Разработка конструкций и синтез рекомбинантных химерных генно-инженерных белков ВИЧ-1 и ис-следование их свойств в твердофазном иммунном анализе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Гасанов, Вагиф Али оглы

• Гасанов, Вагиф Али оглы
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Гасанов, Вагиф Али оглы

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка конструкций и синтез рекомбинантных химерных генно-инженерных белков ВИЧ-1 и ис-следование их свойств в твердофазном иммунном анализе»

Классификация ВИЧ РАЗНОВИДНОСТИ ВИЧ СТОЕНИЕ ВИЧ ГЕНОМ ВИЧ

ПРОНИКНОВЕНИЕ В КЛЕТКУ И ЦИКЛ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ CD4 — главный рецептор ВИЧ. Рецепторы хемокинов — корецепторы ВИЧ. СОБЫТИЯ ПОСЛЕ ПРОНИКНОВЕНИЯ ВИРУСА В КЛЕТКУ. ВИЧ И ИММУННАЯ СИСТЕМАДендритные клетки как основные антигенпредставляющие клетки.

Взаимодействие дендритных клеток с В- и Т-лимфоцитами.

Лимфоидная ткань как место репликации вируса.HLA и иммунный ответ на ВИЧ.

Клеточный ответ на ВИЧ.

Т-хелперы 1 и 2 типа.

Гуморальный иммунный ответ на ВИЧ.Gpl20.Gp41.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ52525353535454565858585959606061616262626363646465МАТЕРИАЛЫ Реактивы Ферменты ОлигонуклеотидыБактериальные штаммы Ecsherichia coli Питательные среды Буферные растворы Приборы и оборудование МЕТОДЫКлонирование, посев на чашки, культуральное выращивание.

Индукция синтеза белка.

Анализ белка электрофорезом в ПААГ.

Перенос на нитроцеллюлозную мембрану и иммуноблот.

Осаждение ДНК этаноломВыделение плазмидной и фагмидной ДНК из небольшого объема ночной культурыЭлектрофорез ДНК.

Расщепление ДНК рестриктазами.

Лигирование фрагментов ДНК по "липким концам"Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Определение нуклеотидной последовательности.

Хроматография на колонке с Chelating Sepharose.

Повторная хроматография на колонке с Chelating Sepharose. (только для гес 24-41). Диализ.

Ионобменная хроматогрфия на Q Sepharose.

656667676868697070727579808183МАСС-спектрометрия. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕПОДБОР УСЛОВИЙ ДЛЯ НАРАБОТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41)В ФЕРМЕНТЕРЕ.

Подбор рН.

Подбор температуры.

Подбор условий по насыщенности раствора кислородом. Подбор оптимальных скоростей вращения венчика шейкера. НАРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41) И АНАЛИЗ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПАРТИЙ. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ПОЛУЧЕННЫХ ПАРТИЙ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41).

ОЦЕНКА СТРУКТУРЫ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (24-41).

Проверка иммунологических свойства белка гес (24-41) в иммуноблоте. РАЗРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ХИМЕРНОЙ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ ЭПИТОПОВ 2F5 И 4Е10 КОРОВОГО БЕЛКА GP41 ВИЧ-1, И НОСИТЕЛЯ - МУТАНТНОГО, НЕТОКСИЧНОГО БЕЛКА ФНО, СПОСОБНОГО ТРИМЕРИЗОВАТЬСЯ, ДЛЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ЭПИТОПОВ ВИЧ-1 В ФОРМЕ, СООТВЕТСТВУЮЩЕЙ ТАКОВОЙ У НАТИВНОГО ВИРУСА. СОЗДАНИЕ ПЛАЗМИДЫ, НЕСУЩЕЙ ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК REC(TNF-2F54E10).

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ НАРАБОТКА И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (TNF-2F54E10).

86 ОЦЕНКА ХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННОГО ХИМЕРНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА REC (TNF-2F54E10), ДОКАЗАТЕЛЬСТВО ЕГО СПОСОБНОСТИ ТРИМЕРИЗОВАТЬСЯ.

89 Проверка иммунологических свойства белка rec (TNF-2F54E10) в иммуноблоте.

90 Доказательство тримеризации рекомбинантного химерного белка rec (TNF-2F54E10) путем анализа гетеротримеров.

