Дипептидилпептидаза 4 как главный компонент комплекса пролин-специфичных пептидаз Tenebrio molitor тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Терещенкова Валерия Феликсовна

• Терещенкова Валерия Феликсовна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Терещенкова Валерия Феликсовна

Список сокращений

Введение

1. Ферментативный гидролиз пролин-богатых пептидов и белков (обзор литературы)

1.1. Проламины и целиакия

1.1.1. Пролин-специфичные пептидазы (PSP) для гидролиза проламинов и пептидов проламинов

1.1.1.1. Гидролиз токсических пептидов глиадинов POP из Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) и Flavobacterium meningosepticum (FM)

1.1.1.2. Гидролиз токсических пептидов проламинов пролилэндопептидазой из термостабильной бактерии Sphaerobacter thermophiles

1.1.1.3. Гидролиз глиадинов пептидазами молочнокислых бактерий

1.1.1.4. Гидролиз проламинов пептидазами грибов

1.1.1.5. Гидролиз проламинов PSP из насекомых

1.1.2. Другие пептидазы, гидролизующие проламины и их токсические пептиды

1.1.2.1. Гидролиз глиадинов цистеиновой пептидазой ЕР-В2 из Hordeum vulgare

1.1.2.2. Гидролиз глиадинов цистеиновой пептидазой из Triticum aestivum

1.1.2.3. Гидролиз глиадинов пептидазами из ротовой полости человека

1.1.2.4. Гидролиз пептидов глиадинов пептидазой KumaMax, созданной на основе кумамолизина-As (KumaWT) из ацидофильной бактерии Alicyclobacillus sendaiensis

1.1.2.5. Гидролиз глиадинов цистеиновыми пептидазами из насекомого

Tenebrio molitor

1.1.3. Гидролиз глиадинов комбинациями ферментов с разной специфичностью

1.1.3.1. Гидролиз глиадинов смесью аспергилопепсина из Aspergillus niger (ASP) и дипептидилпептидазы 4 (DPP 4) из Aspergillus oryzae

1.1.3.2. Гидролиз глиадинов комплексом пептидаз сырого млечного сока папайи

1.2. Коллагены

1.2.1. PSP для гидролиза коллагенов

1.2.2. Цистеиновые пептидазы для гидролиза коллагенов

1.3. Заключение

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Анализ PSP в геномах человека, Tribolium castaneum и транскриптомах T. castaneum и T. molitor

2.2. Филогенетический анализ последовательностей PSP Homo sapiens, T. castaneum, T. molitor

2.3. Характеристика активных центров и субстрат-связывающих субсайтов PSP

2.3.1. Сериновые PSP

2.3.2. Металлозависимые PSP

2.3.3. Пост-пролин расщепляющие пептидазы с широкой субстратной специфичностью (PPCPbs)

2.4. Оценка уровня экспрессии кДНК найденных PSP T. castaneum и T. molitor

2.5. Анализ специфических доменов, связанных с возможной локализацией найденных PSP

2.6. Изучение локализации активностей PSP в кишечнике личинок T. molitor биохимическими методами

2.7. Выделение и очистка DPP 4 из кишечника личинок T. molitor

2.8. Идентификация выделенной PSP

2.9. Структура DPP

2.10. Получение рекомбинантной DPP 4 T. molitor (rTmDPP 4)

2.10.1. Выбор конструкции для получения rTmDPP

2.10.2. Клонирование гена, кодирующего rTmDPP

2.11. Экспрессия DPP 4 T. molitor в клетках Pichiapastoris

2.12. Очистка и идентификация rTmDPP

2.13. Изучение физико-химических и энзиматических свойств DPP 4 T. molitor

2.14. Влияние специфических ингибиторов на активность DPP

2.15. Синтез и изучение специфических ингибиторов DPP 4, аналогов дипептидов Xaa-Pro

2.16. Гидролиз глиадинов и фрагментов их токсических пептидов DPP

2.17. Гидролиз глиадинов комплексом пищеварительных пептидаз T. molitor

3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы

3.2. Определение активности пептидаз по хромогенным субстратам

3.3. Определение активности пептидаз по флуорогенным субстратам

3.4. Определение активности пролидазы в реакции с нингидрином

3.5. Фракционирование экстракта T. molitor

3.6. Изучение локализации пептидаз в кишечнике личинок T. molitor

3.7. Влияние рН на активность и стабильность rTmDPP

3.8. Изучение субстратной специфичности DPP

3.9. Изучение влияния специфических ингибиторов DPP

3.10. Гидролиз глиадинов

3.11. Гидролиз пролин- и глутамин-богатых пептидов глиадинов

3.12. Проведение электрофореза и пост-электрофоретического тестирования активности

