Получение и использование магнитных частиц для стабилизации белков в водно-органических смесях: На прим. моноклон. антител и α-химотрипсина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Киселев, Максим Всеволодович

• Киселев, Максим Всеволодович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Киселев, Максим Всеволодович

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 1.1 Белки в водно-органических смесях б

1.1.1 Неспецифические взаимодействие фермента и 6 органического растворителя

1.1.2 Специфические взаимодействия белков с 12 органическими растворителями

1.2. Методы стабилизации белков к инактивации в водно- 15 органических системах

1.2.1 Иммобилизация белков

1.3 Магнитные носители для иммобилизации белков

1.3.1 Магнитные материалы

1.3.2 Способы синтеза мелкодисперсных магнитных частиц

1.4 Физико-химические характеристики взаимодействия 26 белок-лиганд

1.4.1 Способы расчета параметров связывания

1.4.2 Анализ графиков в координатах Скетчарда

1.4.3 Анализ нелинейных графиков в координатах Скетчарда

1.5 Характеристика циклоспоринов 32 1.5.1. Общие сведения о цикпоспоринах

1.5.2 Фармакодинамика циклоспорина А

1.5.3 Фармакокинетика циклоспорина А

1.5.4 Метаболизм и элиминирование циклоспорина А

1.5.5 Методы анализа циклоспоринов

2. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ И ПОСТАНОВКА 44 ЗАДАЧИ

3. ВЫБОР ОБЪЕКТОВ

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47 4.1. Материалы

4.1.1 Реактивы

4.1.2 Приборы и материалы

4.2 Методы

4.2.1 Получение суспензии мелкодисперсного магнетита

4.2.2 Получение покрытий магнитных частиц

4.2.3 Рентгенофазовый анализ

4.2.4 Интерференционная микроскопия

4.2.5 Квазиупругое рассеяние лазерного света

4.2.6 Активация полимерных покрытий магнитных частиц

4.2.7 Иммобилизация антител на частицах

4.2.8 Определение активности иммобилизованного а- 53 химотрипсина

4.2.9 Активация циклоспорина С

4.2.10 Получение конъюгата активированного циклоспорина 54 С с флуоресцеин- гексаметиледиамином

4.2.11 Получение конъюгата активированного циклоспорина 55 СсБСА

4.2.12 Методика проведения твердофазного 55 иммуноферментного анализа

4.2.13 Методика проведения иммунофлуоресцентного 56 анализа с использованием магнитных частиц

4.2.14 Экстракция циклоспорина А из крови пациентов

4.2.15 Определение концентрации циклоспорина А в 57 экстракте из крови пациентов

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1 Получение мелкодисперсного магнетита

5.2 Получение покрытий магнитных частиц

5.2.1 Гидроксиапатитное покрытие

5.2.2 Покрытие из окиси титана (IV)

5.2.3 Получение ПЭИ покрытия

5.2.4 Покрытие из поперечно-сшитого ПАА

5.3 Активация полимерных покрытий магнитных частиц 71 5.4. Иммобилизация белков на поверхности частиц

5.4.1 Иммобилизация на неорганических покрытиях

5.4.2 Иммобилизация на полимерных покрытиях

5.5. Свойства а-химотрипсина, иммобилизованного на 74 магнитных частицах

5.6. Стабильность иммобилизованного а-химотрипсина в 76 водно-этанольных смесях

5.7 Свойства антител, иммобилизованных на магнитных 84 частицах

5.8. Разработка метода иммуноанализа циклоспорина А в 87 этанольных экстрактах крови пациентов

5.8.1 Получение конъюгатов для иммуноанализа

5.8.2.Выбор концентрации органической компоненты

5.8.3 Подбор условий экстракции циклоспорина А из 91 образцов крови

5.8.4 Построение градуировочной зависимости

5.8.5 Сравнение с существующими методами

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и использование магнитных частиц для стабилизации белков в водно-органических смесях: На прим. моноклон. антител и α-химотрипсина»

