Новые селективные пептидные субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Семашко, Татьяна Александровна

• Семашко, Татьяна Александровна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Семашко, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИСТЕИНОВЫХ ПЕПТИДАЗ СЕМЕЙСТВА С1 (Обзор литературы).

1.1. Классификация цистеиновых пептидаз.

1.2. Распространение, биологические функции и применение пептидаз семейства С

1.3. Процессинг пептидаз семейства С1.

1.4. Структура пептидаз семейства С1.

1.5. Типы ферментативной активности пептидаз семейства С1.

1.6. Активный центр и механизм катализа.

1.7. Активация и ингибирование ферментов.

1.8. Зона связывания пептидаз семейства С1.

1.9. Группы, используемые для детекции ферментативного гидролиза пептидаз.

1.10. Субстраты пептидаз семейства С1.

1.11. Специфичность пептидаз семейства С1.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые селективные пептидные субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина»

Пептидгидролазы семейства С1 (папаина) относятся к клану цистеиновых пептидаз, содержащих в активном центре остаток цистеина. Они выявлены в различных группах организмов. Родоначальником этого семейства является растительная пептидаза папаин. Этот фермент, а также близкие к нему цистеиновые пептидазы из тропических фруктов бромелаин и фицин имеют важное практическое значение и используются в пищевой промышленности, фармакологии, научных исследованиях. Большую группу цистеиновых пептидаз семейства С1 составляют цистеиновые лизосомальные катепсины млекопитающих и человека. Цистеиновые катепсины не только осуществляют неселективную лизосомальную деградацию белков, но и принимают участие в более специфических процессах как в нормальных физиологических условиях (активации проферментов, созревании гормонов, презентации антигенов и т.д.), так и при развитии различных патологий (остеопорозе, ревматоидном артрите, атеросклерозе, метастазировании и инвазии раковых опухолей и т.д.). Большой интерес представляют также цистеиновые пептидазы некоторых групп насекомых, у которых катепсин-подобные ферменты выполняют пищеварительную функцию. Сведения об организации и эволюции пищеварительной системы насекомых важны как с фундаментальной точки зрения, так и для разработки экологически безопасных методов борьбы с насекомыми-вредителями.

Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз семейства С1 (папаина) в природном материале требует их селективной детекции. Однако синтетические субстраты, обычно используемые для определения активности этой группы ферментов, больше удовлетворяют специфичности сериновых трипсиноподобных пептидаз. Это снижает как селективность, так и чувствительность корректного определения активности пептидаз семейства папаина. В связи с этим весьма актуальной задачей является разработка селективных и эффективных субстратов для тестирования активности ферментов этого семейства, как в гомогенном состоянии, так и в составе сложных ферментных смесей. Примером таких многокомпонентных систем служит комплекс пищеварительных пептидаз ряда насекомых-вредителей зерновых запасов. Наиболее изученным представителем этой группы насекомых является большой мучной хрущак ТепеЪпо тоШог, пищеварительный комплекс которого содержит цистеиновые и сериновые пептидазы. Ключевую роль в протеолизе пищевых белков играют цистеиновые пептидазы. Основными пищевыми белками Т. тоШог являются главные запасные белки семян пшеницы - глиадины, которые в значительных количествах присутствуют и в пищевом рационе человека. Однако употребление в пищу глиадинсодержащих продуктов 5 может вызывать тяжелое аутоиммунное заболевание ЖКТ целиакию (диагносцируемое у 2% населения). Отдельные пептиды глиадинов, вызывающие аутоиммунный ответ у больных целиакией, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз. Мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать главные пищеварительные цистеиновые пептидазы этого насекомого-вредителя. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. тоШог, которые могут иметь весьма важное значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии.

Основной целью данной работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности цистеиновых эндопептидаз семейства С1.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Использованы международные однобуквенные и трехбуквенные сокращения названий аминокислот. Все аминокислоты в Ь-ряда, если не оговорено особо.

Abz- о-аминобензоил (антранилоил)

Ас- ацетил

-АСС 7-амино-4-карбамоилметилкумарин

-AMC 7-амино-4-метилкумарид

-AFC 7-амино-4-трифторметилкумарид

Вое- трет-бутилоксикарбонил

BtOH N-гидрокси-бензотриазоловый эфир

Bz- бензоил

Bzl- бензил

DCC 1^,М'-дициклогексил-карбодиимид

DMF диметилформамид

DMSO диметилсульфоксид

Dnp 2,4-динитрофенил

DTT дитиотреитол

Е-64 Ь-транс-эпоксисукцинил-лейциламидо(4-гуанидино) бутан

EDDnp этилендиамин 2,4-динитрофенил

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

Et этил

For- формил

FPLC быстрая (высокоскоростная) жидкостная хроматография белков

Glp- пироглутамил

HEPES К-2-гидроксиэтилпиперазин-]М'-этансульфоновая кислота

IUBMB (=The International Union of Biochemistry and Molecular Biology)