93 ЗАКЛЮЧЕНИЕ95 ВЫВОДЫ96 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

98 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫВВЕДЕНИЕАКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫПроблема ВИЧ/СПИД на нашей планете с каждым годом становится все острее. Официальная статистика утверждает, что сейчас в мире от ВИЧ/СПИДа погибло более 25 млн. человек, 65 млн. инфицировано и количество инфицированных с каждым днем возрастает. Все ранние применяемые классические методы защиты от ВИЧ/СПИД не привели к каким-либо значимым результатам, лишь с внедрением в клиническую практику высокоактивной многокомпонентной специфической антиретровирусной терапии стало возможным на некоторое время продлить жить ВИЧ-инфицированным. Но несмотря ни на что, гибель ВИЧ-инфированных на сегодняшний день неизбежна. Связанно это с некоторыми особенностями ВИЧ:• Не зафиксировано ни одного случая выздоровления от СПИДа. Итог заболевания - смерть.• ВИЧ обладает крайне высокой вариабельностью (субтипы + рекомбинантные формы).• Отсутствует адекватная модели ВИЧ-инфекции/СПИДа на животныхТ.о. классические пастеровские подходы для создания вакцины не применимы. Мы не можем вводить в организм человека, ослабленный или убитый вирус, т.к. есть возможность инфицировать человека, что затем приведет и к гибели. Нельзя вводить и разрушенный ВИЧ, а так же некоторые его части, полученные из нативного вируса, т.к. существует вероятность того, что в полученном препарате может присутствовать вирус неповрежденный, что в конечном итоге приведет к заражению и гибели человека. Единственным направлением, признанным на данный момент наиболее безопасным иперспективным, является вакцина созданная на основе генно-инжинерных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ.

В мире существует великое множество кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИДа, многие проходят клинические испытания. К сожалению, ни одна до сих пор не достигла главного результата - защиты от ВИЧ-инфекции.

На основе полученного мирового опыта можно предположить, что при подборе последовательности рекомбинантного белка необходимо опираться как на наиболее консервативные части белков ВИЧ-1, так и на наиболее иммуногенные, при этом различные эпитопы белков ВИЧ могут группироваться друг с другом, т.е. рекомбинантная молекула должна быть химерной. Также необходимо учитывать сложную пространственную структуру белков ВИЧ, т.е. эпитопы могут быть не линейными, а пространственными (конформационными).

Но, помимо создания рекомбинантных белков — основ кандидатных вакцин, также очень остро стоит вопрос масштабного производства тех из них, которые прошли доклинические испытания. Связанно это, прежде всего с тем, что те количества белка, которые получают в обычной биотехнологнической лаборатории, не могут покрыть потребностей при проведении клинических испытаний. Процесс получения больших количеств рекомбинантных белков отличается от получения их в аналитических количествах и, помимо высокого качества получаемого препарата необходима и воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантных белков. Не стоит забывать, что любая информация, полученная в момент испытаний, может повлечь за собой изменение состава или структуры рекомбинантного белка, что приведет к перенастройке всей производственной линии. Т.о. весь процесс получения рекомбинантных белков, копирующих иммунореактивные участки белков ВИЧ-1, от аналитических количеств до макроколичеств должен находится в одних руках - в руках коллектива авторов.

Все это говорит о том, что создание вакцины против ВИЧ/СПИДа на сегодняшний день является не прикладной, а фундаментальной задачей. Мировая общественность признает, что до появления вакцины, способной противостоять ВИЧ/СПИДу, должно пройти 15-20 лет. Поэтому любая информация, полученная во время проведения испытаний кандидатных вакцин, будет способствовать модернизации новых серий кандидатных вакцин. Подобная модернизация, в свою очередь приведет к скорейшей победе над страшным заболеванием и сохранению жизни и здоровья миллионам людей на планете.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: наработать в количествах, достаточных для проведения второй фазы клинических испытаний рекомбинантный белок rec (24-41), прошедшего доклинические и первую фазу клинических испытаний как основа анти-ВИЧ/СПИД-вакцины «ВИЧРЕПОЛ», создание новой серии рекомбинантных белков - основ вакцин против ВИЧ/СПИД.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ1. Подобрать условия для наработки рекомбинантного белка rec (24-41) в ферментере.

2. Добиться воспроизводимости получения новых партий рекомбинантного белка rec (24-41) и наработать данный белок.

3. Произвести хроматографическую очистку полученных партий рекомбинантного белка rec (24-41).

4. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (24-41).

5. Разработать рекомбинантную химерную белковую молекулу, состоящую из эпитопов 2F5 и 4Е10 белка gp41 ВИЧ-1, и носителя - нетоксичного мутантногоTNF, способного тримеризоваться, для представления эпитопов ВИЧ-1 в форме, соответствующей таковой у нативного вируса.

6. Создать плазмиду, несущую ген, кодирующий белок rec (TNF-2F54E10).

7. Произвести ферментативную наработку и хроматографическую очистку рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10).