ВВЕДЕНИЕ

В последние несколько десятилетий внимание многих исследователей в области белковой химии и энзимологии сконцентрировано на проблеме стабилизации белков, главным образом ферментов и антител, в системах, содержащих полярные органические растворители. Интерес к стабильности белков в системах вода -полярный органический растворитель вызван перспективностью широкого применения таких систем для решения прикладных задач, таких как: проведение ферментативных реакций с участием гидрофобных субстратов и эффекторов, иммуноанализ и аффинная очистка соединений, нерастворимых и плохо растворимых в воде Также, проблема функционирования белков в водно-органических смесях актуальна с фундаментальной точки зрения. За годы исследований в этой области разработан ряд подходов, направленных на повышение устойчивости белков к инактивирующему и денатурирующему действиям органических растворителей. За годы исследований в области неводной белковой химии разработан целый ряд подходов, направленных на повышение стабильности белков в системах «вода - смешивающийся с водой органический растворитель». Разработанный подходы можно условно разделить на две группы: Первая - эта группа методов стабилизации, позволяющих сохранить гомогенность системы. К этой группе методов относятся введение в систему различных аддитивов, таких как полиэлектролиты и хаотропные агенты и химическая модификация белковой глобулы [1]. «Гомогенные» методы крайне удобны в фундаментальных исследованиях, например для прояснения роли воды в биокатализе, выявления данных о взаимосвязи структуры и функциональных свойств ферментов путем перехода к различным формам надмолекулярной организации биокатализаторов, не реализующимся в водных растворах. Основным недостатком таких систем является сложность разделения белка и реакционной среды.

Вторая группа методов - эта «гетерогенные» методы. Отличительной чертой этих методов является пространственное разделение белка и реакционной среды. Одним из наиболее часто

применяемых таких приемов является иммобилизация на разного рода носителях. При всех очевидных преимуществах этого подхода он имеет ряд существенных недостатков. Зачастую проведению реакций в гетерогенных системах мешают диффузионные ограничения. Уменьшение размеров носителей для увеличения скоростей протекания реакций приводит к усложнению отделения белков от реакционной среды. Таким образом, весьма актуальной представляется разработка методов стабилизации белков, позволяющих объединить преимущества как гомогенных, так и гетерогенных методов.

Одним из возможных путей решения этой проблемы является иммобилизация белков на мелкодисперсных магнитных носителях. Иммобилизация белков приводит к фиксации их активной конформации и повышению устойчивости к инактивации под действием органического растворителя; высокая дисперсность частиц позволяет избежать диффузионных ограничений при взаимодействии антитела с антигеном; магнитная восприимчивость дает возможность быстро перевести систему из микрогетерогенного (псевдогомогенного) состояния в истинно гетерогенное (твердая фаза и оптически прозрачный супернатант).

В данной работе мы предлагаем методы синтеза мелкодисперсных магнитных носителей для иммобилизации белков с целью стабилизации в водно-органических смесях и демонстрируем возможность использования таких систем в практических приложениях.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Киселев, Максим Всеволодович

6. выводы

1. Синтезированы и охарактеризованы по физическим и химическим свойствам магнитные частицы с покрытиями из гидроксиапатита, окиси титана (IV), полиэтиленимина и полиакриламида. Установлено, что все полученные покрытия пригодны для целей иммобилизации белков.

2. Продемонстрировано, что иммобилизация а-химотрипсина на магнитных частицах с гидроксиапатитным и полиакриламидным покрытиями приводит к существенному расширению интервала концентраций органического растворителя, в котором фермент сохраняет высокую каталитическую активность. Это создает предпосылки для использования ферментов, иммобилизованных на магнитных частицах в практических приложениях, например в ферментативном синтезе в неводных средах.

3. Показано, что иммобилизация на магнитных частицах с полиакриламидным покрытием приводит к значительной стабилизации монокпональных антител против циклоспорина А.

4. На основе антител, стабилизированных иммобилизацией на магнитных частицах разработана новая система иммуноанализа циклоспорина А в водно-органических смесях со значительным содержанием органической компоненты. Статистический анализ и сравнение с результатами твердофазного иммуноферментного анализа и радиоиммуноанализа показывают перспективность использования разработанной аналитической системы в клинической и лабораторной практике.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Киселев, Максим Всеволодович, 1999 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гладилин А.К, Левашов А.В. Катализ надмолекулярными фермент-полимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах. Успехи биологической химии, т. 36. 1996, с.141-161

2. Khmelnitsky Yu. L., Mozhaev V. V., Belova А. В., Sergeeva M. V., Martinek К Denaturation capacity: a new quantitative criterion for selection of organic solvents as reaction media in biocatalysis. Eur. J. Biochem. 1991. 198, 31-41.

