonoid types from Flos Sophorae / Q. Mou, J. He, R. Yin et al. // Molecules. - 2017. - Vol. 22. - №. 6. - 12 p.

95. Ogienko, A. G. A new method of producing monoclinic paracetamol suitable for direct compression / A. G. Ogienko, E. V. Boldyreva, A. Y. Manakov et al. // Pharmaceutical research. - 2011. - Vol. 28. - №. 12. - P. 3116-3127.

96. Oleszek, W. Isolation, chemical characterization and biological activity of red clover (Trifolium pratense L.) root saponins / W. Oleszek, M. Jurzysta // Acta Societatis Botanicorum Poloniae. - 1986. - Vol. 55. - №. 2. - P. 247-252.

97. Peng, J. Efficient new method for extraction and isolation of three flavonoids from Patrinia villosa Juss. by supercritical fluid extraction and high-speed counter-current chromatography / J. Peng, G. Fan, Y. Chai, Y. Wu // Journal of Chromatography A. -2006. - Vol. 1102. - №. 1-2. - P. 44-50.

98. Piersen, C. E. Chemical and Biological Characterization and Clinical Evaluation of Botanical Dietary Supplements: A Phase I Red Clover Extract as a Model / C. E. Piersen, N. L. Booth, Y. Sun et al. // Current Medicinal Chemistry. - 2004. - Vol. 11. - №. 11. - P. 1361-1374.

99. Qian, Z. M. Rapid method for simultaneous determination of flavonoid, saponins and polyacetylenes in Folium ginseng and Radix ginseng by pressurized liquid extraction and high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection and mass spectrometry / Z. M. Qian, J. Lu, Q. P. Gao, S. P. Li // Journal of Chromatography A. - 2009. - Vol. 1216. - №. 18. - P. 3825-3830.

100. Rates, S. M. K. Plants as source of drugs / S. M. K. Rates // Toxicon. - 2001. - Vol. 39. - №. 5. - P. 603-613.

101. Routray, W. Microwave-assisted extraction of flavonoids: a review / W. Routray, V. Orsat // Food and Bioprocess Technology. - 2012. - Vol. 5. - №. 2. - P. 409424.

102. Sabudak, T. Trifolium L.-a review on its phytochemical and pharmacological profile / T. Sabudak, N. Guler // Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives. - 2009. - Vol. 23. - №. 3. - P. 439-446.

103. Shahat, A. A. Isolation and identification of a new flavonoid glycoside from Carrichtera annua L. seeds / A. A. Shahat , K. A. Abdelshafeek , H. A. Husseiny // Pharmacognosy research. - 2011. - Vol. 3. - №. 3. - P. 151.

104. Shan, B. Ethanol modified supercritical carbon dioxide extraction of flavonoids from Momordica charantia L. and its antioxidant activity / B. Shan, J. H. Xie,

J. H. Zhu, Y. Peng // Food and Bioproducts Processing. - 2012. - Vol. 90. - №. 3. - P. 579-587.

105. Sun, Y. J. Preparative isolation of two prenylated biflavonoids from the roots and rhizomes of Sinopodophyllum emodi by Sephadex LH-20 column and high-speed counter-current chromatography / Y. J. Sun , L. X. Pei, K. B. Wang et al. // Molecules. -2016. - Vol. 21. -№. 1. - P. 10.

106. Sundaresan, A. Biological Activity of Biochanin A: A Review / A. Sundaresan, T. Radhiga, B. Deivasigamani // Asian Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2018. - Vol. 4. - №. 1. - Р. 1-5.

107. Sutherland, I. A. Role of counter-current chromatography in the modernisation of chinese herbal medicines / I. A. Sutherland, D. Fisher // Journal of Chromatography A. - 2009. - №. 1216. - P. 740-753.

108. Tay, K. C. Formononetin: A review of its anticancer potentials and mechanisms / K. C. Tay, L. T. H. Tan, C. K. Chan et al. // Frontiers in pharmacology. -2019. - Vol. 10. - Article 820.

109. Thoorens, G. Microcrystalline cellulose, a direct compression binder in a quality by design environment—A review / G. Thoorens, F. Krier, B. Leclercq et al. // International Journal of Pharmaceutics. - 2014. - Vol. 473. - №. 1-2. - P. 64-72.