8. Оценить структуру и иммунологические свойства полученного рекомбинантного белка rec (TNF-2F5-4E10), доказать его способность к тримеризации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫВпервые проведена масштабная наработка рекомбинантного белка гес(24-41). Показана воспроизводимость наработки партий рекомбинантного белка гес(24-41). Создан штамм-продуцент ВЦ24-41) способный продуцировать белок rec (24-41) в условиях ферментации. Проведена работа по подбору оптимальных условий для экспрессии белка rec (24-41) в условиях ферментации. Подобраны условия очистки и рефолдинга макроколичеств рекомбинантного белка rec (24-41).

Впервые получен тример 2F5-4E10 на основе белка TNF. Создан ген, кодирующий белок rec (TNF-2F5-4E10). Получена плазмида, несущая данный ген. На основе плазмиды создан штамм-продуцент BL21(TNF-2F5-4E10). Наработан и очищен rec (TNF-2F5-4E10). Была доказана мономерная и тримерная структуры молекулы. Показана возможность тримеризоваться в различных растворах. Получены доказательства специфического взаимодействия rec (TNF-2F5-4E10) с сыворотками ВИЧ-позитивных людей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬСозданна база по масштабированию рекомбинантных химерных белков, проработана методика их ферментативной наработки, показа воспроизводимость процесса наработки.

Полученный рекомбинантный белок гес (24-41) как основа вакцины «ВИЧРЕПОЛ» продолжит дальнейшие клинические испытания.

Рекомбинантный химерный белок гес (TNF-2F5-4E10) является первым из новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД. Он пригоден для дальнейших исследований и представления к доклиническим испытаниям. На данной серии возможно изучение всех комбинаций тримерных белков ВИЧ-1.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ1. Создан штамм-продуцент BL21 (DE3)£. coli, несущий в себе плазмиду рЕТ15Ь гес24-41, способный продуцировать рекомбинантный белок гес (24-41) в условиях ферментации.

2. Были подобраны оптимальные условия для ферментативной наработки рекомбинантного белка гес (24-41).

3. Проведены работы по хроматографической очисте макроколичеств гес (24-41). Рекомбинантный белок гес (24-41) был наработан в количестве, необходимом для проведения второй стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ».

4. Показана воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантного белка гес (24-41).

5. Для полученного рекомбинантного белка гес(24-41) доказана структура, подтверждено распознавание ВИЧ-позитивными сыворотками в твердофазном иммунном анализе.

6. Разработан белок новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе тримеризующей мутантной молекулы ФН(Ж32Н.

7. Получена плазмида, кодирующая рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F54EI0), получен штамм-продуцент.

8. Рекомбинантный белок rec(TNF-2F54E10) ферментативно наработан и хроматографически очищен.

9. Доказана структура рекомбинантного белка rec(TNF-2F54E10) масс-спектрометрией. Показана способность тримеризоваться путем анализа гетеротримеров.

10. Для rec (TNF-2F54E10) изучены свойства твердофазным иммунным анализом (иммуноблотом) и показано распознавание rec (TNF-2F54E10) ВИЧ-позитивными сыворотками.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Гасанов, Вагиф Али оглы

выводы

1. Были подобраны оптимальные условия для ферментативной наработки рекомбинантного белка rec (24-41).

2. Проведены работы по хроматографической очисте макроколичеств rec (24-41). Рекомбинантный белок rec (24-41) был наработан в количестве, необходимом для проведения второй стадии клинических испытаний вакцины против ВИЧ/СПИД «ВИЧРЕПОЛ».

3. Показана воспроизводимость наработки новых партий рекомбинантного белка rec (24-41).

4. Для новых партий гес(24-41) доказана структура, подтверждено распознавание ВИЧ-позитивными сыворотками в твердофазном иммунном анализе.

5. Разработан белок новой серии кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе тримеризующей мутантной молекулы <i>HOR32H.

6. Впервые получена плазмида, кодирующая рекомбинантный химерный белок rec (TNF-2F54E10), получен штамм-продуцент.

7. Впервые рекомбинантный белок rec (TNF-2F54E10) ферментативно наработан и хроматографически очищен. Доказана структура данного белка масс-спектрометрией. Впервые показана способность тримеризоваться путем анализа гетеротримеров.

8. Для rec (TNF-2F54E10) изучены свойства твердофазным иммунным анализом (иммуноблотом) и показано распознавание rec (TNF-2F54E10) ВИЧ-позитивными сыворотками.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Не смотря на то, что детально изучен ВИЧ, а также процессы патогенеза и многие вопросы молекулярной биологии вируса остается неясным каким образом возможно защитить организм человека от ВИЧ.

