Разработка композиционного состава и технологических этапов производства вакцины на основе модельных гибридных белков Е7-БТШ70 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Жученко Максим Андреевич

• Жученко Максим Андреевич
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Жученко Максим Андреевич

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ВИРУС ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

1.2. СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И СВОЙСТВА ОНКОБЕЛКОВ Е7

1.3. СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ 21 ТЕПЛОВОГО ШОКА

1.4. ЛИТЕРАТУРНАЯ СПРАВКА ПО БЕЛКАМ Е7-БТШ70

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.1. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ШТАММЫ

2.1.2. РАСТВОРЫ, РЕАКТИВЫ

2.1.3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА

2.1.4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 47 2.2.1. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ ГИБРИДНЫХ

БЕЛКОВ

2.2.1.1. ИЗУЧЕНИЕ ПРИМЕСНОГО ПРОФИЛЯ Е7-БТШ70,

СТРАТЕГИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ И СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ

2.2.1.2. МЕТАЛЛ-ХЕЛАТ АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ КАК 53 СТАДИЯ «ЗАХВАТА» ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОЧНОГО ЛИЗАТА

2.2.1.3. АНИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ КАК СТАДИЯ 58 «ТОНКОЙ» ОЧИСТКИ Е7-БТШ70

2.2.1.4. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ И ПЕРЕВОД ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ 62 В БУФЕР АФИ

2.2.2. АКТИВНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ СУБСТАНЦИЯ

2.2.2.1. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА АФИ

2.2.2.2. КОНТРОЛЬ АФИ - СПЕЦИФИКАЦИЯ, АНАЛИТИЧЕСКИЕ 75 МЕТОДИКИ, ВАЛИДАЦИЯ, АНАЛИЗЫ СЕРИЙ

2.2.2.3. ВЫБОР ПЕРВИЧНОЙ УПАКОВКИ АФИ

2.2.2.4. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ АФИ

2.2.3. ГОТОВАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ ФОРМА

2.2.3.1. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ГЛФ

2.2.3.2. ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА

2.2.3.3. ОПИСАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА ГЛФ

2.2.3.4. КОНТРОЛЬ ГЛФ - СПЕЦИФИКАЦИЯ, АНАЛИТИЧЕСКИЕ 95 МЕТОДИКИ

2.2.3.5. ВЫБОР ПЕРВИЧНОЙ УПАКОВКИ ГЛФ

2.2.3.6. ИССЛЕДОВАНИЯ СТАБИЛЬНОСТИ ГЛФ

2.2.4. РАСЧЁТ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ 104 ПРОИЗВОДСТВА

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ 117 РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ 118 ВЫВОДОВ

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 119 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка композиционного состава и технологических этапов производства вакцины на основе модельных гибридных белков Е7-БТШ70»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Группа вирусов папилломы человека (ВПЧ) включает свыше 100 различных типов [1] [2]. Более 20 из них инфицируют гениталии и слизистую ануса [3]. Установлено, что ВПЧ 16 и 18 типов служат основным провоцирующим фактором в развитии некоторых форм рака, в частности, рака шейки матки, аденокарциномы, рака влагалища, полового члена и т.д [4] [5]. Домашние животные также склонны к инфицированию папилломавирусом. Папилломы наиболее сильно распространены среди крупного рогатого скота, лошадей, кошек и собак. Несмотря на отсутствие летальных случаев, папилломы наносят существенный вред здоровью, снижают качество жизни пациентов, требуют длительного лечения и весьма часто рецидивируют независимо от типа лечения.

На сегодняшний день терапия заболеваний, ассоциированных с ВПЧ, осуществляется двумя зарегистрированными в РФ вакцинами Гардасил® и Церварикс®, содержащих в качестве действующих веществ рекомбинантные вирусоподобные частицы главного капсидного белка ВПЧ L1. Препараты направлены на профилактику инфекций, вызываемых ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов, и, соответственно, ассоциированных с ними заболеваний, таких как рак половых органов, генитальных бородавок и неоплазий.

Существенным недостатком имеющихся вакцин является их профилактическая направленность, низкая эффективность при вакцинации пациентов среднего и пожилого возраста, необходимость повторной вакцинации, высокая стоимость, а также строгие требования к условиям хранения, что может создавать определенные трудности при массовой вакцинации широких слоев населения.!Отечественных профилактических и терапевтических вакцин для лечения заболевших не разработано, что в контексте программы импортозамещения обосновывает актуальность темы исследования.

Качество фармацевтического продукта не может быть доказано за счёт выходного контроля, а должно закладываться на этапе фармацевтической

разработки. Фармразработка, впервые описанная в ICH Q8, нацелена на моделирование качественного продукта, обеспеченного надлежащим процессом производства, а также позволяет выработать научно-обоснованный подход к разработке спецификаций и управлению рисками качества. Основные понятия и этапы фармацевтической разработки биофармацевтических препаратов, адаптированные под описываемое исследование, предложены на рисунке 1.

Последние изменения отечественного законодательства - ФЗ №429 от 22.12.2014 гармонизируют требования, предъявляемые к производству и контролю лекарственных препаратов для медицинского и ветеринарного применений, и дополняет ФЗ №61. В этом свете, а также вследствие поэтапного перехода на регистрационный формат CTD, правильное планирование фармацевтической разработки является приоритетной задачей. Настоящее исследование является частью масштабной НИИР, проведённой в рамках государственных контрактов № 16.N08.12.1024 и № 13411.1008799.13.173, и направлено на реализацию этапов дизайна молекулы и дизайна лекарственной формы (рис. 1). Результаты исследований могут быть применимы в фармацевтике и ветеринарии.

Рисунок 1. Этапы фармацевтической разработки. Цветом выделена область фармаразработки описываемого исследования.

Предложенное решение данной проблемы основано на получении гибридных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей онкобелка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов, конъюгированных с аминокислотной последовательностью белка теплового шока 70 кДа Mycobacterium tuberculosis. Известно, что онкобелок E7 участвует в пролиферации опухолевых клеток при ВПЧ инфекциях, что делает его подходящей мишенью для использования в качестве действующего вещества лекарственных препаратов. БТШ70, в свою очередь, участвует в активации клеточного иммунитета и способен усиливать иммунный ответ [6] [7] [8] [9].

В научной литературе имеется ряд информации о способах получения и изучении иммуногенности гибридных белков Е7-БТШ70, однако, наряду с проблемами низкой продуктивности при культивировании в E. Coli, авторы не приводят подробной информации по способам очистки целевых белков и не освещают особенности их последующей стабилизации в растворе. Стабильных фармацевтических субстанций и готовых форм с действующими веществами Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 на сегодняшний день не разработано. По этой причине разработка технологии очистки, а также получение композиционного состава АФИ и ГЛФ, обеспечивающего стабильность белков при хранении, являются актуальным задачами.

Цель и задачи исследований. Целью исследования является разработка технологических этапов производства качественной и безопасной биотехнологической вакцины. Гибридные белки Е7-БТШ70 предложены как перспективная модель для создания эффективной вакцины. Методы очистки, обеспечивающие выделение чистого препарата, обладающего антигенными и иммуногенными свойствами, должны способствовать получению нетоксичного,

апирогенного материала, свободного от клеточного балласта. Схема достижения поставленной цели построена в соответствии с требованиями ICH Q8 (рис. 1).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- Разработать технологическую схему хроматографической очистки целевых рекомбинантных белков Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70;

- Произвести оценку антигенных и иммуногенных свойств гибридных белков;

- Предложить компонентные составы субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70, обеспечивающие стабильность при хранении, как минимум, на протяжении 6 месяцев,

- Подобрать эффективный адъювант и предложить состав вакцины Е7-БТШ70, обеспечивающий сохранение активности и стабильности при хранении, как минимум, на протяжении 18 месяцев,

- Отработать технологическую схему производства вакцины в рамках опытно-промышленного производства;

- Рассчитать экономическую эффективность разработанной технологии производства вакцины;

- Оценить безопасность вакцины в рамках доклинических исследований.

Научная новизна. Выделены и идентифицированы балластные белки, препятствующие тонкой очистке гибридных белков, разработана универсальная трёхстадийная схема хроматографической очистки, обеспечивающая получение гибридных белков с чистотой не менее 95%. Подобран компонентный состав субстанций, обеспечивающий сохранность физико-химических и биологических свойств гибридных белков на протяжении 12 месяцев, разработана технологическая схема очистки субстанций. Исследована иммуногенность различных комбинаций гибридных белков и адъювантов, выбрана доза и адъювант, обеспечивающие активность и стабильность вакцины при хранении на протяжении 18 месяцев.

Разработаны технологическая схема хроматографической очистки субстанций и технологическая схема производства вакцины.