110. Tundis, R. Trifolium pratense and T. repens (Leguminosae): edible flower extracts as functional ingredients / R. Tundis, M. Marrelli, F. Conforti et al. // Foods. -2015. - Vol. 4. - №. 3. - P. 338-348.

111. Veeresham, C. Natural products derived from plants as a source of drugs / C. Veeresham // Journal of Advanced Pharmaceutical Technology & Research. - 2012. -Vol. 3. - №. 4. - P. 200-201.

112. Vian, M. A. Clean recovery of antioxidant flavonoids from onions: Optimising solvent free microwave extraction method / M. A. Vian, J. F. Maingonnat, F. Chemat // Journal of Chromatography A. - 2009. - Vol. 1216. - №. 45. - P. 7700-7707.

113. Wang, L. Optimisation of supercritical fluid extraction of flavonoids from Pueraria lobata / L. Wang, B. Yang, X. Du, C. Yi // Food chemistry. - 2008. - Vol. 108. - №. 2. - P. 737-741.

114. Weenink, R. O. Minor constituents of the acetone-soluble lipids of red-clover (Trifolium pratense) leaves / R. O. Weenink // Biochemical Journal. - 1962. - Vol. 82. -№. 3. - P. 523.

115. Weenink, R. O. Lipids of the acetone-insoluble fraction from red-clover (Trifolium pratense) leaves / R. O. Weenink // Biochemical Journal. - 1964. - Vol. 93. -№. 3. - P. 606.

116. Xiao, W. Microwave-assisted extraction of flavonoids from Radix Astragali / W. Xiao, L. Han, B. Shi // Separation and Purification Technology. - 2008. - Vol. 62. -№ 3. - P. 614-618.

117. Xue, Z. Potential Lipid-Lowering Mechanisms of Biochanin A / Z. Xue, Q. Zhang, W. Yu et al. // Journal of agricultural and food chemistry. - 2017. - Vol. 65. - №. 19. - P. 3842-3850.

118. Zhang, F. Microwave assisted extraction of rutin and quercetin from the stalks of Euonymus alatus (Thunb.) Sieb / F. Zhang, Y. Yang, P. Su, Z. Guo // Phytochemical Analysis. - 2009. - Vol. 20. - №. 1. - P. 33-37.

119. Zhang, G. Optimized ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Prunella vulgaris L. and evaluation of antioxidant activities in vitro / G. Zhang, L. He, M. Hu // Innovative food science and emerging technologies. - 2011. - Vol. 12. - №.1. - P. 18-25.

120. Zhang, H.-F. Simultaneous extraction of epimedin A, B, C and icariin from Herba Epimedii by ultrasonic technique / H.-F. Zhang, T.-S. Yang, Z.-Z. Li, Y. Wang // Ultrasonics Sonochemistry. - 2008. - Vol. 15. - №. 4. - P. 376-385.

121. Zhang, J. Purification of flavonoid from Gingko biloba extract by zinc complexation method and its effect on antioxidant activity / J. Zhang, L. Yue, K. Hayat et al. // Separation and Purification Technology. - 2010. - Vol. 71. - №. 3. - P. 273278.

122. Zhang, R. Simultaneous determination and pharmacokinetic study of three isoflavones from Trifolium pratense extract in rat plasma by LC-MS/MS / R. Zhang, S. Wang, M. Lu et al. // Biomedical Chromatography. - 2015. - Vol. 29. - №. 2. - P. 210219.

123. Zhang, Y. Macroporous resin adsorption for purification of flavonoids in Houttuynia cordata Thunb / Y. Zhang, L. I. Shufen, W. U. Xiwen , Z. H. A. O. Xing // Chinese Journal of Chemical Engineering. - 2007. - Vol. 15. - № 6. - P. 872-876.

124. Zhu, H. Analysis of flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV-vis spectrophotometry with comparative study on different extraction technologies / H. Zhu, Y. Wang, Y. Liu et al. // Food Analytical Methods. - 2010. - Vol. 3. - №. 2. - P. 90-97.

