Разработка методических подходов к оценке иммунотоксилогических свойств пестицидов и коррекции их действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, доктор биологических наук Жамсаранова, Сэсэгма Дашиевна

• Жамсаранова, Сэсэгма Дашиевна
• доктор биологических наук
• 1994

Оглавление диссертации доктор биологических наук Жамсаранова, Сэсэгма Дашиевна

ВВЕЩЕНИЕ

1. ОБЗОР-ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунотоконкологическая оценка пестицидов II 1.1.1,.Влияние пестицидов на иммунную систему организма

1.1.2.Разработка систем тестирования иммунотоксикологиче-ских свойств пестицидов

1.2. -Иммунохимический метод выявления пестицидов и антител к ним

1.2 Л.Иммуноферментные методы анализа пестицидов

I.2.2>Методологические аспекты иммуноферментного анализа пестицидов дКСШШШШШ ЧАСТЬ

2. МТЕРИАЛЫ И ИОДЫ

2.1.Объекты и с сл едования

2.2.Препараты

2.3.Методы оценки функционального состояния иммунной системы организма

2.4.Иммунохимические методы анализа

2.5.Статистическая обработка результатов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНИЙ

3.I.Влияние нестицидов (2,4-Д, карбофоса) на функциональные показатели иммунной системы организма животных

3.1 Л.Оценка действия 2,4-Д и карбофоса на гуморальный иммунный ответ 82 3.1.2.Эффект, оказываемый пестицидами, на показатели клеточного иммунитета

3.1.3.Влияние пестицидов на функциональную активность макрофагов

3.1.4.Активность естественных киллерных клеток селезенки мышей при обработке их пестицидами

3.1.о.Оценка иммуномодулирующего действия 2,4-Д и карбофоса в опытах ЮЗ

3.1.б.Влияние карбофоса на формирование поствакцинального иммунитета

- з

3.1.7.Влияние монооксигеназной системы организма на иммуно-токсичность пестицидов

3.1.8.Схема иммунотоксикодогического скрининга пестицидов и определение безопасных для организма концентраций пестицидов по показателям, характеризующим состояние иммунной системы

3.2.йммунохимическое изучение органов и тканей животных, подвергнутых воздействию гербицида

3.2.1.Образование аномальных антигенов и антител к ним в органах и тканях крыс, получавших 2,4-ДА

3.2.2.Выделение и иммунохимическая идентификация белков,связывающих 2,4-Д

3.3.Использование искусственного антигена инсектицид-белок при анализе иммунологической реактивности организма людей, контактирующихся с инсектицидом

3.4.Способы коррекции иммунодефицитных состояний и специфической защиты организма от острых отравлений, вызванных воздействием пестицидов

3.4.1.Влияние иммуностимуляторов на показатели иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов

3.4.2.Специфическая защита организма от отравления гербицидом 2,4-Д ^(ав*^-фрагментами антител к ним.

З.о.Разработка иммуноферментных методов определения 2,4-Д и карбофоса

3.о.I.Иммуноферментный метод определения карбофоса и его производных

3.5.2.Определение 2,4-дихлорфеноксиукеусной кислоты иммуноферментньш методом

4. ЗАКЛЮЧЕНИЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТЗФЫ

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота;

ЧСА - человечий сывороточный альбумин;

СИТ - соевый ингибитор трипсина;

ЭБ - эритроциты барана;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

К-ЧСА - коньюгат карбофос-человечий сывороточный альбумин;

2,4-Д-ЧСА - коньюгат 2,4-Д-человечий сывороточный альбумин;

2,4-ДА- аминная соль 2,4-Д;

РИГА- - реакция пассивной гемагглютинации;

РТПГА - реакция торможения пассивной гемагглютинации;

РСК - реакция связывания комплемента;

ФГА - фитогехмагглютинин;

ПДК - предельно допустимая концентрация;

ЕКК - естественные киллерные клетки;

РИА - .радиоиммунный анализ;

Шк - иммуноферментный анализ; аяута ¿Сс/гАеаС Зплг1/г10

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

Р'ГЩ - реакция "трансплантат против хозяина";

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методических подходов к оценке иммунотоксилогических свойств пестицидов и коррекции их действия»

Актуальность.

Широкое распространение иммунопатологических состояний, в частности, иммунодефицитов среди населения ставит исследователей перед необходимостью разработки специальной методологии раннего выявления заболеваний иммунной системы организма с целью их профилактики и своевременной коррекции болезни (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н.,1990; Петров Р.В. и др.,1992).

По данным органов здравоохранения, выявлена взаимосвязь уров ней заболеваемости населения с экологической ситуацией в регионах, особое внимание обращается на возникновение вторичных имму-нодефицитных состояний в условиях длительного контакта с пестицидами. (Материалы МЗ СССР, подготовленные для Комитета Верховного Совета СССР по вопросам экологии и рационального использования природных ресурсов, по мерам защиты населения СССР от неблагоприятного воздействия нитратов и пестицидов при использовании их в сельском хозяйстве, 1990 г).

За последнее десятилетие накоплены данные, свидетельствующие о том, что пестициды, загрязняющие окружающую среду, способны нарушать функциональную целостность иммунной системы (Кенигсберг Э.Я. ,1981; Рузыбакиев P.M.,1986). ^---------

Возникла новая область науки - иммунотоксикология, объектом изучения которой является иммунная система как "мишень" воздействия ксенобиотиков.

Эксперты ВОЗ при формировании в 1989 г. в Лоцдоне "Международной программы сотрудничества в области иммунотоксикологии" (ICIP) в рамках "Международной программы по безопасности химических веществ" ( IPC.S ) признали актуальность и необходимость исследований по следующим основным направлениям: а) исследование иммунологических характеристик организма при воздействии пестицидов, включая резистентность организма хозяина; б) изучение аутоиммунных реакций организма; в) поиски иммунохимических методов защиты от отравлений и иммунокоррекции состояния организма, подвергнутого воздействию ксенобиотика; г) внедрение аналитических иммунохимических методов в практику токсикологических исследований.

Возрастающий объем внедрения пестицидов в сельское хозяйство, изменение ассортимента препаратов требует определения уровней безопасного и эффективного их применения. При этом остро поднимается вопрос о критериях и методологии оценки иммунотоксично-сти пестицидов и применения принципов иммунобиотехнологии в организации массовых анализов остаточных количеств хими©препаратов .

Цель и задачи исследования.

Целью наших исследований явилось исследование иммунотоксико-логических характеристик пестицидов, определение степени специфичности изменений функций иммунной системы, а также поиски путей и способов специфической защиты и иммунокоррекции организма.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- изучение функционального состояния звеньев иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов;

- разработка схемы иммунотоксикологического скрининга пестицидов;

- количественная оценка безопасных уровней воздействия пестицидов на иммунную систему организма;

- разработка имщунохимических методов определения пестицидов.

Научная новизна.

1. Экспериментально изучено влияние 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты и карбофоса на функциональные показатели иммунной системы организма. Показано, что воздействие данных пестицидов на организм животных вызывает иммунодефицитное состояние.

Исследование иммунотоксикологических свойств пестицидов позволило разработать схему скрининга, использование которой сможет исключить применение в сельском хозяйстве пестицидов, токсичных для иммунной системы организма.

Предложенная в работе математическая модель позволяет определить безопасные для функционирования иммунной системы организма уровни используемых пестицадов.

2.Впервые экспериментально доказана возможность образования аномальных антигенов пестицид-белок и антител к ним. Выделены и очищены белки печени, связывающие пестицид. Показана возможность использования искусственных антигенов пестицвд-белок для раннего доклинического выявления изменений, вызываемых пестицидами.

3. Впервые установлена возможность защиты организма от острых отравлений пестицидами ~ фрагментами антител против искусственных антигенов пестицид-белок. Экспериментально показана возможность иммунокоррекции организма, подверженного воздействию пестицидов, такими иммуностимуляторами как Т-активин, мие-лопид, спленин, левамизол.

4. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения пестицидов, в частности 2,4-Д и производных карбофоса, в биологических жидкостях.

Приоритетность разработок подтвервдена авторскими свидетельствами на изобретения:

1345399 "Способ иммунизации кроликов против сибирской язвы" от 15.06.87 г.

1356288 "Способ иммунизации крупного рогатого скота против сибирской язвы" от 01.08.87 г.

1501724 "Способ иммобилизации гаптенов" от 15.04.89 г.

1545350 "Способ защиты организма от отравления гербицидом" от 22.09.89 г.

1670608'\"Способ получения антигенов карбофоса" от 15.04.91г.

Практическая значимость работы.

Разработанные подходы и методы, а также результаты исследований по иммунотокеикологическому скринингу пестицидов использованы для подготовки и издания методического руководства "Иммуноток синологическая оценка пестицидов", Улан-Удэ, 1993, 103 е., утвер жденного секцией "Экспериментальная патология химической этиологии" Проблемной комиссии АМН СССР "Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс".

По результатам работы подготовлены и изданы методические реко мендации и. руководства:

- "Использование искусственного антигена карбофос-белок для раннего выявления воздействия карбофоса на иммунологическую реак тивность организма", Улан-Удэ, 1984 г., 15 е., утвержденные МЗ РСШСР;

- "йммуноферментный метод определения производных карбофоса", Улан-Удэ, 1989 г., 13 с., утвержденный Ученым Советом Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.

Разработанный иммуноферментный анализ 2,4-Д позволяет определить не только свободную, но и связанную форму препарата, которая, по нашим данным, обладает определенным токсическим эффектом

Иммуноферментный метод определения производных карбофоса позволяет выявить основные метаболиты карбофоса в организме тепло-кровных-моно-, дималатионовые кислоты.

Предлагаемые методы анализа существенно дополняют используемые в настоящее время методы определения пестицидов и способству ют получению новой информации о биологической активности пестицидов.

- "Практикум по иммунологическим методам исследования". Улан-Удэ, 1987 г., 80 с.

- "Иммунотоксикологическая оценка пестицадов". Методическое руководство. Улан-Удэ, 1993 г., 103 с. Руководство утверждено секцией "Экспериментальная патология химической этиологии Проблемной комиссии АМН СССР" Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов,'полимеров и пластических масс".

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Анализ иммунотоксикологических свойств пестицидов

- установлено влияние пестицидов на функционирование иммунной системы организма;

- разработана система скрининга токсичных для иммунной системы организма пестицидов;

- показана возможность использования иммунологических критериев для расчета безопасных уровней пестицидов.

2. Продемонстрирована способность пестицидов связываться с белками органов и тканей и изменять их антигенную структуру. Изменение антигенной структуры иццуцирует процесс антителообразо-вания к аномальным антигенам.

3. Предложен новый метод иммунохимической защиты организма от острых отравлений пестицидами, отличающийся высокой специфичностью. Доказана возможность коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного пестицидами.

4. Разработан иммунофермецтный метод определения пестицидов : и их производных, в частности,связанные и свободные формы 2,4-Д и основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммунотоксикологическая оценка пестицидов.

Открытие пестицидов является выдающимся достижением современной науки. Их применение позволяет предотвращать потери 20-30% урожая от вредителей, болезней и сорняков на суммы, выражаемые миллиардами рублей в год. Комиссия Министерства здравоохранения, просвещения и социального обеспечения США (7?2гаА Е. ,1969) конста тировала, что "потребность в применении пестицидов и других хими катов для борьбы с вредными организмами будет возрастать в течение всего обозримого времени". Однако эта фактическая необходимость не дает права на использование пестицидов в бесконечно возрастающем масштабе, т.к. неизменный объем биосферы не способен выдерживать бесконечно ежегодное 10%-ное увеличение применения пестицидов. Загрязнение окружающей среды, рост за-болеваний животных, птиц, рыб, полезных насекомых и человека служит веским доказательством необходимости изменения стратегии и тактики борьбы с сорняками и паразитами.