3. Клибанов A.M. Биоорг. Химия 1978.4. 82-87

4. Kise H., Tomiuchi Y. Biotechnol. Let. 1991. v.13. p.317-322

5. Affleck R., Xu Z.-F., Suzawa V., Focht K., Clark D.S., Dordick J.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992., v.89. p.1100-1104

6. Weetall H.H. Enzymatic synthesis of gallic acid esters. Appl.Biochim. Biotechnol., 1985, N1, p. 25-28.

7. Singh T. J., Wang J. H. Stimulation of glycogen phosphorylase kinase from rabbit skeletal muscle by organic solvents. J. Biol. Chem. 1979. 254, 8466-8472.

8. Minato S., Hirai A. Characterization of ustilago ribonuclease U2. Effects of chemical modification of glutamic acid-61 and cystine-1 and of organic solvents on the enzymatic activity. J. Biochem. 1979. 85, 327334.

9. Bradbury S. L., Jacoby W. B. Glycerol as an enzyme-stabilizing agent: Effects on aldehyde dehydrogenase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. 69, 2373-2376.

10. Herskovits T.T., Jallet H. Structural stability and solvent denaturation of mioglobin. Science, 1969, v. 165, p.282-285.

11. Herskovits T.T., Gadegbeku В., Jaillet H. On structural stability and solvent denaturation of proteins. I. Denaturation by the alcohols and glycolsl. J.Biol.Chem., 1970, v.245, p.2588-2598.

12. Lubas В., Soltysik-Rasek M. Mechanism of the interactions of aliphatic alcohols with bovine serium albumine in ternary systems - n.m.r. study: 2.Aqueous solutions BSA-alcohols-sulphonamides. Int.J.Biol.Macromol., 1985, v.7, N4, p.242-247.

13. Klibanov A.M. Chemtech. 1986. v. 16. p. 354-359

14.

15.

16.

17.

18.

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Zaks A., Klibanov A.M. J. Biol. Chem. 1988. v.263. p.8017-8021 Otamiri M., Adlercreuts P., Mattiasson B. Biotechnol. Appl. Biochem. 1991. v. 13. p. 54-64

Hailing P.J. Biotechnol. Techniques. 1992. v. 6. p. 271

Kuhl P., Hailing P.J. Biochim. Biophis. Acta. 1991. v.1078. p.326-334

E. Dufour, P. Robert, D. Bertrand, T. Haertle. Conformation Changes of ß-lactoglobulin: An ATR infrared spectroscopic study of the effect of pH and ethanol. J. of Protein Chemistry. 1994. 13. 143-149.

J-M. Glandieres, P. Calmettes, P. Martel, Ch. Zentz, A. Massat, J. Ramstein, B. Alpert. Solvent-induced structural distortions of hors metmyoglobin. Eur. J. Biochem. 1995. 227. 241-248. S. Mitaku, K. Ikuta, H. Iton, R, Katoka, M. Naka, M. Yamada, M. Suwa. Denaturation of bacteriorhodopsin by organic solvents. Biophysical Chemistry. 1988. 30. 69-79.

M.Eisenbach, S. R. Caplan, G. Tanny. Biochim. Biophys. Acta. 1979. 554. 269).

M. Jackson, H. H. Mantsch. Beware of proteins in DMSO. Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1078. 231-235

Arnett E.M. Physico-chemical processes and mixed aqueous solvents. In: Physico-chemical processes and mixed aqueous solvents, Frank F., ed. London: Hoinemann Ltd, 1967, p. 105-128.

Demchenko A.H., Rusyn O.I., Egorov A.M., Tishkov V.l. The solvent effects on the kinetics of bacterial formiat dehydrogenase reaction. Biochim. et Biophys.Acta, 1990,v.1039, p.290-296. West J. B., Hennen W. J., Lalonde J. L., Bibbs J. A., Zhong Z., Meyer E.

F., Jr., Wong C.-H. 1990. Enzymes as synthetic catalysts: mechanistic and active-site considerations of natural and modified chymotrypsin. J. Amer. Chem. Soc. 112: 5313-5320.

Applewhite T.H., Martin R.B., Niemann C. J. Chem.Sos. 1958. 80. 1457 Laidler K.J., Bunting P.S. The chemical kinetics of enzyme action.-Oxford, Clarendon Press, 1973, p.216-220.