Мы наблюдаем многие феномены связанные с данным вирусом. ВИЧ крайне неустойчив, даже незначительный нагрев, неговоря уже о кипячении и обработки специальными растворами, приводит к его гибели или инактивации. ВИЧ крайне малозаразен. Ведь у ВИЧ-инфицированных матерей рождаются ВИЧ-негативные дети, многие годы живут дискордантные пары и ВИЧ-негативный партнер не заражается. Кажется, что лишь незначительный толчок с нашей стороны и проблема решится. Но проходят годы, дажы десятилетия. От ВИЧ погибло людей столько же, сколько и во Второй мировой войне. И если ничего в ближайшие годы не изменится, то 60 миллионов ВИЧ-инфицированных должны будут погибнуть.

Огромные ресурсы брошены на борьбу с этим вирусом, но до сих пор весь мир ничего не может ему противопоставить.

Огромный спектр создаваемых вакцин, пока таюке не привел к значимым результатам. Мировая научная общественность прогнозирует появление вакцины через 15-20 лет. Страшно преставить сколько миллионов людей к тому времени погибнет от ВИЧ-инфекции.

Поэтому сейчас любая кандидатная вакцина, а ососбенно кандидатная вакцина построенная по новому принципу так важна. Любое новое направление в создании вакцинных препаратов против ВИЧ-СПИДа спосбно стать тем толчком, которы сдвинет проблему с мертвой точки, приблизить день победы над ВИЧ, спасти жизни многих людей.

В результате проведенной работы создан белок-тример, способный стать кандидатной вакциной новой серии. Впервые получена возможность копироваться не полько линейные эпитопы, но сложные пространственные, появилась возможность на базе полученного белка создавать тримеры прежде всего поверхностных белков ВИЧ, т.е. абсолютно точно копировать те белки с которыми прежде всего и встечается иммунная система человека.

Созданна база по масштабированию рекомбинантных химерных белков, проработана методика их ферментативной наработки, показа воспроизводимость процесса наработки. Все это позволит в кратчайшие сроки нарабатывать необходимые количества любого рекомбинантного химерного белка — основ кандидатных вакцин, при переходе от доклинических испытаний к клиническим.

На созданной базе и был наработан ранее разработанный лабораторий биотехнологии и СПИДа ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России рекомбинантный белок гес (24-41) - основа вакцины «ВИЧРЕПОЛ», для прохождения дальнейших клинических испытаний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Гасанов, Вагиф Али оглы, 2009 год

1. Emery S, Neuhaus JA, Phillips AN et al. Major clinical outcomes in antiretroviral therapy (ART)-naive participants and in those not receiving ART at baseline in the SMART Study. J Infect Dis 2008; 197: 1133-1144.

2. Katzenstein DA, Hammer SM, Hughes MD et al. The relation of virologic and immunologic markers to clinical outcomes after nucleoside therapy in HIV-infected adults with 200 to 500 CD4 cells per cubic millimeter. N Engl J Med 1996; 335: 1091-1098.

3. Sterne JA, Herna' n MA, Ledergerber В et al. Long-term effectiveness of potent antiretroviral therapy in preventing AIDS and death: a prospective cohort study. Lancet 2005; 366: 378-384.

4. UN AIDS/WHO AIDS Epidemic Update: December 2006.

5. Greener, R. «AIDS and macroeconomic impact», in S, Forsyth (ed.): State of The Art: AIDS and Economics, IAEN, — 2002, p. 49-55.

6. Wolfgang Hiibner (2009). «Quantitative 3D Video Microscopy of HIV Transfer Across T Cell Virological Synapses». Science, 2009, 323: 1743—1747

7. Wolfgang Hubner (2009). «Quantitative 3D Video Microscopy of HIV Transfer Across T Cell Virological Synapses». Science, 2009, 323: 1743—1747.

8. Wolfgang Hubner (2009). «Quantitative 3D Video Microscopy of HIV Transfer Across T Cell Virological Synapses». Science, 2009, 323: 1743—1747.

9. Centers for Disease Control. Kaposi's sarcoma and Pneumocystis pneumonia among homosexual men—New York City and California. Morbidity and Mortality Weekly Report, 1981, v. 30, p. 305.

10. Centers for Disease Control. Pneumocystis Pneumonia—Los Angeles. Morbidity and Mortality Weekly Report, 1981, v. 30, p. 250.

11. The history of AIDS 1981—1986.

12. Centers for Disease Control. Current trends update on acquired immune deficiency syndrome (AIDS) —United States. Morbidity and Mortality Weekly Report, 1982, v. 31, p. 507.