Необходимо сделать упор на интегрированную борьбу с вредными организмами, включающую разные подходы, создание, отбор и исполь зование пестицидов более специфичных и, следовательно, менее ток сичных для других, не вредящих видов. Актуальными остаются вопросы изучения метаболизма и естественного распада пестицидов, их перемещения в окружающей среде и влияния на организм человека и животных.

Важнейшим принципом нормального функционирования организма является поддержание постоянства внутренней среды, которое дости гается деятельностью ряда систем, находящихся между собой в слож ных регуляторных взаимоотношениях. К числу таких систем относится иммунная система организма.

Интерес к изучению иммунной системы организма как "мишени" воздействия химических веществ, условий проявления их модифицирующего действия на иммуногенез значительно возрос в последние годы. Результаты современных исследований показали, что возрастающее число химических веществ действительно оказывает влияние на иммунную систему. Наибольшее внимание уделялось тем соединениям из окружающей среды, которые ослабляли иммунологическую реактивность и повышали восприимчивость к инфекции; меньше данных относительно тех веществ, которые повышали иммунную активность.

1.1.1. Влияние пестицидов на иммунную систему организма.

Иммунвдшгическая реакция является одним из чувствительных индикаторов состояния разнообразных физиологических функций организма и довольно просто определяется (в количественном отношении) рядом методов.

Отсюда всё более и более растущий интерес исследователей к оценке влияния пестицидов на целый ряд самых разнообразных аспектов иммунологических реакций (ало/ег- Ш3. 1980) Сюда можно отнести влияние на выработку антител, реакцию кожных покровов на специфические иммуногены, уровень иммуноглобулинов, восприимчивость к различным инфекциям, уровень комплемента, количество лимфоидных клеток, а также влияние, оказываемое на структуры лим-фоидных органов, которое можно установить гистологическими исследованиями.

3^,(1980) провели обширное исследование влияния самых разнообразных пестицидов на гуморальные и клеточные иммунологические реакции, которые возникают в ответ на четко установленные антигены. Выли проанализированы следующие препараты: диносеб, паратион, пентахлоронйтробензол, ресметрин, пиперонилбутоксид, пиретрины, арохлор 1260. Полученные экспериментальные данные показали, что однократная доза <2^50 пестицида, введенного перорально, оказывает мощное, длительное влияние на иммунологическую реакцию. Наблюдаемый эффект может оказаться или стимуляцией, или угнетением, а может быть непосредственно направлен отдельно на клеточные или на гуморальные иммунологические реакции в зависимости от химической природы пестицвда и его свойств. Изучаемые клеточные и гуморальные показатели иммунологической реакции организма подавлялись под действием диносеба, паратиона, в то время как ресметрин вызывал раннюю, а в некоторых случаях даже весьма длительную стимуляцию клеточной иммунной реакции. Действие последнего из указанных препаратов вызывает значительный интерес и может дать в руки исследователей важный ключ, который позволит разработать действенные стимуляторы клеточных иммунологических реакций. А угнетение иммунных реакций, которое вызывали паратион и диносеб, приводит к тому, что организм становится менее устойчивым к различным инфекционным заболеваниям.

В результате проведенных исследований авторы приходят к выводу о необходимости изучения влияния пестицидов на иммунологические реакции; во-вторых, исследования должны проводиться не только на организменном уровне, но и на клеточном и молекулярном уровне активации Т-, В-клеток и макрофагов.

Серию экспериментов по влиянию разных доз лестицвдов:дихлор-фоса, линдана, малатиона, дециса на показатели клеточного и гуморального иммунитета кроликов после вакцинации ш провели венгерские ученые ^/^£,(1978, 1980, 1983). В работе были использованы дозы 1/10, 1/20,

Полученные авторами результаты свидетельствуют о дозозависимом подавлении показателей клеточного и гуморального иммунитета при введении дихлорфоса, линдана, дециса. Малатион значительно инги-бировал только показатели клеточного иммунитета.

О влияний хлорсодержащего углеводородного инсектицида-токса-фена на функции макрофагов, реакцию гиперчувствительности замедленного действия и антителообразования у мышей-самок и их потомства сообщили ¿2.3. Ов£е/ъ (1983). Воздействие токсафена г/г zde.ro и через лактацию приводило к заметному снижению фагоцитарной функции макрофагов у мышей.: Образование гуморальных антител уменьшалось у взрослых животных, получавших токсафен в дозах 100 или 200 частей на миллион, и у потомства мьшей из группы, получавшей препарат, в дозе 100 частей на миллион га. т£?его и с материнским молоком. Клеточный иммунитет менялся только у потомства мышей, получавших токсафен в дозе 100 частей на миллион.

По мнению авторов как оральное, так и трансплацентарно-лакта-ционное воздействие токсафена приводило к иммуносупрессии. Наибольший эффект отмечен у потомства, которое получало токсафен -¡л ти±&го и с материнским молоком. Иммуносупрессия в большей степени затрагивала макрофаги, вслед за ними гуморальный иммунитет, показатели же клеточного иммунитета нарушались в меньшей степени.

Работами рдда других авторов также показано, что воздействие пестицидов часто оказывает большее токсическое действие на потомство, чем на взрослых животных (Семенчева Э.М. и др.,1979; Горбачевская Е.§.,1980; аее&п <2.£. е£а.б.

Явление иммуносупрессии при воздействии диметоата, этефона, трихлорфона, мета иидофоса в дозе 1/2 Д:э() на крысах и мышах наблюдали В. &е/е/ъ£а.сА е£ ¿2^,(1983).

Полученные данные ( действие на лимфоидные органы, ход временной зависимости и сходство реакций на различные соединения) указывают, по мнению авторов на то, что иммуносупрессия обусловлена освобождением глюкокортикоидов из коры надпочечников, хотя авторы не исключают воздействия на иммунную систему через другие механизмы. б.^-Сашва 1982,1983) изучали связь холинергической стимуляции и иммуносупрессии, вызванной введением паратиона, ма-латиона и ДДВ1. Результаты данного исследования показали взаимосвязь между холинергической стимуляцией и, иммуносупрессией, индуцированной фосфорорганическими пестицидами. Эта связь может быть опосредована через прямое действие ацетилхолина на специфические компоненты иммунной системы. Это предположение подтверж дает тот факт, что на лимфоцитах и макрофагах были обнаружены холинергические рецепторы (^¿сАгпи/г. & О., ¿2гаа£о/1 & ¿Я ЪГ. , 1979; Ш&ееуЖ. 1981).

Альтернативой является гипотеза о том, что наблюдавшаяся иммуносупрессия может быть опосредована глюкокортикоидами, выделявшимися в ответ на токсикохимический стресс. В поддержку этой гипотезы была продемонстрирована увеличенная концентрация плазменных кортикостероидов у крыс после введения сублетальных доз паратиона ТПжгр/гу , 1970). Однако авторы не исключают возможности прямого действия препаратов или их метаболитов на иммунную систему. Дальнейшее понимание иммунотокеикологиче-ского действия пестицидов требует тщательных исследований, которые должны определить истинное значение стрессовых и нестрессовых эффектов в иммуносупрессии, вызванной фосфорорганическими пестицидами.

Интересные данные получены Т. с?71ое£^ег} (1990) с. препаратом ме-копроп, являющимся производным хлорфеноксипропионовой кислоты. Было показано, что мекопроп способствует сильной атрофии коры тимуса, уменьшению белой пульпы селезенки, вызывает сдвиги в дифференциальной картине крови, подавляет функциональные показатели клеточного и гуморального иммунитета у животных. Результаты предшествующих исследований авторов указывали на то, что введение мекопропа вызывало повышенную секрецию глюкокортикоидов корой надпочечников. Удаление надпочечников устраняло возможность повышения глюкокортикоидов в крови при стресс-реакциях, одновременно с этим в значительной мере устранялись или снижались иммунотоксикологические свойства мекопропа.

Здесь, по-видимому, следует отметить, что в исследуемых диапазонах доз мекопроп обладает как иммунотоксикологичееким, так и токсическим действием на другие органы и системы, т.е. влияние на иммунную систему, возможно, не является первичным.

По данным Т. <уСсзь и ^тиеу-л^'иг^Ь/^ 1980) иммунотоксикологи-ческое действие диизопропил-фосфофлуоридата (Д§§) на морских свинок и свиней колебалось в зависимости от количества введений ; , препарата. Однократное введение препарата приводило к значительному повышению комплементарной активности, титра антител и бляш-кообразующих клеток. Многократные введения препарата снижали изучаемые параметры.

Полученные результаты показывают, что Д§§ может стимулировать некоторые иммунологические реакции или подавлять их в зависимости от введенной дозы.

Это показано и^№в/^'г^^/,(1970а,в), который обнаружил повышение комплементарной активности, уровня гемомуина и общего иммунного фона после острой интоксикации кроликов изопропиловым эфиром метил-флуорофосфорной кислоты. Сходные результаты получили и оГ(1973,1974) на морских свинках, получавших хлорофос и паратион,еТ^^й:^^4^' ДО78) У КУР» подверг

- 17 нутых воздействию хлорфенилвинилфоеа. а£., (1987) исследовали действие алдикарба, который относится к карбаматным инсектицидам и нематоцидам, на некоторые показателе иммунной системы мышей. Алдикарб вводили животным с питьевой водой в дозе 1,10,100,100 частей на биллион в течение 14 и 34 дней, определяли количество А0К и титры антител, хемилюминесценцию перитонеальных макрофагов и периферической крови. Полученные результаты свидетельствуют.о том, что алдикарб обладает иммунотоксичностью в чрезвычайно низких дозах. Наиболее интересный факт, полученный в данной работе,-это обратная зависимость эффекта от дозы, выявленная, как после 14, так и после 34 дней воздействия алдикарба. Этот эффект авторы наблюдали во всех четырех опытах, в которых использовали две линии мышей из разных источников и алдикарб из двух источников. Этот факт вступает в противоречие с классической концепцией,согласно которой с увеличением дозы токсичность увеличивается. Хотя в литературе известны аналогичные примеры ( Ж. ,1977), однако выяснение механизма этого эффекта, по-видимому, еще предстоит.

Среди публикаций, отражающих влияние пестицидов на иммунную систему, обращают внимание работы, которые указывают на роль макрофагов при воздействии пестицидов на организм.

Ранее отмечалось о нарушении фагоцитарной функции и «£с-рецеп-торной активности альвеолярных макрофагов кошек ( Зъс/еИ Ж аС. ,1979), об ингибиции розеткообразующей способности альвеолярных макрофагов крыс, подвергнутых воздействию гексахлорбен-зола. М.З., &оггг£ег . ,1977). По мнению авторов действие инсектицида на макрофаги может быть обусловлено гидрофобно-стью молекулы, способностью вызывать нарушения в липидных областях мембран и, таким образом, изменять целостность мембран и внутриклеточных структур.

О снижении количества и функциональной активности макрофагов, подвергнутых воздействию разных концентраций .линдана та vitro указывают et (1978). Критической концентрацией, вызывающей достоверные изменения функций макрофагов, является доза, равная 10"%. По мнению Q'.3curh7&.S).

Однако не всегда исследования i/ъ vitro коррелируют с данными, полученными гл. -vtw . Так, В.Ю.Ахувдов и др.(1981) сообщили о значительном снижении миграционной активности макрофагов морских свинок при введении севина (15 мг/кг) в течение трех месяцев пе-рорально. А внесение в инкубационную среду севина не влияло на миграционную активность макрофагов, полученных от интактных животных.

Приведенные выше данные, а также ряд других работ (Олефир А.И. и др.,1977; (2с/о/пбвб£., ¿teAota^ty ,1980) указывают на высокую чувствительность макрофагов к воздействию пестицидов.

