Разработка комплексного препарата "Витарол-Е" для антиоксидантной и антибактериальной защиты карповых рыб при аэромонозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Дрошнев, Алексей Евгеньевич

• Дрошнев, Алексей Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Дрошнев, Алексей Евгеньевич

1. Введение.

Обзор литературы

2.1.Аэромоноз. Общая характеристика болезни.

2.1.1. Патогенез и клиническая картина заболевания.

2.1.2. Влияние аэромонад на состояние ПОЛ и АОЗ у некоторых видов культивируемых рыб.

2.1.3. Антиоксидантное действие токоферолов.

2.1.4. Диагностика.

2.1.5. Меры борьбы и профилактика.

Собственные исследования

3. Материалы и методы

4. Результаты исследований

4.1. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОЗ) рыб в естественной среде и 34 искусственных условиях содержания.

4.2. Антиоксидантная защита карпов при экспериментальном 37 аэромонозе.

4.3. Разработка рецептуры препарата для лечения аэромоноза карповых рыб.

4.3.1. Технологический процесс изготовления препарата «Витарол-Е».

4.3.2. Технические требования.

4.4. Антибактериальные и антиоксидантные свойства препарата йода и «Витарола-Е» при аэромонозе (in vitro и in vivó).

4.5. Изучение токсичности препарата «Витарол-Е» для рыб.

4.6. Испытание профилактической эффективности «Витарола-Е» в аквариальных условиях.

4.7. Биологические свойства аэромонад, выделенных от рыб.

4.7.1. Морфология и культуральные свойства аэромонад.

4.7.2. Биохимические свойства аэромонад.

4.8. Биологические свойства аэромонад, выделенных из воды.

4.8.1. Культурально-морфологические свойства аэромонад выделенных из воды.

4.9. Патогенные свойства аэромонад.

4.10. Испытание терапевтической эффективности «Витарола-Е» в производственных условиях.

4.11. Сравнительный анализ эффективности антимикробного действия нитрофуранов и «Витарола-Е» в условиях товарного карповодства.

5. Обсуждение.

6. Выводы.

7. Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка комплексного препарата "Витарол-Е" для антиоксидантной и антибактериальной защиты карповых рыб при аэромонозе»

Актуальность темы. Рыба, как ценный белковый продукт, должна составлять в рационе питания человека не менее 20%. Потребление рыбы и рыбной продукции по рекомендации Института питания РАМН, должно составлять не менее 20 кг в год (в настоящее время - 10—11 кг). В условиях, когда добыча океанических рыб резко сокращается, а рыбные запасы внутренних водоемов находятся в критическом состоянии, источником увеличения объемов пищевой рыбопродукции является аквакультура.

Аквакультура - искусственное выращивание рыб, гидробионтов и растений в контролируемых и управляемых человеком условиях. Из всех продовольственных отраслей это наиболее динамично развивающийся сектор экономики.

Высокая плодовитость рыб, быстрый рост при невысоких кормовых затратах свидетельствуют о больших потенциальных возможностях рыбоводства и вполне могут позволить за короткий период времени резко увеличить производство товарной продукции. В настоящее время различают три основных направления аквакультуры: 1.Прудовое рыбоводство; 2.Пастбищное рыбоводство; 3.Садковое выращивание (в пресной и морской воде).

В 2005 году рыбоводными хозяйствами было выращено 113,1 тыс.тонн товарной рыбы и 600 млн. экз. посадочного материала различных видов рыб. К концу 2010 года объемы производства планируется увеличить до 240 тыс. тонн. (Мамонтов Ю.П., 2006)

Отличительной особенностью рыбоводства является выращивание рыб в поликультуре, что позволяет эффективно использовать кормовые ресурсы экосистемы прудов при условии культивирования видов, не конкурирующих в питании.

Искусственное содержание гидробионтов в условиях, значительно отличающихся от естественных, приводит к изменению поведенческих реакций рыб и появлению новых, ранее не известных болезней.