13. Gottlieb et al. Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency; N. Engl. J. Med. 1981, 305 1425—1431.

14. Durack D. T. Opportunistic infections and Kaposi's sarcoma in homosexual men; N. Engl. J. Med. 1981, 305 1465—1467.

15. Goedert et al. Amyl nitrite may alter T lymphocytes in homosexual men; Lancet 1982, 1 412—416 .

16. Jaffe et al. National case-control study of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia in homosexual men: Part 1, Epidemiologic results; Ann. Int. Med. 1983, 99 145—151.

17. Mathur-Wagh et al. Longitudinal study of persistent generalized lymphadenopathy in homosexual men: Relation to acquired immunodeficiency syndrome; Lancet 1984, 1, 1033—1038.

18. Newell et al. Toxicity, immunosupprressive effects, and carcinogenic potential of volatile nitrites: possible relationship to Kaposi's sarcoma; Pharmacotherapy, 1984, 4, 284—291.

19. Barre-Sinoussi F. et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, v. 220, p. 868.

20. Gallo R. et al. Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, v. 220, p. 865.

21. Вирусы Т-клеточной лейкемии человека.

22. Gallo R. et al. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 1984, v. 224, p. 500

23. Sarngadharan M. et al. Antibodies reactive with human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) in the serum of patients with AIDS. Science, 1984, v. 220, p. 506

24. Schupbach J. et al. Serological analysis of a subgroup of human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science, 1984, v. 220, p. 503

25. Popovic M. et al. Detection, isolation, and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science, 1984, v. 220, p. 497

26. Coffin J. et al. What to call the AIDS virus? Nature, 1986 v. 321, p. 10

27. Gelderblom H.R., Ozel M., Pauli G. (1989). "Morphogenesis and morphology of HIV. Structure relations". Arch. Virol 106: 1-13.

28. Clavel, F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science, 1986, v. 233, p. 343—346.

29. Marx J.L. (1988). "Tracking variation in the AIDS virus family". Science 241: 659660.

30. Molbak K., Lauritzen E., Fernandes D. (1986). "Antibodies to HTLV-IV associated with chronic fatal illnes resembling "slim" didease". Lancet 8517: 1214 1215.

31. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for AIDS. Science 1983, 220: 868-71.

32. Gallo RC, Sarin PS, Gelmann EP, et al. Isolation of human T cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983, 220: 865-7.

33. Clavel F, Guetard D, Brun-Vezinet F, Chamaret S, Rey MA, Santos-Ferreira O. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science 1986,233:343.

34. Liu SL, Schacker T, Musey L, et al. Divergent patterns of progression to AIDS after infection from the same source: HIV type 1 evolution and antiviral responses. J Virol 1997,71:4284-95.

35. Kirchhoff F, Greenough TC, Brettler DB, Sullivan JL, Desrosiers RC. Brief report: Absence of intact nef sequences in a long-term survivor with nonprogressive HIV-1 infection. N Engl J Med 1995, 332: 228-32.

36. Oh SY, Cruickshank WW, Raina J, et al. Identification of HIV-1 envelope glykoprotein in the serum of AIDS and ARC patients. J Acquired Immune Defic Syndr 1992, 5: 251.

37. Sunila I, Vaccarezza M, Pantaleo G, Fauci AS, Orenstein JM. Gpl20 is present on the plasma membrane of apoptotic CD4 cells prepared from lymph nodes of HIV-1-infected individuals: an immunoelectron microscopic study. AIDS 1997, 11: 27-32.

38. Gelderblom HR, Gentile M, Scheidler A, Ozel M, Pauli G. Zur Struktur und Funktion bei HIV. AIFO 1993,5:231.

39. Wong-Staal F. HIVes and their replication. In: Fundamental Virology, Ed.: Fields BN, Knipe DM et al. Raven Press, Ltd., New York 1991.

40. Wei P, Garber ME, Fang SM, Fischer WH, Jones KA. A novel CDK9-associated C-type cyclin interacts directly with HIV-1 Tat and mediates its high-affinity, loop-specific binding to TAR RNA. Cell 1998, 92: 451-62.

41. Aiken C, Konner J, Landau NR, Lenburg ME, Trono D. Nef induces CD4 endocytosis: Requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic do-main. Cell 1994, 76: 853-64.

42. Collins KL, Chen BK, Walker BD, Baltimore D. HIV-1 nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. Nature 1998, 391: 397-401.

43. Peter F. HIV nef: The mother of all evil? Immunity, 1998, 9: 433-7.

44. Miller RH, Sarver N. HIV accessory proteins as therapeutic targets. Nat Med 1997, 3: 389-94.

45. Bour S, Schubert U, Strebel K. The HIV type 1 vpu protein specifically binds to the cytoplasmic domain of CD4: Implications for the mechanism of degradation. J Virol 1995,69:1510-20.