пептидаз в геле

3.13. Масс-спектрометрический анализ

3.14. Клонирование гена DPP 4 T. molitor

3.15. Получение препарата rTmDPP 4 в экспрессионной системе P. pastoris

3.16. Очистка rTmDPP

3.17. Синтез специфических ингибиторов DPP

3.17.1. Синтез N-оксисукцинимидного эфира бутилоксикарбонил-Ь-изолейцина (Boc-Ile-ONsu)

3.17.2. Синтез Boc-Xaa-Pip, Boc-Xaa-Mf, Boc-Xaa-Im, где Xaa = Pro, Ile

3.17.3. Снятие защитной Boc-группы

3.18. Подготовка биологического материала для секвенирования кДНК, сборка контигов, поиск открытых рамок считывания (ORF)

3.19. Поиск и сборка последовательностей PSP

3.20. Филогенетический анализ последовательностей и предсказание ортологов

3.21. Анализ уровня экспрессии PSP

3.22. Анализ структуры последовательностей PSP

3.23. Проведение скрининга ингибиторов DPP 4 методом молекулярного докинга

3.24. Моделирование трехмерной структуры DPP 4 T. molitor

Выводы

Благодарности

Приложение

Список литературы

Список сокращений

В работе были использованы стандартные трехбуквенные и однобуквенные сокращения аминокислот (все аминокислоты L-ряда, если не указано особо), а также следующие сокращения: ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ТНБС - тринитробензолсульфоновая кислота УБ - универсальный ацетатно-фосфатно-боратный буфер Abz- - о-аминобензоил (антранилоил)

AM (anterior mesenteron) - передняя часть средней кишки личинок Tenebrio molitor

AMC - 7-амино-4-метилкумарин

Boc - трет-бутилоксикарбонил

Bz - бензоил-

DMF - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DTT - дитиотреитол

Glp - пироглутамил-

HEPES - 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-!-ил]этансульфоновая кислота

HONSu - N-оксисукцинимид

Hyp - 4-гидроксипролин

Im - имидазолид (остаток имидазола)

Mf - морфолид (остаток морфолина)

Pip - пиперидид (остаток пиперидида)

pNA - п-нитроанилид (остаток п-нитроанилина)

РМ (posterior mesenteron) - задняя часть средней кишки личинок T. molitor PSA - персульфат аммония SDS - додецилсульфат натрия Suc - сукцинил-

TEMED - ^^№,№-тетраметилэтилендиамин Tris - 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-!,З-диол Z - бензилоксикарбонил-

Ферменты:

APP - аминопептидаза Р

СС (cysteine cathepsins) - цистеиновые катепсины

CND (cytosolic nonspecific dipeptidase) - цитозольная неспецифичная дипептидаза DPP - дипептидилпептидаза

FAP (fibroblast activation protein) - белок активации фибробластов LAP - лейцинаминопептидаза PEP - пролилэндопептидаза

PGСP (post-glutamine cleaving peptidases) - пост-глутамин расщепляющие пептидазы РОР - пролилолигопептидаза PRCP - пролилкарбоксипетидаза

PSP (praline-specific peptidases) - пролин-специфичные пептидазы rTmDPP 4 - рекомбинантная DPP 4 T. molitor rhDPP 4 - рекомбинантная DPP 4 человека TmDPP 4 - DPP 4 T. molitor

XPD (Xaa-Pro dipeptidase) - Xaa-Pro дипептидаза, пролидаза Ингибиторы:

DFP - диизопропилфторфосфат

Е-64 - транс--эпоксисукцинил-Ь-лейциламидо-(4-гуанидино)-бутан

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

TLCK - Na-тозил-L-лизинхлорметилкетон гидрохлорид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дипептидилпептидаза 4 как главный компонент комплекса пролин-специфичных пептидаз Tenebrio molitor»