Международный союз биохимии и молекулярной биологии

Me метил

MES 2-(1\Г-морфолино)этансульфоновая кислота

Рас- фенилацетил

PMSF фенилметилсульфонилфторид

PSA персульфат аммония

-pNA л-нитроанилид

РИА р-нафтиламид додецилсульфат натрия вп соевый ингибитор трипсина Куница

Бис- сукцинил

ТЕМЕБ ]М,]Ч-тетраметилэтилендиамин

ТшСР цистеиновая пептидаза ТепеЬгю тоШог

Тпв трис-гидроксиметиламинометан ъ- бензилоксикарбонил вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография

2,2'ДПДС 2,2' -дипиридилдисульфи д

4,4'ДПДС 4,4'-дипиридилдисульфид

ДТНБК 5,5' -дитиобис-(2-нитробензойная кислота)

КПВС криогель поливинилового спирта

ПААГ полиакриламидный гель

ТЭА триэтиламин

УБ ацетат-фосфат-боратный универсальный буфер

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Семашко, Татьяна Александровна

выводы

1. Проведен дизайн и осуществлен химико-энзиматический синтез ряда хромогенных и флуорогенных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1: 01р-РЬе-А1а-рМА, С1р-Уа1-А1а-рМА, АЬг-РЬе-А1а-рЫА, С1р-РЬс-А1а-АМС, 01р-РЬс-А1а-АРС.

2. Определены кинетические параметры гидролиза синтезированных субстратов пептидазами семейства С1 различного происхождения: растительными ферментами папаином, бромелаином и фицином, а также катепсинами В и Ь млекопитающих и человека. Показано, что эффективность гидролиза флуорогенных субстратов значительно выше, чем хромогенных.

3. Синтезированные пироглутамилпептиды 01р-РЬе-А1а-рКА, 01р-Уа1-А1а-рМА, С1р-РЬе-А1а-АМС и 01р-РЬе-А1а-АРС селективны для цистеиновых пептидаз семейства С1 и, в отличие от коммерчески доступных субстратов, не расщепляются пептидазами других кланов.

4. Предложен высокочувствительный экспресс-метод детекции цистеиновых пептидаз семейства С1 после нативного электрофореза в ПААГ с использованием синтезированных флуорогенных субстратов 01р-РЬе-А1а-АМС и 01р-РЬе-А1а-АРС.

5. С использованием синтезированных субстратов идентифицированы и охарактеризованы катепсин В- и катепсин Ь-подобные пищеварительные цистеиновые пептидазы из личинок большого мучного хрущака ТепеЬгю тоШог.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне признателен руководителям работы Ирине Юрьевне Филипповой и Елене Николаевне Элпидиной за ценные советы в ходе выполнения работы и помощь во время ее написания. Автор особенно благодарен E.H. Лысогорской и Е.С. Оксенойт за синтез отдельных использованных субстратов и советы по выполнению экспериментов, Д.П. Жужикову за предоставление образцов из насекомых. Автор также признателен Я.Е. Дунаевскому и М.А. Белозерскому за советы и помощь в проведении некоторых экспериментов. Автор благодарен отделу Хроматографии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ в лице Л. А. Баратовой, Н. В. Федоровой, А. Л. Ксенофонтова и Л. В. Кордюковой за проведение аминокислотного анализа и помощь в анализе данных по ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Автор также признателен сотрудникам Лаборатории криохимии (био)полимеров ИНЭОС РАН В.И. Лозинскому и Б.Л. Шаскольскому за предоставленные криогель поливинилового спирта, методики и внимание. Автор благодарен A.A. Байкову за консультации в области ферментативной кинетики. Автор признателен сотруднице отдела Биоэнергетики Е.А. Поповой за помощь в работе с микропланшетным флуориметром и внимание. Автор хотел бы поблагодарить студентов Химического факультета МГУ Д.П. Василькову, Е.А. Воротникову, С.С. Терехова, студентов факультета Биоинженерии и биоинформатики МГУ В.Р. Голяева, П.А. Бабкина, А.Г. Мартынова за участие в экспериментах. Автор также хотел бы поблагодарить Г.Н. Баландину, Т.И. Величко, A.B. Беляеву, О.М. Аникину, И.А. Гоптарь, Ю.А. Смирнову, М.С. Исакова, Т.А. Семенову и М.А. Семашко за моральную поддержку на протяжении времени выполнения работы. Автор хотел бы выразить отдельную благодарность A.B. Бачевой за ценные советы и помощь при выполнении и написании работы и за внимание.