125. Xiao, H. Pharmacological Targets and the Biological Mechanisms of Formononetin for Alzheimer's Disease: A Network Analysis / H. Xiao, X. Qin, J. Wan, R. Li // Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research. - 2019. - Vol. 25. - P. 4273-4277.

126. Occhiuto, F. Effects of phytoestrogenic isoflavones from red clover (Trifolium pratense L.) on experimental osteoporosis / F. Occhiuto, R. De Pasquale, G. Guglielmo et al. // Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives. - 2007. -Vol. 21. - №. 2. - P. 130-134.

ПРИЛОЖЕНИЕ

IN5ЛЛт ОГ РНАКМАСУ

Закрытое акционерное общество "Санкт-Петербургский институт фармации"

»1

1 кхы> 1 Росс««, Лсниигрллска» обл., Вссюлижский р-н. П. Куи.моло«с«ий. 245 Телефакс <-7(812) 603-74-2» <г-1пш]_ 1лГ<миЧ1осНп|ка ш

УТВЕРЖДАЮ ГЕНЕРАЛЬНЫЙ ДИРЕКТОР

ЗА< фармации»

профессор жаров В.Г.

АКТ АПРОБАЦИИ

Технологии получения фитосубстаиции - очищенного комплекса флавоноидов клевера лугового травы и таблеток на основе фитосубстанции. разработанные аспирантом кафедры промышленной технологии лекарственных препаратов ФГБОУ ВО СПХФУ Нгуен Тхи Шен. были апробированы в лабораторных условиях ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации».

Полученные опытные партии фитосубстанции и таблеток на ее основе по показателям качества соответствовали требованиям разработанных НД (спецификаций качества).

Руководитель группы ГЛС

ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации»,

к. фарм. наук /,. \ Демченко Д.В.

УТВК

ФУ

[.А. Наркевич

Комиссия н а кг шве: Председателя

и членов комиссии

Акт внедрения результатов научней практической работы в учебный процесс

проректора по учебной работе, канд. фирм, наук, начальника учебно-

метднческого отдела начальника отдела подготовки кадров высшей квалификации, канд. биол. наук

Ю.Г. ИлЬННОВОЙ Д.С. Грицанеико И А. Титович

назначенная прнкачом ФГБОУ ВО СПХФУ Минздрава России от «03» июня 2019 г. № 234, составила акт о нижеследующем.

Результаты диссертационного исследования Нгусн Тхи Шен на тему «Разработка технологии лекарственного средства с фитосубсганпией из клевера лугового травы», представленного на соискание ученой степени кандидата фармацевтических паук, а именно: « Технология очищенного комплекса флавопоидон клевера лугового травы », «Технология и стандартизация таблеток с фитосубстанцией клевера душного травы» внедрены в учебный процесс по учебной дисциплине «Технология фитопрепаратов» в рамках программы высшего образования - программы бакалавриата но направлению подготовки 18.03.01 «Химическая технология. Производство готовых лекарственных средств» очной формы обучения.

11рсдссдатсль

ч. юны комиссии

проректор но учебной работе, канд. форм, наук

начальник учебпо- С

методического отдела начальник отдела подготовки кадрон ныешей квалификации, канд. биол. наук

Ю Г Ильилоаа Д.С. 1 рицаненко

И.А. Титович

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАЛИДАЦИОННЫХ ХАРАКТЕРИСТИК АНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ «ОСТАТОЧНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ РАСТВОРИТЕЛИ» МЕТОДОМ «ГХ» В ФИТОСУБСТАНЦИИ ИЗ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО ТРАВЫ.

В рамках выполнения валидации методики газовой хроматографии (ГХ) для определения остаточных органических растворителей в фитосубстанции из клевера лугового травы были получены и обработаны результаты по следующим параметрам: специфичность, предел количественного определения, линейность, правильность.