Nagamoto H., Yasuda T., Inone H. Effect of organic solvents on the activity of Glycoamilaze. Biotech. Bioeng., 1986, v.28, p.1172-1177.

29. Compton P.D., Coll R.J., Fink A.L. Effects of methanol cryosolvents on the structural and catalytic properties of bovine trypsin. J.Biol.Chem., 1986, v.261, N3, p.1248-1252.

30. Maurel P. 1978. Relevance of dielectric constant and solvent hydrophobicity to the organic solvent effect in enzymology. J. Biol. Chem. 253: 1677-1683.

31. Fink A. L. The effect of dimethyl sulfoxide on the interaction of proflavine with a-chymotrypsin. Biochemistry. 1974. 13, 277-280.

32. Faller L., Sturtevant J. M. The kinetics of the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate in organic solvent-water mixtures. J. Biol. Chem. 1966. 241, 4825-4834.

33. Bundy H. F., Moore R. L. Chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of m-, p-and o-nitroanilides of N-benzoyl-L-tyrosine. Biochemistry. 1966. 5, 808811.

34. Ruwart M. J., Suelter С. H. Activation of yeast pyruvate kinase by natural and artificial cryoprotectants. J. Biol. Chem. 1971. 246, 59905993.

35. Uhing R. J., Janski A. M., Graves D. J. The effect of solvents on nucleotide regulation of glycogen phosphorylase. J. Biol. Chem. 1979. 254, 3166-3169.

36. Mitaku S, Ikuta K., Itoch H., Kataoka R., Naka M., Yamada M., Suwa M. Denaturation of bacteriorhodopsin by organic solvents. Biophys.Chem., 1988, v.30, p.69-79.

37. Alkantara A.R., Garcia-Blanco F., Heras A.M., Sinisterra J.V., Ballesteras A. Influence of organic-aqueous media in the DNAse activity of micrococcal endonuclease, 1989, v.52, p.323-336.

38. Дузу П. Криобиохимия. M.: Мир, 1980.

39. Kneusel R. Е., Merchant S., Selman В. R. Properties of the solvent-stimulated ATPase activity of chloroplast coupling factor 1 from Chlamydomonas reinhardii. Biochim. Biophys. Acta. 1982. 681, 337344.

40. Sakurai H., Shinohara К., Hisabori Т., Shinohara К. Enhancement of adenosine triphosphatase activity of purified chloroplast coupling factor 1 in an aqueous organic solvent. J. Biochem. 1981. 90, 95-102.

41. Selman-Reimer S., Merchant S., Selman B. R. Isolation, purification, and characterization of coupling factor 1 from Chlamydomonas reinhardii. J. Biochemistry. 1981. 20, 5476-5482.

42. Wolosiuk R. A., Corley E., Crawford N. A., Buchanan В. B. Dual effects of organic solvents on chloroplast phosphoribulokinase and NADP-glyceraldehyde-3-P-dehydrogenase. FEBS Lett. 1985. 189, 212216.50.

43. Dreyfus M., Fries J., Tauc P., Herve G. Solvent effects on allosteric equilibria : Stabilization of T and R conformations of Escherichia coli aspartate transcarbamylase by organic solvents. Biochemistry. 1984. 23, 4852-4859.

44. Sawada H., Asano S., Maruyama H., Shinoda M., Aoki J. Studies on human prostatic acid phosphatase. III. The effects of alcohols on human erythrocyte acid phosphatase and on human prostatic acid phosphatase. J. Chem. Pharm. Bull. 1980. 28, 3466-3472.

45. Lozano P., Diego Т., Iborra J. L. Effect of water-miscible aprotic solvents on kyotorphin synthesis catalyzed by immobilized a-chymotrypsin. Biotechnol. Lett. 1995. 17, 603-608.

46. M. L. Barnard, K.J. Laidler. 1952. J. Am. Chem. Sos. 74. 6099-6101,

47. K.J. Laidler., M. C. Ethier. 1953. Arch. Biochem. Biophys. 44, 338-345,

48. M. Castaneda-Agullo, L. M. Del Castillo. 1959. J. Gen. Physiol. 42, 17634,

49. Родионова М.В.Белова А.Б., Можаев В.В., Березин И.В. Биотехнология 1988, 4. 69-72

50. Белова А. Б., Можаев В. В., Левашов А. В., Сергеева М.В., Мартинек К. Хмельницкий Ю. Л. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам. Биохимия. 1991. Т.56. 11. с. 1923-1945.