Введение

Актуальность проблемы. Пролин является единственной иминокислотой среди двадцати природных протеиногенных аминокислот. В связи с этим, пролин-богатые белки обладают рядом структурных особенностей. Наличие остатка пролина в полипептидной цепи изменяет ее конформацию, тем самым препятствуя деградации пролин-богатых белков пептидазами широкого спектра действия. В природе гидролиз пролин-содержащих белков осуществляется преимущественно под действием особой группы протеолитических ферментов - пролин-специфичных пептидаз (praline-specific peptidases, PSP). В силу уникальной специфичности PSP оказываются вовлеченными в «тонкую» регуляцию различных метаболических процессов, дифференциацию и созревание клеток, процессинг биологически активных пептидов и белков, формирование иммунного ответа. В связи с этим в настоящее время исследования PSP сфокусированы, главным образом, на изучении их регуляторной функции и имеют ярко выраженную медицинскую направленность, обусловленную определяющей ролью PSP в развитии самых различных заболеваний, таких как диабет, рак, болезни Альцгеймера и Паркинсона, гипертония, нейропсихические заболевания. Между тем, в тени оказывается исследование уникальной способности PSP расщеплять устойчивые к протеолизу пролин-богатые белки и пептиды, хотя среди них есть такие, изучение расщепления которых имеет важное значение как с теоретической, так и с научно-практической точек зрения. Так, в частности, серьезной проблемой, не решенной до настоящего времени, является гидролиз проламинов - белков злаковых, составляющих основу рациона большинства населения.

В структуре проламинов содержится до 30% аминокислотных остатков пролина и до 50% остатков глутамина [1, 2]. Некоторые пептиды проламинов, главным образом, глиадинов из семян пшеницы, устойчивые к протеолизу пищеварительными пептидазами человека [3, 4], вызывают у предрасположенных людей аутоиммунное заболевание -целиакию. Целиакия - это хроническое наследственное аутоиммунное заболевание, характеризующееся стойкой непереносимостью глютена (основного компонента клейковины), сопровождающееся развитием атрофии слизистой оболочки тонкой кишки, связанного с ней синдрома мальабсорбции и развитием различных дефицитных состояний [5, 6]. Поэтому поиск и характеристика PSP, способных расщеплять эти трудногидролизуемые пептиды и пригодных для разработки лекарственных средств для энзимотерапии целиакии, является актуальной задачей.

Высоким потенциалом в этом отношении обладают жуки из семейства Tenebrionidae Tenebrio molitor и Tribolium castaneum - вредители запасов зерновых

7

культур, для которых проламины являются главными пищевыми белками. Исходя из этого, природный комплекс пищеварительных пептидаз этих насекомых должен содержать набор PSP, необходимый для гидролиза проламинов. Следует отметить, что в литературе нет данных о комплексах PSP какого-либо отдельного вида. Имеются лишь данные об отдельных пептидазах, полученные, в основном, для млекопитающих, а для остальных животных, включая насекомых, информации очень мало.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось выявление комплекса PSP у тенебрионид на геномном и транскриптомном уровнях и подробная характеристика главной пищеварительной PSP этих насекомых - дипептидилпептидазы 4 (DPP 4).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Аннотировать и охарактеризовать спектр PSP в геноме Т. сastaneum и транскриптомах кишечника личинок T. molitor и Т. сastaneum, оценить уровень экспрессии генов этих белков в вышеназванных транскриптомах.

2. Выделить и идентифицировать наиболее высоко экспрессируемую и активную пищеварительную PSP T. molitor.

3. Получить активный рекомбинантный препарат этого фермента и провести его физико-химическую и биохимическую характеристику.

4. Изучить гидролиз глиадинов и их иммуногенных пептидов охарактеризованной PSP, а также комплексом пролин-специфичных и пост-глутамин расщепляющих пептидаз T. molitor.

Научная новизна и практическая значимость работы заключается в выделении нового пищеварительного фермента насекомого - DPP 4 T. molitor, получении его в рекомбинантной форме в экспрессионной системе Pichia pastoris и исследовании его физико-химических и биохимических характеристик, включая способность расщепления глиадинов и их токсических пептидов. Полученные данные могут быть использованы в медицине и пищевой промышленности для разработки на основе исследованных ферментов лекарственных препаратов и безглютеновых продуктов питания.

Публикации и апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Российских и Международных научных конференциях: Международной научной конференции по биоорганической химии "XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" и VIII Российском симпозиуме "Белки и пептиды", Москва, Россия (2017); 9th General Meeting of the International Proteolysis Society, Penang, Malaysia (2015); VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды", Новосибирск, Россия (2015); XIVth International Symposium on Proteinases, Inhibitors and Biological Control, Portoroz,

8

Slovenia (2014); VII Всероссийской конференции "Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция", Петрозаводск, Россия (2014); 38th FEBS (Federation of European Biochemical Societies) Congress, Saint Petersburg, Russia (2013); VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Уфа, Россия (2013).

Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Tereshchenkova V.F., Goptar I.A., Zhuzhikov D.P., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Oppert B., Filippova I.Y., Elpidina E.N. Prolidase is a critical enzyme for complete gliadin digestion in Tenebrio molitor larvae. // Arch. Insect Biochem. Physiol. - 2017. -V. 95. - No. 4. - P. e21395.