Практическая значимость. Данные, полученные в ходе диссертационной работы, позволили получить и охарактеризовать модельные гибридные белки Е7-БТШ70, предназначенные для использования в качестве действующих веществ вакцины против заболеваний, ассоциированных с ВПЧ. Разработанная методика очистки может быть применима к ряду антигенов на основе структурных элементов разнообразных семейств ДНК-содержащих вирусов, помимо онкопротеинов Е7, включающих Т-антиген полиомавируса SV-40 и фактор синтеза Е1а аденовируса, а также их конъюгированные производные. Показана стабильность субстанций и вакцины, разработаны техническая и нормативная документация для их производства: технологические карты, методики, фармацевтическая статья предприятия, описывающие процесс производства и спецификацию на продукт. Проведены доклинические испытания терапевтической вакцины.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял разработку и оптимизацию процессов металл-хелат-аффинной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографий. Автором проведена идентификация примесного профиля, скриннинг композиционного состава субстанций и вакцины, исследована стабильность препаратов при хранении и наработаны опытные серии для обеспечения доклинических исследований препарата. Методы контроля качества субстанций и вакцины разрабатывалась совместно с сотрудниками аналитической лаборатории и с Кухаренко А.Е. (ФГУП ГосНИИгенетика).

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2015). Апробация диссертационной работы проведена на межотдельческой конференции сотрудников лабораторий ФГУП ГосНИИгенетика в ходе которой принято

заключение о соответствии работы специальности 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология) (Москва, 2015). Проверка текста диссертационной работы, осуществлённая интерактивной программой АНТИПЛАГИАТ (https://www.antiplagiat.ru/), установила, что диссертация является оригинальной на 97,19% при заимствовании, оцененном равным 2,81%. Заимствованные источники в подавляющем количестве относятся к разделу «Обзор литературы».

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, описание практического использования результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка литературы и приложений. Диссертация представлена на 144 страницах, включая 24 рисунка и 22 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 130 источника.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Идентифицирован профиль примесных белков в субстанциях целевых белков Е7-БТШ70 и выбраны условия получения активных субстанций на их основе с содержанием основного вещества не менее 95%. Показаны антигенные свойства гибридных белков в отношении первичных антител к Е7 и БТШ70. Установлено, что биохимические свойства гибридных белков во многом совпадают со свойствами онкобелков Е7 и белков теплового шока.

2. Разработана технология хроматографической очистки, включающая металл-хелат-аффинную хроматографию в денатурирующих условиях, позволяющую получить целевой белок со степенью чистоты 85%, два этапа анионообменной хроматографии, увеличивающую чистоту материала более чем 95% и гель-фильтрационную хроматографию, предназначенную для перевода гибридных белков в буфер активной фармацевтической субстанции.

3. Выбрана комбинация сахарозы, полисорбата 80 и фосфатного буферного раствора в диапазоне рН 6.8 - 7.4, позволяющая получить стабильные растворы субстанций гибридных белков, сохраняющие показатели качества в пределах спецификации в течение 12 месяцев при хранении при -20 оС.

4. Показано, что сорбция гибридных белков на гидроокись алюминия и их последующее однократное введение мышам C57BL/6 вызывает наибольшую экспрессию рецепторов клеток, специфичных при иммунном ответе на ВПЧ, включая Т-хелперные, Т-цитотоксические и NK-клетки, обуславливая значительный фармакодинамический эффект при введении вакцины и её стабильность в течение 18 месяцев при хранении при 2-8 оС.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ВИРУС ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

Папилломавирусы человека, ВПЧ (Human Papillomavirus, HPV) — группа вирусов из рода папилломавирусов, рода А семейства паповирусов (Papovaviridae). Передаются только от человека к человеку, приводят к изменению характера роста эпителиальных тканей и образованию папиллом за счёт заражения базальных клеток эпидермиса. Дифференцирующие клетки шиповатого и зернистого слоёв эпидермиса выступают местом экспрессии белков и сборки вирусов [10].

Папилломавирусы представлены вирусами сферической формы, диаметром 5255 нм, без суперкапсида. Капсид кубического типа симметрии состоит из 72 капсомеров. Геном вируса представлен кольцевидной замкнутой двухцепочечной ДНК с молекулярной массой 5 х 10-6 Да, образован приблизительно 8000 парами оснований, разделенных на 6 ранних генов (E, early), ответственных за репликацию, регуляцию транскрипции вирусного генома и трансформацию клеток, и 2 поздних (L, late) гена, контролирующих образование капсида, см. рисунок 2. Различия в последовательностях ранних и поздних генов обуславливают классификацию папилломавирусов.

Рисунок 2. А - Структура генома вируса папилломы человека 16 типа. Ранние гены - Е1, Е2, Е4, Е5, Е6, Е7, поздние гены - Ь1, Ь2. Б, В - структура капсида ВПЧ.

Инфицирование половых органов и анальной области папилломавирусом несёт высокий риск развития доброкачественных и злокачественных неоплазий и проявляется в форме двух заболеваний - кондиломы и дисплазии, при этом, злокачественность неоплазий обусловлена свойствами ранних генов. Идентификация типа папилломавирусов в организме пациента позволяет установить клинический исход и определить наиболее эффективную терапию. Так, известно, что папилломавирусы 2 и 27 типов опосредуют появление «простых» бородавок, 6 и 11 типов связаны с незлокачественными папилломами и кондиломами аногенитальной области и гортани, а 16 и 18 типов - с карциномами. Другие типы ВПЧ также могут приводить к инвазивному раку или карциномам [11]. Несмотря на тот факт, что большинство злокачественных новообразований причисляют к полиэтиологическим заболеваниям, именно вирусным факторам онкогенеза придается особое значение. Патогенез рака шейки матки, рака полового члена, а также рака мочевого пузыря, по мнению многих авторов, связана с инфицированием

именно папилломавирусом. В последние годы появилось множество информации о возможном участии ВПЧ в онкологической патологии лёгких.

Литературные данные свидетельствуют, что два ранних гена Е6 и Е7 являются онкогенами, способными изменять клеточный цикл за счёт связывания с белками-супрессорами р53 и рЯЬ. Показано, что прочность связывания и степень инактивации белков-супрессоров напрямую влияют на вероятность перевода незлокачественной папилломы в злокачественное новообразование. Продуктами экспрессия онкогенов Е6 и Е7 являются онкопротеины Е6 и Е7, играющие критическую роль в патогенезе опухолевого роста при инфицировании ВПЧ 16 и 18 типов и приводящие к подавлению механизмов иммунного контроля активности ВПЧ [12].

ВПЧ является одной из наиболее распространённых инфекций, передающихся половым путём, так, в мире ежегодно около 250 000 женщин умирает от рака шейки матки, что указывает на чрезвычайную важность поиска эффективных методов лечения инфекции [13] [14]

Стоит отметить, что ВПЧ поражает не только лиц из группы риска, но и большинство ведущих половую жизнь мужчин и женщин. Около 90% женщин заражаются папилломавирусом уже через два года после начала половой жизни, при этом, четверть из них заражаются даже при наличии одного постоянного партнера. У 99,7% женщин с гистологически подтвержденным диагнозом рака шейки матки диагностируют ВПЧ инфекцию [14]. Последние исследования подтверждают, что у 85% пациенток с кондиломами вульвы и промежности существуют признаки папилломавирусной инфекции во влагалище или на шейке матки. Более того, у 1025% из них выявляются ассоциированные с ВПЧ заболевания - цервикальные интраэпителиальные неоплазии различной степени тяжести [11] [15]. Зачастую папилломавирусная инфекция сочетается с другими заболеваниями, передающимися половым путем [15]. Наиболее существенным являются

бактериальный вагиноз, урогенитальный хламидиоз, микоплазмоз, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции.

Таким образом, среди наиболее значимых заболеваний урогенитального тракта, ассоциированных с ВПЧ, можно выделить: хронический эндоцервицит и вагинит, кондиломы шейки матки и наружних половых органов, цервикальные внутриэпителиальные неоплазии I, II и III типов, рак шейки матки (плоскоклеточный, аденокарцинома), внутриэпителиальные неоплазии вульвы и вагины I, II и III типов, а также интраэпителиальные неоплазии пениса, анальную интраэпителиальную неоплазию.

На настоящий момент не существует комплексной терапии пациентов с ВПЧ-ассоциированной инфекцией. Тем не менее, разработан ряд принципов, позволяющий достигать положительных результатов при лечении [16] [11].

Первый принцип можно определить, как «принцип деструкции», направленный на механическую обработку неопластических образований. «Принцип деструкции» основан на применении цитотоксических препаратов (подофиллин, подофиллотоксин, 5-фторурацил и др.), химической декструкции (трихлоруксусная кислота, солкодерм и др.) и физической деструкция (криодеструкция, лазеродеструкция, диатермокоагуляция, электрохирургический метод, фотодинамическая терапия).

Вторичный иммунодефицит, сопряжённый с развитием ВПЧ-инфекции обосновывает использование иммуномодуляторов различных групп и механизмов действия, лежащих в основе второго принципа терапии ассоциированных с ВПЧ заболеваний. Иммунобиологические препараты позволяют повысить эффективность терапии, снизить частоту рецидивов и ускорить элиминацию вируса из организма [17].