46. Mariani R, Chen D, Schrofelbauer В et al. Species-specific exclusion of APOBEC3G from HIV-1 virions by vif. Cell 2003; 114: 21-31

47. Sheehy AM, Gaddis NC, Choi JD et al. Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral vif protein. Nature 2002; 418: 646-650

48. Turelli P, Mangeat B, Jost S, Vianin S, Trono D. Inhibition of hepatitis В virus replication by APOBEC3G. Science 2004; 303: 1829

49. Bour S, Geleziunas R, Wainberg MA. The HIV type 1 (HIV-1) CD4 receptor and its central role in promotion of HIV-1 infection. Microbiol Rev 1995, 59: 63-93.

50. Banda NK, Bernier J, Kurahara DK, et al. Cross-linking CD4 by HIV gpl20 primes T cells for activation induced apoptosis. J Exp Med 1992, 176: 1099-106.

51. Olson W, Israel R, Jacobson J et al. Viral resistance and pharmacologic analyses of phase I/II study patients treated with the HIV-1 entry inhibitor PR0542. Abstract 561, 10th CROI 2003, Boston. Abstract 561

52. Dalgleish AG, Beverley PC, Clapham PR, et al. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature 1984, 312: 763-7.

53. Klatzmann D, Champagne E, Chamaret S, et al. T-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV. Nature 1984, 312: 767-8.

54. Edwards TG, Hoffman TL, Baribaud F, et al. Relationships between CD4 independence, neutralization sensitivity and exposure of a CD4-induced epitope in an HIV-1 envelope protein. J Virol 2001, 75:5230-9.

55. Levy JA, Mackewicz CE, Barker E. Controlling HIV pathogenesis: the role of the noncytotoxic anti-HIV response of CD8+ T cells. Immunology Today 1996,17: 21724.

56. Cocchi F, DeVico AL, Garzino-Demo A, Arya S, Gallo RC, Lusso P. Identification of RANTES, MlP-la, and MIP-ip as the major HIVsuppressive factors produced by CD8+T cells. Science 1995,270: 1811-5.

57. Deng H, Liu R, Ellmeier W, et al. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 1996, 381: 661-6.

58. Doranz В J, Rucker J, Yi Y, et al. A dual-tropic primary HIV-1 isolate that uses fusin and the p-chemo-kine receptors CKR-5, CKR-3, and CKR-2b as fusion cofactors. Cell 1996, 85: 1149-58.

59. Dragic T, Litwin V, Allaway GP, et al. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature 1996, 381: 667-73.

60. Feng Y, Broder CC, Kennedy PE, Berger EA. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 1996, 272: 872-7.

61. Chan DC, Fass D, Berger JM, Kim PS. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein. Cell 1997, 89: 263-73.

62. Kilby JM, Hopkins S, Venetta TM, et al. Potent suppression of HIV-1 replication in humans by T-20, a peptide inhibitor of gp41-mediated virus entry. Nat Med 1998, 4: 1302-7.

63. Deng HK, Unutmaz D, Kewalramani VN, Littman DR. Expression cloning of new receptors used by simian and human immunodeficiency viruses. Nature 1997, 388: 296-300.

64. Liao F, Alkhatib G, Peden KWC, Sharma G, Berger EA, Farber JM. STRL-33, anovel chemokine receptor-like protein, functions as a fusion cofactor for both macrophage-tropic and T cell line-tropic HIV-1. J Exp Med 1997, 185: 2015-23.

65. Liu R, Paxton WA, Choe S, et al. Homozygous defect in HIV-1 coreceptor accounts for resistance of some multiply-exposed individuals to HIV-1 infection. Cell 1996, 86: 367-77.

66. Biti R, Ffrench RF, Young J, Bennetts B, Stewart G, Liang T. HIV-1 infection in an individual homozygous for the CCR5 deletion allele. Nature Med 1997, 3: 252-3.

67. Dean M, Carrington M, Winkler C, et al. Genetic restrictions of HIV-1 infection and progression to AIDS by a deletion allele of the CKR5 structural gene. Science 1996, 273:1856-62.

68. Anzala AO, Ball ТВ, Rostron T, O'Brien SJ, Plummer FA, Rowland-Jones SL. CCR2-64I allele and genotype association with delayed AIDS progression in African women. Lancet 1998, 351: 1632-3.

69. Winkler C, Modi W, Smith MW, et al. Genetic restriction of AIDS pathogenesis by an SDF-1 chemokine gene variant. Science 1998, 279: 389-93.

70. Murakami T, Nakajima T, Koyanagi Y, et al. A small molecule CXCR4 inhibitor that blocks T cell line-tropic HIV-1 infection. J Exp Med 1997, 186: 1389-93.