На необходимость проведения экспериментов ш шгю г/ ъ/l vitro при оценке иммунотоксичности пестицидов указывают работы ^o/msoa,(1987). Авторами было показано, что инсектицид хлордан не вызывал значительных изменений показателей гуморальных и клеточ-но-опосредованных иммунных реакций взрослых мышей {^оAnson. -Л'. Ш ¿tat. ,1986). Однако добавление хлордана к системам анализа клеточной и гуморальной иммунной реакции in vitro значительно снижало иммунную активность. Результаты, полученные авторами, свидетельствуют о том, что имм^шосупрессивный эффект не зависит от цитотоксичности при низких концентрациях хлордана, что указывает на возможность влияния последнего на иммунную активность гл. rivo . Изучение причин неоднократного действия хлордана показало, что метаболиты хлордана проявляли собственную иммунотоксич-ность в системе гл. z>itr-o . По мнению авторов значительное подавление иммунных реакций ш vitro связано с антипролиферативным действием хлордана и его метаболитов. Отсутствие иммунотоксич-ности последнего в системе ш тлгю связано со способностью хлордана и его метаболитов связываться с компонентами сыворотки крови, что ведет к'снижению иммуносупрессивной активности данных соединений.

Особый интерес представляют исследования toa^e. et (1979,1982). Авторы, определяя иммунологические показатели у мьшей Ва^/е, , обработанных дильдрином или гексахлорбензолом и зараженных ($лс&кпгап1а. или ShzgrriDcLiz/m. бегдШ^ установили подавление реакции на эритроциты барана, ингибицию реакции на поливи-нилпиролидон, уменьшение количества Т-, В-клеток и макрофагов, подавление реакции на фитогемагглютинин (#ГА).

Обследование причин изменения иммунологического статуса мышей, в частности Т-клеток селезенки, полученных от обработанных дильд рином и инфицированных ЗесЗб-та/иа. мышей с помощью метода обработки пролиффующих клеток митомицином С (для ингибирования синтеза ДНК) или обработкой антисывороткой к антигену, выявило отсутствие реакции ингибирования нормальных Т-клеток на §ГА. Супрессорная активность Т-клеток была установлена по наличию клеток, содержащих антиген и количеству ДНК. Дальнейшее исследование по анализу изолированных клеток печени, селезенки, легких и перитонеальных макрофагов выявило, что добавление'макрофагов к селезеночным культурам Т-клеток вызывало супрессию 1ГАстимулированных Т-клеток. Этот фактор макрофагов, вызывающий супрессию Т-клеток, не оказывал влияния ни на интактные контрольные клетки, ни на Т-клетки от инфицированныхмышей. Однако, когда этот фактор добавляли к Т-клеткам селезенки мышей, обработанных дильдрином и зараженных^е^А/псиио., или к клеткам селезенки мышей, подвергнутых воздействию дильдрина или гекса-хлорбензола, он ингибировал их пролиферативную активность. Это. указывает на то, что фактор действует на примированные инсектицидами Т-клетки. В то же время макрофаги, полученные от животных, обработанных инсектицидами, не способны представить адекватный антиген хозяину, что указывает на состояние супрессии, даже если и вырабатывается фактор.

В этой связи интересным представляется развитие исследований по изучению продуцирования супрессорного фактора макрофагами в сочетании с продукцией интерферона, простагландинов, которые играют роль иммуномодуляторов.

Следует отметить, что супрессия функций иммунной системы, выявляемая при воздействии пестицидов на организм {6шг-деа.& ,1987 За1раг$е.С., & , 1982; <Л Ю., 1987 а, б; наблюдалась при низких дозах, не вызывающих признаков токсического эффекта, что указывает на высокую чувствительность иммунокомпетентных клеток и органов к действию ядохимикатов.

Ряд работ, выполненных разными авторами, посвящено изучению влияния пестицидов, на иммунную систему людей, подвергавшихся воздействию пестицидов через профессиональные контакты или через пищевую цепь.

По данным к.¿^ег/ргсг/гогс^е^ £¿¿7^1982) у 33-х лиц, подвергнутых профессиональному воздействию хлорорганических пестицидов, установлено глубокое угнетение функций сегментоядерных нейтрофи-лов: хемотаксиса, слипания, фагоцитоза и восстановления нитроси-него тетразолия. По мнению авторов, поражение функций нейтро-фильных гранулоцитов следует иметь в виду как пр^располагающий фактор развития инфекционных заболеваний системы дыхания при боль ших концентрациях инсектицидов в воздухе рабочей зоны.

О влиянии хлорорганических пестицидов на миграцию лейкоцитов крови сообщили <0. Зсаслук её(1978) ^ЖЖа^аг^/А, 'Ш'^^сыг^с (1979). Хлорорганичеекие пестициды - ДДТ, ДЦЕ, ^- ГХЦГ, меток-сихлор в концентрациях, характерных для крови человека; ингиби-ровали миграцию лейкоцитов крови людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидами. По мнению польских иммунологов ингибиция миграции лейкоцитов отражает состояние гиперчувствительности замедленного типа и, возможно, индуцирована стимуляцией лимфоцитов специфическим антигеном, комплексом антиген-антитело или конъю-гатом гаптен-носитель.

Выявлено, что у лиц, профессионально контактирующих с пестицидами, при наличии 3-6- кратного превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, в период сезонных работ подавлялась иммунная реакция организма. Выявленная иммуносупрессия проявлялась в статистически достоверном снижении уровня столбнячного антитоксина по сравнению с контролем (Руссу-Лупан %Л. и др., 1983). Интересно отметить, что авторы выявили сходные закономерности подавления иммунной реакции организма как в натурных исследованиях, так и в эксперименте на животных, что свидетельствует о сходстве патогенеза интоксикации пестицидами у человека и животных.

Н.Е. а£. ,(1978) описали в своей работе необычный случай гемолитической анемии. Результаты лабораторных исследований показали иммунологическую природу анемии, а в качестве имму-ногена был определен дильдрин. Болезнь перешла в состояние ремис сии лишь после удаления селезенки.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о разностороннем влиянии пестицидов на функционирование иммунной системы организма человека и животных. Это может быть и стимулирующее, и угнетающее действие в зависимости от химической природы пестицида, от дозы и кратности введения, вида животного и методов тестирования.

Так, &{1пгта$.9>,£еепгсиг. <771. (1980) обобщили данные о влиянии ДЦТ на продукцию антител к нескольким антигенам у семи видов животных, включая серебряного карася, кур, уток, крыс, морских свинок, кроликов и человека.

В зависимости от нескольких факторов, то есть изучаемого вида животных, дозы и режима приема ДЦТ и используемого антигена, может не наблюдаться никакого эффекта, возможно увеличение продукции ан тител, или даже первоначальное возрастание, за которым следует по давление вторичной стадии продукции антител. Очевидно также, что на результат контакта с антигеном влияла схема эксперимента, то есть величина интервала между иммунизацией и изучением эффекта, или время приема пестицида, т.е. применялся ли он до, после или одновременно с антигеном.

Иммунный ответ включает в себя работу большой сети органов и различных типов клеток, выполняющих взаимосвязанные функции. Реак ция на внешние сигналы управляется сложной регуляторной сетью высокоспециализированных клеточных популяций и субпопуляций,сложным образом связанных между собой.

Химические соединения, в частности пестициды, действуют на иммунную систему и в конечном счете на некоторые её,функции на раз

- 23 личных уровнях "иммунологического древа" (Вчаип Д.Р. 1981). Они могут влиять на афферентное звено иммунного ответа, затрагивающее количество и функции моноцитов (макрофагов, Т-,В-клеток) на различных этапах связывания антигена, переваривания и презентации лимфоцитам; они могут влиять и на центральное звено иммунного ответа.

Последнее свойство присуще соединениям, которые модифицируют синтез ДНК или модифицируют функции супрессорных, хелперных клеток и эффекторных Т- и В-клеток, или же производят оба эффекта. И, наконец, они могут влиять на эфферентное звено иммунного ответа, экспрессирующую эффекторные функции иммунитета, развивающиеся в процессе прохождения центральной части ответа.

В конце концов любой иммуносупрессивный эффект, вызванный химическими соединениями, приводит к одному или более из следующих последствий: а) снижение сопротивляемости организма инфекционным заболеваниям; б) изменение механизма иммунологического надзора, приводящее к увеличению числа и частоты опухолей; в) развитие ги перчувствительности у восприимчивых особей и г) инициации аутоим мунных заболеваний {ЗирНх>па$2{., "ТУЬшъго <£6. ,1984).

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Жамсаранова, Сэсэгма Дашиевна

-195-ВЫВОДЫ

1. Разработана и экспериментально апробирована двухуровневая система щумунотоконкологического скрининга пестицидов, представляющая собой комплекс методов, позволяющих поэтапно выявить наиболее чувствительное звено иммунной системы.

2. Пестициды - карбофос и 2,4-Д оказывают выраженный дозоза-висимый иммуносупрессивный эффект на показатели клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также функции перитонеаль ных макрофагов.

3. Подавление функций перитонеальных макрофагов мышей, подвер женных. воздействию пестицидов, ш utvo коррелирует с данными, полученными in. vítro . Экспериментальные данные позволяют рекомендовать анализ функций макрофагов in vitro для предварительной оценки иммунотоксичности пестицидов, а также для предварительного отбора и подбора доз иммунокорригирующих средств. Однако это не исключает необходимости анализа функций иммунокомпетентных кле ток в условиях'и. vivo.

4. Функциональные нарушения иммунной системы могут быть использованы з качестве критерия вредности при оценке пороговых доз пестицидов. Предложена математическая модель, использующая иммунологические показатели для расчета пороговых доз воздействия на иммунную -систему организма. Экспериментальная проверка показала справедливость данного подхода.

5. Выявлены аномальные комплексы пестицид-белок в органах и тканях животных, подвергнутых воздействию пестицидов, которые вызывают индукцию антител к ним. Изучена динамика образования аномальных антигенов и антител к ним. Выделены и очищены белки печени , связывающие 2,4-Д.

6. Разработан и внедрен метод искусственных антигенов и антисывороток к ним для выявления раннего доклинического воздействия карбофоса на иммунологическую реактивность организма людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидом.

7. Выявлен защитный,эффект (аё')^ - фрагментов, специфичных к 2,4-Д, при остром отравлении гербицидом.

8. Экспериментально установлена коррекция. Т-активином, миело-пидом, спленином, левамизолом иммунодефицитного состояния организма животных, 'подвергнутых воздействию пестицидов. Наибольшим корригирующим эффектом обладал миелопид, который восстанавливал функциональные показатели всех звеньев иммунной системы организма.

9. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения 2,4-Д и производных карбофоса и антител к ним.

Интервал определяемых концентраций связанного 2,4-Д составил (15-1000) нг/мл, производных карбофоса - (0,3-150) нг/мл.

Методы апробированы при анализе препаратов в органах и тканях животных, отравленных пестицидами, для определения не требуется экстракция и очистка проб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунная система организма стала объектом пристального изучения исследователей, занимающихся токсическим действием химических соединений, сравнительно недавно. Причиной тому особенности функционирования иммунной системы, сложности методических приее " мов, а также, завуалированность нарушений со стороны иммунной системы сопряженными изменениями других систем. Однако, все больше представляется фактов, свидетельствующих о способности химических соединений вызывать изменения в функционировании иммунной системы организма. В настоящее время ведется разработка единой системы оценки иммунотоксикологических свойств ксенобиотиков,вклю чая и пестициды.

Среди множества пестицидов, используемых в практике защиты растений, животных и человека, гербицид 2,4-Д и инсектицид карбофос (малатион)- являются классическими препаратами для борьбы с сорняками и насекомыми, широко применяющимися в практике сельского хозяйства.