На сегодняшний день терапия заболеваний, ассоциированных с ВПЧ, осуществляется двумя зарегистрированными вакцинами Гардасил® и Церварикс®. Гардасил® в качестве действующих веществ содержит рекомбинантные

вирусоподобные частицы главного капсидного белка Ь1 ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов, в качестве адъюванта - аморфный гидроксифосфат-сульфат алюминия (ААИБ). Препарат направлен на профилактику инфекций, вызываемых ВПЧ 6, 11, 16 и 18 типов, а также ассоциированных с ним заболеваний, таких как рак половых органов, генитальных бородавок и неоплазий [18]. Церварикс® также содержит рекомбинантные вирусоподобные частицы главного капсидного белка Ь1 ВПЧ 16 и 18 типов, в качестве адъювантов используется система АБ04, представленная 3-0-дезацил-4Л-монофосфориллипидом А (МРЬ), сорбированным на гидроксид алюминия. Вакцина применяется для профилактики рака шейки матки, предраковых и диспластических повреждений, вызванных ВПЧ 16 и 18 типов [19].

Значительными недостатками этих вакцин являются их профилактическая направленность, необходимость повторной вакцинации, и высокая цена вследствие отсутствия аналогов. Терапевтических вакцин для лечения заболеваний, вызванных ВПЧ, до настоящего времени не разработано.

Известно, что при иммунизации мышей белками Ь1 ВПЧ 16 типа, сорбированных на аморфном гидроксифосфат-сульфате алюминия, гидроокиси алюминия (А1(ОИ)3) и ортофосфате алюминия (Л12(Р04)3), именно АЛИБ генерирует наиболее высокие титры антител и способствует активации клеточного звена иммунного ответа [20]. Система АБ04, используемая в Церварикс®, в свою очередь, запускает ключевые врожденные иммунные механизмы, вызывая Т- и В- клеточный ответ [21] [22] [23].

Сравнительный анализ структуры ААИБ и АБ04 показывает, что значительную роль в их иммуногенности играют модификации неорганических соединений алюминия. Так, ААИБ получают осаждением алюминиевых квасцов гидроксидом натрия, действие АБ04 обусловлено комбинацией гидроксида алюминия и МРЬ. Неорганические соединения алюминия стимулируют преимущественно гуморальный иммунитет, действуя на вспомогательные клетки и Т-хелперные

лимфоциты 2 типа [24], а также приводят к активации фагоцитов и запуску нескольких воспалительных реакций.

Несмотря на высокую эффективность ААНБ и ЛБ04 их использование в составе готовых лекарственных форм осложнено особенностями лицензирования адъювантов в РФ, а также патентными ограничениями компаний разработчиков. Ближайшей доступной альтернативой ЛАНБ и АБ04 является гидроокись алюминия. Гидроокись алюминия лицензирована для использования в ЕС и США [25], большинство отечественных вакцин также содержат неорганические соединения алюминия.

1.2. СТРУКТУРА, ФУНКЦИИ И СВОЙСТВА ОНКОБЕЛКОВ Е7

Основное свойство онкопротеинов Е7 заключается в их способности изолировать гипофосфорилированные формы белком ретинобластомы (рЯЬ) и провоцировать их деградацию [26]. В исследованиях биопсийного материала была установлена связь между гиперэкспрессией Е7 и уменьшением количества рЯЬ, указывая на зависимость деградации рЯЬ от трансформационной активности Е7. Онкопротеины штаммов высокого риска (16 и 18) связывают рЯЬ плотнее и фосфорилируются до большей степени нежели Е7 штаммов низкого риска, различия обусловлены разной аффинностью Е7 к рЯЬ для различных штаммов ВПЧ [27].

Аминокислотную последовательность онкопротеинов Е7 можно условно разделить на три региона СЮ, СЯ2 и СЯ3 (рисунок 3). Регионы СЮ и СЯ2 представлены неструктурированными гибкими последовательностями, готовыми к взаимодействию с белком ретинобластомы без предварительной реструктуризации Е7. Аминокислотный участок ЬНСУБ, принадлежащий СЯ2, непосредственно ответственен за связывание с В-Ьох рецептором рЯЬ. Регион СЯ3, в свою очередь, способен автономно сворачиваться в высоко структурированный цинк-связывающий домен с р1^2а1р3а2 - топологией (рисунок 4 - А, Б) [28] [29].

10 20 30 40 50

! III

впч18 mhgpkatlqdivlhlepqnei-pvdllcheqlsds-eeendeidgvnhqhlparr впч16 ;dtptlheymldlqp----ettdlycyeqlndsseee-deidgpagqaepdr-

-14 И-

cri cr2

--1/ N-

55 70 80 90 100

впч18 aepqrinmlctflcl впч16 — ahynivtf|ck

/I_

|earielwessaddlrafqqlflntlsfv1pwBasqq 105 [dstlrlcvqsthvdirtle dllmgtlgIVC qSQKP 98

cr3

Рисунок 3. Аминокислотные последовательности ВПЧ16 и 18 типов. Гидрофобные остатки, образующие гидрофобное ядро и интерфазу димера Е7 выделены жирным шрифтом, остатки цистеина, ответственные за координацию цинка выделены серым цветом. CR1, CR2, CR3 - консервативные регионы Е7 №1, 2, 3 соответственно.

Определение геометрической координации цинка методами ЯМР и EXAFS-спектроскопии, в совокупности с расчётом структурных особенностей для всех возможных комбинаций цистеина, показало, что цинк связывается с цистеином, на в положениях 66/69 и 99/102 [29]. Известно, что включение цинка в структуру Е7 опосредует цинк-зависимую димеризацию Е7, а также определяет взаимодействие Е7 с большим количеством разнообразных клеточных белков, включённых в клеточные циклы развития и апоптоза.

Известно, что добавление ЭДТА, способствующее удалению цинка из структуры Е7, приводит к разворачиванию CR3 региона [30]. Эти данные подтверждают, что цинк является важным элементом в поддержании свёрнутого состояния CR3 региона. Интерфаза димера Е7 также поддерживается гидрофобными взаимодействиями ^2^3-складки и боковых аминокислотных остатков, площадь гидрофобного ядра оценивается равной 2058 А [28].

Одиннадцать гидрофобных остатков, из которых пять являются строго консервативными, три - высоко консервативными, составляют относительно малое гидрофобное ядро каждого мономера, часть их них опосредует внутримолекулярные контакты, дополнительно обуславливающие димеризацию. Кроме того, 03-участок первого мономера формирует антипараллельное взаимодействие с в2-участком второго мономера. Интересно отметить, что БН- группы, не участвуют в формировании межмолекулярных контактов из-за стерических ограничений [29].

В попытках идентифицировать участки региона СЯ3, ответственные за межмолекулярные взаимодействия, на поверхности Е7 были размечены консервативные аминокислотные остатки. Анализ показал два консервативных участка поверхности димерной структуры Е7, являющимися предположительными сайтами связывания (рисунок 4 - В, Г) [28].

Один из участков находится на внешних краях двух а1 спиралей, второй размещён на в1-складке внешней поверхности димера. Оба участка демонстрируют высокую консервативность среди Е7 различных генотипов. Электростатическая карта поверхности Е7 демонстрирует, что области вокруг а1 спирали (участок №1) и в1-складки (участок №2) являются соответственно наиболее электроотрицательным и электроположительным (рисунок 4 - Д, Е). Эти наблюдения могут подтверждать, что а1 и в1 регионы СЯ3 опосредуют межмолекулярные контакты и, эти контакты скорее всего связаны с электростатическими свойствам белков.

Рисунок 4. А, Б - пространственная структура димера Е7 (Е7 ), розовым и жёлтым выделены ионы цинка, сносками отмечены элементы третичной

структуры димера Е7. В, Г, Д, Е - поверхностные свойства димера Е7. Оттенками зелёного цвета (В, Г) выделены области консервативных аминокислотных остатков. Оттенками красного (Д) выделены электроотрицательные области, оттенками синего (Е) - электроположительные. Расчёт электростатических потенциалов проведён в программе GRASP. Ж -структурная модель конформеров Е7 и его комплексов с pRb в растворе. Е72 -димер Е7, Е7п - олигомер Е7. З - возможные конформационные переходы Е7. Е74 -тетрамер Е7, GdmHCl - гуанидин гидрохлорид.

В многочисленных исследованиях было показано, что Е7 демонстрирует АТФ-зависимую шаперонную активность на ряде модельных белков. Изучение конформации Е7 в растворе показало, что увеличение доступности подхода растворителя к гидрофобным поверхностям димера Е7 при физиологических значениях рН и в присутствии восстановителей, способствует формированию межмолекулярных комплексов. Определено, что обработка Е7 хелатирующими агентами приводит к олигомеризации димера до молекулярного комплекса Е7П с молекулярной массой 790 кДа и диаметром 50 нм [31] (рисунок 4 - Ж). Е7П термодинамически более стабилен нежели Е72, к его образованию могут приводить многие физиологические и стрессовые ситуации, включающие окисление, уменьшение уровня цинка и сверхэкспрессию Е7 [31].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Жученко Максим Андреевич, 2016 год

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bosch FX. The causal relation between human papillomavirus and cervical cance / Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, Meijer CJLM, Shah KV // J Clin. Pathol., Vol. 244, 2002. pp. 55- 65.