51. Mozhaev V. V., Khmelnitsky Yu. L., Sergeeva M. V., Belova А. В., Klyachko N. L., Levashov A. V., Martinek K. 1989. Catalytic activity and denaturation of enzymes in water/organic cosolvent mixtures, a-Chymotrypsin and laccase in mixed water/alcohol, water/glycol and water/formamide solvents. Eur. J. Biochem. 184: 597-602.

52. V. S. Narayan and A. M. Klibanov. Are Water-lmmiscibility and apolarity of the solvent relevant to enzyme efficiency. Biotechnology and Bioengineering. 1993. 41. 390-393.

53. A. Zaks, A. M. Klibanov. 1985. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents. Proc. Nath. Acad. Sci. USA. 82. 3192-3196,

54. A. Zaks, A. M. Klibanov. 1988. Enzyme catalysis in non-aqueous solvents. J. Biol. Chem. 263. 3194-3201.

55. Панк M., Киррет О., Паберит H., Аавиксаар А. Влияние органических растворителей на активность бактериальных металлопротеиназ. Изв. АН ЭССР (серия химия), 1984, т.ЗЗ, N4, с.224-229.

56. The R., Hasselbach W. Stimulatory and inhibitory effects of dimethyl sulfoxide and ethylene glycol on ATPase activity and calcium transport of sacroplasmic membranes. Eur.J.Biochem., 1977, v.74, p.611-621.

57. Березин И.В., Мартинек К., Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977, 280с.

58. Brill A.S., Castleman B.W., McKnight М.Е. Assotiation of methanol and ethanol with heme proteins. Optical analysis and thermodinamic models. Biochem., 1980, v. 1.9, N.23, p.5157-5167.

59. Muhoberac B.B., Brill A.S., Assotiation of alcohols with heme proteins. Optical analysis and thermodinamic models. Biochem., 1980, v.19, N23, p.5157-5167.

60. Muiswinkel-Voetberg van H., Visser J, Veeger C. Conformational Studies of lypoamide dehydrogenaze from pig heart interconversion of dissociable and non-dissosiable forms. Eur.J.Biochem., 1973, v.33, N2, p.265-270.

61. Gorbunoff M.J. Biochemistry. 1971. 10. p. 250-257

62. Clement G.E., Bender M.L.. Biochemistry. 1963.2. p.836

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69

70

71

72

73

74

75

76

Greenfield N., Fasman G. Biochemistry 1969 .8. p. 4108-4116

Miles J.L., Morpey E., Grain F., Gross S., San Julian J., Canady W.J. J.

Biol. Chem. 1962. 237. p. 1319

Heidberg J., Holler E., Hartman H. Ber. Bunsenges Phys. Chem. 1967. 71. p 19.

Seydoux F. Biochem. Biophys. Acta. 1969. 171. p. 145-156

Inward P. W., Jencks W. P. The reactivity of nucleophile reagents with

furoyl-chymotrypsin. J. iol. Chem. 1965. 240, 1986-1996.

Inouye K., Izawa S., Saito A., Tonomura B. Effects of alcohols on the

hydrolysis of colominic acid catalyzed by Streptococcus neuraminidase.

J. Biochem. 1995. 117, 629-634.

Kricka L. J., De Luca M. Effect of solvents on the catalytic activity of firefly luciferase. Arch. Biochem. Biophys. 1982. 217, 674-681. Pesheck P. S., Lovrien R. Cosolvent control of substrate inhibition in cosolvent stimulation of p-glucuronidase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. 79, 417-421.

Compton P. D., Coll R. J., Fink A. L. Effects of methanol cryosolvents on the structural and catalytic properties of bovine trypsin. J. Biol. Chem. 1986. 261, 1248-1252.

Kumakura M., Kaetsu I. Effect of organic solvents on enzymatic hydrolysis of celluloses. Z. Nturforsch. 1983. 38, 79-82. Kudryashova E. V., Vinogradov A. A., Belova А. В., Mozhaev V. V. 1994. Influence of protein surface hydrophobicity on the stability in organic solvents (with modified a-chymotrypsin as an example). Rus. J. Bioorg. Chem. 20: 274-280.