2. Tereshchenkova V.F., Goptar I.A., Kulemzina I.A., Zhuzhikov D.P., Serebryakova M.V., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Oppert B., Filippova I.Y., Elpidina E.N. Dipeptidyl peptidase 4 - an important digestive peptidase in Tenebrio molitor larvae. // Insect Biochem. Mol. Biol. - 2016. - V. 76. - P. 38-48.

3. Semashko T.A., Vorotnikova E.A., Sharikova V.F., Vinokurov K.S., Smirnova Y.A., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A., Oppert B., Elpidina E.N., Filippova I.Y. Selective chromogenic and fluorogenic peptide substrates for the assay of cysteine peptidases in complex mixtures. // Anal. Biochem. - 2014. - V. 449. - P. 179-187.

Тезисы докладов, представленных на научных конференциях:

4. Терещенкова В.Ф., Клячко Е.В., Беневоленский С.В., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Рекомбинантная DPP 4 Tenebrio molitor: получение, свойства и способность гидролизовать токсические пептиды глиадинов. // Acta Naturae, Спецвыпуск, Международная научная конференция по биоорганической химии "XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" и VIII Российский симпозиум "Белки и пептиды". - 2017. - C. 140.

5. Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н., Соколенко Н.И., Терещенкова В.Ф., Воротникова Е.А., Симонян Т.Р., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А. Проламинрасщепляющие пептидазы. Дизайн и синтез пептидомиметиков для их поиска и изучения. // Acta Naturae, Спецвыпуск, Международная научная конференция по биоорганической химии "XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова" и VIII Российский симпозиум "Белки и пептиды". - 2017. - C. 124.

6. Терещенкова В.Ф., Гоптарь И.А., Жужиков Д.П., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Биоинформатический анализ и биохимическая характеристика комплекса кишечных пролин-специфичных пептидаз Tenebrio molitor. // Acta Naturae, "V съезд биохимиков России", Спецвыпуск. - 2016. - Т. 1. - С. 212.

7. Филиппова И.Ю., Соколенко Н.И., Воюшина Т.Л., Терещенкова В.Ф., Элпидина Е.Н. Ингибирование дипептидил пептидазы 4 различного происхождения цикличскими амидами - аналогами пролина. // Acta Naturae, "V съезд биохимиков России", Спецвыпуск. - 2016. Т. 2. - С. 106-107.

8. Tereshchenkova V.F., Filippova I.Yu, Oppert B., Zhuzhikov D.P., Elpidina E.N. Characterization of the intestinal proline-specific peptidases complex of Tenebrio molitor. Study of Cry1Ac and Cry3Aa toxins influence on the expression of their genes. // Abstracts of Proteolysis Conference IPS. - 2015. - P. 40.

9. Терещенкова В.Ф., Филиппова И.Ю., Жужиков Д.П., Элпидина Е.Н. Характеристика комплекса кишечных пролин-специфичных пептидаз T. molitor. Изучение влияния токсинов Cry1Ac и Cry3Aa на экспрессию их генов. // Сборник тезисов VII Российский симпозиум "Белки и пептиды". - 2015. - С. 253.

10. Sharikova (Tereshchenkova) V.F., Goptar I.A., Smirnova Yu.A., Oppert B., Filippova I.Yu., Elpidina E.N. Isolation and characterization of proline specific dipeptidyl peptidase IV from the Tenebrio molitor larval midgut. // Protein Science. - 2014. - V. 23. - N. S1. - P. 176-177.

11. Sharikova V.F., Oppert B., Filippova I.Yu, Elpidina E.N. Proline Specific Peptidases - important digestive peptidases in Tenebrio molitor and Tribolium castaneum. // Book of Abstracts, XIVth International Symposium on Proteinases, Inhibitors and Biological Control. - 2014. - P. 101.

12. Шарикова В.Ф., Гоптарь И.А., Смирнова Ю.А., Величко Т.И., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Выделение и характеристика пролин-специфичной дипептидил-пептидазы IV из кишечника личинок Tenebrio molitor. // Материалы VII Всероссийской конференции "Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция". - 2014. - С. 93.

13. Элпидина Е.Н., Филиппова И.Ю., Гоптарь И.А., Семашко Т.А., Мартынов А.Г., Смирнова Ю.А., Воротникова Е.А., Шарикова В.Ф. Глутамин- и пролин-специфичные пептидазы насекомых-вредителей зерновых запасов и аутоиммунное заболевание целиакия. // Материалы VI Российского симпозиума «Белки и пептиды». -2013. - С. 101.