71. Schols D, Struyf S, Van Damme J, et al. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4. J Exp Med 1997, 186: 1383-8.

72. Chen JD, Bai X, Yang AG et al. Inactivation of HIV-1 chemokine co-receptor CXCR-4 by a novel intrakine strategy. Nat Med. 1997,; 3:1110-6.

73. Zou YR, Kottmann AH, Kuroda M, Taniuchi I, Littman DR. Function of the chemokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development. Nature 1998,393: 595-9.

74. Stremlau M, Owens CM, Perron MJ et al. The cytoplasmic body component TRIM5alpha restricts HIV-1 infection in Old World monkey s. Nature 2004; 427: 848-853

75. Zack J A, Arrigo SJ, Weitsman SR, Go AS, Haislip A, Chen ISY. HIV-1 entry into quiescent primary lymphocytes: Molecular analysis reveals a labile, latent viral structure. Cell 1990, 61: 213-22.

76. Chun TW, Carruth L, Finzi D, et al. Quantification of latent tissue reservoirs and total body viral load in HIV-1 infection. Nature 1997, 387:183-8.

77. Ganesh L, Burstein E, Guha-Niyogi A et al. The gene product murrl restricts HIV-1 replication in resting CD4+ lymphocytes. Nature 2003; 426: 853-857

78. Kohl NE, Emini EA, Schleif WA, et al. Active HIV protease is required for viral infectivity. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 4686-90.

79. Geij'tenbeek ТВ, Torensma R, van Vliet SJ, et al. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 2000, 100: 575-85.

80. Embretson J, Zupancic M, Ribas JL, et al. Massive covert infection of helper T lymphocytes and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS. Nature 1993,362:359-62.

81. Pantaleo G, Graziosi C, Demarest JF, et al. HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease. Nature 1993, 362: 355-8.

82. O'Brien WA, Grovit-Ferbas K, Namazi A, et al. HIV-type 1 replication can be increased in peripheral blood of seropositive patients after influenza vaccination. Blood 1995, 86: 1082-9.

83. Veazey RS, DeMaria MA, Chailfoux LV et al. Gastrointestinal tract as a myjor site of CD4 T cell depletion and viral replication in SIV infection. Science 1998; 280: 427-31

84. Brenchley JM, Schacker TW, Ruff LE et al. CD4 T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract. J Exp Med 2004; 200: 749-59

85. Mehandru S, Poles MA, Tenner-Raze К et al. Primary HIV-1 infection is associated with preferential depletion of CD4 T lymphocytes from effector sites in the gastrointestinal tract. J Exp Med 2004; 200: 761-70

86. Douek DC, Betts MR, Hill BJ et al. Evidence for increased T cell turnover and decreased thymic output in HIV infection. J Immunol 2001; 167: 6663-8

87. Dion ML, Poulin JF, Bordi R et al. HIV infection rapidly induces and maintains a substantial suppression of thymocyte proliferation. Immunity 2004; 21: 757-68

88. Carrington M, Nelson GW, Martin MP, et al. HLA and HIV-1: heterozygote advantage and B*35-Cw*04 disadvantage. Science 1999: 12, 28: 1748-52.

89. Kaslow RA, Carrington M, Apple R, et al. Influence of combinations of human major histocompatibility complex genes on the course of HIV- 1 infection. Nat Med 1996: 2: 405-11.

90. Lockett SF, Robertson JR, Brettle RP, et al. Mismatched human leukocyte antigen alleles protect against heterosexual HIV transmission. J Acq Imm Defic Syndr 2001: 27: 277-80.

91. Kaul R, Rowland-Jones SL, Kimani J, et al. New insights into HIV-1 specific cytotoxic T-lymphocyte responses in exposed, persistently seronegative Kenyan sexworkers. Immunol Lett 2001, 79: 3-13.

92. Rosenberg ES, Billingsley JM, Caliendo AM, et al. Vigorous HIV-1-specific CD4 T cell responses associa-ted with control of viremia. Science 1997, 278: 1447-50.

93. Keet IP, Tang J, Klein MR, et al. Consistent associations of HLA class I and II and transporter gene products with progression of HIV type 1 infection in homosexual men. J Infect Dis 1999, 180: 299-309.

94. Martin MP, Gao X, Lee JH, et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nat Genet. 2002, Aug;31(4):429-34.

95. Goulder PJ, Phillips RE, Colbert RA, et al. Late escape from an immundominant cytotoxic T-lymphocyte response associated with progression to AIDS. Nat Med 1997,3:212-7.

