Разработка методов количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи на основе ПЦР с детекцией в режиме реального времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Аммур, Юлия Игоревна

• Аммур, Юлия Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аммур, Юлия Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярно-биологическая характеристика вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи (КПК)

1.1.1. Семейство Рагатух<шпс1ае. Вирусы кори и эпидемического паротита

1.2.2. Семейство Togaviridae. Вирус краснухи

1.1.3. Вакцинопрофилактика заболеваний, вызванных вирусами КПК

1.1.3.1. Вакцинные штаммы вируса кори

1.1.3.2. Вакцинные штаммы вируса эпидемического паротита

1.1.3.3. Вакцинные штаммы вируса краснухи

1.1.4. Традиционные методы количественной оценки вирусов

1.2. Молекулярные методы количественного определения вирусных нуклеиновых кислот

1.2.1. Общие принципы полимеразной цепной реакции

1.2.2. Реакция обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР)

1.2.3. ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

1.2.4. Количественная ПЦР с детекцией в режиме реального времени (кПЦР-РВ)

1.2.5. Количественная оценка вирусов методом ПЦР-РВ, интегрированным с культуральным методом (ИКМ-ПЦР)

1.2.6. Мультиплексная ПЦР

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Вирусный материал

2.1.2. Культуры клеток

2.1.3. Реактивы

2.2. Методы

2.2.1. Культивирование клеточных линий и вирусов

2.2.2. Определение титра вирусов КПК по ЦПД

2.2.3. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.2.4. Клонирование ПЦР-продуктов в плазмидном векторе

2.2.5. Определение титра вирусов КПК по содержанию вирусной РНК методом количественной ПЦР-РВ

2.2.6. Выявление вирусов КПК методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени

2.2.7. Электрофорез ПЦР-продуктов в агарозном геле

2.2.8.Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение вирусного материала и калибраторов

3.1.1. Получение вирусного материала при культивировании вакцинных штаммов вирусов кори (Ь-16), эпидемического паротита (Ь-З) и краснухи (\Vistar 11А 27/3)

3.1.2. Получение образцов калибраторов вирусов КПК

3.2. Разработка методических приемов количественного определения вирусов КПК с помощью метода на основе ПЦР-РВ

3.2.1. Подбор праймеров и зондов для выявления вирусов КПК и анализ их специфичности

3.2.2. Отработка выделения вирусных РНК

3.2.3. Построение калибровочных кривых

3.2.4. Оптимизация условий определения титра вирусов КПК методом на оснве ПЦР-РВ

3.2.5. Чувствительность, линейность и эффективность метода оценки титра вирусов КПК на основе ПЦР-РВ

3.2.6. Воспроизводимость метода количественного определения вирусов КПК на основе ПЦР-РВ

3.2.7. Оценка метода количественного определения вирусов КПК на основе ПЦР-РВ на контрольных вакцинных препаратах

3.3. Определение корреляции результатов определения титра вирусов КПК методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД

3.3.1. Зависимость корреляции значений титров, полученных методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД, от клеточного субстрата

3.3.1.1. Репродукция вируса краснухи в диплоидных и перевиваемых культурах клеток

3.3.1.2. Репликация вируса кори в диплоидных и перевиваемых культурах клеток

3.3.2. Влияние множественности заражения культуры клеток вирусами КПК на корреляцию значений титров, полученных методом на основе ПЦР-РВ и по ЦПД

3.4. Оптимизация условий мультиплексной ПЦР для одновременного выявления вирусов КПК