14. Смирнова Ю.А., Гоптарь И.А., Евсютина Д.В., Мартынов А.Г., Лобанова А.О., Шарикова В.Ф., Филиппова И.Ю., Элпидина Е.Н. Анализ и характеристика комплексов пищеварительных пролинспецифичных пептидаз личинок жуков-вредителей зерновых запасов Tenebrio molitor и Tribolium castaneum. // Материалы VI Российского симпозиума «Белки и пептиды». - 2013. - С. 170.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит 44 рисунка, 21 таблицу, приложение, содержащее 6 рисунков, список литературы, включающий 160 библиографических ссылок.

1. Ферментативный гидролиз пролин-богатых пептидов и белков (обзор литературы)

Некоторые важные и широко представленные в природе белки, такие как глютен и коллаген, богаты остатками L-пролина. В связи с циклической структурой пролина эти белки достаточно хорошо защищены от ферментативной деградации типичными пищеварительными ферментами. Для гидролиза пролин-богатых пептидов и белков требуются специализированные пролин-специфичные пептидазы (proline-specific peptidases, PSP). В обзоре литературы приведены характеристики основных пролин-богатых белков, и собраны сведения о пептидазах из различных источников, приспособленных к эффективному расщеплению этих белков.

1.1. Проламины и целиакия

Проламины - главные запасные белки семян злаковых культур. Название этих белков обусловлено их аминокислотным составом - проламины богаты остатками пролина (до 30%) и глутамина (до 50%) [1, 2, 7, 8].

Первоначально классификация пролин-богатых белков семян злаковых была основана на их растворимости. Было выделено две фракции этих белков: растворимые в спирте и нерастворимые в нем [1]. Спирторастворимые белки зерновых были названы проламинами. В пшенице проламины называют глиадинами, в кукурузе - зеинами, в ячмене - гордеинами, во ржи - секалинами. Спиртонерастворимые фракции называют глютелинами, а у пшеницы глютенинами. Первоначально проламины и глютелины относили к различным группам белков, но позднее выяснилось, что по первичной структуре глютелины родственны проламинам. Нерастворимость глютелинов в спирте обусловлена наличием дисульфидных связей между отдельными полипептидами. Поэтому в последнее время глютелины стали относить также к проламинам [2, 7]. Глиадины и глютенины в семенах пшеницы являются главными компонентами глютена (клейковины). Все проламины могут быть разделены на различные семейства. Они различаются по таким свойствам, как молекулярная масса, pI, аминокислотный состав.

В структуре проламинов присутствуют отдельные участки, или домены, которые имеют как разнообразный аминокислотный состав и, возможно, разное происхождение, так и аминокислотные последовательности, состоящие или из повторяющихся участков, основу которых составляют один или несколько коротких пептидных мотивов, или обогащенные определенными аминокислотными остатками, такими как Gln, Pro, Met [2]. Пептидные связи, образованные этими аминокислотами, в первую очередь, циклическим остатком иминокислоты Pro, присутствие которого нарушает структуру белковой

12

спирали, не являются «удобными» для гидролиза большинством известных пептидаз, так как не соответствуют их специфичности. То есть, ферментативный гидролиз проламинов значительно затруднен. Между тем, в природе эти запасные белки гидролизуются как в семенах растений при прорастании, так и у человека и сельскохозяйственных животных, которые питаются зерновыми продуктами. Однако было показано, что в пищеварительном тракте человека присутствуют недорасщепленные пищеварительными ферментами человека пролин- и глутамин-богатые пептиды проламинов, которые вызывают у предрасположенных людей аутоиммунное заболевание тонкого кишечника - целиакию [5, 6, 9, 10].

Токсичными для больных целиакией являются пролин- и глутамин-богатые пептиды, полученные из а-глиадинов (низкомолекулярная разновидность глиадинов) и у-глиадинов (цистеинбогатые глиадины, стабилизированные дисульфидными связями) [3, 4, 11]. Примером первого является 33-мерный пептид

LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF а-2 глиадина который является прекрасным субстратом для трансглютаминазы 2 (Т02) - фермента, который участвует в механизме патогенеза, модифицируя остатки глутамина в пептидах глиадинов. Другой пептид - FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ, образующийся из у-5 глиадина, имеет в своем составе 26 аминокислотных остатков. Однако для модельных исследований чаще всего используют более короткие пептиды. Подробный перечень трудногидролизуемых пептидов представлен в таблице 1.

