Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат технических наук Дмитриева, Татьяна Александровна

• Дмитриева, Татьяна Александровна
• кандидат технических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат технических наук Дмитриева, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Высшие базидиомицеты - продуценты протеолитических ферментов и других ценных биологически активных соединений.

1.2 Основные технологические стадии производства сыра.

1.3 Молокосвертывающие ферменты в сыроделии

1.3.1 Свойства молокосвертывающих ферментов и механизм их действия.

1.3.2 Основные продуценты молокосвертывающих ферментов и коммерческие препараты на их основе.

1.3.3 Биосинтез молокосвертывающих ферментов различными продуцентами

1.4 Методы выделения и очистки ферментных препаратов.

1.5 Кинетика ферментативных реакций

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Условия культивирования объектов исследования

2.3 Изучение динамики роста культур базидиальных грибов

2.4 Определение молокосвертывающей и протеолитической активности.

2.5 Концентрирование и фракционная очистка ферментных препаратов.

2.6 Определение молекулярной массы исследуемых ферментов.

2.7 Изучение кинетических констант и состава активного центра исследуемых ферментов.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Сравнительная характеристика различных видов базидиомицетов по уровню молокосвертывающей активности в динамике глубинного культивирования.

3.2 Культурально-морфологические признаки базидиомицетов, отобранных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

3.2.1 Культурально-морфологические признаки вида Coprinus lagopides.

3.2.2 Культурально-морфологические признаки вида Cerrería sp.

3.3 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Coprinus lagopides в динамике роста на разичных питательных средах.

3.4 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Cerrería sp. в динамике роста на различных вариантах питательных сред.

3.5 Сравнительный анализ молокосвертывающей и протеолитической активности у видов Coprinus lagopides и Cerrena sp.

3.6 Анализ различных схем выделения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Coprinus lagopides.

3.7 Разработка метода получения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Cerrena sp.

3.8 Физико-химическая характеристика молокосвертывающих ферментов базидиамицетов Coprinus lagopides и Cerrena sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра)

3.9 Сравнительный анализ полученных грибных ферментов с отраслевым препаратом животного происхождения по основным показателям, принятым в сыроделии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов»

Актуальность проблемы.

Сыроделие появилось в жизни человека не менее 8 тысяч лет назад. Существует легенда, что арабские кочевники, путешествуя по жаре и перевозя молоко в мешках, сделанных из желудков животных, получали молочный сгусток наподобие сыра. В те времена путешественники не догадывались о той роли, которую выполнял сычужный фермент, содержащийся в стенках мешков. И только в XX веке были завершены детальные, на высоком молекулярном уровне исследования, позволившие понять тонкий механизм сычужного свертывания молока.

Однако, несмотря на столь большую историю и очевидный технический прогресс, этот процесс продолжает оставаться одним из наиболее сложных разделов современного пищевого производства. Связано это с тем, что технология сыроварения включает в себя несколько взаимосвязанных и взаимозависимых факторов различной природы (физической, химической, биологической), существенно влияющих на качество и выход целевого продукта. При этом биологическая компонента является наиболее важной в технологии сыроделия т.к. качество используемого молочного сырья, качество молокосвертывающих препаратов, а также природа и биологические особенности продуцентов ферментов часто сильно варьируют и амплитуда этих изменений не всегда может быть своевременно выявлена и учтена сыроделами. При производстве любых сортов сыра ключевым моментом является именно выбор молокосвертывающего фермента, потому что практически этим фактором определяются и выход и вкусовые характеристики готового продукта. При этом важнейшей характеристикой выбираемого фермента является его субстратная специфичность и уровень общей протеолитической активности.

Основополагающей операцией в производстве сычужных сыров является энзиматическое свертывание молока, в результате которого образуется сгусток, содержащий большую часть казеинов и жиров молока. Тысячелетиями для свертывания молока в сыроделии использовали сычужный фермент, образующийся в сычуге - четвертом отделе желудка молодняка жвачных. В последние десятилетия, в связи с дефицитом сычужного фермента, а также его высокой себестоимостью, широко практикуют ферменты, близкие по своему действию к сычужному — комплексы пепсинов и других энзимов, продуцируемых различными микроорганизмами. Поэтому исследования, связанные с получением заменителей сычужного фермента, являются актуальной проблемой современной биотехнологии. Замена общепризнанного, но дорогостоящего сычужного фермента микробными или грибными протеазами узкого специфического действия, представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия [18,33,65,68].

Цели и задачи исследования. Основная цель данных исследований -поиск и изучение продуцентов молокосвертывающих ферментов среди культур высших базидиальных грибов.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести отбор продуцентов с выраженным биосинтезом протеиназ молокосвёртывающего действия среди культур 11 видов базидиомицетов, выращенных в глубинных условиях;

• подобрать для отобранных продуцентов оптимальные условия роста и биосинтеза молокосвертывающих ферментов;

• провести анализ культуральной жидкости продуцентов па содержание ферментов молокосвертывающего действия и оценить соотношение уровня специфической молокосвёртывающей активности (МСА) и общей протеолитической активности (ПА);

• подобрать условия и методы концентрирования, выделения и очистки ферментных молокосвёртывающих препаратов из кульгурального фильтрата продуцентов;

• оценить ориентировочно (методом гель-фильтрации) молекулярную массу полученных ферментов;

• определить кинетические параметры выделенных ферментов;

• сравнить ферментативные характеристики молокосвёртывающих препаратов из базидиомицетов со стандартным коммерческим образцом животного происхождения.