2. Cogliano V. Carcinogenicity of human papillomaviruses / Cogliano V, Baan R, Straif K, Grosse Y, Secretan B, El Ghissassi F // Lancet Oncol. 2005. Vol. 6. P. 204.

3. Human papillomavirus infection and cervical cancer // World Health Organization. 2004. URL: http://www.who.int/vaccine_research/diseases/hpv/en/

4. Goodman A. Primary vaginal cancer // Surg. Oncol. Clin. N. Am. 1998.

5. Zhou J.. Expression of vaccinia recombinant HPV16 L1 and L2 ORF proteins in

epithelial cells is sufficient for assembly of HPV virion-like particles // Virology. 1991. Vol. 5. P. 21.

6. Jia-Hai Ma. Heat shock protein 70/MAGE-3 fusion protein vaccine can enhance cellular and humoral immune responses to MAGE-3 in vivo / Jia-Hai Ma, Yan-Fang Sui, Jing Ye, Ya-Yu Huang, Zeng-Shan Li, Guang-Sheng Chen, Ping Qu Hong-Ping Song, Xiu-Min Zhang // Cancer Immunology. 2005. Vol. 54. pp. 907-914.

7. Prohaszka Z. Heat shock protein 70 is a potent activator of the human complement system / Prohaszka Z., Singh M., Nagy K., Kiss E., Lakos G., Duba J., Fust G. // Cell Stress Chaperones. 2002. Vol. 7. pp. 17-22.

8. Campisi J. Role of extracellular HSP72 in acute stress-induced potentiation of innate immunity in active rats / Campisi J., Fleshner M. // J. Appl. Physiol. Vol. 94. pp. 4352.

9. Davies E. L. Heat shock proteins form part of a danger signal cascade in response to lipopolysaccharide and GroEL / Davies E. L., Bacelar M. M., Marshall M. J., Johnson E., Wardle T. D., Andrew S. M., Williams J. H. // Clin. Exp. Imminol. 2006. Vol. 145. pp. 83-189.

10. Hagensee ME. Three-dimensional structure of vaccinia virus-produced human papillomavirus type 1 capsids / ME Hagensee, NH Olson, TS Baker, DA Galloway // J. Virol. Jule 1994. Vol. 68. No. 7. pp. 4503-4505.

11. Исаков В. А. Использование циклоферона в терапии папилломавирусной инфекции. Рекомендации для врачей / Исаков В. А., Ермоленко Д. К., Кутуева Ф. Р. СПб-Великий Новгород. 2007. 64 с.

12. Дмитриев Г. А. Проблемы ранней диагностики папилломавирусной инфекции / Дмитриев Г.А., Киселев В,И., Латыпова М.Ф. // Клиническая дерматология и венерология. 2006. № 1. С. 38-40.

13. Прилепская В. Н. Папилломавирусная инфекция: диагностика, лечение и профилактика / Прилепская В. Н., Роговская С. И., Кондриков Н. И., Сухих Г. Т.. Москва: МЕДпресс-информ, 2007.

14. Dunne E.F. Prevalence of HPV Infection Among Females in the United States / Dunne EF, Unger ER, Sternberg M, McQuillan G, Swan DC, Patel SS, Markowitz LE // The Journal of the American Medical Association. February 2007. Vol. 297. No. 8. pp. 813-819.

15. Буданов П. В. Принципы лечения папилломавирусной инфекции / Буданов П. В., Вороной С. В., Асланов А. Г. // Вопр. гинекол. акуш. перинатал. 2004. Т. 3.

№ 4. С. 70-75.

16. Редькин Ю. В. Клиническая эффективность комбинации препаратов панавир и индинол в лечении женщин с папилломавирусной инфекцией / Редькин Ю. В., Батурова О. Г. // Terra Medica Nova. 2008. № 2. С. 36-41.

17. Moscicki AB. HPV vaccines: today and in the future // J. Adolesc. Health. 2008. Vol. 43(4). pp. 26-40.

18. PRODUCT MONOGRAPH GARDASIL // www.merck.ca. 2015. URL: http:// www.merck.ca/assets/en/pdf/products/GARDASIL-PM_E.pdf

19. PRODUCT MONOGRAPH CERVARIX // www.gsk.ca. 2014. URL: http:// www.gsk.ca/english/docs-pdf/product-monographs/Cervarix.pdf

20. Caulfield MJ. Effect of Alternative Aluminum Adjuvants on th Absorption and Immunogenicity of HPV16 L1 VLPs in Mice / Caulfield MJ, Shi L, Wang S, Wang B, Tobery TW, Mach H, Ahl PL, Cannon JL, Cook JC, Heinrichs JH, Sitrin RD // Hum. Vaccin. Jul-Aug 2007. Vol. 3. No. 4. pp. 139-145.

21. De Becker G. The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells / De Becker G, Moulin V, Pajak B, Bruck C, Francotte M, Thiriart C, et al. Int Immunol 2000;12(6):807-15. // Int. Immunol. June 2000. Vol. 12. No. 6. pp. 807-815.

22. Bernstein DI. Safety and immunogenicity of glycoprotein dadjuvant genital herpes vaccine / Bernstein DI, Aoki FY, Tyring SK, Stanberry LR, St Pierre C, Shafran SD, et al.. Clin Infect Dis 2005;40(9):1271-81. // Clin. Infect. Dis.. May 2005. Vol. 40. No. 9. pp. 1271-1281.

23. Boland G. Safety and immunogenicity profile of an experimental hepatitis B vaccine adjuvanted with AS04 / Boland G, Beran J, Lievens M, Sasadeusz J, Dentico P, Nothdurft H, et al. // Vaccine. December 2004. Vol. 23. No. 3. pp. 316-320.

24. Kool M. 2008. Cutting edge: alum adjuvant stimulates inflammatory dendritic cells through activation of the NALP3 inflammasome / Kool M, Petrilli V, De Smedt T, Rolaz A, Hammad H, van Nimwegen M, Bergen IM, Castillo R, Lambrecht BN, Tschopp J // J. Immunol.. September 2008. Vol. 181. No. 6. pp. 3755-3759.

25. Immunological Adjuvants. Technical Report Series 595 // apps.who.int. 1976. URL: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/41209/1/WHO_TRS_595.pdf

26. Munger K. Complex formation of human papillomavirus E7 proteins with the retinoblastoma tumor suppressor gene product / Munger K, Werness BA, Dyson N,

Phelps WC, Harlow E, Howley PM // EMBO J.. December 1989. Vol. 8. No. 13. pp. 4099-4105.

27. Münger K. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes / Münger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM, Schlegel R // J. Virol.. October 1989. Vol. 63. No. 10. pp. 4417-4421.

28. Liu X. Structure of the Human Papillomavirus E7 Oncoprotein and ts Mechanism for Inactivation of the Retinoblastoma tumor suppressor / Liu X, Clements A, Zhao K, Marmorstein R // J. Biol. Chem. January 2006. Vol. 281. No. 1. pp. 578-586.

29. Ohlenschlager O. Solution structure of the partially folded high-risk human papilloma virus 45 oncoprotein E7 / Ohlenschlager O, Seiboth T, Zengerling H, Briese L, Marchanka A, Ramachandran R, et al. // Oncogene. September 2006. Vol. 25. No. 44. pp. 5953-5959.

30. Alonso LG. High-risk (HPV16) human papillomavirus E7 oncoprotein is highly stable and extended, with conformational transitions that could explain its multiple cellular binding partners / Alonso LG, García-Alai MM, Nadra AD, Lapeña AN, Ameida FL, Gualfetti P et al. // Biochemistry. 2002. Vol. 41. No. 33. pp. 1051010518.

31. Alonso LG. The HPV16 E7 viral oncoprotein self-assembles into defined spherical oligomers / Alonso LG, García-Alai MM, Smal C, Centeno JM, Iacono R, Castaño E, Gualfetti P, de Prat-Gay G // Biochemistry. March 2004. Vol. 43. No. 12. pp. 33103317.

32. Sheng Q. The DnaJ domain of polyomavirus large T antigen is required to regulate Rb family tumor suppressor function / Sheng Q, Denis D, Ratnofsky M, Roberts TM, DeCaprio JA, Schaffhausen B // J. Virol. December 1997. Vol. 71. No. 12. pp. 94109416.

33. Münger K. The role of human papillomaviruses in human cancers // Front Biosci. March 2002. Vol. 7. pp. 641-649.

34. Münger K. Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein / Münger K, Basile JR, Duensing S, Eichten A, Gonzalez SL, Grace M, Zacny VL // Oncogene. November 2001. Vol. 20. No. 54. pp. 7888-7898.

35. Alonso LG. Chaperone Holdase Activity of Human Papillomavirus E7 Oncoprotein / Alonso LG, Smal C, Garcia-Alai MM, Chemes L, Salame M, de Prat-Gay G // Biochemistry. January 2006. Vol. 45. No. 3. pp. 657-667.