Скученное содержание, обильное кормление, техногенные факторы, стрессы различного характера оказывают негативное влияние на организм животных и рыб, в результате приводят к развитию адаптивной реакции, угнетению иммунной системы и возникновению различных патологических процессов (Федоров Ю.Н., 2003; Бычкова Л.И., Юхименко JI.H., 2007). И только у некоторой части рыб, при этом, развиваются адаптивные реакции, направленные на сохранение вида и, как правило, довольно длительное время отрицательно сказывающиеся на их продуктивности (Leung K.Y.et.al., 1994; Mikryakov B.R., 1999; Kozinska A. et.al., 2000;).

Развитие аквакультуры должно сопровождаться проведением прикладных исследований в области кормления и технологий производства, охраны здоровья культивируемых объектов.

Одной из серьезных причин, сдерживающих развитие рыбоводства, являются бактериальные, вирусные, грибковые, паразитарные болезни рыб. Следует иметь в виду, что некоторые заболевания различной этиологии у рыб протекают с похожими клиническими признаками. Факторы техногенного характера могут провоцировать возникновение новых, ранее не встречавшихся болезней у рыб. В этой связи необходимо проводить их дифференциальную диагностику, а также обоснованно и целенаправленно подходить к выбору терапевтических средств.

Многолетний опыт использования лечебных средств при бактериальных инфекциях показал, что некоторые препараты со временем оказываются малоэффективными; микроорганизмы приобретают устойчивость к действию таких препаратов, как антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны. И если раньше стратегия лечения была направлена на уничтожение возбудителей болезней в организме рыб, то в настоящее время предпочтение отдается использованию препаратов, обеспечивающих повышение устойчивости макроорганизма к заражению болезнетворными агентами. В первую очередь, это - иммуностимуляторы и пробиотики. (Новоскольцева Т.М., 2002; Leszek G. et.al., 2004).

Использование в практике рыбоводства пробиотиков показало их высокий эффект в первую очередь за счет восстановления баланса естественной микрофлоры кишечника. По имеющимся сведениям, ветосубалин индуцирует образование интерферона в организме рыб. Однако существенным недостатком при использовании пробиотиков является их высокая стоимость.

Другим важным фактором, обеспечивающим стабильность любого организма от влияния патологических процессов, является антиоксидантная защита (АОЗ). Изучением механизма АОЗ начали заниматься в 50-х годах прошлого века в связи с поражающими факторами ионизирующего излучения.

Процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и АОЗ находятся в динамическом равновесии. (Regoli F., et.al., 1995; Sakai M et.al., 2001; Wink D.A. et al., 2001).

Их нарушение приводит к развитию у рыб различных патологий (Богдан В.В., 2002; Герунова Л.К.,2004).

Аэромоноз рыб семейства карповых - сложный патологический процесс, затрагивающий различные стороны обмена веществ, вызываемый условнопатогенной бактерией рода Aeromonas и сопровождающийся гибелью до 70% поголовья рыб (Афанасьев В.И., 1979; Грищенко Л.И., 2007; Асадчая Р.Л., 2008).

В современной практике рыбоводства для профилактики и борьбы с аэромонозом пресноводных рыб, в частности — карповых, широко используют различные антибактериальные лекарственные средства, вопросам же коррекции про- и антиоксидантных процессов уделяется еще недостаточно внимания.

Цель работы - изучить изменения в течении свободнорадикальных процессов и системе антиоксидантной защиты в норме и при заболевании рыб аэромонозом, усовершенствовать меры борьбы и профилактики болезни путем повышения естественной резистентности организма рыб, с использованием антибактериальных и антиоксидантных препаратов.