Научная новизна работы

Представленная работа является первым исследованием протеиназ молокосвёртывающего действия культур базидиальных грибов, характерных для лесной зоны Северо-западного региона России и хранящихся в коллекции кафедры микробиологического синтеза Технологического института. Из 24 видов, представленных в коллекции, в динамике глубинного роста изучено 11 видов базидиомицетов, из них для шести видов биосинтез молокосвёртывающих ферментов изучен впервые.

Впервые показано, что соотношение основных источников питания (C:N) регулирует не только уровень молокосвёртывающей активности культур базидиомицетов, но и оказывает значительное влияние на весь спектр субстратной специфичности протеаз, синтезируемых продуцентами.

Впервые установлено, что биосинтез молокосвёртывающих ферментов с узкой или широкой субстратной специфичностью (МСА и ПА) и их соотношение, регулируются не только соотношением источников углерода и азота в искусственной среде выращивания культур, но и существенно зависят от трофических свойств, характерных для вида-продуцента в природных условиях.

Впервые показано, что учёт природных трофических особенностей продуцента способствует выбору таких условий культивирования, которые позволяют без больших технических затрат получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности и низким уровнем общего неспецифического протеолиза.

Практическая значимость работы

В условиях глубинной культуры проведён отбор высших базидиальных грибов - продуцентов протеиназ молокосвёртывающего действия.

Оптимизированы составы питательных сред и условия культивирования избранных видов базидиомицетов.

Разработанные методы выделения и очистки молокосвёртывающих ферментных препаратов из культу ральных фильтратов культур базидиомицетовых грибов служат базой для получения энзимных комплексов с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого уровня общей протеолитической активности.

Дана сравнительная оценка ферментативных и физико-химических свойств полученных молокосвёртывающих препаратов и сычужного коммерческого препарата, используемого в практике сыроделия. Показано, что по уровню и специфичности молокосвёртывающей активности вышеназванные препараты сопоставимы между собой.

Предлагаемые в качестве продуцентов молокосвёртывающих ферментов культуры высших базидиомицетовых грибов не проходят стадии спороношения в ходе биотехнологического процесса, соответственно исключается опасность контаминации спорами рабочих помещений и каких-либо профзаболеваний у персонала на производстве.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на 2-ом Центральном европейском пищевом конгрессе (Будапешт,2004), 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), "ВЮСАТ-2004"(НатЬиг§, 2004), Ш-ем Международным Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийском конкурсе инновационных проектов «Живые системы» (Киров, 2005), 3-ем Центральном европейском пищевом конгрессе (Болгария,2006), XI Международном конгрессе по микробиологии (Болгария, 2006), 5-ом Международном конгрессе по пищевой биотехнологии (Греция, 2007), 13-ом международном симпозиуме по биотехнологии (Китай, 2008), 14-ом международном конгрессе по пищевой науке и технологии (Китай, 2008).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Дмитриева, Татьяна Александровна

ВЫВОДЫ

1. Отобраны в качестве продуцентов молокосвёртывающих ферментов культуры двух видов нетоксичных базидиальных грибов - Coprinus lagopides (съедобен) и Cerrena sp., обладающие наиболее высоким уровнем МСА среди культур 11 видов макромицетов, исследованных в динамике глубинного роста.

2. Изучены культурально-морфологические и физологические признаки культур продуцентов, подтверждающие надёжность их видовой идентификации.

3. Установлено, что указанные продуценты нуждаются в разных трофических условиях для активного биосинтеза протеиназ молокосвёртывающего действия. Среди изученных вариантов (свыше 10) питательных сред, имеющих различные источники углерода и азота и разные соотношения C:N, подобраны условия для синтеза МСФ - для продуцента Coprinus lagopides это натуральная среда (сусло с соей), для продуцента Cerrena sp.- глюкозо-пептонная среда №7.

4. Установлено, что уровень МСА продуцентов в условиях культуры существенно зависит от соотношения в среде C:N, что отражает трофические особенности этих грибов в природных условиях.

5. Изучены различные варианты схем выделения и очистки ферментных препаратов из КФ исследуемых продуцентов. Предложена схема выделения молокосвёртывающих ферментов, обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям практического сыроделия - высокий уровень специфической МСА и низкий уровень общего протеолиза.

6. Оценены молекулярные массы грибных молокосвёртывающих ферментов. У обоих продуцентов - C.lagopides и Cerrena sp. ММ этих ферментов была практически одинакова и оставляла 35±0.5 icDa.

7. На основе линеаризации уравнения Михаэлиса определены кинетические характеристики полученных грибных ферментов - константы Михаэлиса и максимальные скорости реакций.

8. На основе кинетических параметров (при различных рН субстрата) определена константа ионизации (рК), позволяющая предположить наличие в активном центре молокосвёртывающей протеиназы из Coprinus lagopides аминокислотного остатка гистидина.