96. Pinto LA, Sullivan J, Berzofsky JA, et al. Env-specific cytotoxic T lymphocyte responses in HIV seronegative health care workers occupationally exposed to HIV contaminated body fluids. J Clin Invest 1995, 96: 867-76.

97. Altfeld M, Allen TM, Yu XG, et al. HIV-1 superinfection despite broad CD8+ T-cell responses containing replication of the primary virus. Nature. 2002; 420: 434-9.

98. Harari A, Rizzardi GP, Ellefsen К et al. Analysis of HIV-1 and CMV specific memory CD4 T cell responses during primary and chronic infection. Blood 2002; 100:1381-1387

99. Lichterfeld M, Yu XG, waring MT et al.HIV-1 specific cytotoxicity is preferentially mediated by a subset of CD8+ T cells producing both interferon gamma and tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 2004, 104, 487-494

100. Saha K, Zhang J, Gupta A et al. Isolation of primary HIV-1 that target CD8+ T lymphocytes using CD8 as a receptor. Nat Med 2001, 7: 65-72.

101. Douek DC, Brenchley JM, Betts MR et al. HIV preferentially infects HIV-specific

102. CD4 T cells. Nature 2002; 417: 95-98

103. Lu W, Wu X, Lu Y, Guo W, Andrieu JM. Therapeutic dendritic-cell vaccine for simian AIDS. Nat Med 2003; 9(1): 13-14

104. Lu W, Arraes LC, Ferreira WT, Andrieu JM. Therapeutic dendritic-cell vaccine for chronic HIV-1 infection. Nat Med 2004; 10 (12): 1359-1365

105. Walker CM, Moody DJ, Stites DP, Levy JA. CD8+ lymphocytes can control HIV infection in vitro by suppressing viral replication. Science 1986, 234: 1563-6.

106. Baier M, Werner A, Bannert N, Metzner K, Kurth R. HIV suppression by interleukin-16. Nature 1995,378:563.

107. Pal R, Garzino-Demo A, Markham PD, et al. Inhibition of HIV-1 infection by the a-chemokine MDC. Science 1997, 278: 695-8.

108. Zhang L, Yu W, He T et al. Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-1 activity of CD8 antiviral factor. Science 2002, 298: 995-1000.

109. Clerici M, Giorgi JV, Chou CC, et al. Cell-mediated immune response to HIV (HIV) type-1 in seronegative homosexual men with a recent sexual exposure to HIV-1. J Infect Dis 1992, 165: 1012-9.

110. Ferrantelli F, Rasmussen RA, Buckley KA et al. Complete protection of neonatal rhesus macaques against oral exposure to pathogenic111. simian-human immunodeficiency virus by human anti-HIV monoclonal antibodies. J Infect Dis 2004; 189: 2167-2173

111. Schmitz JE, Kuroda MJ, Santra S et al. Effect of humoral immune responses on controlling viremia during primary infection of rhesus monkeys113. with simian immunodeficiency virus. J Virol 2003; 77: 2165-2173

112. Wong MT, Warren RQ, Anderson SA, et al. Longitudinal analysis of the humoral immune response to HIV type 1 gpl60 epitopes in rapidly progressing andnonprogressing HIV-1 infected subjects. J Infect Dis 1993, 168: 1523-7.

113. Montefiori DC, Pantaleo G, Fink LM, et al. Neutralizing and infection-enhancing antibody responses to HIV type 1 in long-term nonprogressors. J Infect Dis 1996, 173: 60-7.

114. Mazzoli S, Trabattoni D, Lo Caputo S, et al. HIV-specific mucosal and cellular immunity in HIV-seronegative partners of HIV-seropositive individuals. Nat Med 1997,3:1250-7.

115. Heijne G., Gavel Y. Topogenetic signals in integral membrane proteins.// Eur. J. Biochem.- 1988- 174, pp. 671-678.

116. Белки и пептиды: в 2 т.- М.: Наука,- 1995.- Т.1, сс. 368-384.

117. Filloux A.,Michel G., Bally М. GSP-depended protein secretion in gram-negative bacteria: the Xcp system of Pseudomonas aeruginosa J / FEMS Microbiol. Rev.- 1998- 22(3), pp.177-198

118. Birnboim H., Doly I. A rapid alcaline procedure for screening recombinant plasmid DNA.// Nucleic Acids Research.- 1979- 7, pp. 1513.

119. Hanish I., McClell & M. Activity of DNA modification and restriction enzymes in KGB, a potassium glutamate buffer.// Gene Anal. Techn.-1988- 5, pp. 105-107.

120. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. М.: Мир, 1984480 с, ил.

121. Генетическая инженерия. /Щелкунов С.Н.-Новосибирск, издательство Новосибирского университета 1994-С.94-176.