Таблица 1. Трудногидролизуемые пептидные последовательности глиадинов [12].

Peptide Sequence Origin and location1 Reference

33-mei' LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF a-2 gliadin, 56-88 Shan et al 2002

26-mei' FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ y-5 gliadm. 26-51 Shan et al 2005

20-mei' LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ y-5 gliadm. 60-79 Arentz-Hansen et al 2002

20-mei' QQQQPPFSQQQQSPFSQQQQ gluteiihi Vader et al 2002

19-mer LGQQQPFPPQQPYPQPQPF A-gliadin. 31-49 Stnrgess et al 1994

17-mer QLQPFPQPELPYPQPQS A-gliadin. 57-73 Anderson et al 2000

15-mer YQGQGIIQPQQPAQL y-gliadin Vader et al 2002

15-mer QQPPFSQQQQQPLPQ gluteiihi Vader et al 2002

14-mer PQPQLPYPQPQLPY a-2 alia dill. 62-75 Arentz-Hansen et al 2000

13-mer LGQQQPFPPQQPY A-gliadin. 31-43 Marsh et al 1995

12-mer FSQPQQQFPQPQ y-5 gliadm. 102-113 Arentz-Hansen et al 2002

12-mer QLQEFPQPQLPY a-9 gliadin, 57-68 Arentz-Hansen et al 2000

10-mer QPQQSFPQQQ y-gliadin Sjostrom et al 199S

1 a2-gliadin of Arentz-Hansen 2000: /5-gliadm of Arentz-Hansen 2002: A-gliadin of Kasarda et al 1984

Степень воспалительного процесса при целиакии варьирует от повышенного содержания межэпителиальных лимфоцитов в эпителии ворсинок тонкого кишечника до атрофии слизистой оболочки. В связи со сложностью диагностики, которая ранее базировалась на результатах биопсии, целиакия считалась редким заболеванием, которое свойственно жителям Европы и проявлялось в течение первых лет жизни. Однако, после того, как стали доступны такие чувствительные и специфичные методы, как серологические тесты, стало возможным оценить действительное число больных [13]. Скрининговые исследования показали, что данное заболевание не связано с возрастом, может возникнуть в любой момент и встречается гораздо чаще, чем считалось, а именно у 1-2 % населения Земли, причем у большинства пациентов оно протекает со слабо выраженной симптоматикой или имеет нетипичные клинические проявления. У взрослого человека целиакия диагностируется, как правило, не ранее, чем через десять лет после первых признаков заболевания [14].

Классическим проявлением целиакии считается синдром мальабсорбции (нарушенного всасывания). При этом наблюдаются следующие симптомы: хроническая диарея, метеоризм, снижение массы тела, признаки дефицита витаминов и

микроэлементов. При длительном течении велик риск развития онкологических и других аутоиммунных заболеваний, а также нервных расстройств [15-17].

В настоящее время лекарств от целиакии нет, и единственным эффективным способом поддержания здоровья пациентов является соблюдение строгой диеты, исключающей глютен-содержащие продукты. Однако придерживаться такой диеты сложно, она сильно ограничивает рацион питания человека, ведет к асоциализации, депрессивным состояниям. Более того, у пациентов, придерживающихся такой диеты, наблюдается нехватка витаминов и минералов, а также склонность к анемии и остеопорозу.

В связи с этим разрабатываются различные терапевтические стратегии для борьбы с заболеванием. Особенное место среди них занимает энзимотерапия, то есть прием с пищей препаратов пептидаз, способных гидролизовать трудногидролизуемые пептиды проламинов [18]. Данный подход основан на непосредственном воздействии на патоген, а именно на недорасщепленные пептиды, имеющие в своем составе большое количество остатков пролина и глутамина.

1.1.1. Пролин-специфичные пептидазы (PSP) для гидролиза проламинов и пептидов проламинов

В связи с тем, что токсические пептиды богаты остатками пролина, очевидно, что один из путей их гидролиза заключается в использовании PSP, расщепляющих в белках и пептидах связи, образованные остатком Pro [18]. Большая часть PSP является экзопептидазами - дипептидилпептидазы (dipeptidylpeptidase, DPP) 2, 4, 8, 9, пролилкарбоксипептидаза (prolylcarboxypeptidase, PRCP), аминопептидазы P (aminopeptidases P, APP 1, 2, 3) и пролидаза (prolidase, XPD). Пролилолигопептидазы (prolyloligopeptidase, POP) относятся к группе пролилэндопептидаз (prolylendopeptidase, PEP). Белок активации фибробластов (fibroblast activation protein, FAP) обладает как экзо-, так и эндопептидазной активностями. Помимо этого, к рассматриваемому комплексу PSP можно отнести еще две экзопептидазы с широкой субстратной специфичностью, способные также гидролизовать пептидные связи после остатка пролина - (post-proline cleaving peptidases with broad substrate specificity, PPCPbs): лейцинаминопептидазу (LAP) и цитозольную неспецифичную дипептидазу (CND). В таблице 2 приведены формулы субстратов, демонстрирующие специфичность разных типов PSP и PPCPbs.