36. Clements A. Oligomerization properties of the viral oncoproteins adenovirus E1A and human papillomavirus E7 and their complexes with the retinoblastoma protein / Clements A, Johnston K, Mazzarelli JM, Ricciardi RP, Marmorstein R // Biochemistry. December 2000. Vol. 39. No. 51. pp. 16033-16045..

37. Zhu X. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK / Zhu X, Zhao X, Burkholder WF, Gragerov A, Ogata CM, Gottesman ME, Hendrickson WA // Science. June 1996. Vol. 272. No. 5268. pp. 1606-1614.

38. Hartl FU. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature. June 1996. Vol. 381. No. 6583. pp. 571-579.

39. Flynn GC. Peptide-binding specificity of the molecular chaperone BiP / Flynn GC, Pohl J, Flocco MT, Rothman JE // Nature. October 1991. Vol. 353. No. 6346. pp. 726-730.

40. Rüdiger S. Interaction of Hsp70 chaperones with substrates / Rüdiger S, Buchberger A, Bukau B // Nat. Struct. Biol. May 1997. Vol. 4. No. 5. pp. 342-349.

41. Bukau B. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines / Bukau B, Horwich AL // Cell. February 1998. Vol. 92. No. 3. pp. 351-366.

42. // www.ncbi.nlm.nih.gov: [сайт]. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ AAK44587

43. Schmid D. Kinetics of molecular chaperone action / Schmid D, Baici A, Gehring H, Christen P // Science. February 1994. Vol. 263. No. 5149. pp. 971-973.

44. Flaherty KM. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein / Flaherty KM, DeLuca-Flaherty C, McKay DB // Nature. August 1990. Vol. 346. No. 6285. pp. 623-628.

45. Gething MJ. Molecular chaperones: clasping the prize // Curr. Biol. December 1996. Vol. 6. No. 12. pp. 1573-1576.

46. Palleros DR. ATP-induced protein-Hsp70 complex dissociation requires K+ but not ATP hydrolysis / Palleros DR, Reid KL, Shi L, Welch WJ, Fink AL // Nature. October 1993. Vol. 365. No. 6447. pp. 664-666.

47. Janin J. The structure of protein-protein recognition sites / Janin J, Chothia C // J. Biol. Chem. September 1990. Vol. 265. No. 27. pp. 16027-16030.

48. Findly RC. In vivo phosphorus-31 nuclear magnetic resonance reveals lowered ATP during heat shock of Tetrahymena / Findly RC, Gillies RJ, Shulman RG // Science.

March 1983. Vol. 219. No. 4589. pp. 1223-1225.

49. Davies EL. Heat shock proteins form part of a danger signal cascade in response to lipopolysaccharide and GroEL / Davies EL, Bacelar MM, Marshall MJ, Johnson E, Wardle TD, Andrew SM, Williams JH // Clin. Exp. Immunol. July 2006. Vol. 145. No. 1. pp. 183-189.

50. Multhoff G. Heat shock protein 70 (Hsp70) stimulates proliferation and cytolytic activity of natural killer cells / Multhoff G, Mizzen L, Winchester CC, Milner CM, Wenk S, Eissner G, Kampinga HH, Laumbacher B, Johnson J // Exp. Hematol. November 1999. Vol. 27. No. 11. pp. 1627-1636.

51. Multhoff G. Heat shock protein 70 (Hsp70): membrane location, export and immunological relevance / Multhoff G // Methods. November 2007. Vol. 43. No. 3. pp. 229-237.

52. Hantschell M. Hsp70 plasma membrane expression on primary tumor biopsy material and bone marrow of leukemic patients / Hantschell M, Pfister K, Jordan A, Scholz R, Andreesen R, Schmitz G, Schmetzer H, Hiddemann W, Multhoff G // Cell Stress Chaperones. November 2000. Vol. 5. No. 5. pp. 438-442.

53. Schmitt E. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy / Schmitt E, Gehrmann M, Brunet M, Multhoff G, Garrido C // J. Leucocyte Biol. January 2007. Vol. 81. No. 1. pp. 15-27.

54. Li Z. Roles of heat shock proteins in antigen presentation and cross presentation / Li Z, Menoret A, Srivastava P // Curr. Opin. Immunol. February 2002. Vol. 14. No. 1. pp. 45-51.

55. Amoscato AA. Rapid extracellular degradation of synthetic class I peptides by human dendritic cells / Amoscato AA, Prenovitz DA, Lotze MT // J. Immunol. October 1998. Vol. 161. No. 8. pp. 4023-4032.

56. Евдонин А.Л. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции / Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. // Цитология. 2009. № 2. С. 130-137.

57. Wendling U. A conserved mycobacterial heat shock protein (hsp) 70 sequence prevents adjuvant arthritis upon nasal administration and induces IL-10-producing T cells that cross-react with the mammalian self-hsp70 homologue/ Wendling U, Paul L, van der Zee R, Prakken B // J. Immunol. March 2000. Vol. 164. No. 5. pp. 27112717.

58. Londono LP. Immunisation of mice using Salmonella typhimurium expressing human papillomavirus type 16 E7 epitopes inserted into hepatitis B virus core antigen

/ Londono LP, Chatfield S, Tindle RW, Herd K, Gao XM, Frazer I, Dougan G // Vaccine. April 1996. Vol. 14. No. 6. pp. 545-552.

59. Tindle RW. Identification of B epitopes in human papillomavirus type 16 E7 open reading frame protein / Tindle RW, Smith JA, Geysen HM, Selvey LA, Frazer IH // J. Gen. Virol.. June 1990. Vol. 71. No. 6. pp. 1347-1354.

60. Ressing ME. Human CTL epitopes encoded by human papillomavirus type 16 E6 and E7 identified through in vivo and in vitro immunogenicity studies of HLA-A*0201-binding peptides / Ressing ME, Sette A, Brandt RM, Ruppert J // J. Immumol. June 1995. Vol. 154. No. 11. pp. 5934-5943.

61. Chen XS. Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16 / Chen XS, Garcea RL, Goldberg I, Casini G, Harrison SC // Mol. Cell. March 2000. Vol. 5. No. 3. pp. 557-567.

62. Stressgen Biotechnologies I, Immune responses against HPV antigens elicited by compositions comprising an HPV antigen and a stress protein or an expression vector capable of expression of these proteins, US6524825B1, 2000.

63. "Аванген" О, Рекомбинантный гибридный белок, препарат для иммунотерапии на его основе и способ иммунотерапии рецидивирующего папилломатоза гортани, RU2290204, 2006.

64. Gordonova IK. Comparative study of Saccharomyces cerevisiae LPS / Gordonova IK, Nikitina ZK, Bykov VA // Bull. Exp. Biol. Med. October 2002. Vol. 134. No. 4. pp. 370-373.

65. Wegele H. Sti1 is a novel activator of the Ssa proteins / Wegele H, Haslbeck M, Reinstein J, Buchner J // J. Biol. Chem. July 2003. Vol. 278. No. 28. pp. 2597025976.

66. Palleros DR. DnaK ATPase activity revisited / Palleros DR, Reid KL, Shi L, Fink AL // FEBS Lett. December 1993. Vol. 336. No. 1. pp. 124-128.

67. McCarty JS. DnaK as a thermometer: threonine-199 is site of autophosphorylation and is critical for ATPase activity / McCarty JS, Walker GC // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. November 1991. Vol. 88. No. 21. pp. 9513-9517.

68. Cegielska A. Functional domains of the Escherichia coli dnaK heat shock protein as revealed by mutational analysis / Cegielska A, Georgopoulos C // J. Biol. Chem. December 1989. Vol. 264. No. 35. pp. 21122-21130.

69. Brown CR. The constitutive and stress inducible forms of hsp 70 exhibit functional

similarities and interact with one another in an ATP-dependent fashion / Brown CR, Martin RL, Hansen WJ, Beckmann RP, Welch WJ // J. Cell. Biol.. March 1993. Vol. 120. No. 5. pp. 1101-1112.

70. Chu NR. Immunotherapy of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7-expressing tumour by administration of fusion protein comprising Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin (BCG) hsp65 and HPV16 E7 / Chu NR, Wu HB, Wu T, Boux LJ, Siegel MI, Mizzen LA // Clin. Exp. Immunol. August 2000. Vol. 121. No. 2. pp. 216225.

71. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems // Appl. Microbiol. Biotechnol. January 2003. Vol. 60. No. 5. pp. 523-533.

72. Bucher MH. Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein / Bucher MH, Evdokimov AG, Waugh DS // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.. March 2002. Vol. 58. No. 3. pp. 392-397.

73. Wu J. Hexahistidine (His6)-tag dependent protein dimerization: a cautionary tale / Wu J, Filutowicz M // Acta Biochim. Pol. 1999. Vol. 46. No. 3. pp. 591-599.

74. Porath J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G // Nature. December 1975. Vol. 258. No. 5536. pp. 598-599.

75. Chen BP. Expression vectors for affinity purification and radiolabeling of proteins using Escherichia coli as host / Chen BP, Hai T // Gene. February 1994. Vol. 139. No. 1. pp. 73-75.