1. Оборудование и материалы

Аппаратура-

Газовый хроматограф, оснащенный пламенно-ионизационным детектором Clarus 680 зав.№ 680S12103101, свидетельство о поверке № 0031035 действительно до 12 марта 2021 г; весы лабораторные электронные ГОСТ 24104-2001 HTR-224-C, заводской № 29525058, свидетельство о поверке № 0028353 действительно до 09 марта 2021 г. Вспомогательное оборудование -

Капиллярная колонка Elite-5 60 м, 0,32 мм, 1 мкм;Стандартные образцы:

СОП 0007-03 СТХ состава гексана, 99,4 %, ООО «ЭКРОСХИМ», годен до 07.2021 г;

СОП 0032-03 СТХ состава этанола, 99,9 %, ООО «ЭКРОСХИМ», годен до 07.2021 г

Диметилсульфоксид для анализов, Merck, годен до 10.2020 г.

2. Приготовление стандартных и анализируемых растворов, процедура анализа

Остаточные органические растворители. Содержание этанола в субстанции должно быть не более 0,5%, содержание гексана - не более 0,029%. Определение проводят методом газовой хроматографии. Реактивы:

Диметилсульфоксид для анализов, аналогичного качества или классом выше; Стандартные образцы: СО состава гексана, 99,4%; СО состава этанола, 99,9%.

Испытуемый раствор. Около 0,10 г (точная навеска) субстанции помещают во флакон для парофазного анализа, добавляют 5,0 мл диметилсульфоксида, закрывают пробкой и герметично укупоривают.

Стандартный раствор гексана. Около 0,058 г (точная навеска) стандартного образца гексана помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

Стандартный раствор. Около 0,10 г (точная навеска) стандартного образца этанола и 1,0 мл стандартного раствора гексана помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают. Растворы используют свежеприготовленными.

5,0 мл стандартного раствора помещают во флакон для парофазного анализа, закрывают пробкой и герметично укупоривают.

Готовят не менее трех проб испытуемого образца и пяти проб стандартного раствора.

Хроматографические условия

Колонка капиллярная ЕШе-5 60м, 0,32 мм, 1 мкм (5% дифенил-95%

диметил полисилоксан),

допускается использование альтернативной колонки, удовлетворяющей требованиям пригодности хроматографической системы

Газ-носитель Температура термостата колонки

Температура инжектора Температура детектора Детектор

Парофазный дозатор

Температура

термостатирования

образца

Время

термостатирования Температура иглы Температура линии переноса

Время нагнетания Ввод пробы Давление Время

хроматографирования

азот, 2 мл/мин, деление потока 10 мл/мин

60 оС в течение 8 минут, увеличение температуры со

скоростью 15 оС/мин до 180 оС

120 оС

220 оС

ионизационно-пламенный, расход водорода - 40 мл/мин, расход воздуха - 400 мл/мин

80 оС

40 мин 100 оС

120 оС 2 мин 0,06 мин 28

16 мин

Хроматографируют паровую фазу стандартного раствора, получая не менее 5 хроматограмм. Порядок выхода компонентов: пик этанола, пик гексана, пик диметилсульфоксида. Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пикам этанола и гексана на хроматограмме стандартного раствора, не менее 10000 теоретических тарелок;

факторы асимметрии пиков этанола и гексана на хроматограмме стандартного раствора должны находиться в пределах от 0,8 до 1,5;

разрешение между пиком этанола, пиком гексана и пиком растворителя

(диметилсульфоксид) на хроматограмме стандартного раствора не менее 1,5;

относительные стандартные отклонения времён удерживания и площадей, рассчитанные

по пикам этанола и гексана на хроматограмме стандартного раствора, не более 5 %.

Хроматографируют паровую фазу испытуемых растворов, получая не менее 3 хроматограмм.

На хроматограмме испытуемого раствора не учитывают пики, не относящиеся к определяемым

органическим растворителям.

Содержание этанола в процентах (Х) вычисляют по формуле:

5 • а • 5 • Р 5 • а • Р

X =-0-=-0-, где

5 • а • 10 • 100 • 100 5 • а • 20000

5 - значение площади пика этанола на хроматограмме испытуемого раствора, цУ*сек; 50 - среднее значение площадей пиков этанола на хроматограммах стандартного раствора, цУ*сек;

ао - навеска стандартного образца этанола, в граммах; а - навеска испытуемой субстанции, в граммах;

Р - содержание основного вещества в стандартном образце, в процентах.