Ahmed S. A., iles E. W. Aliphatic alcohols stabilize an alternative conformation of the tryptophan synthase 0C2P2 complex from Salmonella typhimurium. J. Biol. Chem. 1994. 269, 16486-16492. Schuster S.M. Effect of organic solvents on the beef heart mitochondrial adenosine thriphosphatase. Biochemistry, 1979, v. 18, N7, p. 1162-1167. Мосолов В.В., Соколова Е.В. Взаимодействие гликолей и глицерина с активными центрами трипсина и химотрипсина. Докл.АН СССР, Биохимия, 1972, т.207, N1, с.228-231.

77. Laidler K.J., Bunting P.S. The chemical kinetics of enzyme action.-Oxford, Clarendon Press, 1973, p.216-220.

78. Ohama H, Sugiura N., Tanaka F., Yagi K. Effect of alcohol on the structure and function of D-amino acid oxidase. Biochemistry. 1977. 16, 126-131.

79. Yu.L. Khmelnitsky, S.H. Welch, D.S. Clark, J.S. Dordick. J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, p. 2647-2648.

80. J. Broos (1994) Enzymes in organic media. Effects of Crown Ethers and Other Organic Additives on the Activity and Selectivity. Thesis Enschede, Koninklijke biblioteek, Den Haag.

81. J.O. Rich, J.S. Dordick. Controlling subtilisin activity in organic media by imprinting with nucleophilic substrate. J. Am. Chem. Soc., 1997, v. 119, p. 3245-3252.

82. P.P. Wangikar, P.C. Michels, D.S. Clark, J.S. Dordick. Structure and function of subtilisin BPN solubilized in organic solvents. J. Am. Chem. Soc., 1997, v. 119, p. 70-76.

83. J.E. Matsuura, M.E. Powers, M.C. Manning, E. Shefter. Structure and stability of insulin dissolved in 1-octanol. J. Am. Chem. Soc., 1993, v. 115, p. 1261-1264.

84. M.E. Powers, J.E. Matsuura J. Brassell, M.C. Manning, E. Shefter. Enhanced solubility of proteins and peptides in nonpolar solvents through hydrophobic ion pairing. Biopolymers, 1993, v. 33, p. 927-932.

85. J.D. Meyer, J.E. Matsuura, B.S. Kendrick, E.S. Evans, G.J. Evans, M.C. Manning. Solution behavior of a-chymotrypsin dissolved in nonpolar organic solvents via hydrophobic ion pairing. Biopolymers, 1995, v. 35, p. 451-456.

86. J.D. Meyer, B.S. Kendrick, J.E. Matsuura, J.A. Ruth, P.N. Bryan, M.C. Manning. Generation of soluble and active subtilisin and a-chymotrypsin in organic solvents via hydrophobic ion pairing. Protein Res., 1996, v. 47,p. 177-181.

87. Q. Jene, J.A. Pearson, C.R. Lowe. Surfactant modified enzymes: solubility and activity of surfactant-modified catalase in organic solvents. Enzyme Microb. Technol., 1997, v. 20, p. 69-74.

88. M.V. Sergeeva, V.M. Paradkar, J.S. Dordick. Peptide synthesis using proteases dissolved in organic solvents. Enzyme Microb. Technol., 1997, v. 20, p. 623-628.

89. A. Matsushima, Y. Kodera, M. Hiroto, H. Nishimura, Y. Inada. Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potent tools in biotechnological processes. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1996, v. 2, p. 1-17.

90. T. Ke, C.R. Wescott, A.M. Klibanov. Prediction of the solvent dependence of enzymatic prochiral selectivity by means of structure-based thermodynamic calculations. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 3366-3374.

91. Y.-F. Wang, K. Yakovlevsky, B. Zhang, A.L. Margolin. Cross-linked crystals of subtilisin: versatile catalyst for organic synthesis. J. Org. Chem., 1997, v. 62, p. 3488-3495.

92. C.R. Wescott, H. Noritomi, A.M. Klibanov. Rational control of enzymatic enantioselectivity through solvation thermodynamics. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 10365-10370

93. N. Khalaf, C.P. Govardhan, J.J. Lalonde, R.A. Persichetti, Y.-F. Wang, A.L. Margolin. Cross-linked enzyme crystals as highly active catalysts in organic solvents. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 5494-5495.

94. P. Sears, M. Schuster, P. Wang, K. Witte, C.-H. Wong. Engineering subtilisin for peptide coupling: studies on the effects of counterions and site-specific modifications on the stability and specificity of the enzyme. J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, p. 6521-6530.