76. Borsig L. Expression and purification of His-tagged beta-1,4-galactosyltransferase in yeast and in COS cells / Borsig L, Berger EG, Malissard M // Biochem. Biophys. Res. Commun. November 1997. Vol. 240. No. 3. pp. 586-589.

77. Janknecht R. Rapid and efficient purification of native histidine-tagged protein expressed by recombinant vaccinia virus / Janknecht R, de Martynoff G, Lou J, Hipskind RA, Nordheim A, Stunnenberg HG // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. October 1991. Vol. 88. No. 20. pp. 8972-8976.

78. Kuusinen A. Purification of recombinant GluR-D glutamate receptor produced in Sf21 insect cells / Kuusinen A, Arvola M, Oker-Blom C, Keinänen K // Eur. J. Biochem. November 1995. Vol. 233. No. 3. pp. 720-726.

79. Леонов В.С.. Разработка промышленного способа культивирования штаммов-

продуцентов гибридных рекомбинантных белков E7 вируса папилломатоза человека 6 и 11 типов и белка теплового шока HSP 70 / Леонов В.С., Литвинова Н.А., Горожанина Е.В. // Биофармацевтический журнал. 2014. Т. 6. № 1. С. 1216.

80. // www.matrixscience.com: [сайт]. URL: http://www.matrixscience.com/

81. // www.lifetechnologies.com: [сайт]. URL: https://www.lifetechnologies.com/ru/ru/ home/brands/thermo-scientific/pierce-protein-biology.html?cid=fl-ts-pierce

82. GE Healthcare. IMAC SepharoseTM 6 Fast Flow // www.gelifesciences.com. 2005. URL: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/ Files/1314787424814/litdoc28404622AD_20110831150217 .pdf

83. GE Healthcare. IMAC SepharoseTM High Performance // www.gelifesciences.com. 2006. URL: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/ Related%20Content/Files/1314787424814/litdoc28404620_20140518231426.pdf

84. Morris AM. Protein aggregation kinetics, mechanism, and curve-fitting: a review of the literature / Morris AM, Watzky MA, Finke RG // Biochim. Biophys. Acta. March 2009. Vol. 1794. No. 3. pp. 375-397.

85. // protcalc.sourceforge.net: [сайт]. URL: http://protcalc.sourceforge.net/

86. Amersham Biosciences. Q Sepharose™ High Performance // webspace.pugetsound.edu. 2002. URL: http://webspace.pugetsound.edu/facultypages/ jgrinstead/460/Lab_Info_files/Q_SP_technical.pdf

87. YMC. Columns and bulk packings // www.ymctaiwan.com. 2011. URL: http:// www.ymctaiwan.com/download/pdf/pdf05.pdf

88. Antosiewicz J. Prediction of pH-dependent properties of proteins / Antosiewicz J, McCammon JA, Gilson MK // J. Mol. Biol. May 1994. Vol. 238. No. 3. pp. 415-436.

89. Березов Т.Т. Биологическая химия: Учебник - 2-е изд., перераб. и доп. Москва: Медицина, 1990. 452-455 с.

90. Al-Shakhshir RH. Contribution of electrostatic and hydrophobic interactions to the adsorption of proteins by aluminiumcontaining adjuvants / Al-Shakhshir RH, Regnier FE, White JL, Hem SL // Vaccine. January 1995. Vol. 14. No. 1. pp. 41-44.

91. Wolff L. Forces determining the adsorption of a monoclonal antibody onto an aluminiumhydroxide adjuvant: Influence of intterstitial fluid component // Vaccine. March 2009. Vol. 27. No. 12. pp. 1834-1840.

92. Sellers SP. Principles of biopharmaceutical protein formulation: an overview / Sellers SP, Maa YF // Methods Mol. Biol. 2005. Vol. 308. pp. 243-263.

93. Yoshioka S. Stability of Drugs and Dosage Forms. New York: Kluwer Academic Publishers, 2002. 102 - 221 pp.

94. Patra RC. Antioxidant effects of a tocopherol, ascorbic acid and L-methionine on lead induced oxidative stress to the liver, kidney and brain in rats / Patra RC, Swarup D, Dwivedi SK // Toxicology. May 2001. Vol. 162. No. 2. pp. 81-88.

95. Wu LH. Effects of EDTA and low molecular weight organic acids on soil solution properties of a heavy metal polluted soil / Wu LH, Luo YM, Christie P, Wong MH // Chemosphere. February 2003. Vol. 50. No. 6. pp. 819-822.

96. Fayed ME. Enhancing the stability of recombinant human erythropoietin in albuminfree formulations. King Abdulaziz: B. Pharm. Sci. , 2004. 52-53 pp.

97. Privé GG. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins // Elsevier. April 2007. Vol. 41. No. 4. pp. 388-397.

98. Wang W. Dual effects of Tween 80 on protein stability / Wang W, Wang YJ, Wang DQ // International journal of pharmaceutics. January 2008. Vol. 347. No. 1-2. pp. 31-38.

99. Lourenco C. Steric stabilization of nanoparticles: size and surface properties / Lourenco C, Teixeira M, Simöes S, Gaspar R // International journal of Pharmaceutics. July 1996. Vol. 138. No. 1. pp. 1-12.

100. Jovanovic N. Distinct effects of sucrose and trehalose on protein stability during supercritical fluid drying and freeze-drying / Jovanovic N, Bouchard A, Hofland GW, Witkamp GJ, Crommelin DJ, Jiskoot W // Eur. J. Pharm. Sci. March 2006. Vol. 27. No. 4. pp. 336-345.

101. Chen Y. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm / Chen Y, Foote RH, Brockett CC // Cryobiology. August 1993. Vol. 30. No. 4. pp. 423 - 431.

102. // www.fda.gov: [сайт]. URL: http://www.fda.gov/Food/ IngredientsPackagingLabeling/GRAS/

103. Wolff L. Forces determining the adsorption of a monoclonal antibody onto an aluminium hydroxide adjuvant: influence of interstitial fluid components / Wolff L, Flemming J, Schmitz R, Gröger K, Goso C, Müller-Goymann C // Vaccine. March 2009. Vol. 27. No. 12. pp. 1834-1840.

104. Hansen B. Effect of the strength of adsorption of hepatitis B surface antigen to aluminum hydroxide adjuvant on the immune response / Hansen B, Belfast M, Soung G, Song L, Egan PM, Capen R, Hogenesch H, Mancinelli R, Hem SL // Vaccine. February 2009. Vol. 27. No. 6. pp. 888-892.

105. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION. CFR - Code of Federal Regulations Title 21 // www.accessdata.fda.gov. 2014. URL: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/ cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?fr=610.15

106. HUMAN HEALTH RISK ASSESSMENT // www.world-aluminium.org. URL: http:/ /www.world-aluminium.org/media/filer_public/2013/01/15/fl0000237.pdf

107. Austyn JM. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage / Austyn JM, Gordon S // Eur. J. Immunol.. October 1981. Vol. 11. No. 10. pp. 805-815.

108. Ziegler-Heitbrock HW. CD14: cell surface receptor and differentiation marker / Ziegler-Heitbrock HW, Ulevitch RJ // Immunol Today. March 1993. Vol. 14. No. 3. pp. 121-125.

109. Ройт A. Иммунология / Ройт А, Бростофф Дж., Мейл Д. Москва: "Мир", 2000. 179 с.

110. Mosmann T. Two types of murine helper T cell clone. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins / Mosmann T, Cherwinski H, Bond M, Giedlin M, Coffman R // J. Immunol.. April 1986. Vol. 136. No. 7. pp. 2348-2357.

111. Ikarashi Y. Mouse NK1.1+ cytotoxic T cells can be generated by IL-2 exposure from lymphocytes which express an intermediate level of T cell receptor / Ikarashi Y, Maruoka H, Shinohara K, Sugimura T, Terada M, Wakasugi H // Immunol. Lett. April 1998. Vol. 61. No. 2-3. pp. 165-173.

112. van de Winkel JG. Human IgG Fc receptor heterogeneity: molecular aspects and clinical implications / van de Winkel JG, Capel PJ // Immunol. Today. May 1993. Vol. 14. No. 5. pp. 215-221.

113. Мейл Д. Иммунология / Мейл Д, Бростофф Дж, Рот ДБ, Ройтт А. Москва: Логосфера, 2007. 568 pp.

114. Eggert LD. Calcium and phosphorus compatibility in parenteral nutrition solutions for neonates / Eggert LD, Rusho WJ, MacKay MW, Chan GM // Am. J. Hosp. Pharm.. January 1982. Vol. 39. No. 1. pp. 49-53.

115. Lewis RJ. Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials, 11th Edition. New York: Wiley, 2004. 3274 pp.

116. Benjamin BE. Ciprofloxacin and sodium phosphates not compatible during actual Y-site injection // Am. J. Health Syst. Pharm. August 1996. Vol. 53. No. 15. pp. 18501851.

117. Lloyd CW. Management of hypophosphatemia / Lloyd CW, Johnson CE // Clin. Pharm. February 1988. Vol. 7. No. 2. pp. 123-128.