Содержание гексана в процентах (Х) вычисляют по формуле:

5 • а • 5 • Р 5 • а • Р

X =-0-=-0-, где

5 • а • 10 • 10 • 100 • 100 5 • а • 200000

5 - значение площади пика этанола на хроматограмме испытуемого раствора, цУ*сек; 5о - среднее значение площадей пиков этанола на хроматограммах стандартного раствора, цУ*сек;

ао - навеска стандартного образца этанола, в граммах; а - навеска испытуемой субстанции, в граммах;

Р - содержание основного вещества в стандартном образце, в процентах. За результат принимают среднее значение трех испытаний.

3. Проведение валидационных испытаний 3.1. Специфичность

Цель:

Определить способность методики измерять точно и селективно содержание нормируемых остаточных органических растворителей (этанол, гексан) в фитосубстанции клевера лугового травы относительно стандартного образца в присутствии основного вещества и возможных примесей, а также оценить пригодность хроматографической системы. Критерии приемлемости:

• На хроматограмме холостого раствора (диметилсульфоксид) отсутствуют пики с временами удерживания этанола и гексана;

• На хроматограмме стандартного раствора пики этанола и гексана идентифицируемы, и наблюдается четкое разделение с системными пиками и пиком растворителя;

• Выполнены требования проверки пригодности хроматографической системы;

• Содержание этанола и гексана в фитосубстанции соответствует требованиям; доверительный интервал средних результатов анализа должен лежать внутри предельной нормы содержания этанола и гексана, определенной методикой;

• На хроматограмме специфичного раствора наблюдается четкое разделение пиков этанола и гексана с системными пиками и пиком растворителя в присутствии сухого экстракта;

• На хроматограмме модельного раствора наблюдается четкое разделение пиков этанола и гексана с пиком этилацетата и системными пиками.

Приготовление специфичного раствора:

Около 0,058 г (точная навеска) стандартного образца гексана помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают (раствор А).

Около 0,10 г (точная навеска) стандартного образца этанола и 1,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают. 5,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводили объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивали (раствор Б). Около 0,10 г (точная навеска) фитосубстанции помещали во флакон для парофазного дозатора, прибавляли 5,0 мл диметилсульфоксида и 0,1 мл раствора Б, закрывали пробкой и герметично укупоривали.

Приготовление модельного раствора:

Около 0,058 г (точная навеска) стандартного образца гексана помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают (раствор А).

Около 0,10 г (точная навеска) стандартного образца этанола, около 0,10 г (точная навеска) стандартного образца этилацетата и 1,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают. 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

5,0 мл стандартного раствора помещают во флакон для парофазного анализа, закрывают пробкой и герметично укупоривают.

Приготовленные растворы хроматографировали согласно методике в следующей последовательности:

• Холостой раствор, регистрируют 1 хроматограмму; оценивают чистоту колонки;

• Стандартный раствор, регистрируют 5 хроматограмм; проверяют пригодность хроматографической системы;

• Испытуемый раствор, регистрируют 3 хроматограммы;

• Специфичный раствор, регистрируют 1 хроматограмму;

• Модельный раствор, регистрируют 1 хроматограмму. Результаты:

Хроматограммы холостого, стандартного, испытуемого, специфичного и модельного растворов приведены на рисунках 1-5. Результаты хроматографирования стандартного, специфичного и модельного растворов приведены в таблицах 1-4.

Рис. 1. Хроматограмма холостого раствора.

Рис. 2. Хроматограмма стандартного раствора.

Таблица 1. Результаты хроматографирования стандартного раствора.

Этанол

№ хроматограммы раствора сравнения Время удерживания, мин. Площадь ^*сек. Число теор. тарелок Фактор асиммет рии Разрешение Я

1 4,26 95894 38286 0,875 21,29

2 4,26 96057 38549 0,877 21,35

3 4,26 96329 39367 0,890 21,35

4 4,26 95653 38456 0,882 21,42

5 4,26 98107 38107 0,881 21,33

6 4,26 94994 38881 0,891 21,39

Среднее значение 4,26 96172 38608 0,883 21,35

Стандартное отклонение 0,00 1050

ОСО, % 0,00 1,09

Гексан

№ хроматограммы раствора сравнения Время удерживания, мин. Площадь ^*сек. Число теор. тарелок Фактор асиммет рии Разрешение Я

1 6,30 452205 58871 0,995 45,38

2 6,30 457322 57881 0,996 45,21

3 6,30 459521 57616 0,996 45,21

4 6,30 458733 58085 0,994 45,32

5 6,30 463670 58597 0,998 45,26

6 6,30 453368 56931 0,995 45,29

Среднее значение 6,30 457470 58997 0,996 45,28

Стандартное отклонение 0,00 4215

ОСО, % 0,00 0,92

Рис. 3. Хроматограмма испытуемого раствора.