9. Сравнительным анализом ферментативных свойств молокосвёртывающих препаратов из базидиальных культур и стандартного коммерческого образца животного происхождения показано, что новые грибные ферменты не уступают стандартному образцу по основным требованиям, предъявляемым к МСФ, и могут быть рекомендованы для апробации их в практике сыроделия наравне с существующими сычужными препаратами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При производстве любых сортов сыра ключевым моментом успешного решения технологического процесса является именно выбор молокосвертывающего фермента, так как практически этим фактом определяются и выход и вкусовые характеристики готового продукта. При этом важнейжей характеристикой выбираемого фермента является его специфичность и уровень общей протеолитической активности. Замена общепризнанного, дорогостоящего сычужного фермента животного происхождения бактериальными или грибными протеазами узкого специфического действия представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия.

Объектами нашего исследования служили культуры высших базидиальных грибов из основных наиболее крупных порядков класса Basidiomycetes— Aphyllophorales и Agaricales.

В данной работе мы исследовали культуры семи видов афиллофоровых грибов и четыре вида агариковых. Все штаммы этих видов были выделены в чистую культуру из плодовых тел, собранных преимущественно в пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга, и хранятся в коллекции культур базидиомицетов кафедры микробиологического синтеза технологического института.

Практически все виды афиллофоровых грибов являются нетоксичными, в том числе и объекты нашего исследования: Trametes suaveolens (L.:Fr.) Fr., Trametes ochracea (Pers.)Gilb.et Ryvarden, Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr., Ganoderma lucidum (Leyss.: Fr.) P.Karst., Cerrería sp. , Bjerkandera adusta (Fr.) Karst., Grifóla frondosa (Dicks.: Fr.) Gray.

Из агариковых (пластинчатых) грибов в качестве объектов исследования использованы культуры четырёх видов съедобных грибов:

Flammulina velutipes (Fr.) P.Karst, Panus conchatus (Bull.: Fr.) Fr., Coprinus lagopides P.Karst., Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Quel.

В качестве объекта сравнения ферментативных свойств препаратов, полученных из базидиомицетов, с существующими в практике молочной промышленности молокосвёртывающими препаратами был использован стандартный сычужный препарат — «отраслевой стандартный образец сычужного порошка ГОСТ 9225 - 84» , ВНИИМС, г.Углич.

Уровень молокосвертывающей активности определяли по методу Kawai. Метод основан на определении времени, за которое происходит образование молочного сгустка. В качестве субстрата использовали свежее стандартное натуральное молоко.

На основании полученных данных (в первую очередь скорость роста и уровень ферментативной активности — МСА и ПА) для дальнейших исследований были отобраны культуры видов Coprinus lagopides и Cerrena sp., как наиболее перспективные продуценты молокосвертывающих ферментов.

Агариковый макромицет Coprinus lagopides в природе имеет независимый сапротрофный тип питания. Важной биологической особенностью этого вида, которую мы наблюдали при работе с культурой, является способность образовывать в условиях in vitro небольшие плодовые тела, и это служит полной гарантией отнесения культуры к указанному виду. Достоверная таксономическая идентификация вида обеспечивает надёжность микроскопического контроля всего биотехнологического процесса.

Кроме того, из литературных источников известно, что биомасса Coprinus lagopides проявляет гиполипидемический эффект в опытах на животных. Есть патентные данные, что культура Coprinus domesticus - вид очень близкий к Coprinus lagopides, обладает выраженным биосинтезом внеклеточных протеиназ фибрино- и тромболитического действия.

Аналогичные данные имеются и по культуре вида Cerrena sp. Эти обстоятельства служили дополнительным обоснованием биотехнологической целесообразности выбора именно этих продуцентов в качестве исследуемых.

Подбор питательных сред с целью получения наиболее высокой молокосвертывающей активности у отобранных продуцентов проводили на средах с различными источниками углерода и азота, варьируя их соотношение. Таким образом, по изучению характера роста и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов культурами Coprinus lagopides и Cerrena sp. в различных трофических условиях, можно констатировать, что оба исследованных вида характеризуются активным биосинтезом протеиназ молокосвёртывающего действия. Однако, максимальные уровни молокосвёртывающей активности и её соотношение к общей ПА наблюдаются у этих видов при культивировании на питательных средах существенно различающихся по химической природе основных источников питания.

Так, для продуцента Coprinus lagopides, исследованного на натуральной среде и двух вариантах полусинтетической среды, оптимальной была натуральная среда, где источником азота служила соевая мука, а источником углеводов - пивное сусло. Известно, что и соя и сусло являются богатыми и комплексными источниками питания. Так, соевая мука может содержать до 30-40% белка, близкого по аминокислотному составу к животному белку, до 30% общих углеводов (из которых до 15% растворимых моно- и олигосахаров и до 10-13 % полисахапидов), до 15% жиров, 1-2% лецитина (основного компонента фосфолипидов). Основным углеводным компонентом пивного сусла является мальтоза (до 50-60% от общего состава Сахаров), кроме того сусло содержит глюкозу, пентозы, дисахариды, минеральные вещества, например фосфаты, а также свободные аминокислоты - пролин, лейцин, фенилаланин, валин и др. соединения. В природных условиях грибы из рода Coprinus, включая вид Coprinus lagopides, обитают на различных и богатых органикими веществами смешанных (комплексных) субстратах — лесная подстилка (обычно перемешана с землёй, включает продукты распада растительных остатков), удобренные или унавоженные почвы, газонная земля, полуразрушенные пни, гниющая древесина и т.п. Поэтому понятно, что в условиях культуры этот вид «предпочёл» натуральную питательную среду, имеющую более богатый органический состав.