118. Martin RR. Fatal poisoning from sodium phosphate enema: case report and experimental study / Martin RR, Lisehora GL, Braxton M, Barcia PJ // J. Am. Med. Assoc.. April 1987. Vol. 257. No. 16. pp. 2190- 2192.

119. McDonald C. The effect of urea on the solubility of methyl p-hydroxybenzoate in aqueous sodium chloride solution / McDonald C, Lindstrom RE // J. Pharm. Pharmacol. January 1974. Vol. 26. No. 1. pp. 39-45.

120. Tressler LJ. Medicine bottle caps // Pharm. J.. 1985. Vol. 235. P. 99.

121. Golightly LK. Pharmaceutical excipients. Adverse effects associated with inactive ingredients in drug products (Part I) / Golightly LK, Smolinske SS, Bennett ML, Sutherland EW, Rumack BH // Med. Toxicol. Adverse Drug Exp. March-April 1988. Vol. 3. No. 2. pp. 128-165.

122. Yudkin J. Sugar and Disease // Nature. September 1972. Vol. 239. pp. 197 - 199.

123. Shelley WB. Polysorbate 80 hypersensitivity / Shelley WB, Talanin N, Shelley ED // Lancet. May 1995. Vol. 345. No. 8960. pp. 1312-1313.

124. Alade SL. Polysorbate 80 and E-Ferol toxicity / Alade SL, Brown RE, Paquet A // Pediatrics. April 1986. Vol. 77. No. 4. pp. 593-597.

125. World Health Organization. Toxicological evaluation of certain food additives with a review of general principles and of specifications. Seventeenth report of the joint FAO-WHO Expert Committee on Food Additives // apps.who.int. 1974. URL: http:// apps.who.int/iris/bitstream/10665/41072/1/WH0_TRS_539.pdf

126. Goldenthal KL. Safety evaluation of vaccine adjuvants. AIDS Res Hum Retroviruses 1993. Vol. 9. pp. 47-51.

127. Lippert WC. Optimal intramuscular needle-penetration depth / Lippert WC, Wall EJ // Pediatrics. September 2008. Vol. 122. No. 3. pp. 556-563.

128. Administering Vaccines: Dose, Route, Site, and Needle Size // www.immunize.org.

URL: http://www.immunize.org/catg.d/p3085.pdf

129. // www.immunize.org: [сайт]. URL: http://www.immunize.org/

130. Широкова И. Вакцины - специфический сегмент рынка // Ремедиум. 2012. pp. 22-29.

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Технологическая схема производства АФИ и ГЛФ

Сорбент IMAC Sepharose FF, система AKTA Purifier 100, колонна объёмом 0,4 2-8 оС

Сорбент Q HP ^Sepharose , система AKTA Purifier 100, \колонна объёмом 0,1 2-8 оС

Сорбент Q HP ^Sepharose , система AKTA Purifier 100, \колонна объёмом 0,1 2-8 оС

Сорбент Q HP ^Sepharose , система AKTA Purifier 100, \колонна объёмом 0,1 2-8 оС

Сорбент Superdex 200, система AKTA Purifier 100, колонна объёмом 0,12 л, 2-8 оС

Реакционная ёмкость, мешалка .магнитная, 2-8 оС .

Машина розлива Groninger DFH

У

Реакционная ёмкость, мешалка магнитная, 2-8 оС у

(Машина розлива

Groninger DFH

еточный лиз гибридных белков Е7-БТШ70

Металл-хелат

аффинная роматограф

Анионообменная хромато гр афи я

Анионообменная хромато гр афи я

анионообменном рбен

Гель-

фильтрационная роматограф

Нормировани концентрации убстанции

Розлив „.субстанции

паковка маркировка,

ыходно контроль субстанции оответствии ФСП

готовле го то вой лекарственной формы

лекарственной формы

маркировка

го то вой екарственн [ы

Выходной ко нт рол ь гот ов ой лекарственной формы

Буферные растворы: VHP IMAC A: 20 мМ трис-HCl, 30 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, pH=8,0; VHP IMAC B: 20 мМ трис-HCl, 500 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, 0,1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, 10% глицерин, pH=8,0

Буферные растворы : VHP Q A1: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, pH 8.0; VHP Q B1: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, 1M NaCl, pH 8.0

Буферные растворы : VHP Q A2: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, pH 8.0; VHP Q B2: 20 мМ трис-HCl, 0.1% полисорбат 20, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ L-глутатион, 1M NaCl, pH 5.0

Буферные растворы VHP Q CONC A: 20 мМ трис-HCl, 10 мМ L-глутатион, 1 мМ ЭДТА, 0,1 % полисорбат 20, pH 8,0; VHP Q CONC B: 20 мМ трис-HCl, 50 мМ L-глутатион, 1 мМ ЭДТА, 0,1% полисорбат 20, pH 8,0.

Буферный раствор VHP S E: натрия дигидрофосфат мо но гид ра т 0,86 мг/мл, на тр ия гидр оф осф ат д од ека гидра т 6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл, полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0

Буферный раствор АФИ: натрия дигидрофосфат мо но гид ра т 0,86 мг/мл, на тр ия гидр оф осф ат д од ека гидра т 6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл, полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0

Ко нт ейн еры плас ти ковые из пол иэ тил ен тер еф тал ат а с полипропиленовой крышкой номинальным объёмом 5, 30, 60 и 12 5 мл.

В соответствии с проектом ФСП на субстанции Е7-БТШ70

В соответствии с проектом ФСП на субстанции Е7-БТШ70

Вспомогатель ные вещества - натрия дигидрофосфат моногидрат, натрия гидрофосфат додекагидрат, натрия хлорид, сахароза, полисорбат 80, соответствующие текущей версии Eur.Ph.

Буферный раствор ГЛ Ф: натрия дигидрофосфат мо но гид ра т 0,86 мг/мл, на трия гидр оф осф ат д од ека гидра т 6,72 мг/мл, натрия хлорид 8,77 мг/мл, сахароза 50 мг/мл, полисорбат 80 0,005 мг/мл, pH 7.0,

Раствор гидроокиси алюминия, 10 мг/мл до конечной концентрации в ГЛФ 0,8 мг/мл

Шприцы предварительного наполнения из боросиликатного стекла !-го гидролитического класса, укупоренные бромбутиловым плунжером, закрытые колпачком из полипропилена со вставкой из резины.

В соответствии с проектом Ф СП на ГЛФ

В соответствии с проектом Ф СП на ГЛФ

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Краткое изложение процесса производства ГЛФ

Наименован ие стадий, операций Описание производственного процесса.

ВР-1 Водоподготовка

Получение воды очищенной Вода очищенная должна соответствовать требованиям фармакопейной статьи ФС 42-2619-97 и внутренней спецификации предприятия для воды очищенной, в которую включен дополнительный показатель удельной электрической проводимости по Европейской фармакопее (не более 4,3 мкСм/см при 20 °С).

Получение воды для инъекций и чистого пара Воду для инъекций получают из воды очищенной путем дистилляции. Показатели качества воды для инъекций должны соответствовать требованиям ФС 42-2620-97 и внутренней спецификации предприятия, содержащей дополнительный показатель удельной электрической проводимости по Европейской фармакопее (не более 1,1 мкСм/см при 20 оС).

ВР-2 Воздухоподготовка

Подготовка сжатого воздуха Сжатый воздух, необходимый для технологических процессов и управления системами автоматики, получают при использовании безмасляного компрессора. Из ресивера участка энергоносителей охлажденный сжатый воздух поступает под давлением 0,6 МПа и проходит многоступенчатую очистку. Перед поступлением в чистые помещения давление в линии сжатого воздуха, используемого для выполнения технологических операций, снижается в редукторе до 0,3 МПа. Сжатый воздух поступает стерильным.

Подготовка азота Азот поступает в производство с участка энергоносителей, где его получают при использовании генератора азота. Из ресивера участка энергоносителей азот под давлением до 0,58 МПа по трубопроводу поступает на участок и подвергается очистки от пыли, влаги и масла. Очищенный азот при давлении 2,0 бар поступает по трубопроводу в производственные помещения

Подготовка вентиляцион ного воздуха Подготовка вентиляционного воздуха осуществляется в системе вентиляции и кондиционирования. Вентиляционная установка обеспечивает забор атмосферного воздуха, его очистку и кондиционирование, подачу в помещения, рециркуляцию и частичный выброс отработанного воздуха. Помещение розлива оборудовано локальной зоной ламинарного потока стерильного воздуха с фильтрами высокой эффективности класса Н14, создающие класс чистоты А для защиты открытых технологических операций. Для обеспечения требуемой чистоты воздушной среды создается многократный воздухообмен, для обеспечения избыточного давления объем поступающего воздуха на 10 % -30 % превышает объем выходящего воздуха.