1.12. Заключение

Цистеиновые пептидазы семейства С1 (папаина) - обширная группа ферментов, схожих по первичной и пространственной структуре, а также по строению активного центра, каталитическому механизму, оптимальным условиям проявления каталитической активности. Для многих представителей семейства С1 проведен рентгеноструктурный анализ, на основании которого и данных по субстратной специфичности с использованием набора синтетических пептидов сформировано представление о строении зоны связывания. Эта довольно протяженная область, насчитывающая до 7 подцентров (S1-S4 и Si'-S3'). Общим для семейства является предпочтение в Pi-положении субстратов остатков Arg, Lys, а также Gin и Leu. Определяющим для специфичности цистеиновых пептидаз семейства папаина считается аминокислотный остаток в положении Р2, причем наилучшим в этой позиции рассматривается гидрофобный ароматический остаток Phe. Недавние исследования по скринингу ферментативной активности цистеиновых пептидаз семейства папаина с использованием комбинаторных пептидных библиотек показали, что, вопреки устоявшемуся мнению, положение Р2 могут занимать и небольшие алифатические аминокислотные остатки, например, Val. Следует отметить, что и более удаленные от расщепляемой связи подцентры связывания также вносят заметный вклад в скорость гидролиза субстратов.

Анализ литературы показывает, что использование комбинаторных пептидных библиотек позволяет провести быстрый скрининг ферментативной активности, но в силу неоднозначности получаемых результатов такой подход не может заменить пока стандартные исследования ферментов с использованием набора субстратов.

В качестве субстратов для тестирования ферментативной активности цистеиновых пептидаз семейства С] описано большое разнообразие модифицированных пептидов. Наиболее широко применяемыми хромогенными субстратами являются п-нитроанилиды пептидов, содержащие в положениях Pi и Р2 от расщепляемой связи остатки Arg и Phe соответственно. Эти соединения обладают умеренной растворимостью, высокой стабильностью в водных смесях, удовлетворительными кинетическими характеристиками, но низкой селективностью, поскольку расщепляются ферментами семейства трипсина. Используемые флуорогенные субстраты цистеиновых пептидаз также неселективны.

Таким образом, основным недостатком использующихся в настоящее время синтетических пептидных субстратов цистеиновых пептидаз является их низкая

51 селективность. Это в значительной степени снижает чувствительность корректного определения активности этой группы ферментов. Серьезной проблемой является также необходимость использования для получения субстратов сложного многостадийного синтеза, что приводит к снижению выхода оптически чистого продукта. В связи с этим разработка новых селективных субстратов для тестирования цистеиновых пептидаз семейства папаина и эффективных (в том числе и ферментативных) методов их синтеза является актуальной проблемой.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основной целью данной работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности ряда цистеиновых пептидаз семейства С1.

Объектами исследования являлись цистеиновые пептидазы этого семейства различного происхождения: растительные ферменты папаин, бромелаин и фицин, лизосомальные катепсины млекопитающих и человека - катепсины В и Ь, а также цистеиновые пептидазы насекомого - вредителя зерновых запасов ТепеЬпо тоШог (ТшСР).

Выбор этих ферментов из всего многообразия цистеиновых пептидаз семейства С1 был обусловлен их практической и функциональной значимостью в различных протеолитических процессах, что было подробно рассмотрено в обзоре литературы.

Цистеиновые пептидазы растений используются как в научных исследованиях при структурном анализе белков, так и в медицине, фармацевтической, пищевой и косметической промышленности.

Внимание к цистеиновым катепсинам обусловлено ключевой ролыо этих ферментов в лизосомальной деградации белков в норме и при развитии патологических состояний.

Уникальность цистеиновых пептидаз из Т. тоШог состоит в том, что они являются секретируемыми пищеварительными ферментами (у человека и животных цистеиновые пищеварительные пептидазы отсутствуют). Следует отметить, что по сравнению с цистеиновыми пептидазами растений и млекопитающих, цистеиновые пищеварительные пептидазы из насекомых исследованы довольно скупо. Это связано, прежде всего, с их чрезвычайно высокой нестабильностью, что сводит к минимуму все усилия по их выделению и очистке, и, следовательно, характеристике. Между тем, эти ферменты могут иметь весьма большое значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии. Это тяжелое аутоиммунное заболевание (диагносцируемое у

2% населения), связанное с нарушением пищеварения из-за стойкой непереносимости запасных белков злаков - проламинов. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет: больным предлагается строгое пожизненное исключение из пищи продуктов, содержащих проламины (глютен) из пшеницы, ржи и ячменя. Отдельные пептиды проламинов, вызывающие аутоиммунный ответ у больных целиакией, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз [112]. Исходя из того, что глиадины (главные запасные белки пшеницы) являются основным пищевым

53 субстратом насекомого-вредителя Т. molitor, мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать пищеварительные цистеиновые пептидазы из этого насекомого-вредителя. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. molitor.