Другой исследованный продуцент - Cerrería sp., предпочитал в условиях культуры более строгий по питательному составу вариант среды -полу синтетическую, где источником углеводов является глюкоза (15 г/л), источник азота - бактериальный пептон (1г/л) на фоне минеральных солей. В природных условиях вид Cerrería sp., в отличие от вида Coprinus lagopides, занимает более узкую и определённую нишу обитания. Он является типичным представителем ксилотрофных базидиомицетов, обитает на твёрдой древесине лиственных пород, которую активно разрушает по типу белой гнили, т.е. расщепляет основные компоненты древесного субстрата — сложные лигнин-целлюлозные комплексы. Известно, что древесина содержит ничтожные количества азота (< 1%), в связи с чем соотношение C:N в ней очень высокое. Тот факт, что МСА продуцента более, чем в 3 раза выше на «бедной» (условно) среде, чем на «богатой», то можно предположить, что культура лигнотрофного вида Cerrena sp. в условиях среды богатой по азоту, может испытывать давление по типу катаболитной репрессии.

Поскольку многие фермены содержат коферменты, в качестве которых могут выступать ионы металлов, то в ходе работы изучали влияние различных микроэлементов на уровень биосинтеза молокосвертывающих ферментов. Установлено, что уровень молокосвертывающей активности обоих продуцентов может быть повышен на 10-14% при внесении в питательную среду солей Zn2+, Cu2+, Fe2+ в концентрации 1мг/л и СоСЬ в концентрации 5мг/л.

Как уже указано, важнейшим аргументом использования молокосвертывающего препарата в практике сыроделия является соотношение в нём молокосвёртывающей и протеолитической активности. В динамике роста исследуемых культур, наряду с определением динамики МСА по стандартному молочному субстрату проводили оценку уровня общей протеолитической активности по стандартному образцу препаратов казеина. Установлено, что на оптимальной для Coprinus lagopides натуральной среде нарастание молокосвёртывающей активности идёт не сцепленно с уровнем общей ПА т.е. биосинтез протеиназ с узким и широким спектром протеолитческой активностью идут независимо друг от друга, что позволяет получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого общего неспецифического протеолиза.

В ходе дальнейшей работы были экспериментально изучены различные способы концентрирования и очистки молокосвертывающих ферментов. В итоге пришли к выводу, что наиболее оптимальной схемой их выделения из КФ продуцента является концентрирование и очистка методом ультрафильтрации с последующей лиофильной сушкой препарата.

Удельная молокосвертывающая активность фермента, полученного из культуральной жидкости гриба Cerrería sp. составила 78.2 Е/мг. Для ферментного препарата из Coprinus lagopides удельная молокосвертывающая активность была 76.0 Е/мг. Для стандартного образца сычужного препарата — 72.8 Е/мг. При этом, соотношение молокосвёртывающей и протеолитической активности у стандартного сычужного препарата было 910, у препаратов из базидиомицетовых культур Coprinus lagopides и Cerrena sp.- 835 и 782 соответственно.

По технологическим требованиям, предъявляемым в сыроделии к молокосвёртывающим препаратам, предназначенным для получения высококачественных сыров, соотношение молокосвертывающей и протеолитической активности желательно иметь в пределах 1000. Для сыров низкого или невысокого качества допускают использование ферментных препаратов с соотношением МСА к ПА в пределах 300.

Изучены физико-химические характеристики полученных молокосвертывающих препаратов из базидиомицетов Coprinus lagopides и Cerrena sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра).

Молекулярная масса ферментов, ориентировочно оцененная методом гель-фильтрации (Сефадекс G-75 и Биогель-300), составляет для молокосвертывающего фермента из Coprinus lagopides 39±0.5 кОа, для молокосвёртывающего фермента из культуры Cerrena sp. — в пределах 35±0.5 KDa. Молекулярная масса используемых в практике сыроделия ферментов животного происхождения варьирует в пределах 33 KDa - 38 KDa.

Полученные грибные молокосвертывающие ферменты были также изучены применяя линеаризацию уравнения Михаэлиса-Ментен в обратных величинах по кинетическим характеристикам, определяя константы Михаэлиса и максимальную скорость реакции. Получены следующие характеристики:

Для фермента из культуры Coprinus lagopides

Km = (70±0.01 )* 10"4 моль/л

Vmax = (0.251±0.006)*10"6 моль/(мин*мг).

Для фермента из культуры Cerrena sp.

Km = (9.5±0.01)*10~4 моль/л

Vmax =(1.70±0.06)*10"6 моль/(мин*мг).