Таблица 2. Специфичность PSP и PPCPbs. Xaa - любая аминокислота, Xbb - любая

аминокислота, за исключением Pro.

Фермент Субстрат

POP, FAP (Хаа)п-ХЬЬ-Рш|ХЪЬ-(Хаа)п, п = 1-13 (длина пептида не более 30 аминокислотных остатков)

DPP 2, 4, 8, 9, FAP ХЬЬ-Рш|ХЬЬ-(Хаа)п, п = 2-12

PRCP (Хаа)п-ХЬЬ-Рш|ХЪЬ, п - любое число

APP 1, 2, 3 ХЪЬ|Рш(Хаа)п, п = 1-9

XPD ХЪЬ|Рш

LAP Рго|ХЬЬ-(Хаа)п, п = любое число

CND Рго|ХЬЬ

1.1.1.1. Гидролиз токсических пептидов глиадинов POP из Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) и Flavobacterium meningosepticum (FM)

Для изучения гидролитических свойств бактериальных РОР из Myxococcus xanthus (MX), Sphingomonas capsulata (SC) и Flavobacterium meningosepticum (FM) были взяты два родственных пептида глютена PQPQLPYPQPQLP (а-2 глиадин, 62-74) и LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF (а-2 глиадин, 56-88), по-видимому, играющие ключевую роль в развитии целиакии [19-22]. Для определения активности, специфичности и стабильности пептидаз в кислых условиях были проведены in vitro и in vivo эксперименты. Было обнаружено, что активности POP по обоим глютеновым субстратам были практически одинаковы, однако, ферменты проявляли значительные отличия в специфичности, связанные с длиной субстрата. Пептидаза SC хорошо гидролизовала субстрат PQPQLPYPQPQLP, но имела незначительную активность по отношению к LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF. Напротив, как FM, так и MX пептидазы расщепляли оба взятых для исследования субстрата, тем не менее, пептидаза FM проявляла большую активность по субстрату LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF, чем пептидаза MX. В итоге, при анализе продуктов гидролиза обоих субстратов было обнаружено, что пептидаза SC расщепляла и Pro-Gln, и Pro-Tyr связи (PQPQLPjYPjQPQLP), пептидаза FM лучше расщепляла связь Pro-Gln (PQPQLPYPjQPQLP), а пептидаза MX предпочитала Pro-Tyr сайт (PQPQLPjYPQPQLP). Аналогичным образом было установлено, что при гидролизе субстрата LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF пептидазы SC и MX образовывали короткие фрагменты из 4-5 аминокислотных остатков, тогда как

результатом действия пептидазы FM являлись длинные интермедиаты, образующиеся преимущественно из-за предпочтений пептидазы в расщеплении в основном центральной Pro-Gln связи. Таким образом, были выявлены различия в специфичности исследованных ферментов, но высокая активность расщепления обоих пептидов глютена делает их потенциальными кандидатами для лечения целиакии [22].

Данные пептидазы были получены в виде рекомбинантных белков с 6-ти гистидиновым тегом (His6-tag) в Escherichia coli [23]. С помощью рентгеноструктурного анализа была определена третичная структура ферментов: открытая структура фермента из SC (SC-POP) (с разрешением 1,8 Ä) (рис. 1A) и в комплексе с ингибитором Z-Ala-пролиналем с разрешением 1,5 Ä - для фермента из MX (MX-POP) (рис. 1Б). Молекула MX-POP состоит из двух доменов: каталитического а-домена (каталитическая триада представлена Ser533, Asp616 и His651) и ß-домена типа пропеллера, который ответственен за субстратную специфичность. Этот домен взаимодействует с каталитическим доменом за счет водородной связи между Asp196, Glu197 и Arg572 и солевого мостика между Asp145 и Arg618. Изучение активного центра позволило выдвинуть гипотезу о том, что важными для специфичности остатками являются Asn534, Tyr453 (образуют водородные связи с карбонильной группой ингибитора) и Arg618. Молекула SC-РОР похожа по своему строению за исключением области взаимодействия между доменами.