В работе решались следующие задачи:

1. дизайн и химико-энзиматический синтез селективных пептидных субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1;

2. определение кинетических параметров гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами различного происхождения;

3. анализ селективности субстратов;

4. использование субстратов для идентификации и характеристики цистеиновых пептидаз в составе сложных ферментных смесей на примере пищеварительного комплекса личинок большого мучного хрущака Т. molitor.

2.1. Дизайн субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1

В нашу задачу входило получение пептидных субстратов семейства папаина, которые отвечали бы следующим требованиям:

1. соответствие аминокислотной последовательности субстратов специфичности ферментов;

2. наличие в субстратах таких структурных элементов, которые обеспечивали бы достаточную растворимость целевых соединений и возможность прямого спектрофотометрического или флуориметрического детектирования ферментативной активности.

В соответствии с этим, структура субстратов может быть выражена общей формулой A-Xaa-YaajB, где А = Glp (пироглутамил), Abz (о-аминобензоил); В = pNA (п-нитроанилид), AMC (7-амидо-4-метилкумарин) и AFC (7-амидо-4-трифторметилкумарин); Хаа = Phe, Val; Yaa = Ala, место предполагаемого гидролиза субстратов показано стрелкой.

Поскольку субстрат-связывающая область цистеиновых катепсинов невелика по размерам, предлагаемые субстраты - короткие ди- и трипептиды. Исходя из анализа имеющихся литературных данных по субстратной специфичности исследуемых ферментов, мы предположили, что в подцентре P¡ субстратов может находиться небольшой по размеру аминокислотный остаток аланина (Yaa = Ala). В положении Рг,

54 которое является определяющим для специфичности семейства С1, находятся гидрофобные остатки Хаа = Phe, Val. Введение в это положение остатка Val основано на анализе литературных данных по скринингу пептидных библиотек, согласно которым эффективность гидролиза субстратов, содержащих Val в этом положении, примерно в 2 раза выше, чем с Phe [89, 108]. N-концевая группировка субстратов (А) представлена остатками пироглутаминовой (Glp) и о-аминобензойной кислот (Abz). Остаток пироглутаминовой кислоты, являясь более гидрофильным, чем большинство использующихся защитных групп, введен для обеспечения растворимости субстратов в водно-органических смесях. Группировка Abz является флуорогенным маркером. В качестве С-концевых остатков (В) использованы хромогенная и-нитроанилидная (pNA) и флуорогенные 4-амино-7-метил- и 4-амино-7-трифторметилкумаридные группировки (AMC) и (AFC) соответственно, присутствие которых .обеспечивает удобство и точность контроля ферментативной активности по изменению спектральных и флуоресцентных характеристик субстратов в ходе гидролиза. Таким образом, нами были предложены следующие субстраты:

Glp-Phe-Ala-pNA (I) Glp-Val-Ala-pNA (II) Abz-Phe-Ala-pNA (III) Glp-Phe-Ala-AMC (IV) Glp-Phe-Ala-AFC (V)

Возможность всех предложенных соединений являться субстратами цистеиновых пептидаз семейства С1 была проверена с помощью метода гибкого молекулярного докинга.

Для этого на первом этапе необходимо было провести анализ первичной и пространственной структуры ферментов. Особый интерес представлял анализ локальных изменений в структуре субстрат-связывающей области.

Исследуемые нами ферменты изучены в разной степени. Для папаина и катепсинов В и L известны первичные и пространственные структуры предшественников и зрелых пептидаз. Для бромелаина в базе данных белковых последовательностей UniProt

113] известно две последовательности, Р14518 (определенная секвенированием зрелого белка) и 023799 (определенная на уровне транскрипта), имеющие небольшое различие в области одной из важных для каталитического механизма аминокислот Asn-175. В соответствии с масс-спектрометрическими данными триптического гидролизата препарата коммерческого бромелаина, для -дальнейшего анализа была выбрана

55 последовательность 023799. Для фицина известны только фрагменты аминокислотной последовательности Ы-конца и в районе активного центра.

Сравнение последовательностей цистеиновых пептидаз, изучаемых в работе, приведено на рисунке 23. В районах, включающих аминокислотные остатки активного центра Суз-25,1 Пй-1 59, 01п-19 Азп-175, наблюдается высокая степень гомологии. Следует отметить протяженный пропептид, присущий цистеиновым пептидазам семейства С1. В соответствии с литературными данными, катепсин Ь- (или папаин-) подобные пептидазы имеют более длинный пропептидный участок, в котором присутствуют высококонсервативные мотивы ЕКБНП\Т и СЫРО, в отличие от катепсин В-подобных пептидаз. Следует обратить внимание на участок дополнительной петли, присутствующий в катепсин В-подобных пептидазах и включающий два последовательных остатка гистидина, связывание с которыми С-конца субстрата обуславливает пептидил-дипептидазную активность катепсина В. Из представленного выравнивания видно, что аминокислоты, определяющие специфичность пептидаз в Зг-положении, различны. Для папаина и катепсин Ь-подобных пептидаз это положение занимают гидрофобные аминокислоты, тогда как для бромелаина и катепсина В в нем присутствуют также отрицательно заряженные остатки, что может приводить к связыванию в Бг-положении не только гидрофобных аминокислот субстратов, но и положительно заряженных (табл. 15).