Таблица 2. Результаты хроматографирования испытуемого раствора.

№ хроматограм мы Этанол Гексан

Время удерживан ия, мин Площад ь, ^*сек. Количествен ное содержание, % Время удерживан ия, мин Площад ь, ^*сек Количествен ное содержание, %

1 4,26 24320 0,13 6,30 8668 0,0005

2 4,26 25557 0,13 6,30 7976 0,0005

3 4,26 22602 0,12 6,30 8226 0,0005

Среднее значение 4,26 0,13 6,30 0,0005

Стандартное отклонение 0,00 0,006 0,00 0,00

ОСО,% 0,00 4,62 0,00 0,00

300-

250-

200- о с •0 £

150- 1 «о

100- о

50- 00 (М т , щ Л 43 , 1

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5

Рис. 4. Хроматограмма специфичного раствора.

Таблица 3. Результаты хроматографирования специфичного раствора.

Название пика на хроматограмме специфичного Время удерживания, мин. Площадь, ^*сек. Число теор. тарелок Фактор асимметрии Разрешение, Я

раствора

Этанол 4,28 101057 38929 0,874 21,28

Гексан 6,36 522520 56932 0,995 45,35

Диметилсульфоксид 13,21

Рис.5. Хроматограмма модельного раствора.

Результаты хроматографирования модельного раствора представлены в таблице 4.

№ раствора Наименование пика на хроматограмме Время удерживания, мин Разрешение, Я

модельного раствора

Модельный раствор Этанол 4,26 21,28

Гексан 6,30 3,32

Этилацетат 6,66 42,68

Диметилсульфоксид 13,18

Выводы: На хроматограммах холостого раствора отсутствуют системные пики с временами удерживания пика этанола и гексана. На хроматограмме специфичного раствора пики этанола, гексана и диметилсульфоксида хорошо разделены между собой и системными пиками. На хроматограмме модельного раствора пики этанола, гексана, диметилсульфоксида и возможных примесей хорошо разделены между собой и системными пиками. Содержание этанола и гексана в фитосубстанции соответствует требованиям. Выполняются требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы».

Данная методика дает возможность точно и селективно измерять содержание этанола и гексана в фитосубстанции в присутствии системных пиков, растворителя (диметилсульфоксида), возможных примесей и действующего вещества, а также оценивать пригодность хроматографической системы.

3.2. Предел количественного определения

Предел количественного определения (ПКО) устанавливали исходя из соотношения сигнал/шум.

Для ПКО это соотношение не менее 10.

Цель:

Установить ПКО этанола и гексана. Доказать, что этанол и гексан в фитосубстанции надежно детектируются на нормируемом уровне и поддаются количественному определению. Критерии приемлемости:

• Соотношение сигнал/шум не менее 10;

• Относительное стандартное отклонение (ОСО) площадей пиков этанола и гексана по 6 последовательным хроматограммам не более 5%.

На основании хроматограмм холостого и стандартного растворов, полученных для показателя «Специфичность», рассчитывали соотношение сигнал-шум пиков этанола и гексана в стандартном растворе по формуле:

2 • h

S / N =-,

Noise

где s / n - соотношение сигнал-шум;

Noise - шум, рассчитанный по 1 хроматограмме холостого раствора в диапазоне

времени выхода пика этанола (гексана); h - средняя высота пика этанола (гексана) на хроматограммах стандартного

раствора.