Задачи исследований:

- определить значение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у рыб семейства карповых в норме и при аэромонозе;

- разработать рецептуру препарата на основе йодсодержащих веществ в комплексе с минеральными веществами и антиоксидантами и определить возможность коррекции состояния антиоксидантной системы защиты у карповых рыб при аэромонозе;

- разработать лабораторный регламент по производству, контролю и применению препарата «Витарол-Е» против аэромоноза карповых рыб;

- изучить сравнительную терапевтическую и профилактическую эффективность разработанного препарата in vitro и in vivo;

- в разных регионах РФ выделить от карпов, с подозрением на заболевание аэромонозом, культуры бактерий, изучить основные биологические свойства; провести сравнительный анализ патогенности аэромонад, изолированных из внутренних органов рыб и рыбохозяйственных водоемов;

- испытать в условиях неблагополучного по аэромонозу карпов хозяйства терапевтическую эффективность разработанного комплексного препарата.

Научная новизна. Определены показатели, характеризующие состояние процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у рыб в норме, а также при спонтанном и экспериментальном аэромонозе.

Впервые показана эффективность витамина Е, природного биоантиоксиданта, для стабилизации параметров антиоксидантной защиты и предотвращения развития процессов свободно-радикального окисления у рыб семейства карповых при аэромонозе.

Проведена идентификация выделенных штаммов аэромонад в рыбхозах Московской, Владимирской, Калужской, Липецкой, Ростовской, Тверской областей по морфологическим, культурально-биохимическим и биологическим свойствам. Установлено, что наиболее вирулентными свойствами обладают виды A.sobria, A.hydrophila.

Получен патент РФ на изобретение №2344824 от 27 января 2009 года: «Препарат для лечения инфекционных заболеваний рыб бактериальной этиологии и способ лечения инфекционных заболеваний рыб бактериальной этиологии».

Практическая ценность. Разработана лекарственная форма препарата «Витарол-Е», обладающего выраженными антиоксидантными и антибактериальными свойствами в отношении вирулентных штаммов аэромонад.

Препарат «Витарол-Е» испытан комиссионно и показал высокую эффективность при аэромонозе карпов в рыбоводческом хозяйстве «Нарские острова» Московской области. Препарат используется также в других -рыбоводческих хозяйствах-——- —---—«

Разработаны «Методические рекомендации по ветеринарному контролю, диагностике и профилактике опасных заболеваний рыб в аквакультуре», рассмотренные и одобренные на секции «Инфекционная патология», протокол №4 и утвержденные Российской академией сельскохозяйственных наук 01 ноября 2006 года. «Методические наставления по определению уровня свободнорадикального окисления и состояния системы антиоксидантной защиты организма рыб», рассмотренные и одобренные на Ученом Совете ВИЭВ 19 января 2010 года, протокол № 1.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на: международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004г.); 4-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005г.); международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005г.); заседании научно-консультативного Совета по болезням рыб Межведомственной Ихтиологической комиссии и Секции патологии рыб и охраны гидробионтов Отделения ветеринарной медицины РАСХН (Москва, 2009г.); заседаниях Ученого совета ВИЭВ (2004-2009гг.); межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2010г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных трудов, в том числе патент РФ, 2 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Материалы диссертации иллюстрированы 20 таблицами, 14 рисунками. Список литературы включает 147 публикаций, в том числе 70 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Дрошнев, Алексей Евгеньевич

б.Выводы I I i 1. Установлено, что антиоксидантная защита карпов характеризуется следующими показателями ферментативной системы: каталаза — от 4,0 до 5,1 мкМ Н202/л х мин х 103, пероксидаза - от 4,2 до 4,4 ед.опт.пл/л х сек., церулоплазмин - от 30,8 до 37,2 мкМ бензохинона/л х мин., I j супероксиддисмутаза - от 25,3 до 29,0 ЕД/мл, витамин Е - от 10,5 до 14,5 | мг/л. i 2. Определено патогенетическое значение свободнорадикального