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Семашко, Татьяна Александровна, 2011 год

1. Enzyme Nomenclature. Academic Press, San Diego, California, 1992. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/

2. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database. Nucleic Acids Res., 2008, 36, 320-325. http://merops.sanger.ac.uk/

3. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. Handbook of Proteolytic Enzymes. Academic Press, 1998.

4. Hartley B.S. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem., 1960, 29, 45-72.

5. Rawlings N.D., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidases. Biochem. J., 1993, 290, 205-218.

6. Otto H.-H., Schirmeister T. Cysteine proteinases and their inhibitors. Chem. rev., 1997, 97, 133-171.

7. Chang A., Scheer M., Grote A., Schomburg L, Schomburg D. BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme information system: new content and tools in 2009. Nucleic Acids Res., 2009, 37, 588-592. http://www.brenda-enzvmes.org

8. Schomburg, I., Hofmann, O., Baensch, C., Chang, A., Schomburg, D. Enzyme data and metabolic information: BRENDA, a resource for research in biology, biochemistry, and medicine. Gene Fund. Dis., 2000, 3(4), 109-118. http://www.brenda-enzymes.org

9. Brocklehurst K., Salih E. A re-evaluation of the nomenclature of the cysteine proteinases of Carica papaya and a rational basis for their identification. Biochem J., 1983, 213(2), 559560.

10. Kimmel J.R., Smith E.L. Crystalline papain. I. Preparation, specificity, and activation. J. Biol. Chem., 1954, 207, 515-531.

11. Yamamoto H., Tabata M. Correlation of papain-like enzyme production with laticifer formation in somatic embryos of papaya. Plant Cell Rep. 1989, 8, 251-254.

12. Konno K, Hirayama C, Nakamura M, Tateishi K, Tamura Y, Hattori M, Kohno K. Papain protects papaya trees from herbivorous insects: role of cysteine proteases in latex. Plant J., 2004, 37(3), 370-378.

13. Polaina J., MacCabe A.P. Industrial enzymes: structure, function and applications, ra. 11. GrzonkaZ., Kasprzykowski F., Wiczk W. Cysteine proteinases. Springer, 2007, 181-195

14. Shuren J. Topical Drug Products Containing Papain; Enforcement Action Dates. United States Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services, 2008. http://www.fda.gov/QHRMS/DQCKETS/98fr/FDA-2008-N-0481 -n.pdf

15. Chobotova K., Vernallis A.B., Majid F.A. Bromelain's activity and potential as an anticancer agent: Current evidence and perspectives. Cancer Lett., 2010, 290(2), 148-156.

16. Bethune M.T., Strop P., Tang Y., Sollid L.M., Khosla C. Heterologous expression, purification, refolding, and structural-functional characterization of EP-B2, a self-activating barley cysteine endoprotease. Chem Biol. 2006,13(6), 637-47.

17. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, Cathepsin H, and cathepsin L. Methods Enzymol., 1981,80, 535-561.

18. Bohley P., Seglen P.O. Proteases and proteolysis in the lysosome. Cellular and Molecular Life Sciences, 1992, 48(2), 151-157.

19. Lecaille F., Kaleta J., Bromme D. Human and parasitic papain-like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design. Chem Rev., 2002,102(12), 4459-4488.

20. Palermo C., Joyce J.A. Cysteine cathepsin proteases as pharmacological targets in cancer. Trends in Pharmacological Sciences, 2008, 29(1), 22-28.

21. Rengel Y., Ospelt C., Gay S. Proteinases in the joint: clinical relevance of proteinases in joint destruction. Arthritis Res Ther., 2007, 9(5), 221-231.

22. Biihling F., Waldburg N., Reisenauer A., Heimburg A., Golpon H., Welte T. Lysosomal cysteine proteases in the lung: role in protein processing and immunoregulation. Eur Respir J., 2004, 23(4), 620-628.

23. Vasiljeva O., Reinheckel Т., Peters C., Turk D., Turk V., Turk B. Emerging roles of cysteine cathepsins in disease and their potential as drug targets. Curr Pharm Des., 2007, 13(4), 387-403.

24. Dickinson D.P. Cysteine peptidases of mammals: their biological roles and potential effects in the oral cavity and other tissues in health and disease. Crit Rev Oral Biol Med., 2002, 13(3), 238-275.