Константа Михаэлиса для реннина составляет от 7*10"6 до 5*10"4 моль/л.

На основе линеаризации уравнения Михаэлиса были также определены кинетические характеристики молокосвертывающего фермента из Coprinus lagopides при различных рН субстрата. По полученному значению константы ионизации, ориентируясь на таблицы справочных данных, можно предположить, что в состав активного центра исследуемого молокосвёртывающего фермента из базидиальной культуры Coprinus lagopides входит гистидин.

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что выделенные из культур базидиомицетов молокосвёртывающие ферменты и сычужный фермент «Реннин», близки не только по величине молекулярного веса, но и имеют значения константы Михаэлиса одного плана. Эти характеристики указанных ферментов сравниваются впервые.

Таким образом, в результате проведённых исследований, впервые обнаружено наличие высокой молокосвертывающей активности у культур базидиальных грибов Coprinus lagopides и Cerrena sp., предложены схемы получения ферментных препаратов с высокой молоксвертывающей и низкой общей протеолитической активностью, получены физико-химические характеристики новых грибных ферментов.

Сравнительный анализ ферментативной активности препаратов из культур Coprinus lagopides и Cerrena sp. и стандартного образца сычужного препарата показал, что препараты грибного происхождения по своим свойствам практически не уступают популярному коммерческому аналогу. Молочные сгустки, полученные с использованием исследуемых грибных ферментных препаратов, имели плотную и эластичную консистенцию и не имели привкуса горечи.

Это свидетельствует о перспективности и целесообразности использования препаратов из культур Coprinus lagopides и Cerrena sp. в качестве заменителей дорогостоящих и дефицитных сычужных препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Дмитриева, Татьяна Александровна, 2011 год

1. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983. - 363 с.

2. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А, Шмелев В.П. Биофизика, Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. 336 с.

3. Бегунов В.Л. Книга о сыре. — Пищевая промышленность, 1974. 216с.

4. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов. Методы исследования, под ред. канд. биол. наук О. П. Низковской, Л.: Наука. 1979.- 72 с.

5. Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов В 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн 8: Инженерная Энзимология / И. В. Березин, А. А. Клесов, В. К. Швядис и др. -М.: высш. Шк., 1987.-143с.

6. Бисько H.A., Бухало A.C., Вассер С.П. и др. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре, Киев: Наукова думка. 1983. -312 с.

7. Бич Г., Мелвин М., Таггарт Дж. Пищевые продукты напитки и биотехнология // Биотехнология. Принципы и применение: пер с англ. /под редакцией И Хиггинсаи др. -М. : Мир, 1988. 91-131.

8. Бредихина С.А. Юрин В.Н. Техника и технология производства сливочного масла и сыра. М.: КолосС. 2007. — 319с.

9. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. -: Наукова думка, 1988. 144 с.

10. Бухало A.C., Билай T.I., Бесараб Б.Н. Протеолггична актившсть деяких вищих базидюмицетов // Мисробюлог. ж. 1971. - Т. 33, N 5. - С.663-665.

11. Бэккер 3. Э. Физиология грибов и их практическое применение. — М.: Издательство МГУ, 1963. -268 с.

12. Бэст Д. Химия и технология // Биотехнология. Принципы и применение перевод с англ / под редакцией И Хиггинса и др. — М Мир, 1988. с. 132-189.

13. Венн Д. Сыр. Краткий курс знатока. Эксмо, 2005. - 64с.

14. Галыкин В.А., Розенталь А.Д. Методы фракционирования белков. Методические указания/ЛТИ им. Ленсовета, Л., 1988. — 18с.

15. ГОСТ 20264.2 88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности, М.: Изд-во стандартов. 1988.

16. Горленко М.В., Бондарцева М.А., Тарибова Л.В. и др. Грибы СССР, М.: Мысль. 1980. -303с.

17. Грачева И. М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов, М.: Из-во «Элевар». 2000. 512с.

18. Гудков А. В. Сыроделие: Технологические, биологические и физико-химические аспекты, М. Дели принт, 2004.- 804с.

19. Даниляк Н.И., Семичаевский В.Д., Дудченко Л.Г., Трутнева И. А. Ферментные системы высших базидиомицетов, Киев: Наукова думка. 1989. -280 с.

20. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения: Дисс.докт. биол.наук, Л., 1991

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М., 1962. 390с.

22. Дмитриева Т.А., Колесников Б.А., Шамцян М.М. Скрининг продуцентов молокосвертывающих ферментов среди культур высших базидиомицетов//Естественные и технические науки. № 3, 2009. с.145-147.

23. Дмитриева Т.А., Корчмарёва A.B., Шамцян М.М., Денисова Н.П. Молокосвертывающие ферменты высших грибов. Естественные и технические науки. № 2(34), 2008. С. 197-200.

24. Дмитриева Т.А., Соколова C.B., Фейст И.В., Шамцян М.М., Корчмарёва A.B. Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов. II Межд. конф. «Химия, структура и функции биомолекул». Октябрь 2006, Минск, Беларусь. С.46.

25. Дытнерский Ю.И. Барометрические процессы. М.: Химия, 1986. - 272с

26. Жданова Е.А., Дьяченко П.Ф., Ферментные препараты в молочной промышленности, М.: Пищ. пром., 1962. — 63с.