Отсутствие материалов по иммунотоксичности пестицидов в "Методических л/казаниях по гигиенической -и токсикологической оценке новых пестицидов, предлагаемых для.внедрения в сельскохозяйственную практику, побудило нас к изучению их.

В результате проведенных исследований нами предложена система скрининга иммунотропных свойств химических средств защиты растений. Система скрининга, использованная при анализе иммунотоксичности карбофоса и 2,4-Д, позволяет выявить слабое звено в функционировании иммунной системы, рассчитать пороговую, дозу пре парата по показателям иммунной реактивности, а.также подобрать наиболее эффективные средства иммунокоррекции.

О высокой чувствительности иммунной системы организма к действию пестицидов свидетельствует тот факт, что уровень 2,4-Д,не вызывающий гистологических изменений в почках крыс, составлял 15 мг/кг массы тела в сутки (GhenW.Z, et at ,1981). Известно,что почки являются органом-мишенью для.структурных, физиологических и химических эффектов 2,4-Д.

В наших экспериментах доза 2,4-Д, рассчитанная и проведенная экспериментально и не изменяющая показатели иммунной системы организма, составила 0,94 мг/кг. Поскольку иммунологические механизмы направлены на охрану внутренней среды организма, использование иммунологических критериев при регламентировании пестицидов предотвратит нежелательные последствия использования пестицидов.

В предложенной схеме оценки иммунотоксичности пестицидов нашли отражение методы исследования ж vivo v гл vitro . Сочетание этих методов позволяет выявить прямое или опосредованное действие изучаемых препаратов.

Полученные нами данные об изменении функции макрофагов под. . влиянием пестицидов как in. vitro , так и ш vivo , возможно, отражают общую картину влияния, фармакологических и химиотерапевти-ческих средств на модулирование функций макрофагов. Корреляции изменений функций макрофагов in vitro и in vim под влиянием 2,4-Д и карбофоса позволяют нам рекомендовать анализ макрофагов как первичный тест оценки иммунотропного действия пестицидов.

Анализируя научную информацию о влиянии пестицидов на иммунную систему, можно отметить ряд исследований, объясняющих механизмы иммуномодулирующего действия пестицидов, их метаболитов и примесей, содержащихся в технических формах препаратов.

Так, К. Stodges s et ¿г*?.,(1986) предложена ускоренная методика отбора in vitro потенциальных иммунотоксичных пестицидов, основан ная на определении цитотоксических Т-лимфоцитов. Эта методика, по мнению авторов, является простой, быстрой и практичной в использовании по следующим причинам: а)легкость интерпретации данных; ;б) отсутствие осложняющих факторов со стороны целостного организма, и в) легкость изучения.; широкой области концентраций исследуемого вещества. Ранее были предложены методы исследовав ния шиИго , позволяющие определить влияние химических соединений на возникновение гуморальной иммунной реакции. Однако, необ^ ходимы методы в системе ш гн1го , изучающие воздействие препаратов на способность Т-клеток отвечать на это воздействие.

Данная методика может быть проведена в присутствии и в отсутствие усиленной НДЦШ фракции печени 5-9. Исследование а) относительно легко осуществить; б) позволяет легко анализировать результаты; в) занимает только одну неделю; г) позволяет определить, должно ли испытуемое соединение вступить в обмен веществ, чтобы оказать воздействие на иммунную систему.

По результатам исследований авторов малатион и фенитротион совсем не оказывали ингибирующего действия на активность цитоток сических лимфоцитов после предварительной обработки ферментной системой, однако этил- и метилпаратион, а также фентион только частично обезвреживались. С другой стороны, ферментная система 5-9 не изменяла степени воздействия карбаматных пестицидов,кар-барила и карбофурана на активность цитотоксических Т-лимфоцитов. Никакого усиления иммуносупрессии после инкубации с ферментной системой не наблюдалось.

Анализ литературных данных по иммунотоксическим воздействиям фосфорорганических и карбаматных инсектицидов показал, что од нократная доза препаратов, введенная т ьсгю , подавляла иммунную реакцию организма. Это согласуется с данными, полученными ш ш1го.

Однако, корреляция между обработкой т vitro и многократным воздействием in vitro не такая уж строгая. Такое различие может быть результатом различных режимов обработки, включая используемый метод и время введения, кроме того, длительное введение пестицидов влечет за собой изменения в метаболизме соединения.

Использование ферментной системы $-9 позволяет учитывать влияние метаболизма на иммунотоксичность соединения.

Преимущество методов исследования in vitro заключается в том, что а ^расходуется меньше животных; б)используемые животные не подвергаются побочным воздействиям, таким как холинергические реакции; в) исключаются факторы, возникающие при использовании целого организма, такие как гормональное влияние на иммунную систему. Для эффективного изучения иммунотоксического воздействия соединений необходимо сочетать исследования in vivo и in vitro.

При определении порога вредного действия химических веществ рекомендуется определить границы мевду физиологической адаптацией и компенсацией нарушенных функций.- Для этой цели предлагается системы различных методических приемов (Голиков С.Н. и др.,1986). Одним из методических приемов является оценка единства организма и среды обитания с использованием целой серии различных "нагрузочных" тестов, когда применяются экстремальные нагрузки химической, физической или биологической природы. Такие ."нагрузочные", тесты позволяют выявить уменьшение адаптационных или компенсаторных возможностей организма.

Так как иммунный ответ организма представляет собой сложный многокомпонентный процесс, оценка иммунотоксикологических свойств пестицидов должна включать изучение иммунологического параметра , который максимально определяет иммунную реактивность организма - хозяина. Наилучшим образом отражает -иммунную реактивность организма оценка защитных сил хозяина при введении патогенов. В качестве патогенов могут быть использованы бактерии, вирусы, паразиты.

Использование инфекционных патогенных агентов позволило определить развитие синергизма мевду инфекционными факторами и химическими загрязнителями окружающей среды. Было показано, что этот синергизм может выражаться в состоянии иммуносупрессии, которая или не наблюдалась при независимом и отдельном воздействии, или была выше, чем аддитивная в слз/чае применения обоих факторов {ЗСоо*е.2Ж ,1982).

Продукция макрофагами растворимого фактора, который индуцирует Т-супрессорные клетки, была показана на примере клеток печени и, в меньшей степени, клеток селезенки мышей, получавших диль-дрин, а затем инфицированных ¿feisAmania tropica, . Этот фактор при добавлении вместе с фитогемагглютинином к культурам селезеночных Т-клеток вызывал супрессию пролиферативной активности Т-клеток. Данный фактор не оказывал влияния ни на нормальные контрольные клетки, ни на Т-клетки от -инфицированных 5teish.mcm.La. мышей. Однако, когда этот фактор добавляли к Т-клеткам, полученным от обработанных дильдрином и инфицированных SteisAmania. мышей или от мышей, обработанных.дильдрином, он ингибировал их пролиферативную активность. По-видимому, фактор действовал лишь на примированные дильдрином клетки.

Секреция макрофагами ингибирующих факторов наблюдалась при состоянии супрессии, выразившейся в,ингибиции антигенпредставля-ющей способности ( Жоояе. 3.S). ,1982).

Модели с использованием инфекционных патогенных агентов могут позволить с большей чувствительностью выявить потенциальные возможности иммунотоксичности пестицидов.

Токсичность фосфорорганичееких пестицидов для млекопитающих срав нительно низка благодаря быстрому превращению исходного соединения в нетоксичные метаболиты под действием карбоксидгстераз (Shu-terman W.C. ,1971; '7na£êip7Jd.iJI/r.<?72. etaê*I960)-Однако, примеси, образующиеся при производстве и.хранении фоефорорганических сое^ динений при повышенных-температурах увеличивают токсичность этих пестицидов {Vme/svJV.efo£. ,1977; aâdric/gz m Л etc/£Wn\Vmdsu J.eta?.^.1981 ). Эти загрязнители не только токсичны сами по себе, но и ингибируют карбокеилэстеразу, препятствуя разрушению исход-ног о пестицида ( TTiofttzpuc/i Ж 771. -et ai., 1979 ). Группой исследователей Калифорнийского университета изучалась токсичность загрязняющей примеси 0,0,S -триметилтиофосфата, который обнаружен.в малатионе, фенитротионе и ацефате ( f/metsz/Jt. eto£. ,1977). В. работе В.H.ÏÏeaens état. ,(1985), K.E.&octgers- е/о£.,(198Ъ) исследовалось действие этой фосфорорганической примеси на иммунную систему мышей. У мышей, предварительно обработанных 0,0,3-триметилтиофосфатом, снижались и гуморальная, и клеточная иммуные реакции, наблюдалось сокращение функциональных зон вилочковой железы и общего числа лимфоцитов. Спленоциты мышей in vitro были не способны генерировать реакции, обусловленные цитотоксическими Т-лимфоцитами, и образование АОК было подавленным. Пролиферативная реакция спленоцитов животных, которым вводили нетоксичные дозы 0,0,5 - триметилфос-фортиоата, на конканавалин А : не подавлялась сколько-нибудь значительно, а ответ на липополисахарид был ослабленным в первый день после введения примеси. Хотя при введении высоких доз (20, 40 мг/кг), вызывающих снижение количества лимфоцитов в селезенке и тимусе, реакция спленоцитов на митогены была подавленной в течение всего периода исследования {^ev-ens Ô.W.etoâ. ,1985). Синтез интерлейкина-2, являющегося ишунорегуляторным соединением, возрастал в культуре спленоцитов животных, которым предварительно вводили О,- триметилфосфор-тиоат . (Stadlers Ж&. е/а£., 1986).

Ранее авторами {Жосl^ar-s Х.ё. макрофаги наиболее чувствительные к обработке Q,0,S -триметилтио-фосфатом иммунокомпетентные клетки. Наблюдалось увеличение размеров : макрофагов., повышенное содержание в макрофагах эстераз. У мак рюфагов животных, обработанных 0,0,3 -триметилтиофосфатом, была понижена антигенпредставляющая способность. Процент CJа—п ол ожи— тельных макрофагов был ниже, чем у контрольных животных, увеличивалось продуцирование интерлейкина-1 (Жос/gers Ж ё. е/ о£ ,1985с) Спустя день после введения 0,0,6' -триметилтиофосфата макрофаги были способны подавлять пролиферацию опухолевых клеток Р-815,про-лиферативные реакции на конканавалин Ä и липополисахарид, блокировать проявление гуморальной иммунной реакции.

По мнению авторов, макрофаги обработанных 0,0,5 -триметилтиофосфатом животных вызывают угнетение иммунных реакций путем выделения неустойчивого цитостатического фактора. В пользу этого предположения получены данные о том, что фактор макрофагов обработанных животных обладал способностью блокировать пролифератив-ную реакцию на митогены и гуморальную- на эритроциты барана ( Jtoc/gerzJt. ё. efoß. , 1987).

В литературе имеются примеры участия макрофагов в выделении цитоетатических факторов. В число каццидатов в медиаторы действия крупных макрофагов по подавлению иммунитета включают проста-г л андины (TTl^ottöt. efo8., 1975: Jeesczci О.Э. e~f ов. ,1975), интер-фероны Johnson Я9?z. е?а£. ,1975), аргиназу {Ое^зоп, ¿Я 1978) и продукты распада комплемента {^с/с/леТ/. О. ,1977). Кроме того показано, что интерлейкин-I при определенных обстоятельствах об

-Обладает цитостатическим действием (.^Ьг^й:^. е±о£. , 1986).

Следует отметить, что подобные изменения функций иммунной системы организма наблюдались в дозах, не вызывающих признаков отравления (потери веса тела, или недомогания, увеличения уровня холинэстеразы в сыворотке крови, отсутствие гистопатологических изменений в печени, легких, сердце, коже, мозгу, селезенке или • кишечнике) ( ¿Ьелеля &Ж ,1985). .