25. Rosenthal P.J., Kim K., McKerrow J.H., Leech J.H. Identification of three stage-specific proteinases of Plasmodium falciparum. J Exp Med., 1987, 166(3), 816-821.

26. Sabnis Y.A., Desai P.V., Rosenthal P.J., Avery M.A. Probing the structure of falcipain-3, a cysteine protease from Plasmodium falciparum: Comparative protein modeling and docking studies. Protein Science, 2003,12(3), 501-509

27. Руденская Г.Н., Пупов Д.В. Цистеиновые протеиназы микроорганизмов и вирусов. Биохимия, 2008, 73(1), 3-17.

28. Sajid М., McKerrow J.H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol., 2002,120(1), 1-21.

29. Yasuhara Т., Takai Т., Yuuki Т., Okudaira H., Okumura Y. Biologically active recombinant forms of a major house dust mite group 1 allergen Der f 1 with full activities of both cysteine protease and IgE binding. Clin Exp Allergy., 2001, 31(1), 116-124.

30. Shakib F., Ghaemmaghami A.M., Sewell H.F. The molecular basis of allergenicity. Trends Immunol., 2008, 29(12), 633-642.

31. Terra W.R., Ferreira C. Insect digestive enzymes: properties, compartmentalization and function. Comparative Biochemistry and Physiology, 1994,109B, 1-62.

32. Wieman K.F., Nielsen S.S. Isolation and partial characterization of a major gut proteinase from larval Acanthoscelides obtectus Say (Coleoptera: Bruchidae). Comp. Biochem. Physiol., 1988, 89B, 419-426.

33. Wiederanders B. Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase propeptides. Acta Biochim Pol., 2003, 50(3), 691-713.

34. Rowan A.D., Mason P., Mach L., Mort J.S. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro. J. Biol. Chem., 1992, 267(22), 15993-15999.

35. Guay J., Falgueyret J.P., Ducret A., Percival M.D., Mancini J.A. Potency and selectivity of inhibition of cathepsin K, L and S by their respective propeptides. Eur J Biochem., 2000, 267(20), 6311-6318.

36. Cygler M., Sivaraman J., Grochulski P., Coulombe R., Storer A.C., Mort J.S. Structure of rat procathepsin B: model for inhibition of cysteine protease activity by the proregion. Structure, 1996, 4, 405-416

37. Coulombe R., Grochulski P., Sivaraman J., Cygler M. Structure of human procathepsin L reveals the molecular basis of inhibition by the prosegment. EMBO J., 1996, 15(20): 54925503.

38. Nagler D.K., Sulea T., Menard R. Full-length cDNA of human cathepsin F predicts the presence of a cystatin domain at the N-terminus of the cysteine protease zymogen. Biochem Biophys Res Commun., 1999, 257(2), 313-318.

39. Drenth J. , Jansonius J. N., Koekoek R., Swen H.M., Wolthers B. G. Structure of Papain. Nature, 1968,218, 929-932.

40. Kamphuis I.G., Kalk K.H., Swarte M.B., Drenth J. Structure of papain refined at 1.65 A resolution. JMol Biol., 1984,179(2), 233-256. .

41. McGrath M.E. The lysosomal cysteine proteases. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 1999, 28, 181-204.

42. Storer A.C., Menard R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Methods Enzymol., 1994, 244, 486-500.

43. Shokhen M., Khazanov N., Albeck A. Challenging a paradigm: theoretical calculations of the protonation state of the Cys25-Hisl59 catalytic diad in free papain. Proteins, 2009, 77(4), 916-926.

44. Polgar L., Halasz P. Current problems in mechanistic studies of serine and cysteine proteinases. Biochem J., 1982, 207(1), 1-10.

45. Ma S., Devi-Kesavan L.S., Gao J. Molecular dynamics simulations of the catalytic pathway of a cysteine protease: a combined QM/MM study of human cathepsin K. J Am Chem Soc., 2007,129(44), 13633-13645.

46. Murray D.R. The activation of papain by cyanide and other substances. I. Biochem J., 1933, 27(2), 543-556.

47. Werner G.J. The Activation of Papain and Related Plant Enzymes with Sodium Thiosulfate. Archives of biochemistry, 1945, 8(3), 385-393.

48. Purr A. The activation phenomena of papain and cathepsin. Biochem J., 1935, 29(1), 1320.

49. Aoyagi T., Takeuchi T., Matsuzaki A., Kawamura K., Kondo S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. JAntibiot (Tokyo), 1969, 22(6), 283-286.

50. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun., 1967, 27(2), 157-162.

51. Turk D., Guncar G., Podobnik M., Turk B. Revised definition of substrate binding sites of papain-like cysteine proteases. Biol Chem., 1998, 379(2), 137-147.