95. L. You, F.A. Arnold. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. Protein Eng., 1994, v. 9, p. 77-83.

96. J.C. Moore, F.H. Arnold. Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents. Nature Biotechn., 1996, v. 14, p. 458-467.

97. Brady C., Metcalfe L., Slaboszewsky D., Frank D. // J. Am. Oil Chem. Soc. 1988. Vol. 6. P. 917-927.

98. Samejumi H., Kimura K. in Enzyme Engineering: Future Directions (L.B. Wingard, ed.). New York: Plenum Press. 1974. P. 131.

99. Hustedt H., Kroner K.H., Menge U., Kula M.-R. // Trend Biotechnol. 1985. Vol. 3. P. 139-143.

100. Kuo J.Y., Goldstein J. // Enzyme Microb. Technol. 1983. Vol. 5. P. 285293.

101. H. Kise, A. Hayakawa and H. Noritomi Protease-catalyzed synthetic reaction and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents J. of Biotechnology, 14 (1990) 239-254,

102. K. Kawashiro, H. Ishizaki, S. Sugiyama, H. Hayashi. Esterification of N-Benzyloxycarbonyldipeptides in Ethanol-water with immobibized papain. Biotechnology and Bioengineering, 42, 1993, 309-314.

103. Yu. V. Mutin, V. Schellenberg, H.-D. Jakubke. Bioorg. Khim. 14, 5, 1988., C.F. Barbas, C.-H. Wong, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 533.

104. R. Vazquez-Duhalt, K. M. Semple, D.W.S. Westlake and Ph. M. Fedorak Effect of water-miscible organic solvents on the catalytic activity of cytochrome c Enzyme Microb. Technol. 1993, 15.

105. H. Kise, A. Hayakawa and H. Noritomi Enzymatic reactions in aqueous-organic Media. Chitin-alpha-chymotrypsin complex as a catalist for amino acid esterification and peptide synthesis in organic solvent. Biotechnology Letters 9, 543-548, 1987,

106. H. Kise and K. Fujimoto Enzymatic reaction in aqueous-organic media. Medium effect and nucleophilic specificity in subtilisin-catalysed peptide synthesis in organic solvents Biotechnology Letters. 10. 883-888 (1988).

107. D. Clare and J. Bailey. Deactivation of a-chymotrypsin-CNBr-sepharose4B conjugates in aliphatic alcohols. Biochemica et Biophysica Acta, 788. 1985. 181-188

108. E. Wehtje, P. Aldercreutz and B. Mattiasson. Reaction kinetics of immobilized a-chymotrypsin in organic media. 1. Influence at solvent polarity. Biocatalysis, 1993, 7. 149-161.

109. E. Wehtje, P. Aldercreutz and B. Mattiasson. Reaction kinetics of immobilized a-chymotrypsin in organic media. 2. Effects of substrate partition. Biocatalysis, 1993, 7. 163-176

110. Mozhaev V.V., Sergeeva M.V., Belova A.B., Khmelnitsky Yu.L. Multipoint attachment to a support protects enzyme from inactivation by organic solvent. a-Chymotrypsin in aqueouse solution of alcohols and diols. Biotechnol. Bioengin. 1990. 35, 653-659

111. Reslow M., Adlercreutz P., Mattiasson B. // Eur. J. Biochem. 1988. Vol. 172. P. 573-578.

112. Маркевича Л.Э., Зидермане A.A., Блум Э.Я., Лидак М.Ю. Об использовании магнитофореза для локализации коллоидных частиц ферромагнетика в живом организме. Магнитная гидродинамика, 1980, 4, 139-142

113. Каганов М.И., Цукерник В.М. Природа магнетизма. М. Наука, 1982, с 192

114. Пасынков В.В., Сорокин B.C. Материалы электронной техники. М. Высшая школа, 1986, с. 367.

115. Дубровский И.М., Егоров Б.В., Рябошапка К.П. Справочние по физике. Киев, Наукова думка 1986, с. 267-276, 525-526.

116. Магнитные порошки, под ред. Эфендиева А.З. Махачкала, изд-во Дагестанского Университета, 1975, с. 121.

117. Mosbach К., Schroeder U. Preparation and application of magnetic polymers for targeting drugs. FEBS Lett. 1979, 102, p. 112-116.