27. Заикина H.A., Коваленко А.Е., Галынкин В.А., Дьяков Ю.Т., Тишенков А.Д. Основы биотехнологии высших грибов, СПб.:Проспект Науки, 2007. — 336с.

28. Иммобилизованные клетки и ферменты, под ред. Дж. Вудворда, М.: Мир, 1988.-215 с.

29. Калек К. Сыр. Иллюстрированная энциклопедия, М. Лабиринт Пресс, 2003. -256с.

30. Краюшкин В.А., Свириденко Ю.Я., Бузов И.П., О молокосвертывающих препаратах, "Молочная промышленность", №2, 1997.С.37-39.

31. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. 3-е изд., доп., перераб., исправл. -М.: Наука, 1986. 336 с.

32. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов/ И.М. Грачева, Ю.П. Грачер, М.С. Мосичев. // "Легкая пищевая промышленность", 1982-240 с.

33. Маттисон Н.Л., Фалина Н.П. Протеолитическая активность афилофоровых грибов в поверхностной культуре // Микол. и фитопатол. 7, N5. — С.394-399.

34. Зб.Машанский В.Ф., Конев Ю.Е., Жилина З.А., Аравийская C.B., Терешин И.М. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата. A.c. СССР №854983, 1981. Бюлл. № 30 от 15.08.81

35. Микеш О. Н. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. М. : Мир, 1982.С.56-62.

36. Низковская О.П., Маттисон Н.Л. Протеолитическая активность агариковых грибов в культуре. // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л.: Наука, 1973. - С. 13-19.

37. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Милова Н.М. Характеристика культур агариковых грибов по протеолитической активности //Микол. и фитопатол. -1975.-Т. 9, N6.-С. 488-489.

38. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Дроздова Т.Н. протеолитическая активность базидиомицетов из пор. Aphyllophorales, И. Казеиназа // Микол. и фитопатол. 1979. - Т. 13, N 3. - С. 217-220.

39. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Дроздова Т.Н. протеолитическая активность базидиомицетов из пор. Aphyllophorales // I. Молокосвертывающая активность // Микол. и фитопатол. 1980. - Т. 14, N 1.-С. 36-40.

40. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Шиврина А.Н., Чеботарев А.И. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата. A.c. СССР №522230, 1973. Бюлл. № 27 от 25.07.76

41. Панфилова Н.Е. Молоко и здоровье, Минск: Ураджай, 1998, с.24-26.

42. Паронян А.Х., Куимова Т.Ф., Красильников H.A. Сравнительная характеристика способности свертывать молоко у различных представителей пор. Actinomycetales // Микробиология. 1975. - Т. 64, N 3. - С. 538-541.

43. Патент №2192137, Россия, МПК7А23С19/02. Способ производства сыра / В. Н. Лебедьков, А. М. Русинова , С. П. Нигматзянова (Россия). № 2000121189/13; Заявлено 07.08.00; Опубл. 10.11.02

44. Патент №2354698 C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента (RU).Дмитриева Т.А., Шамцян М.М., Денисова Н.П., Змитрович И.В., Корчмарева А.В. Заявл. 12.09.2006; Опубл. 10.05.09; Бюл.№13. 7с.

45. Пономарева Т., Беленький Г. Масло, сыр и все из молока, М. Феникс, 2000. -352с.

46. Руденская Г.Н., Гайда JI.B., Степанов В.М. Протеиназы из базидиального гриба Russula decolorans // Мат. II Всес. Симпозиума по химии протеолит. ферментов. Углич, 1979. - С. 54-55.

47. Руденская Г.Н., Гайда А.В., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans Fr. шт. 0456 // Биохимия. 1980. - Т. 45, N3.-С. 561-568.

48. Скотт Р. Рбинсон Р., Уилби Р. Производство сыра: сырье, технология, рецептуры, СПб: Профессия, 464с.

49. Теплы М., Машек Я., Гавлова Я., Молокосвертывающие ферменты животного и микробного происхождения, М: Пищевая промышленность, 1980.-268с.

50. Типограф Д.Я., Петина Т.А. Условия культивирования Aspergillus candidus, шт. 111 и его ферментативные комплексы // Приклад, биохим. и микробиол. -1966.-Т. 2,N4.-С. 417-424.

51. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А. и др. Ферментация и технология ферментов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1983. 335с.

52. Усанова Т.И., Логунова Г.И., Розенталь А.Д. Лабораторно-практические работы по биотехнологии для подготовки рабочих по учебной группе профессий «Оператор биотехнологических производств в профтехучилищах». Л.:ВНИИ профтехобразование, 1989. — 40с.

53. Успехи медицинской микологии/ Под общей редакцией Ю. В. Сергеева. — М. : Национальная академия микологии, 1994 — 680 с.

54. Фалина H.H. Выращивание зимнего опенка Flammuna velutipes (Fr) Sing 1 для получения мицелия и протеолитических ферментов // Производство высших съедобных грибов в СССР. — Киев: Наукова думка, 1978, c.l 11-114.