52. Bromme D., Bonneau P.R., Lachance P., Storer A.C. Engineering the S2 Subsite Specificity of Human Cathepsin S to a Cathepsin L- and Cathepsin B-like Specificity. The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(48), 30238-30242.

53. Гершкович A.A., Кибирев B.K. Хромогенные и флуорогенные пептидные субстраты протеолитических ферментов. Биоорг. Химия, 1988,14(11), 1461-1488.

54. Lottenberg R., Christensen U., Jackson C.M., Coleman P.L. Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates. Methods Enzymol. 1981, 80C, 341-361

55. Smith R.E. Contributions of histochemistry to the development of the proteolytic enzyme detection system in diagnostic medicine. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1983,31(1A), 199-219.

56. Smith R.E., Bissel E.R., Mitchell A.R., Pearson K.W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thrombosis research, 1980,17(314), 393-402.

57. Tchoupe J.R., Moreau Т., Gauthier F., Bieth J.G. Photometric or fluorometric assay of cathepsin B, L and H and papain using substrates with an aminotrifluoromethylcoumarin leaving group. Biochem. Et Biophys. Acta, 1991,1076, 149-151.

58. Kamboj R.C., Pal S., Raghav N., Singh H. A selective colorimetric assay for cathepsin L using Z-Phe-Arg-4-methoxy-beta-naphthy 1 amide. Biochimie, 1993, 75(10), 873-878.

59. Ohlsson B.G., Westrom B.R., Karlsson B.W. Enzymoblotting: a method for localizing proteinases and their zymogens using para-nitroanilide substrates after agarose gel electrophoresis and transfer to nitrocellulose. Anal Biochem., 1986,152(2), 239-244.

60. Fareed J., Messmore H.L., Walenga J.M., Bermes E.W. Jr. Diagnostic efficacy of newer synthetic-substrates methods for assessing coagulation variables: a critical overview. Clin Chem., 1983, 29(2), 225-236.

61. Weder J.K.P., Kaiser K.-P. Fluorogenic substrates for hydrolase detection following electroforesis. Journal of Chromatography A, 1995,698, 181-211.

62. Smith R.E. Identification of protease isozymes after analytical isoelectric focusing using fluorogenic substrates impregnated into cellulose membranes. J Histochem Cytochem., 1984, 32(12), 1265-1274.

63. Sinha P., Gossrau R. Investigation of proteases with chromogenic substrates after isoelectric focusing (IEF). Histochemistry, 1984, 81, 161-165.

64. Sato E., Matsuhisa A., Sakashita M., Kanauka Y. New water-soluble fluorogenic amine. 7-Aminocoumarin-4-methanesulfonic acid (ACMS) and related substrates for proteinases. Chem. Pharm. Bull., 1988, 36(9), 3496-3502.

65. Sato E., Matsuda K., Kanaoka Y. New fluorogenic substrates for microdetermination of cathepsin C. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 1990, 38(7), 2043-2044.

66. Harris J.L., Backes B.J., Leonetti F., Mahrus S., Ellman J.A., Craik C.S. Rapid and general profiling of protease specificity by using combinatorial fluorogenic substrate libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(14), 7754-7759.

67. Филлипова И.Ю., Лысогорская E.H., Оксенойт E.C., Комаров Ю.Е., Степанов В.М. Флуоресцентные субстраты аспартатных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. Биоорг. Химия, 1986,12(9) 1172-1180.

68. Lecaille F., Authie Е., Moreau Т., Serveau С., Gauthier F., Lalmanach G. Subsite specificity of trypanosomal cathepsin L-like cysteine proteases. Probing the S2 pocket with phenylalanine-derived amino acids. Eur. J. Biochem., 2001, 268, 2733-2741.

69. Garcia-Echeverria C.s Rich D.H. Effect of P2' substituents on kinetic constants for hydrolysis by cysteine proteinases. Biochem. and Biophys. Res. Com., 1992,187(2), 615-619.

70. Lecaille F., Serveau C., Gauthier F., Lalmanach G. Revisiting the S2 specifity of pa-pain by structural analogs of Phe. FEBS Letters, 1999, 445, 311-314.

71. Gray C.J., Boukouvalas J., Szawelski R.J., Wharton C.W. Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases. Biochem J., 1984, 219(1), 325-328.

72. Gray C.J., Sullivan J.M. Synthesis of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) derivatives and their hydrolysis by plant cysteine proteinases. J. Chem. Tech. Biotechnol., 1989, 46, 11-26.

73. Filippova I.Y., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. L-Pyroglutamyl-L-phenylalanyl-L-leucine-p-nitroanilide a chromogenic substrate for thiol proteinase assay .Anal. Biochem., 1984,143(2), 293-297.

74. Vinokurov K.S., Oppert В., Elpidina E.N. An overlay technique for postelectrophoretic analysis of proteinase spectra in complex mixtures using p-nitroanilide substrates. Anal. Biochem., 2005, 337, 164-166.