Усиленное образование интерлейкина-2, участвующего в реализации клеточного и гуморального иммунного ответа, по мнению авторов, может привести к индукции супрессорных Т-клеток. В свою очередь, ищцукция супрессорных клеток приводит к ослаблению иммунных реакций организма. В работах С.СЖпд. е1 о£. ,(1984) было показано, что избыток интерлейкина-2 может способствовать образованию антиген-специфических и антиген-неспецифических супрессорных Т-клеток. И, наконец, усиленное образование интерлейкина-2 может быть реакций на увеличение синтеза интерлейкина-1 макрофагами .

Таким образом, выявленная в наших экспериментах индукция анР тигенспцифических Т-супреесоров при воздействии 2,4-Д и карбофоса может быть следствием изменения активности медиаторов, как указано выше.

Следующая серия экспериментов посвящена роли глютатиона в им-мунотоксичности, обусловленной -триметмлтиофосфатом.

По результатам оты^оъ ЗЖ.Жотаз.^Згпатига,(1966) иммуносупрессивный эффект 0,0,«5 -триметилтиофосфата усиливался з присутствии глютатиона и цитозоля, что позволило.авторам предположить необходимость наличия глютатиона для формирования иммунотоксич-ности данного препарата. Хотя ферментативное или неферментативное взаимодействие химических соединений с глютатионом является одним из путей их детоксикации, многие исследователи приводят данные о том, что глютатион способствует биологическому активированию химических канцерогенов и мутагенов. Об уменьшении концентрации глютатиона во всех клетках, особенно в гепатоцитах, млекопитающих, подвергнутых воздействию 0,0,5 -триметилфосфоро-тиоата, свидетельствуют данные ,(1980).

При введении крысам ( н) 0,0,5 -триметилфосфоротиоата при сопутствующем истощении глютатиона значительное количество меченого препарата ковалентно связывалось с легкими. Другими органами, проявляющими значительную ковалентную связь с радиоактивностью, были печень, почки и повздошная кишка.

Предварительная обработка ингибитором монооксигеназной системы снижала уровень меченого препарата, связанного с легкими, истощение глютатиона и токсичность 0,0,5 -триметифосфоротиоата.Эти результаты свидетельствуют о том, что ковалентное связывание происходит вследствие метаболизма 0,0,5- триметилфосфоротиоата и что метаболиты вовлечены в механизм токсичности. Механизм поражения органов, вовлекающий в ковалентную.связь реактивные метаболиты с тканевыми макромолекулами, показан для ряда гепатоток-сических, нефротоксических и пневмотоксических компонентов.

Резюмируя полученные и литературные данные по иммунотоксич-ности карбофоса и его аналога малатиона необходимо отметить существенную роль его примесей: 0,0,6' -триметилфосфортиоата и 0,0 диметил 5-зтилфосфоротиоата. Сам малатион, попадая в организм, метаболизируется под действием карбоксиластераз, образуя метаболиты, не обладающие иммунотоксическими свойствами. Скорее всего эти метаболиты представляют собой ди- и мономалатионовые кислоты. Примеси, присутствующие в коммерческом препарате фосфорорга-нических пестицидов, при введении в организм ингибируют актив

- 188 ность карбоксилэстераз,./ йнгибирование карбоксилестераз ткани,которые ответственны за детоксикацию малатиона, является одним из факторов, обуславливающих токсичность малатиона {Jmomuro^Жосе-дата. Л. ,1984). Другим фактором, влияющим на иммунотокеичность малатиона, является образование иммунотоксичных конъюгатов при метаболической активации 0,0,5-триметилфосфоротиоата в организме или в присутствии глютатиона и цитозоля. Одним из механизмов иммунотоксичности могут быть те изменения в функционировании иммунной системы,которые описаны выше.

Последствия ингибиции функций иммунной системы организма при отсутствии явных признаков токсичности могут оказаться весьма серьёзными и для людей, т.к. фоефорорганические пестициды широко используются в быту в борьбе с домашними и садовыми вредными насекомыми. Даже частичное угнетение иммунитета может привести к повышенной опасности бактериальных, вирусных и других инфекций, нарушить устойчивость к этим инфекциям.

Иммунологические средства издавно привлекали внимание исследователей в качестве антидотов для терапии острых отравлений лекарственными препаратами и химическими соединениями. Тем более, в настоящее время не существует удовлетворительного способа лечения отравлений пестицидами.

Новый подход к лечению острых отравлений пестицидами заключается в том, что создается препарат, который в состоянии химически . связывать потенциально активный яд, нейтрализовать его био логическую активность и удалять его из кровотока.: Такой метод лечения предупреждает появление рецидивов и хроническую нейроток-сичность, уменьшает также продолжительность лечения обычными средствами типа атропина, ибо при этом методе токсичное вещество выводится из организма (Борисенко H.S.,Пьянзина В.И.,1977;

- 189

СоебитЖа.МЛеС.тлт,$i/feer ,1982;0bat&i97!.fituc/г m&.,

1984; Заве/» 77?., JCrcrnz S.Werr/попл. , 1984.

Известно, что при пероральном отравлении крыс паракватом концентрация препарата в плазме крови остается сравнительно постоян ной в течение 30 часов, тогда как концентрация в легких возрастает в несколько раз. В других органах не наблюдается такого накопления параквата. : а.ЖWrz^hi е/ о£., (1987) получили поликлональные и монокло-нальные антитела, которые обладали способностью связывать парак-ват. Полученные антитела в равной степени препятствовали накоплению параквата в легочных срезах крыс iavitro . По мнению авторов, антитела связывают паракват в растворе и таким образом предотвращают ш vitro его накопление в легочной ткани. По-видимому, антитела не способны влиять на утечку из легких или на внутрикле точный метаболизм параквата.

0 значительном увеличении концентрации параквата в плазме крови мышей, отравленных паракватом, после введения ^(ав*^-фрагментов антител свидетельствуют данные ^.Cadot €taE., \ 1985).

Полученные наш данные также указывают на защитный эффект S-(o6})£ -фрагментов антител к 2,4-Д. Наряду с нейтрализацией токсического эффекта наблюдалось повышенное выделение 2,4-Д с мочой. ■

Таким образом, использование специфических-, фрагментов экзогенных, антител в-терапевтических целях является перспективным в. условиях острых отравлений пестицидами. Однако, необходимы дальнейшие исследования для определения минимального количества специфических фрагментов, :необходимого для-получения-клинического эффекта.

Разработанные методы синтеза коньюгата и получения." антител к пестицидам играют существенную роль в.специфичности получаемых

- 190 антител и, соответственно, выраженности защитного действия от токсических эффектов.

Так, в работъ ов., (1979) показано, что антитела, полученные к келевану и очищенные аффинной хроматографией, были способны предотвращать ингибированиеч.кепоном АТ§-азной, активности в различных тканях т жЬ-о 7 Келеван как производное кепона был- г использован для-синтеза конъюгата, Одним из механизмов токсического действия кепона как и других хлорорганических.пестицидов является, ингибироавние митохоидриальной АТ$-азы. Очищенные антитела были эффективны в предотвращении ингибирования активности фер мента и другими хлорорганическими пестицидами (аддрин, ДДТ, ми-рекс). Однако, нехлорированньзе ингибиторы фермента не взаимодействовали с антителами.;-По мнению авторов, перекрестные реакции антител к кепону с другими-пестицидами являютсярезультатом на-, личия хлор-углеродной -связи в молекулах пестицидов.

В случае использования антител или их фрагментов,в терапевтических целях-. даншШ .факт можно, рассматривать как положительное явление, позволяющее использовать одни и те же антитела при отравлениях различными пестицидами одного класса химических соединений. В зависимости от необходимости получения узкоспецифических или видоспецифических антител подходы и методы должны быть дифференцированными. Примером могут служить исследования ё.Жевс/-тал е/ о£„ (1985). 0 протективных свойствах антител против пара-оксона-фосфорорганического инсектицида.

Другим перспективным направлением современной клинической иммунологии является использование биологически активных препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением функций иммунной системы. Все большее применение в клинике получают такие препараты как Т-активин, миелопид, интерферон и другие.

Использование левамизола, спленина, Т-активина и миелопида для коррекции нарушений иммунной системы организма, вызванных воздей ствием карбофоса и 2,4-Д, дало положительные результаты. Лечебный эффект иммуностимуляторов, нормализующих те или иные показатели иммунной системы организма, указывает на иммунотокси-кологические свойства изучаемых пестицидов. Однако, степень эффективности- иммунокоррекции варьировала у разных иммуностимуляторов .

Наилучший эффект наблюдался при введении миелопида мышам,подвергнутым воздействию карбофоса и 2,4-Д. По-видимому, высокая эф фективность миелопида связана с тем, что миелопептиды являются полифункциональными иммуномодулирующими медиаторами, оказывающими воздействие как на В-, так и на Т-звено иммунной' систем, в особенности существенна их способность конкурировать с супреесор-ной активностью Т-лимфоцитов.

В клинической практике терапии хронических отравлений пестицидами широкое применение нашел левамизол (Рузыбакиев P.M.,1982; Джаббатов Р.Д. Криворучко В.И.,1984).

Механизм иммунотоксического действия 2,4-Д изучен в меньшей степени (Кенисберг Я.З., 1981, Cush^onJ.^., Street J. С., 1982).

В опытах на мышах установлено, что в основе аллергической ги-перчувствительноети к 2,4-Д у животных лежит взаимодействие белков с гербицидом с образованием антигена, который индуцирует антитела реагины Щё ( Сг/зАтак^.Л., Street J. С., 1982).

По данным Кенисберга Я.Э>(1981) иммунодепрессивный механизм гербицида 2,4-Д связан с нарушением функции лизосом в макрофагах и снижением биосинтеза белка.

Проведенные нами исследования по оценке иммунотоксичности 2,4-Д свидетельствуют о том, что .иммунная система наиболее чувст

- 192 вительна к влиянию гербицида.

Достоверные, изменения функции иммунокомпетентных клеток под влиянием 2,4-Д отмечены при отравлении в дозах 2,2 мг/кг.

Анализ иммунологической реакции организма животных.на пестициды позволил-- нам установить, что в основе антигенности пестицидов лежит взаимодействие, их с белками,, в результате которого происходит изменение иммунологической специфичности последних, которая приобретала специфичность присоединившихся пестицидов.

Только в условиях хронического отравления карбофосом или 2,4-Д обнаруживались аномальные антигены с детерминантой пестицида. При этом установлено образование аутоантител к экстрактам органов отравленных животных и комплексам пестицид-белок, и в низких концентрациях антител к пестицидам.

Длительная иммунизация кроликов коньюгатами,карбофос-белок или 2,4-Д-б ел ок. приводила к синтезу антител, к гаптенам .(инсектициду или гербициду). Антисыворотки кроликов, содержащие антитела к пестицидам, позволили, выявить циркулирующие метаболиты карбофоса в крови рабочих, динамику содержания комплексов пестицид-белок.

Совершенствование методов иццикации реакции,антитело-гаптен позволило нам разработать иш^уноферментный анализ 2,4-Д, карбофоса и его метаболитов.

Дальнейшее развитие исследований в области иммуноферментного анализа возможно в расширении ассортимента пестицидов, которые будут определяться с помощью иммунохимических методов. А также в совершенствовании и приборном обеспечении иммунохимических методов анализа микроколичеств пестицидов.

По мнению Ж.О.ТПитта^.Зтф, (1987) использование гомогенного (ЕМСП) анализа будет превалировать благодаря его высокой воспроизводимости и малых затрат времени при выполнении определений. Иммунохимические. анализы будут значительно дополнять существующие : аналитические методы. Антитела, связанные с твердой фазой, могут служить колонками для концентрации пестицидов, извлекаемых из больших объемов воды.