I окисления при аэромонозе карпов, характеризующееся снижением I активности ферментативного звена антиоксидантной защиты и уменьшении ! содержания в крови больных рыб витамина Е, в 2,5-3 раза, накоплением ; токсических веществ перекисей липидов, вследствие нарушения целостности биомембран клеток, что способствует ускоренному развитию болезни. I 3. Разработан комплексный препарат «Витарол-Е» для лечения и. j профилактики аэромоноза карпов. Установлена высокая чувствительность 1 патогенных аэромонад in vitro, 0,125 - 3,75 мкг/мл. У карпов, в течение 5 дней получавших препарат, повышается активность системы | антиоксидантной защиты и устойчивость к заражению аэромонозом. | 4. При сравнительном изучении антимикробного действия фуразолидона и «Витарола-Е» установлено, что задерживающие и подавляющие рост I j аэромонад концентрации препарата «Витарол-Е» в 5-8 раз меньше, чем у | препарата сравнения. При этом в организме поддерживается необходимый I уровень антиоксидантов и повышается резистентность рыб к аэромонозу. I

5. Терапевтическая концентрация «Витарола-Е» 75 мг/кг массы тела, при пятидневном курсе кормления обеспечивает защиту не менее 70% рыб от заболевания аэромонозом. Препарат «Витарол-Е» применяемый в ] терапевтических дозах безвреден для рыб.

6.От рыб из семи рыбоводческих хозяйств Московской, Владимирской,

I Тверской, Липецкой, Калужской и Ростовской областей выделено 97 культур I

I 104 I аэромонад, пяти видов, различающихся по морфологическим, биохимическим и патогенным свойствам. При этом вид А.тесНа был обнаружен только в рыбхозах Московской области. Установлено, что наиболее вирулентными являются штаммы видов А.БоЬпа и А.ЬуёгорЬИа, вызывающие 100% гибель подопытных рыб в течение двух суток после экспериментального заражения.

7. Из воды двух рыбхозов Московской области выделено 76 культур аэромонад, принадлежащих к семи видам: А.Ьус1горЫ1а, А.воЬпа, А.сау1ае, А.уегопи, А.БсЪиЬегШ, А.тесИа, А.эр. У большинства культур выделенных из воды вирулентные свойства не установлены.

8. В производственных условиях установлено, что при 5-ти дневном курсе кормления, препарат «Витарол-Е» оказывает терапевтическое и профилактическое действие, которое выражается в заживлении язвенных поражений, эпителизации кожных покровов, нормализации деятельности кишечника и стабилизации процессов антиоксидантной защиты у рыб.

7. Практические предложения

1. Антибактериальный препарат, обладающий антиоксидантныг^си свойствами - «Витарол-Е».

2. «Методические рекомендации по ветеринарному контролю, диагностике и профилактике опасных заболеваний рыб в аквакультуре»9 рассмотренные и одобренные на секции «Инфекционная патология» протокол №4 и утвержденные Российской академией сельскохозяйственных наук 01 ноября 2006 года

3. «Методические наставления по определению уровня свободнорадикального окисления и состояния системы антиоксидантной защиты организма рыб», рассмотренные и одобренные на Ученом Совете ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко 19 января 2010 года, протокол № 1.

4. Лабораторный регламент по производству, контролю и применению препарата для лечения инфекционных заболеваний рыб бактериальной этиологии «Витарол-Е», утвержденный директором ВИЭВ им. Я.Р.Коваленк0 8 декабря 2009 года, протокол № 15.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Дрошнев, Алексей Евгеньевич, 2010 год

1. Allan В J. & Stevenson R.M. W. Extracellular virulence factors of Aeromonas hydrophila in fish infections // Canadian Journal of Microbiology, 1981, 27, 1114-1122

2. Altwegg M. Subtiping metods for Aeromonas species. // The Genus Aeromonas, pp. 109-125.

3. Amin N.E., Abdallah I.S. Elallawy T. & Ahmed S.M. Motile Aeromonas septisemia among Tilapia nilotica in Upper Egypt // Fish Pathology, 1985,20, 93-97.

4. Amlacher E. Textbook of fish diseases // TFH Publication, Neptune City / New Jersey, 1970.

5. Ansary A., Haneef R.M., Torres J.L. & Yadav M. Plasmid andantibiotic resistance in Aeromonas hydrophila isolated in Malasia from healhy and diseases fish// Journal of Fish Diseases, 1992, 15, 191-196.