75. Taralp A., Kaplan H., Sytwu I.I., Vlattas I., Bohacek R., Knap A.K., Hirama Т., Huber C.P., Hasnain S. Characterization of the S3 subsite specificity of cathepsin B. J Biol Chem., 1995, 270(30), 18036-18043.

76. Alves L.C., Almedia P.C., Franzoni L., Juliano L., Juliano M.A. Synthesis of Na-protected aminoacyl 7-amino-4-methyl-coumarin amide by phosphorous oxycloride and preparation of specific fluorogenic substrates for papain. Pept. Res., 1996, 9(2), 92-96.

77. Fukal L., Kasafirek E. Sensitive assay of cysteine proteinases using new peptide p-nitroanalides. Biotechnol. Appl. Biochem., 1988,10, 473-475.

78. Serveau C., Juliano L., Bernard P., Moreau Т., Mayer R., Gauthier F. New substrates of papain, based on the conserved sequence of natural inhibitors of the cystatin family. Biochimie, 1994, 76(2), 153-158.

79. Gosalia D.N., Salisbury C.M., Ellman J.A., Diamond S.L. High Throughput Substrate Specificity Profiling of Serine and Cysteine Proteases Using Solution-phase Fluorogenie Peptide Microarrays. Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 626-636.

80. Puzer L., Cotrin S.S., Alves M.F., Egborge Т., Araujo M.S., Juliano M.A., Juliano L., Bromme D., Carmona A.K. Comparative substrate specificity analysis of recombinant human cathepsin V and cathepsin L. Arch Biochem Biophys., 2004, 430(2), 274-283.

81. Piper J.L., Gray G.M., Khosla C. Effect of prolyl endopeptidase on digestive-resistant gliadin peptides in vivo. J Pharmacol Exp Ther., 2004, 311(1), 213-219.

82. The UniProt Consortium. The Universal Protein Resource (UniProt) in 2010. Nucleic Acids Res., 2010, 38, 142-148. http://www.uniprot.org

83. Schwede Т., Kopp J., Guex N., and Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology-modeling server. Nucleic Acids Res., 2003,31, 3381-3385. http://swissmodel.expasy.org/workspace

84. Stewart F.H.C. A sintetic approach to peptides of o- and /?-aminobenzoic acids. Aust. J. Chem., 1983,36(8), 1629-1638.

85. Гершкович А. А., Кибирев В.К. Химический синтез пептидов. Наумова Думка, Киев, 1992.

86. Noda К., Oda М., Sato М., Yoshida N. A facile method for preparation of t-bulyloxycarbonylamino acid p-nitroanilides. Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 36, 197-200.

87. Rowan A.D., Mason P., Mach L., Mort J.S. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro. J. Biol. Chem., 1992, 267, 15993-15999.

88. Соловьева T.A., Беляев C.B., Степанов B.M. Очистка пепсина ионообменной хроматографией на аминосилохроме. Химия природ, соед., 1977, 3, 398-403.

89. Гордон А., Форд Р. Спутник химика. Мир, Москва, 1976.

90. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н., Филиппова И.Ю., Маркарян А.Н., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. Биоорган, химия, 1987,13, 748-753.

91. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. Биотехнология, 1995,1(2), 32-37.

92. Nicholas К.В., Nicholas Н.В. Jr., and Deerfield D.W. II. GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation. EMBNEW. NEWS, 1997, 4, 14 http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/

93. Bendtsen J.D., Nielson H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol, 2004,340, 783-795. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

94. Dolinsky T.J., Czodrowski P., Li H., Nielsen J.E., Jensen J.IL, Klebe G., Baker N.A. PDB2PQR: Expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res, 2007, 35, 522-525.

95. Baker N.A., Sept D., Joseph S., Hoist M.J., McCammon J.A. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98, 10037-10041. http://www.poissonboltzmann.org,

96. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics, 1996,14, 33-38.131. http://vvww.pymol.org/

97. Лозинский В.И., Плиева Ф.М., Зубов А.Л. Применение криогелей поливинилового спирта в биотехнологии. V. Сверхмакропористые носители для иммобилизации молекул. Биотехнология. 1995,1(2), 32-37.

98. Аникина O.M., Семашко T.A., Оксенойт E.C., Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю. Субтилизин Карлсберг, нативный и модифицированный, эффективный катализатор синтеза пептидной связи в органической среде. Биоорганическая химия, 2006, 32(2),

99. Frugoni J.A.C. Tampone universale di Britton e Robinson a forza ionica constant. Gazz. Chem. Ital., 1957, 87,403-407.

100. McLellan T. Electrophoresis buffers for Polyacrylamide gels at various pH. Anal. Biochem., 1982,126, 94-99.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly at the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.116.121.