Шире и глубже будут применяться монокловальные антитела. Низкая стоимость и простота иммунохимических методов будут способствовать широкому распространению этих операций в местах, где широко применяются пестициды.

Например, иммуноферментный анализ инсектицида дифлубензурона на 10% дешевле, чем определение его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,-или газожидкостной хроматографии и позволяет анализировать в 10-15 раз больше образцов в день, и требует более низких капитальных затрат при сохранении чувствительности анализа на уровне классических (ВЭЖ или ГЖК). Самую большую экономию средств и времени дают сокращение или исключение этапов очистки образцов.

Агенс-тво по охране окружающей среды США и группа химиков-аналитиков Госкомиссии по регламентации и нормированию пестицидов в России пересматривают список пестицидов, для которых не существует надежных аналитических методов и рекомендует, проводить разработки иммуноферментного анализа остаточных количеств пестицидов.

Множество организаций проявляют интерес к иммунодиагностике,но только некоторые из них разрабатывают коммерческие препараты. Так, фирма За!е1еЛ .¿/пе., (Зал Зги по ЗО., УЗй ) продает моноклональные антитела для определения регуляторов роста растений. Чувствительность метода определения метилового эфира индолил-3-уксусной кислоты находится в пределах от 0,5 до 100 пикомолей в 0,1 мл.

Фирма &г.аги1е Зкшегоп. - ёашго/ьтеп1о£ аЗкод/гоз&сз, Лгс.> (.&иг£гп.~ о/г, Л/Р, 1/3(2 ) выпускает &гХВсгеел. тест-наборы для определения пестицидов. Эти наборы @игьк-Сагс/$ состоят из планшетов и реагентов (антитела и субстраты ферментов). Наборы содержат индикатор, который изменяет цвет, если в испытуемом объекте содер жится пестицид. Эта методика требует нескольких минут для исполнения и является полуколичественной, стабильна в использовании и нашла широкое применение для экспресс-анализа большого числа проб. Недавно фирма разработала два набора для определения гербицида параквата и инсектицида паратиона.

Фирма Утлъигиэзу^етз', ($гс/о/е/ого1 , 77?ё разрабатывает гомогенный иммуноферментный анализ для ряда пестицидов.

Однако большинство иммуноферментных методов определения пестицидов, разработанных в академических лабораториях, еще не получило широкого коммерческого спроса, хотя экономическая выгода оче видна.

Я.Ж.Залёеш/ <?/^(1987) считают, что в ближайшие 10-15 лет доступность иммуноанализа, проводимого на месте, определит ряд экономических решений в агротехнике.

Таким образом, анализ экспериментальных исследований по изучению иммунотоксичности пестицидов привел нас к убеждению, что организм использует иммунологические механизмы для сохранения го-меостаза гораздо шире, чем зто представлялось до настоящего времени.

Разработанные и экспериментально обоснованные методические подходы иммунотоксикологического анализа пестицидов могут быть заложены в научную практику предупредительного санитарного надзора наряду с изучением-безопасности химических веществ по показателям репродуктивной функции, 'мутагенного и аллергенного действия .

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Жамсаранова, Сэсэгма Дашиевна, 1994 год

1. Алимова МЛ'., Маджидов А.В., Камалов З.С. Естественные киле-ры у лиц, длительно контактировавших с пестицидами // Иммуноло-гия-1989.-15.-С.6Ь-70.

2. Арион В.Я. Выделение, физико-химические свойства и биологическая активность Т-активина // Итоги науки-и техники. Иммуноло-гия.^1982.-Т.I0.-С.45-эЗ.

3. Арчаков А.И.,Карузина И.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии //Вест.АМН' СССР-1988.-Т.1.-С.14-23.

4. Ахундов В.Ю.,Лурье Л.М. ,Багирова С-.М. ,Исмайлова И.М. Влияние севина на иммунологическую реактивность организма/Д'иг. и сан.-1981-К.-С. 25-28.

5. Банникова Г .-А. ,Чипышева Г. А. Получение моноспецифических антител к А-белку и иммунохимическое изучение его распределения в нормальных и опухолевых тканях //Вопр.мед.химии-1979-№3-С.292-297.

6. Барсуков А.А.,Филатов А.В.,Васин Ю.А. и др. Хемилюминесцент-ный анализ фагоцитоза макрофагов //Иммунология-1983.-Ш.-С.63-66.

7. Биохимические методы исследования мембран /Под ред.З.Мэдди-М: Мир, 1979.-С.292-297.

8. Борисенко Н.Ф. Изменение антигенной структуры тканевых протеинов под. влиянием ртутьорганических соединений.//Гигиена труда и проф.заболеваний-197о.-#2.-С.31-30.

9. Борисенко Н.Ф.,Пьянзина В.И. О возможности повышения сопротивляемости организма при воздействии этилмеркурхлорида//Гигие-на и санитария-1977.-М.-С. 100-101.

10. Ю.Врок И. Фрагментирование иммуноглобулинов //Иммунологическиеметоды /Под ред.ХДримеля-М.:Мир,1979.-С.390-423.1.. Бургасов П.Н.,Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция-М.:Медицина, 1984. 212 С.

11. Гигиеническая характеристика условий труда и состояние здоровья рабочих, занятых производством карбофоса /Отчет Куйбышевского научно-исследовательского института гигиены.-Куйбышев,1974

12. Голиков С.Н.,Саноцкий И.В.,Тиунов I.A. Общие механизмы токсического действия-Ленинград: Медицина, 1986.-276 С.

13. Горбачевская Е.§. Влияние /-изомера гексахлорцикдогексана на образование антител в условиях хронической интоксикации //Гиг.и сан. -1980. -1Й-С. 72-73.

14. Г'урвич А.Е. »Кузовлева. О.Б.,Туманова А.Ё. Получение Шелково-целлюлозных-комплексов (иммуносорбентов) в виде суспензий, способных присоединять большие количества антител //Биохимия-196,1- . Т. 26. -Вып .5.-С.934-942.

15. Джаббаров Р.Д.,Криворучко "Б.И. -Коррекция левамизолом-Т-системы лимфоцитов .в эксперименте и у лиц, контактирующих с пестицидами //Гигиена.применения, токсикология пестицидов и полимерных материалов-1984-Вып.14.-G.86-87.

16. Дуглас С.Д.,Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике/Пер.с англ.#илатова,Т.П.-М.-;Медицина, 1983. 18.-Дьяконов В.П. Справочник по расчетам на микрокалькуляторах.-М., 1986.

17. Зильбер Л.А. ,Абелев Г.й.,.: Вирусология и иммунология рака-М.: . Медгиз,1962.-458С.v

18. Золртникова.Т.П. ,0 нарушении иммунологической реактивности организма под воздействием пестицидов в условиях теплиц //Гигиена труда и проф.заболеваний-1980.-Ш.-С.38-40.

19. Иммунологические методы /Под ред.ХДримеля-М.:Мир, 1979-518C.

20. Иммунологические методы /Под ред.Г.§римеля-М.¡МедицинаД987-472с.- 199

21. Каледин В.Й. Биохимическое и иммунологическое изучение А-бел ков печени животных, различающихся по чувствительности к канце- , рогенным азокрасителям: Автореф.дисс.канд.мед.наук-Новосибирск, 1972.-17С.

22. Кенигсберг Э.Я.Патогенез иммунологической недостаточности, обусловленной пестицидами.//Сб. :■ В опросы иммунологии-Минск,1979. С.116-121.

23. Кенигсберг Н.Э. Действие пестицидов на иммунную- систему организма животных и основы профилактики иммунологической недостаточности: Автореф.дисс.докт.биолог.наук-Минек,1981-34С.

24. Кирилина ■ Е.А. ,Шанурин С.10. ,аюнина Л.А. и др. Изоляция индивидуального миелопида, обладающего иммуностимулирующей активностью //йммунология-1992.-1°4.С.31-33. , ■■

25. Ковалев й.Е.,Борисова Л.Н. Влияние индукторов-микросомальных оксидаз со смешанной функцией на иммунный ответ у мышей,•вызываемый гетерологичными эритроцитами 7/Ж.МЭЙ-1981.№4-С.42-46.

26. Ковальчук Л.В.,Чередеев А.Н. Актуальные проблемы оценки иммунной системы человека- на современном этапе //Иммунология-1990-№6.-С.4-7.

27. Ковальчук Л.В. Первичные и вторичные.иммунные дефициты у че--ловека /-/Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР.сер.Иммунология.-М.,1979.-Т.8.-С.36-69.

28. Комиссаренко В.П. Спленин:биологические и лечебные.-Киев'.издание АН Украинской ССР-, 1963.-С.41.2Üu —

29. Корпачев B.B. Препараты селезенки в лечении заболеваний.-Киев: Знание,I983-C.IÔ.

30. Кузнецова С.#. Влияние миелопептидов на пролиферацию костномозговых предшественников Т-лимфоцитов //Актуальные проблемы иммунологии . Мммунодефициты и иммунокоррекция.-Владивосток,1987.-С. 1о4.

31. Куньев В.В. Фагоцитарная реакция крови как токсикологический показатель в области гигиены питания: Автореф.канд.дисс.-М., 1968.-I8C.

32. Лисовик Ж.А. Газохроматографическое -определение некоторых фосфорорганических пестицидов в крови больных при острых отрав-л ениях- : Ав т ор еф.ди с с.канд.мед.наук-М.,1980-17С.

33. Лопухин 10.M. Клинический опыт коррекции иммунной системы активным фактором тимуса (Т-активином) //Итоги науки и техники.Иммунология- 1982 . -Т .10 . -С . 30-44 .

34. Мильман M.iil. ,Субханкулова §.Б. Изменение иммунологической специфичности белков органов животных под влиянием ядохимикатов //Мед.журнал Узбекистана-1968-Io.-С.30-32,

35. Миркамалова Л.И.,Маджидов A.B. Влияние пестицидов на спонтанную миграцию лейкоцитов и продукцию фактора, ингибирующего-миграцию их у мышей //Иммунология-1969.-№5.-С.82-84.

36. Михайлова А.А.Миелопептиды: структура, функция, клиническое применение //Итоги науки и техники. Иммунология-Москва,1988.-Т.22 -С.68-90.

37. Михайлова A.A.,Захарова Л.А. Пептидные медиаторы иммунной системы и их использование для иммунокоррекции //Ж.ВХ0 им.Д.И. M ендел еева-1988.-Т.ХХХШ-Ш.-С.545-551.

38. Николаев А.И.,Субханкулова <5.В., Геллер И.О. Иммунные реакции при отравлении ядохимикатами (метилмеркаптофосом, фосфамидом, алдрином и монуроном).//Фармакология и токсикология-1970.-№6.1. С.737-738.

39. О'Врайн Р. Токсичные эфиры кислот фосфора-М:Мир,1964-С.273.,

40. Олефир А.й.,Минцер О.Д.,Сова Р.Е. 0 взаимосвязи показателей естественной резистентности организма при хронической интоксикации хлорофосом, полихлорофосом, севином //Гиг. и сан.-1977.-М.-С.20-28.

41. Олефир А.И. 0 воздействии пестицидов на иммуногенез //Врачебное дело-1978.-№э.-С.14-17.

42. Петров Р.В.,Хаитов P.M.,Манько В.М. и др. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств-М.,1984-370.

43. Петров Р.В.,Хаитов P.M.,0радовекая И.В. Иммунологический мониторинг больших групп населения страны //Иммунология-1992-M-С.43-53.

44. Сидоренко Г.И.- Фундаментальные исследования основа научного потенциала гигиены окружающей среды //Гигиена и санитария.-1989а-№3.-С.4-6.