6. Azzi A., Breyer I., Feher M., Pastori M. // J.Nutr, 2000a, V.l30, №8,ij p. 1649.

7. Azzi A., Stocker A. // Prog. Lipid Res, 2000, V.39, №3, p.231.

8. Bach R., Chen P.K., Chapman G.H. Changes in the spleen of the channel catfish Ictalurus punctatus Rafinesque induced by infection with Aeromonas hydrophila // Journal of Fish Diseases, 1978, 1, 205-217

9. Brenden R.A., Huizinga H.W. Pathophysiology of experimental Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus (L.) // Journal of fish diseases, 1986, 9, 163-167

10. Bullock G.L., Conroy D.A., Snieszko S.F. Diseases of fishes, book 2A: Bacterial diseases of fishes // TFH Publication, Neptune City / New Jersey, 1971.

11. Cahill M.M. Virulence factors in mobile Aeromonas species // Journal of Applied Bacteriology, 1990, 69, 1-16

12. Canesi L., Viarengo A. Age related differences in glutathion metabolism in mussel tissues (Mytilus edulis L.) // Comp. Biochem. Physiol., 1997, N2, p. 217-221.

13. Canesi L., Viarengo A., Leonzio C. et al. Heavy metals and glutathion metabolism in mussel tissues {Mytilus edulis L.) // Aquat. Toxicol., 1999, 46, N 1, p. 67-76.

14. Chang B.J. & Bolton S.M., Plasmids and resistance to anmicrobial agents in Aeromonas sobria and Aeromonas hydrophila clinical isolates // Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1987, 31, 1281-1282.

15. Cipriano R.C., Bullock G.L., Pyle S.W. Aeromonas hydrophila and motile aeromonad septicemias of fish // Fish Diseases Leaflet. 68 / United States Department of the Interior, Washingthon. D.C., 1984.

16. Fliermans C.B., Gordon R.W., Hazen T.C. & Esch G.W. Aeromonas distribution and survival in a thermally altered lake. // Applied and Environmental Microbiology, 1977, 33, 114-127.

17. Flohe L.Guuzler W.A.Schnock H.H. Glutation peroxidase: A — selenoenzyme // FEBS Lett., 1973, 32, p. 132-134.

18. Gaines J.L. Pathology of experimental infection of Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier, (Bacteria: Pseudomonadales) in the channel catfish,1.talurus punctatus (Raflnesque), PhD Thesis, Auburn University, Auburn, Alabama, USA, 1972.

19. George W.I., Nakata M.M., Thompson J. & White M.I. Aeromonas-related diarrhea in adults // Arhives of Internal Medicine, 1985, 145, 2207-2211

20. Hokama A., Honma Y. & Nakasone N. Pili of an Aeromonas hydrophila: purification, characterization and biological role // Microbiology and Immunilogy, 1990,34, 901-915

21. Isani G., Serra R. Cattani O. et al. Adenylaye energy charge and and metallothionein as stress indices in mussels exposed to anoxia // J. Mar. Biol / Assoc. U.K. 1997,N4, p. 1187-1197.

22. Kozinska A. and Antichowicz J. Immunisation of carp against motile Aeromonas // Bull.Vet.Inst., Pulawy, 2000, 44, 53 -58.

23. Leszek Gus and Alicja Kozinska Antibiotic susceptibility of Aeromonas hydrophila and A.sobria isolated from farmed carp (Cyprinus carpio L.) // Bull. Vet.Inst Pulawy , 2004, 48, 391-395

24. Ljungh A. & Wadstrom T. Aeromonas toxins // Pharmacology of bacterial toxins, 1986, pp.289-305

25. Leung K.Y., & Stevenson R.M.W., Characteristics and distribution of extracellular proteases from Aeromonas hydrophila // Journal of General Microbiology 134, 1988, 151-160

26. Leung K.Y., Yeap I.V., Lam T.J., Sin Y.M. Serum resistance as a good indicator for virulence in Aeromonas hydrophila strains isolated from diseased fish in South-East Asia // Journal of Fish Diseases, 18, 1994, 511-518.J