Наименование компонента Концентрация в стандартном растворе, мг/мл S/N (n=6)

Этанол 0,1 587

Гексан 0,0058 2425

На основании полученных значений соотношения сигнал-шум для этанола и гексана в стандартном растворе рассчитывали концентрацию, соответствующую соотношению сигнал -шум 10 (ПКО), готовили раствор, содержащий этанол и гексан в концентрации ПКО (раствор ПКО), что составило 0,002 мг/мл и 0,0000232 мг/мл соответственно. Приготовление раствора ПКО:

Около 0,058 г (точная навеска) стандартного образца гексана помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают (раствор А).

Около 0,20 г (точная навеска) стандартного образца этанола помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают (раствор Б).

1,0 мл раствора А и 1,0 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

5,0 мл стандартного раствора помещают во флакон для парофазного анализа, закрывают пробкой и герметично укупоривают.

Приготовленный раствор хроматографировали согласно методике. Результаты:

На рисунке 6 и в таблице 5 представлены хроматограмма раствора ПКО и результаты хроматографирования раствора ПКО.

1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0 15.5

Рис. 6. Хроматограмма раствора для определения ПКО.

Таблица 5. Результаты хроматографирования раствора с концентрацией ПКО.

Этанол

№ хроматограммы Время удерживания, мин. Площадь, ^*сек. Сигнал-шум

1 4,29 2606 19,743

2 4,29 2747 17,463

3 4,28 2904 16,337

4 4,27 2774 16,964

5 4,27 2838 19,012

6 4,27 2882 17,906

Среднее значение 4,28 2792 17,904

Стандартное отклонение 0,01 109

ОСО, % 0,23 3,90

Гексан

№ хроматограммы Время удерживания, мин. Площадь, ^*сек.. Сигнал-шум

1 6,33 2675 19,517

2 6,34 2631 16,712

3 6,33 2604 15,315

4 6,34 2602 15,083

5 6,34 2687 17,055

6 6,33 2437 14,627

Среднее значение 6,34 2606 16,385

Стандартное отклонение 0,01 90

ОСО, % 0,16 3,45

Вывод:

Соотношение сигнал-шум этанола и гексана 17,904 и 16,385 соответственно; относительное стандартное отклонение площадей пиков на 6 последовательных хроматограммах раствора ПКО менее 5 %.

3.3. Линейность

Линейность определяли путем измерения площади пиков этанола и гексана на хроматограммах, полученных при хроматографировании серии из 6 стандартных растворов с содержанием этанола и гексана в диапазоне концентраций от ПКО до 120 % от нормируемой концентрации.

Цель:

Определить, существует ли линейная зависимость между концентрацией этанола и гексана и площадью пика. Критерии приемлемости•

• Наблюдается линейная зависимость между концентрацией этанола (гексана) и площадью пика;

• Коэффициент корреляции не менее 0,995;

• Уравнение линейной регрессии, применимое к результатам должно иметь отрезок, отсекаемый на координатной оси У (У-т1егсер1) не более 2,0 % от нормируемого содержания растворителя.

Стандартные растворы для исследования линейности готовили путем разведения исходного раствора диметилсульфоксидом согласно таблице 6. Приготовление исходного раствора:

Около 0,058 г (точная навеска) стандартного образца гексана помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают (раствор А).

Около 0,10 г (точная навеска) стандартного образца этанола и 1,0 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают.

5,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объём раствора диметилсульфоксидом до метки и перемешивают. Таблица 6. Приготовление растворов для исследования линейности.

Концентрация, % Объем исходного раствора, мл Объем мерной колбы, мл

ПКО* - -

50 2,5 25

80 4,0 25

90 4,5 25

100 5,0 25

110 5,5 25

120 6,0 25

*Раствор ПКО готовят согласно результатам, полученным в разделе 3.2. Результаты:

Калибровочный график и результаты хроматографирования растворов для исследования линейности представлены на рисунках 7-8 и в таблицах 7-8.

Ethanol

200000 150000 га О < 100000 50000 0.0

00 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 Adjusted Amt

Рис. 7. Калибровочный график этанола.

Таблица 7. Результаты хроматографирования растворов этанола для исследования линейности.

Уровень Концентрация, мг/мл Площадь, цУ*сек. Среднее значение площади, дУ*сек.

1 0,002 2774 2828

2882