55. Фалина H.H. Тромболитическая активность в культурах штаммов Flammulina velutipes (Fr.) Karst. // Микол. и фитопатол. 1980. - Т. 14, N 1. -С. 40-42.

56. Фалина H.H., Морозова Э.Н., Денисова Н.П. и др. Препарат фибринолитического действия из зимнего опенка ( Flammulina velutipes ) // Прикл. биохим. и микробиол. 1978. - Т. 14, N 5. - С. 699-702.

57. Федорова JI.H., Шиврина А.Н. Протеазы сычужного действия в культурах высших грибов // Микол. и фитопатол. 1974.- Т.8, N 1. т -С. 22-25.

58. Федорова JLH., Дроздова Т.Н., Гаврилова В.П. Биосинтез молокосвертывающего фермента базидиальным грибом Russula decolorans шт. О456.//Микол. и фитопатол. 1981. - Т. 15, N 6.- С.496-500.

59. Фейст И.В., Дмитриева ТА., Шамцян М.М. Молокосвертывающие ферменты высших грибов. Сборник конкурсных работ Всероссийского смотра-конкурса научно-техн. творчества студентов ВУЗов «Эврика-2006». Ноябрь 2006, Новочеркасск. С. 210-212.

60. Химия протеолитических ферментов // Мат. II Всес. симпозиума по химии протеолитических ферментов. Углич, 1979. - 158 с.

61. Шалапутина Э.П., Краюшкин И.В., Шалапутина Н.В. Лабораторный практикум по технологии молочных консервов и сыра. — СПб: Гиорд, 2008. — 228с.

62. Экспертиза качества сыров: Метод, руководство. МВШЭ.МР-013-2002. Авт.-сост. Суханова М.:ДеЛи, 2002.-.84с.

63. Югова Л.В., Дорохов В.В., Производство и применение продуктов микробиологических производств. Микробные заменители сычужного фермента, М., 1988. 19с.

64. Яковлев В.И., Технология микробиологического синтеза, Л.: Химия, 1987. — 272с.

65. Яковлева Е. П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами (обзор) // прикладная биохимия и микробиология -1983. —т. 19, N3. —с. 330-346

66. Якуницкая Л.М.,Самарцев М.А. Тенденция развития производства молокосвертывающих ферментов // Биотехнология. 1987.- Т.З, N 5. - С. 586591.

67. Chang S.-T., «Mushroom Biology: The Impact on Mushroom Production and Mushroom Products», Hong-Kong, 1993. 35P.

68. Chang S.-T. Global impact of edible and medicinal mushrooms on humanwelfare in the 21st century: nongreen revolution// International Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, V.I.-P.l-7

69. Das A., Chatterjee M., Roy A. Enzymes of some fungi // Mycologia. -1979.-Vol. 71,N3.-P. 530-536.

70. Denisova N.P. Traditions of using medicinal mushrooms among the nations of the world //ibid, 2001, V.3.- P.98

71. Dmitriyeva Т., Denisova N., Shamtsyan M. Milk-Clotting Activity of Native Liquid of Submerge Cultures of Higher Basidiomycetes. 14th World Congress of Food Science and Technology. Shanghai, October 19-23, 2008. P. 255.

72. Dmytrieva Т., Korchmaryova A., Denisova N., Shamtsyan M. Study of Milk-Clotting Activity From Hygher Basidiomycetes. Proceedings of 5th International

73. Congress on Food Technology "Consumer Protechtion through Food Process Improvement & Innovation in the Real World" Thessaloniki, Greece, 2007. V.l. -p.265-271.

74. Dmitrieva T., Gavrilenko K., Sapronova E., Popov A., Ernazarov A., Shamtsyan M., Denisova N. Milk Clotting Enzymes From Higher Basidiomycetes. 2nd Central European Congress on Food . Budapest, 2004. P.64

75. Dmitriyeva T., Korchmaryova A., Denisova N., Shamtsyan M. Chapter 7 Milk-Clotting Enzymes of Higher Basidiomycetes; In: Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development. Ed. G.E. Zaikov. Nova Science Publishers, New-York. 2008. P.49-57.

76. Dmitrieva T., Shamtsyan M., Korchmaryova A. Milk-Clotting Enzymes From Submerge Cultivated Higher Basidiomycetes. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P.218.

77. Enzyme Nomenklature, Recomendations(1978) of the Nomenklature Committeeof IUB. N4.-L.: Acad. Press, 1979.-606p. Suppl. 2//Europ. J. Biochem. -1981.-Vol. 116.-P. 423-435.

78. Foltmann B. Mammalian milk-clotting proteases: structure, function, evolution and development//Neth. MilkDairyJ. -1981. -Vol. 35,N3-4.-P. 223-231.

79. Fries L. Studies in the physiology of Coprinus. Cultivation experiment with running media // Bot. Notiser. 1956. V.I 09. №1. P. 12-20.

80. Ichishima E., Kumagai H., Tomoda K. Substrate specificity of protease from Pycnoporus coccineus, a wood-deteriorating fungus// Curr. Microbiol. -I980.-Vol. 3,N6.-P. 333-337.