118. Такеоми С., Тикадзуми С. Магнитные жидкости. Москва, Мир, 1993 с. 125-137.

119. Windle P.L., Popplewell J., Charles S.W. IEEE Trans Magn. MAG-11, 1975, p. 1367.

120. Бейли Д., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Москва, Мир, 1989, т. 1.

121. Химическая энзимология, под ред. И.В. Березина, К. Мартинека., Изд. МГК, 1983.

122. Кантор Ч. Шиммел П. Биофизическая химия. Москва, Мир, 1984, т.2

123. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа. 1991.

124. Иммуноферментный анализ. Под ред. Нго Т.Т., Ленхофф Г.М. М.: Мир. 1988

125. РойтА., Основы иммунологии. М.: Мир. 1991

126. Scatchard В. Ann. N.Y. Acfd. Sei., 1949,Vol 51, 600

127. A.Ruegger, M.Kuhn, H.Lichti, H.-R. Loosli, R. Huuenin, C. Quiquerez, A. Von Wartburg Cyclosporin A, ein immunosuppressiv wirksamer peptidmetabolit aus Trichoderma polysporum, Helv. Chim. Acta, v.59, Fasc.4, 2, 1075-1092, 1976.

128. Borel.J.F. ,Di Padova., Quesniaux, V.F.J., RyffelB, Wenger,R.M. (1989).Pharmacology of Cyclosporin. Pharmacol. Rev.41 239-434

129. Baumann G., Zenke G., Wenger R., Hiestand P., Quesniaux, V.,Andersen,E.(1992) Molecular mechanism of immunosuppression. Immunology Today. 13. 136 -142.

130. Scheiber,S.S. and Crabtree, G.R.(1992) The mechanismof action of cyclosporin A and FK506. Transpl. Proc.22. 100-105.

131. Burckart, G.,Starzl, T., Williams, L., Sangri, A., Garter, C.,Diver,W., Ptachsinski,R.,lvatski,S.: Cyclosporin monitoring and pharmacokinetics in pediatric liver transplant patients. Transplant. Proc. 17; 1172-1175, 1985

132. Cocbern,I.T.R. and Krupp,P.: Sandimmun - appisal of drug interactions. In current therapy in nephrology, ad. By V.l. Andreucci and A.Delcanton, 503-518,Kluwer Academy Publishers, Boston, 1989.

133. Bowers,L.D. and Canafax ,D.M.,:Cyclosporin experience with therapeutic monitoring. Ther.Drug.Monit. 6:142 -147,1984.

134. Grevel,G.: Significance of cyclosporin pharmocokinetics. Transplant. Proc.20: 428-434,1988.

135. Grevel,G.: Absorbtion of cyclosporin A after oral dosing. Transplant.Proc.:18. 9-15,1986

136. Kahan,B.: Individualization of cyclosporin therapy using pharmaokinetics.Transplantation 40:457-476,1985.

137. Niederberger W.: Distribution and binding of cyclosporin in blood and tissues. Transplant.Proc.15: 2419-2421,1983

138. Valéry F.J. Quesniaux. Pharmacology of Cyclosporine (Sandimmune), III. Immunochemistry and Monitoring. Pharm. Reviews. Vol. 41.pp 249258.1989.

139. N.A.Cacalano, W.L.Cleveland, and B.F. Erlanger Antibodies to cyclosporin A by a novel route and their use to monitor cyclosporin levels by radioimmunoassay, J. Immulol. Meth. 118, 257-263, 1989.

140. Sandoz. Insert of Ciclosporin RIA-Kit (1986), 5th edn. Basel, Switzerland.

141. Sung C. Lee et.al.. Measurement of Cyclosporin A by a Specific RIA with Monoclonal Antibody and 1251 Tracer. Clin. Biochem. V. 24. P. 43-48. 1991

142. Abbot Laboratories. Insert of TDx Cyclosporin and metalites whole blood. USA. LN 9840-20. 1988.

143. Marc H.V.Van Regenmortel et.al. Analysis of the structural diversity of monoclonal antibodies to cyclosporine. Mol. Immunology. V.27. pp 102910-38. 1990

144. Maurer G., Loosly, H.R.:Drug Metab Dispose.12 :120-126,1984.

145. Freed, B.M. Rosano, T.J.Transplantation 43:123-127,987