45. Сорокин C.B. Регуляция антителообразования иммунокорригирую-щим препаратом миелопидом //Актуальные проблемы иммунологии. Иммунодефицита и иммунокоррекция-Владивоеток.1987.-С.158-159.

46. Сперанский В.В.,Балдаева 3.#. Антигенные изменения в тканях при действии ДЦТ //Мат*, XI научной конференции Восточно-Сибирского технологического института-Улан-Удэ,1973.-С.80-84.

47. Справочник по пестицидам/Под ред.акад.МЫ СССР Л.И.Медведя.-Киев :Урожай,I977-C.204.

48. Гечао Г.//Эйсэй сикэндзё хококу-1988-MOô.P.I-IO.

49. Тессенов В. Реакция "трансплантат против хозяина" на мышах-гибридах первого поколения //Иммунологические методы /Под ред. X.Фримеля-М.:Мир,I979-C.182-186.

50. Тотолян A.A.Дрейдлин Й.С.,Шамкова Н.В. Усовершенствование некоторых тестов первого уровня оценки иммунного статуса //Лаб. дел 0-1987.-№II-С.863-867.

51. Титова В.Г. О влиянии карбофоса на антителогенез //Материалы 32-ой научной конференции молодых ученых (Новосибирский мед.инст) -Нов осибирск,1971.-С.123-126.

52. Федосеева В.Н.,,Шарецкий А.Н. ,Аристовская Л.В. и др. Влияние бензола на различные фазы первичного иммунного ответа у мышей// Иммунол огия.-1988.-М.-С.47-49.бо. ¿Виз ер Л.,Физер М. Реагенты для органического синтеза-М. :Мир, I970-С.354.

53. Aldridge W.N., Miles J.W., Mount D.L» et al. The toxicologic properties of impurities in malathion // Arch. Toxicol.- 1979. v. 42. - p.95-106.

54. Allison A.C. Mechanisms by which activated macrophages nhibit lymphocyte responses //Immunol* lev. 1978. v. 40. p. 3-37*

55. Banerjee B.D. Effects of sub-chronic DDT exposure on humoral and cell-mediated immune responses in albino rats // Bull* of the Environ. Contam. and. Toxicol. 1987a - v. 39. - N 5»- p. 827-834.

56. Banerjee B.D# Sub-chronic effect of DDT on humoral immune response to a thymus-independent antigen (Bacterial lipopoly -saccharide) in mice // Bull, of the Bmriron. Gontam. and Toxi -col. 1987b - v. 39» N 5* - p. 822-826.

57. Braithwaite H.A. .Emergency analysis of paraquat in biological fluids // Human Toxicol. 1987. - v. 6. - a 1.-p.83-86.

58. Braun , Harris «J.JS» Modulation of the immune response by chemotherapy // ^harmac. Ther. 1y81. v. 14. - p. 89.

59. Brimfield A.A., Lenz D.is., Graham 0., et ai. Mouse monoclonal antibodies against paraoxonï potential, reagents for immunoassay with constant immunochemical characteristics //of Agricult. and Food ühem. 1985* - v. 33. - û 6. - p.1237-1242.

60. Bulger W.ü., Kupfer U. Characteristics of Monooxygénase-Mediated lovaient binding of Methoxychlor in Human and Rat Liver Microsomes // Drug Metabolism and Disposition 1989.v. 17. N 5. - p. 487-494.

61. Buslrway R.J., Perkins B., Savage S.A. et al. Determination of atrazine residues in water and soil by enzyme immunoassay

62. Bull. Environ » Contam. Toxicol. 1988.-v. 40.-p. 647-654.

63. Bushway. R.L., Perkins B., Savage S.A. et al. Determinationof atrazine residues in food by enzyme immunoassay // Bull* Environ. Contam. Toxicol. 1989. -v. 42, - II 6,-p, 899-904.

64. Butler IT,P. Antibodies as specific antagonists of toxin, drugs and hormones // Pharmacol. Sev. 1982. - v. 34. -11,- p. 109-114.

65. Oadot K., Descotes J., Grenot C. et al. Increased plasma paraquat levels in intoxicated mice following antiparaquat FCabMg treatment // J. of Immunopharmacol. 1985. - v. 7.- IT 4. p. 467-47?.

66. Casale G.P., Cohen S.D., Di Capua H.A. Effects of para -thion on the IgM and IgG responses to sheep red cells in two mouse strains // Toxicol. 1982. - N 2. - p. 94.

67. Casale G.P», Cohen S.D., Di Capua H.A. The effects of organophosphate-induced cholinergic stimulation on the antibody response to sheep erythrocytes in inbred mice // Toxicol, and Appl. Pharmacol. 1983. - v. 69. -12, - p. 198-205.

68. Casale G.P., Cohen S.D., Di Capua H.A. Parathion-induced suppression of humoral immunity inbred mice. Section of phar -macol. and Toxicol // Toxicology Letters 1984 . v . 23.1. 2. p. 239-247.

69. Catinot E., Hoellinger H., Sonnier M. et al. In vitro co-valent binding of the pyrethroids cismethrin, Cypermethrin and deltamethrin to rat liver homogenate and microsomes //

70. Arch, of Toxicology 1989. - v. 63. - N3.-p. 214-220.

71. Cheung P., Gee S.J., Hammock B.D. Pesticide immunoassay as a biotechnology // ACS Symposium series Amer. Chem. Soc.-1988. v. 362. - p. 217-229.

72. Clark D.A., Gauldie J., Sweeney G. et al. Enchanced suppressor cell activity as a mechanism of immunosuppression by 2,3,7,8 tetrachlorùdibenzo-p-dioxin // Proceeding of the society experimental biology and medicine, - 1981, v. 168. N 2,p. 290-299.

73. Colburn W.Â.-, White C.M. Effect of specific ant is era on the redistribution of chlorinated biphenyls in the mouse

74. Life Sci. 1979. - v. 24. - N 2 - p. 169-176.

75. Cushman J.R., Street J.C. Allergic hypersensitivity to the herbicide 2,j4~D in Balb/c mice / J. Toxicol. Environm» Health. 1982 - H 10. - p. 729-741.

76. Cunningham A.A. A Method of increased sensitivity for detecting single antibody forming cells // Nature - 1965v. 20?. p. 1106-1107.

77. Czagkowska A., Walter Z. Effect of malathion on cleic acid synthesis in phyt©hemagglutinin stimulated human lymphocytes // Human genet. 1980 . v, 56. H 2, p.189-194.

78. Dandliker W.B., Hicks A.N., Levison S.A., Stewart K., Brawn R.J. Effects of pesticides on the immune response

79. Environmental Science and Technology 1980. - v. 14» -12.- p. 204-210.

80. Davies G.E. Toxicology of the immune system // Histo -chemical J. 1981. v. 13. - N 5. - p. 879-884.

81. Desi J., Varga L., Farkas J. Studies on the immunosuppes-sive effect of organochlorine and organophosphoric pesticides in subacute experiments //J. Hyg. Epid. Microbiol. Immunol.- 1978 v. 22. - p. 115-122.

82. Desi J., Warga L., Parkas J. The effect of DDVP, on orga-nophosphorus pesticide on the humoral and cell-mediated immunity of rabbits // Arch. Toxicol. 1980. ) - Suppl. 4 -p.171-174.

83. Desi J., Varga L. Immuntoxikologische untersuchungen der Pestizide von hygienischem Standpunkt // Zentr. fur Pharm., Pharmakother. und Laboratoriumdiagn. 1983» - v.122.-p.154-155

84. Devens B.H., Grayson H.M., Imamura T. et al. 0,0,S-tri -methyl phosphorothioate effects on immunocompetence // Pestic. Biochem. Physiol.- 1985. v. 24. - p. 251-259.

85. Dreher R.M., Podratzki B, Development of an enzyme immunoassay for endosulfan and its degradation products // J.Agric.

86. Food Ghem-. 1988. - v. 36. - I 5. - p. 1072-1075* 110» Bdelman L. Preparation and experimentation of an antidi-gitoxin monoclonal antibody: interest in human treatment // The World Biotech. Report. - 1984. - N 1» - p. 677-682.

87. Van Imon J.M., Seiber J.N., Hammock B.D. Application of immunoassay to paraquat and other pesticides // Bioregulators for pest control / Hedin P.A. Amer. Ghem. Soc. Symposium, series 272, Washington, 1985. p. 307-316.

88. Ercegovich C.D., Pesticide identification at the residue level // Advances in Chemistry, series N 104 / Amer. Chem. Soc., Washington, D.C. Id. by Gould. 1971. - v. 11,- p.162-177.

89. Brlanger B.F. Principles and methods for the preparation of drug protein conjugates for immunological studies //Pharmacol. Rev. 1973. - V. 25. -12, - P. 271 •

90. Bsa A.H., Warz G.A., Newcomte D.S. Immunotoxicity of or-ganochlorine compounds. //J. of clinical immunology and immu-nopathology 1988, v. 49» N 1, p. 41-52.

91. Gainer J.H, Effects of heavy metals and of deficiency of zinc on mortality rates in mice infected with encephalomyocarditis virus . // Amer. J. Vet« Res, 1977.- v. 38. -p. 869-872.

92. Gee S.J., Miyamoto T., Goodrow M.H. et al. Developmentof an enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of the thiocarbamate herbicide molinate //J. Agric. Food Chem,- 1988. v. 36. -14, - p. 863-870.

93. Giurgea P. Beitrag zum Einfluß einiger organochlorurier-ter Pestizide auf die immunologische reaktvität der weilen Ratte // Arch, fur experiment . Veterinärmedizin 1978. - v.32.- N 5. p. 769-774.

94. Habeen A.F» // Analyt. Biochem. 1966.- v. 14.- p. 328.

95. Hammock B.D., Muntma R.O. Potential of immunochemical technology for pesticide analysis // Pesticide analytical methodology 1980. - v. 136. - p* 321-352.

96. Hanke J., Indulski

97. Harrison R.O., Brimfield A.A», ITelson J.O, Development of a monoclonal antibody based enzyme immunoassay method for analysis of maleic hydrazide //J. Agric. Pood Chem, 1989,- v. 37. N 4. - p. 958-964.

98. Heldman B., Balan A., Horowitz 0. et al. A novel immunoassay with direct relevance to protection against organophos;** phate poisoning //MBS Lett. 1985. - v. 180. - H 2. - p.243248.

99. Hermanowicz A., Nawarska Z., Danuta B. et al. The neutrophil function and infectious diseases in workers occupatio-nally exposed to organochloride insecticides //Int, Arch,of Occupât and Environ. Health 1982. - v. 50. - N 4. -p.329-340,

100. Hoellinger H., Sonnier M,, Gray A.J. et al , In vitro covalent binding of cismethrin, bioresmethrin and their common alcogol to hepatic proteins //Toxicol. Appl, Pharmacol,- 1985. v. 77. - p. 11-18.

101. Hambach A., Stiller-Winkler R., Oberbarnscheidt J. et al.

102. Are suppressor CD-cells the primary targer cells of lead immuno-toxicity ?

103. Jung P., Meyer H.H.D., Hamm R.T. Development of a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay for the fungicide fen-prop imorph // J. Agric. Pood Chem. 1989. - v. 37. - N 4.- p. 1183-1187.

104. Johnson H.M., Smith B.C., Baron S. Inhibition of primary in vitro antibody response by interferon preparations // J. Immunol. 1975. - v. 114-. - p.403-404.

105. Johnson K.W., Holsapple M.B., Munson A.E. An immunotoxi-cological evaluation of gamma-chlordaha // Pundam. Appl. Toxicol. 1986. - 16, - p. 317-326.

106. Loose LgD., Macrophage induction of T-suppressor cells in pesticide-exposed and protozoan-infected mice // Environ. Health Perspective 1982. - v. 43. - p. 88 - 97.