81. Ichishima E., Yashimura K., Tomoda K. Acidcarboxypeptidase from wood-deteriorating Basidiomycete Pycnoporus sanguineus!/ Phytochemistry. -1983.-Vol. 22,N4.-P. 825-831.

82. Kawai M. Studies on milk-clotting enzymes produced by Basidiomycete. II. Some properties of Basidiomycete milk-clotting enzymes//Agr. Biol. Chem. -1970a. -Vol. 34,N2.-P. 164-169.

83. Kawai M. Mycolytic enzymes produced by some strains of Coprinus. IT Some characteristics of crude enzymes produced by Coprinus macrorhizusf. Microsporus Hongo and Coprinus radians (Desm.) Fr. //J. Ferment. Technol. -1970b. -Vol. 48,N7.- P. 397-404.

84. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. III. Partial purification and some properties of the enzyme produced by Irpex lacteus Fr. //Agr. Biol. Chem. -1971. -Vol. 35.-P. 1517-1525.

85. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymes and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes!/J. Arg. Chem. Soc. Jpn. -1973 a. -Vol. 47,N8.-P. 467-472.

86. Kawai M. Productivity of pectolytic and racematic enzymes among Basidiomycetes II Ibid. -1973c. -Vol. 47,N9.-P. 523-527.

87. Kawai M. Productivity of amilolytic, celulolytic and xylolytic enzymes among the Basidiomycetes!/Ibid. -1973d. -Vol. 47,N9.-P. 529-534.

88. Kawai M., Otsuka Y. Screening test of Basidiomycetes for the production of proteolytic enzymes and some characteristics of crude enzymes//Trans. Mycol. Soc. Jpn. -1969.-Vol. 10,N1.-P. 29-34.

89. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes.I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes//Agr. Biol. Chem. -1970. -Vol. 34,N2.-P. 159-163.

90. Kikuchi E., Kobajashi H., Kusakabe J., Murakami K. Fiber structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme //Agric. Biol. Chem. -1988.-Vol. 52,N5.-P. 1277-1278.

91. Kobayashi H., Kusakabe L., Murakami K. Purification and characterization of two milk-clotting enzymes from Irpex lacteus //Agr, Biol. Chem. -1983a. -Vol. 47,N3.-P. 551-558.

92. Kobayashi H., Kusakabe I, Murakami K. Substrate specificity of a carboxyproteinase from Irpex lacteus!/Ibid. -1983b. -Vol. 47,N8.-P. 1921-1923.

93. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Milk-clotting enzyme from Irpexlacteus as a calf rennet substrate for cheddar manufacture//Ibid. -1985a. -Vol. 49,N6.-P. 1605-1609.

94. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Subatrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on-casein // 323 - Ibid. - 1985b. - Vol. 49, N 6.-P. 1611-1619.

95. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Substrate specifity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on k-and -casein IIIbid. 1985c. - Vol. 49, N 6. - P. 1621-1631.

96. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Purification and characterization of a pepstatin-insensitive carboxyl proteinase from Polyporus tulipiferae {Irpex lacteus) II Ibid. 1985d. - Vol. 49, N 8. - P. 2393-2398.

97. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Substrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on peptide hormones // Ibid. 1986. - Vol. 50, N 4. - P. 923-930.

98. Koltyga I, Shamtsyan M., Dmitrieva T. Intensification of Yeast Biomass Accumulation And Ethanol Fermentation Process. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P.205.

99. Lowri, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Rendell, R. J., 1951, Protein measurement with the holinphenol reagent. J. Biol.chem.193

100. Misurcova Z., Nerud F. et al. Extra cellular acid proteases from Basidiomycetes/ICeskaMycol. -1986.-Vol. 40,N2.-P. 110-115.

101. Misurcova Z., Nerud F., Musilek V. Screening of Basidiomycetes for the production of milk-clotting enzymes//Ibid. 1987.-Vol. 41,N1.-P. 50-53.

102. Pachlewski R., Chrusciak E. Aktywnosc enzymatic znagrzy bow mikoryzowych//Actamycol. -1979.-Vol. 15,N1.-P. 3-9.

103. Pat. 1177054, GB. 1970. The milk-clotting enzymes from Fomitopsis pinícola, Irpex lacteus, Lenzites saepiaria, Coriolns hirsutus, Coriolus consors.

104. Shamtsyan M., Panchenko A., Spiridonova V., Dmitrieva T., Popov A., Koltyga I., Chistova O., Petrischev N., Denisova N. Bioactive Compounds From Higher Basidiomycetes. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P. 100.

105. M. Shamtsyan, V. Spiridonova, T. Dmitriyeva, A. Popov, N. Petrischev, N. Denisova. Mushroom bioactive substances for food industry. Abstr. 4th Central

106. European Congress on Food "CEFood-2008" Cavtat, Croatia, 15-17 May, 2008. P.63.

107. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review)// International Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, V.l, p.31-62

108. West S. L. Food proteins: sources and properties // J. Chem. Tech. Biotechnol 1984.- Vol. 34 B, N 3.- P. 176-181

109. WhitakerJ. R. Protease of Endothia parasiticalMethodsin Enzymology. -N. Y.: Acad. Press, I970.-Vol. 19.-P. 436-445.