ВР-3 Санитарная подготовка производства

Приготовлен ие дезрастворов Для подготовки «чистых» помещений используют дезинфицирующие растворы на основе таблеток «Пресепт», «Деохлор», средства «Бианол», перекиси водорода, спирта изопропилового, спирта этилового. Для предотвращения появления устойчивых форм микроорганизмов дезинфицирующие средства чередуют. Дезинфицирующие растворы перед использованием подвергают

стерилизующей фильтрации.

Подготовка чистых производстве нных помещений Подготовку чистых производственных помещений проводят согласно разработанных цеховых стандартных операционных процедур и в соответствии с требованиями МУ 42-51-5-93, ГОСТ Р 52249-2009 раздел «Помещения. Производство стерильных лекарственных средств», МУК 4.2.734-99 «Микробиологический мониторинг производственной среды», РДИ 42-505-00 «Инструкция. Порядок проведения контроля параметров воздушной среды в чистых помещениях и методы их измерений при производстве лекарственных средств».

Подготовка тех. одежды и перчаток На производственный участок персонал входит через санпропускник, где обязан сменить комплект переходной спецодежды на комплект технологической спецодежды. Персонал носит чистую промаркированную спецодежду. Комплект переходной, технологической спецодежды стирают по мере загрязнения, периодически меняют. Перчатки используют стерильные неопудренные одноразовые.

Подготовка персонала Персонал, выполняющий работы на производстве, должен быть обучен требованиям стандарта ГОСТ ISO 9001-2011 и GMP. Квалификация персонала оговорена в инструкциях, составленных на каждое рабочее место. Вход в производственную зону осуществляется согласно правилам, описанным в нормативных документах цеха и участка. К работе в производственной зоне допускаются только персонал, прошедший первичные и периодические осмотры, и имеющие личную медицинскую книжку.

Подготовка основного и Химическую посуду очищают согласно соответствующему СОП для белковых препаратов. Оценку качества очистки

вспомогатель ного оборудовани я. производят, контролируя промывные воды по параметрам ТОС, рН, электропроводность. Стерилизацию посуды осуществляют путем автоклавирования согласно соответствующему СОП. Очистку и стерилизацию шлангов и металлических частей машины розлива производят согласно соответствующему СОП. Оценку качества очистки производят, контролируя промывные воды по параметрам ТОС, рН, электропроводность. Оборудование и инвентарь постоянно содержат в чистоте и порядке. Перед началом работы: оборудование должно быть сухим, чистым, герметичным; весы чистые сухие с отметкой о поверке.

ВР-4 Приемка, контроль качества, хранение и движение сырья и материалов

Приемка и хранение вспомогатель ного сырья, первичных упаковочных и вспомогатель ных материалов Приемку вспомогательных и упаковочных материалов производят на складе согласно соответствующему нормативному документу. После получения аналитического листа с положительными результатами передают на участок для использования в производстве.

Приемка и хранение сырья (АФИ) Приемку АФИ производят на складе согласно соответствующему нормативному документу. АФИ хранятся в соответствии с требованиями нормативной документации.

Выдача в производства Отпуск основного и вспомогательного сырья в производство и его учет по количеству осуществляют с записью в журнале

,движение и учет основного и вспомогатель ного сырья выдачи сырья и материалов и в стеллажной карте, в соответствии с технологическим графиком производства и технологической инструкции на производство препарата.

Выдача в производств о, движение и учет первичных упаковочных материалов Перед началом технологического процесса осуществляют расчет необходимого количества первичных упаковочных материалов в соответствии с нормами расхода для производства одной технологической серии. Отпуск первичных упаковочных материалов в производство осуществляют с записью в журнале регистрации и учета отпуска первичных упаковочных материалов.

ВР-5 Подготовка первичных упаковочных материалов

Подготовка шприцев Шприцы инъекционные должны быть стерильными однократного применения из боросиликатного стекла 1-го гидролитического класса с вклеенной иглой и защитным колпачком из полипропилена со вставкой из резины, разрешенные к применению в РФ. Шприцы транспортируют со склада на участок приготовления препарата. В шлюзе упаковочных материалов поверхность внешней упаковки шприцев обрабатывают с помощью 70 % раствора этилового спирта. Табы со шприцами вручную извлекают из внешней упаковки на станции распаковки пакета. Затем табы отправляются по конвейеру в автоматический распаковщик, где освобождаются от внутренней упаковки. Далее табы поступают в машину по удалению пленки. После удаления пленки табы со шприцами попадают в машину по наполнению и укупорки шприцев.

Подготовка плунжеров Плунжеры в производство поступают стерильными, упакованными в трансферную упаковку.

ТП-6 Получение стерильного раствора вакцинной массы

Приготовлен ие буферного раствора Приготовление буферного раствора проводят гравиметрическим методом. Емкость для приготовления буферного раствора устанавливают на весы, загружают воду для инъекций с температурой 15-25 °С. Взвешенные количества натрия дигидрофосфата моногидрата, натрия гидрофосфата додекагидрата, натрия хлорида, полисорбата 80, сахарозы последовательно загружают в стакан приготовления, каждый контейнер со вспомогательным сырьем после загрузки ополаскивают водой для инъекций дважды. Производят перемешивание с помощью магнитной мешалки до полного растворения. Полноту растворения оценивают визуально. Полисорбат 80 перед загрузкой предварительно растворяют в воде для инъекций при комнатной температуре 15-25 °С и перемешивают при помощи магнитной мешалки. Раствор полисорбата 80 загружают в емкость для приготовления буферного раствора. Контейнер после загрузки ополаскивают водой для инъекций дважды. Массу буферного раствора доводят водой для инъекций до финального значения. Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки.

Приготовлен ие полупродукт а - раствора субстанций Производят размораживание субстанций. Приготовление раствора субстанций проводят гравиметрическим методом путём смешения субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70 с буферным раствором. Устанавливают ёмкость приготовления раствора препарата на весы, загружают 20% от конечного объема буферный раствор. В ёмкость приготовления загружают

расчетное количество субстанций Е7(16)-БТШ70 и Е7(18)-БТШ70. Раствор перемешивают при помощи магнитной мешалки. Массу раствора полупродукта доводят буферным раствором до конечной. Раствор перемешивают в течение 20 мин.

Стерилизую щая фильтрация полупродукт а Раствор полупродукта из ёмкости приготовления через стерилизующий фильтр перекачивают в стерильный реактор сведения вакцины. Фильтр проверяют на целостность в соответствии с действующим СОП до и после стерилизующей фильтрации. Использование фильтров однократное.

Стерилизаци я автоклавиров анием полупродукт а- гидроокиси алюминия Раствор гидроокиси алюминия поступает в производство в виде коммерческого сырья с содержанием гидроокиси, равным 10%. Раствор подают в стерильные мешки Allegro и подвергают стерилизации автоклавированием при 121 оС в течение 20 минут. После автоклавирования температуру раствора гидроокиси алюминия доводят до 2-8 оС, выдерживая в холодильнике в течение 2 часов.

Сведение вакцинной массы Сведение вакцины проводят в стерильном миксере жезлового типа WandMixer с постоянным перемешиванием и охлаждающей «рубашкой» для получения гомогенного продукта и контроля температурных параметров процесса сорбции. Подача стерильного полупродукта раствора субстанций и стерильной гидроокиси алюминия осуществляется перистальтическими насосами. После поступления компонентов вакцины в реактор сведения вакцинную массу оставляют перемешиваться в течение 4 часов при 2-8 оС.

ТП-7 Розлив и укупорка

Наполнение и укупорка плунжерами Стерильный раствор препарата разливают в шприцы и укупоривают плунжером на машине по наполнению и укупорке шприцев.

ТП-9 Этикетировка и вставка пластикового штока

Шприцы с препаратом, укупоренные плунжером этикетируются самоклеящейся этикеткой. На этикетке предварительно наполненного шприца указывают наименование и товарный знак предприятия-производителя, наименование и товарный знак владельца регистрационного удостоверения, торговое название препарата с предупредительной маркировкой ®, международное непатентованное название, лекарственную форму, дозировку (в мкг), объем раствора, «Стерильно», номер серии, дату выпуска, срок годности, фармакод. Дополнительно на этикетку наполненного шприца наносят шкалу объемов. В этикетированные наполненные шприцы с плунжером вставляется шток.

УМО-10 Упаковка препарата в потребительскую упаковку и транспортную тару и их маркировка

Упаковка шприцев с препаратом в потребительс кую упаковку и ее маркировка По 0,5 мл раствора в шприцах вместимостью 1 мл из стекла I гидролитического класса (ISO 4802-1) с интегрированной иглой, закрытой колпачком из эластомерного материала (ISO 8871) с дополнительным внешним полипропиленовым колпачком, с поршнем и бромбутиловымплунжером (ISO 8871), покрытымфторполимером. На каждом наполненном шприце наклеена самоклеящаяся этикетка. По 1 предварительно наполненному шприцу в контурной ячейковой упаковке из

пленки ПВХ по ГОСТ 25250-88 или импортной и фольги алюминиевой печатной лакированной по ГОСТ 745-2003 или без фольги.

Упаковка препарата в транспортну ю тару и ее маркировка Групповая упаковка и транспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Опытно-промышленный регламент на производство

лекарственного средства