107. Lovett D., Kozan В., Hadam M. et al. Macrophage cytoto -xicityi Interleukin-1 as a mediator of cytostasis // J. Immunol. 1986. - v. 136. - p. 340-347.

108. Maliwal B.P., Guthrie P.S. Chemical modifications of Insecticide Binding Sites on Human Serum Albumin: Role of Indole, Bilirulin and Patty Acid Binding Sites // Pestic. Biochem. and- t» 22. H - p. 497-373.

109. Ketterer B., Christodoulides L. Two specific azodyecar-cinogen-binding proteins of the rat liver. The identity of amino acid residues which bind the azodye. // Chem. Biol. Interact.- 1969. v. 1. - H 2. - p. 173-183.

110. Knopp D., Nuhn P., Dobberkau H-J. Radioimmunoassay for2,4-dichlorophenoxyacetic acid //Arch. Toxicol»- 1985. v. 58,- p. 27-32.

111. Knight E.V., Alvares A.P., Chin B.H. Effects of phénobarbital pretreatment on the in vivo metabolism of carbaryl in rats //Bull, of Environ. Contain, and Toxicol. 1987. - v. 39.-35T 5.- p. 815-821.

112. Krzystyniak K., Bernier J., Hugo P. et al. Suppression of MHVZ virus-activated macrophages by childrin.

113. Biochem. Pharmacol. 1986,- v. 35. p. 2577-2586.

114. Lafarge-Prayssinet C., Decloitre P. Modulatory effect of the pesticide captan on the immune response in rats and mice // J. of Imm-unopharmacol. 1982. - v. 4. - Iff 182. - p.43-52.

115. Landsteiner K. The specificity of serological reactions.- Harvard University Press, Cambridge, Mass. 194-5* Dover Publications, Inc., lew-Iork, 1962, 330 p.

116. Lankov? R.K., Grothaus G.D., Miller S.A. Immunoassays for crop management systems and Agricultural Chemistry //Biotechnology in Agricultural Chemistry, Amer. Chem. Soc. 1987. -v.19- p. 228—252.

117. Mc. Laren M.L., Lilliwait J.S., Au A.K.S. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ILJSA)s practical aspects of standartiaation and quality control //Med. Lab. Sci. 1981.- v. 38. Ж 3. - P. 245-251.

118. Lis Т., Mierzejwski J. Inhibition of immune response by diisopropyl phosphofluoridate //Arch, of Toxicol. 1980.-v. 45

119. Physiol. 198?. - v. 19. - IM. - p. 104-113*

120. Mallipudi N.M., Umetsu N., Tola R.F. et al. Toxicity of Q,0,S-trimetyl and trimethyl phosphorothioate to rats //J# Agric. Pood Chem. 1979. - v. 27.-p. 463-466,

121. Mallipudi N.M., Talcott I.E., Ketterman A. et al. Pro -perties and inhibition of rat malathion carboxylesterases //J. Toxicol. Invironm. Health 1980. - v.6. - p. 585.

122. Mantovani A., Luiniuf W., Peri G. et al. Effect of chemo -therapeutic agents on natural cell-mediated cytotoxicity in mice // J. Natl. Cancer. Inst, 1978. -v. 61. - p. 1255-1261

123. Marcus Iu, Margel S., Savin H. et al. Therapy of digoxin intoxication in dogs by specific hemoperfusion through agarose, polyacrolein microsphere beads-antidigoxin antibodies // Amer. Heart J» 1985. - v. 110. - N 1. - pt 1. - p. 30-39.

124. Mierzejewski J. The immune processes in animals poisoned with methylfluorophosphoric acid isopropyl ester (1FAJE) 1. Effect of poisoning on certain immunological indices // Exp»Med, Microbiol. (Pol.) 1970a. - v. 22. - p. 269-275.

125. Miller K. Immunotoxicology // Clin. Exp. Immunol. -1985 v. 61. - N 2. - p. 219-223.

126. Olson L.J., Brickson B.J., Hinsdill R.B, et al. Aldicarb immunomodulation in mice! an inverse dose-response to parts per billion levels in drinking water // Arch, of Environ.Contain. and Toxicol. 1987. - v. 16. - IT 4. - p. 433—4-39*

127. Padki M.M., Bhide M.B. Protective antibodies to fenitro-oxon // Indian. J. Med. Res, 1984. - v. 79. - N 1.'- p.137-141.

128. Plescia 0*J., Smith A.H., Greenwich K, Subversion of immune system by tumour cells and the role of prostaglandins // Proe. Natl* Acad. Sci. USA 1975* - v. 72. - p. 1848-1853.

129. Reed B.J., Beatty P.W. Biosynthesis and regulation of glutathioni Toxicological implications // Rev. Biochem. Toxicol. 1980. - v. 2. - p. 213-251.

130. Reyes H., Levi J., Gatmaitan Z. et al. Studies of Y and Z, two hepatic cytoplasmic organic anionbinding proteins: effect of drug, chemicals, hormones and cholestasis. // The J. of Olin. Invest. 1971. - v. 50. - p. 2242-2251.

131. Rodgers K.E., Grayson M.H., Imamura T. et al. In vitro effects of malathion and 0,0,S-trimethyl phosphophthioate on cytotoxic T-lymphocyte responses // Pestic. Biochem and Physiol. 1985a. - v. 24. - p. 260.

132. Rodgers K.E., Imamura T., Devens B.H. Investigations into the mechanism of immune suppression caused by 0,0,S -tri-methyl phosphorothioate. I Characterization of immune cell population affected // Immunopharmacol. 1985 b - v.10.-p. 171.

133. SchwaIbbe M, , Dorn S., Beyermann R. Enzyme immunoassay and fluoroimmimoassay for the herbicide dicl of op-methyl //J". Agricult. and Pood Chem. 1984 - v. 32. - N 4. -p. 734-741.

134. Sharma R.P., Zelman M.G. Immunologic alterations by environmental chemicals: Relevance of studying mechanisms ver -sus effects // J. Immunophar. 1980. - v.2. - H 3. - p. 285.

135. Sidell N., Ramarao G.7., Tompkins W.A. et all Phagocytic and Pc receptor functions of alveolar macrophages in cats following ingestion of hexachlorbenzene // Veterinary and Human Toxicol. - 1979. - v. 21. - N 4. - p. 254-257.

136. Stanker L.H., Bigbee C«, Van Emon J. et al. An immuno -assay to pyrethroidss detection permethrin in meat //J. Agric. Pood Chem. 1989. - v. 39. - N 3. - p. 834-839.

137. Thomas «X.K., Imamura T. Immunosuppressive effect of an impurity of malathion: Inhibition of Murine T-and B lymphocyte responses by 0,0,S-Trimethylphosphorothioate // Toxicol, and Appl. Pharmacol.- 1986. - v. 83. - H 3. - p. 456-464.

138. Tiefenbach B., Hennighausen ¿T., Lange P. Zum mechanis -mus der acuten wirhumgen phosphororganischer pestizide auf das immunsystem //Zbl. Pharm. Pharmkother. and Laboratoriumsdiagn. -1983 v. 122. - N 2. - p. 156.

139. Ting C.C., Stringer S.Y., Hargrave M.S. Induction of suppressor T-cells by interleukin-2 // J, Immunol. 1984.- 1984. v. 133. - p. 261»

140. Traczyk Z., Blaton 0., Arczynska E. et al. Effect of222 —chlorinated pesticides on leukocyte migration in vitro //Acta Med. Pol. 1978. - v. 19. - N 4. - p. 451-459.

141. Traczyk Z., Rudowski W. Organoehlorine insecticides as potential factors influencing blood cell functions // Acta Physiol. Pol. 1979. - v. 30. - N 5/6.-p. 111-118.

142. Tryphonas H., Munro J.C. Risk-benefit assessment in im-munotoxicology // Immunotoxicology a current perspective of principles and practice / Series Gs ecological sciences 1984. -12. - p. 141-150.

143. Umetsu U., Mallipudi B'.M., Toia R.P. et al. Toxicologi-cal properties of phosphorothioate and related esters present as impurities in technical organophosphorus insecticides // J. Toxicol. Snvironm. Health 1981. - v. 7. - p. 481-497.

144. TJmetsu N., Grose F.H., Allahyari E. et al. Effect of im-purites on the mammalian toxicity of technical malathion andacephate // J. Agric. Food Chem. 1977- - v. 25.-p. 946-953.k . , - ; ••

145. Vanderlaan M., Van Bmon J., Watkins B. et al. Monoclonal antibodies for the detection of trace chemicals // Pesticide sciehce and biotechnology / Id. by Greenhalgh R., Roberts T«R.- Oxford etc.: Blackwell Sci . 1987. p. 597-602.

146. Vanderlaan M., Watkins B.I., Stanker L. Environmental monitoring by immunoassay. // Snviron. Sci. Technol. 1988.- v. 22. - I 3. - P. 247-253.

147. Valdimarsson H. Immunity and immunity deficience //Immune system course. Md. and cellular Basis Immunity. Oxford , 1975. - P. 317-332.

148. Vos J.G. Immunotoxicity assessments screening and function studies // Arch, of Toxicol. 1980. - v. 45. - N 4.- p. 95-108.

149. Vos J.G. Methods for testing immune effects of toxic chemicals ï evaluation oft the immunotoxicity of various pesticides in the rats // Pestic. Chem. Hum, Welfare and Environ. / Trac. 5-th Int. Congr. , Kyoto. 1982. - v. 3. - p. 497-504.

150. Walter Z., Czajkowski A., Lipecka K. Effect of malathion on the genetic of human lymphocyte stimulated by phytohemagglu-tinin (PHA). // Human Genetic- 1980, 53 . N 3- p. 375-381.

151. Whaley K., Lappin D., Barkas J. C^ synthesis by human monocytes is modulated by a nicotinic cholinergic receptor // Nature (London) 1991. -v. 293- - p. 580-583.

152. Whisler R.Z., Stodo J.D. Heterogeneity of murine regulatory T-cells. I Subpopulations of amlifier and suppressor1?-cells // J". Взф. Med. 1976. - v. 144. - H 2. - p. 398-413.

153. Wie S.J., Hammock B.D. Development of enzyme linked immunosorbent assays for residue analysis of difflubenzuron and BAT SJR 8514 // J. Agric. Food Chem. - 1982. - v. 30. - Ж 5.- p. 949-957.

154. Wie S., Hammock B.D. Comparison of coating and immunizing antigen structure on the sensitivity and specificity of immuno-assagis for benzoylphenylurea incecticides // J. Agric. and Food Chemistry 1984. - v. 32. - Ж 6. - p. 1294-1301.

155. Wing K.D., Hammock B.D. Stereoselectivity of a radioimmunoassay for the insecticides S-bioallethrin // Experientia-1979. v. 35. - Ж 12. - p. 1619-1620.

156. Wright A.I?. , Green T.P., Robson R.T. et al. Specific polyclonal and monoclonal antibody prevents paraquat accumula -tion into rat lung slices // Biochem . Pharmacol. 1987»- v. 36. -18, p, 1325-1331»

157. Yalow R.S., Berson S.A. Principles of competitive protein-binding assays-Odell W.D. and Daughaday W.H. Id Lippincott J.B. Co., Philadelphia, 1971. p. 374.

158. Yoshida I1., Shimamura T, Immunotoxicity-from the point of "wiew of industrial health // Huxon kocexin karaky kaucu- 1989. v. 13. - N 1. - p. 30-37.

159. Ziprin R.Iu, Fowler S.R. Rozetfee-forming ability of alveolar macrophages from rat lungs inhibition by hexachloroben-zene // Toxicol, and Appl. Pharmacol. 1977. - v. 39.-N 1.- p. 105 109.