Рисунок 1. Третичные структуры (А) SC-РОР и (Б) МХ-РОР (комплекс с ингибитором 2-А1а-пролиналем) [23].

Исследователями был смоделирован сайт связывания РОР из МХ с 13-мерным субстратом PQPQLPYPQPQLP (рис. 2), к которому МХ-РОР и SC-POP проявляют большую специфичность, причем МХ-РОР расщепляет субстрат по связи Р^. На основе

знания структуры сайта связывания можно было объяснить ограничение активности исследуемых ферментов по отношению к длинным субстратам. Из модели стало ясно, что остатки P6-P1 (PQPQLP) взаимодействуют со связывающей полостью лучше, чем ингибитор, а N-конец пептида направлен в сторону контакта доменов и наклонен к участку петли, содержащему Lys161-Pro173. Таким образом, остатки P1' и P2' (Tyr и Pro) тесно взаимодействуют с каталитической полостью, а C-конец «заякорен» петлей Р-домена. Данное предположение было подтверждено мутагенезом остатков сайта связывания. Выявленное снижение активности фермента показало, что, действительно, Arg618 и Asp145 играют важную роль в реализации специфичности и активности фермента, и их модификация может привести к тому, что станет возможным расщепление более длинных субстратов. Arg572 и Ile575 контролируют «закрывание» и «открывание» структуры, Asp 196 и Glu197 стабилизируют «закрытую структуру».

Рисунок 2. Модель комплекса MX-POP с PQPQLPYPQPQLP [23].

Недостатком РОР MX, SC и FM является то, что они не могут гидролизовать целые глиадины. Однако они могут гидролизовать пролин-богатые пептиды, которые образуются под действием пищеварительных пептидаз человека. Длина таких пептидов составляет от 9 до 33 аминокислотных остатков, т.е. она достаточна для возможного гидролиза РОР. Кроме того, оптимум рН для них лежит в диапазоне 7,0-8,5, т.е. они не могут функционировать в желудке при кислых значениях рН, и, более того, показана возможность их расщепления пепсином [24].

1.1.1.2. Гидролиз токсических пептидов проламинов пролилэндопептидазой из термостабильной бактерии Sphaerobacter thermophiles

В работе [25] была получена в рекомбинантной форме новая термостабильная PEP из бактерии Sphaerobacter thermophiles. Молекулярная масса составила 77 кДа. Фермент

стабилен в диапазоне рН 5,0-8,0 с оптимумом активности при рН 6,6. Температурный оптимум активности находится при 63°С. Способность гидролизовать токсические пептиды проламинов была проверена на субстратах LGQQQPFPPQQPY, PQPQLPYPQPQLPY а-глиадина и SQQQFPQPQQPFPQQP у-гордеина. В таблице 3 представлены сайты расщепления пептидов по остаткам пролина.

Таблица 3. Пептидные фрагменты, идентифицированные MALDI TOF после инкубации пептидов с PEP S. thermophiles [25].

Amino acid sequence Preferred cleavage site

Peptide 1 LGQQQPFPPQQPY LGQQQP1FPP1QQP1Y

(a31-43 gliadin)

Identified L G Q QQ P -/P-F

fragments LGQQQPFPP -/P-Q

LGQQQPF P P Q Q P -/P-Y

Peptide 2 PQPQLPYPQPQLPY (ci62-75 PQPQLPYPQPQLP 1Y

gliadin)

PQPQLPYPQPQLP -/P-Y

Identified

fragments

Peptide 3 SQQQFPQPQQPFPQQP SQQQFP|QPQQP|FP|QQP

Cy-hordein)

Identified SQ Q Q F P -/P-Q

fragments SQQQFPQ P Q Q P -/P-F

SQQQFPQPQQPFP -/P-Q

В связи с тем, что оптимум работы фермента находится в нейтральном диапазоне рН, а температурный оптимум составляет 63°С, изучаемую PEP предлагается использовать не в качестве энзиматичского средства для лечения целиакии, а для получения безглютеновых напитков и продуктов питания. Было показано, что добавление фермента к ячменному солоду снижает концентрацию глютена. Таким образом, PEP S. thermophiles может быть использована для высокотемпературного заваривания ячменного солода в процессе пивоварения [25].

1.1.1.3. Гидролиз глиадинов пептидазами молочнокислых бактерий

В работах [26, 27] изучался гидролиз а-глиадинов пептидазами из молочнокислых бактерий различных штаммов (таблица 4). В клеточных экстрактах Lactobacillus plantarum CRL 775 и Pediococcuspentosaceus CRL 792 наблюдалась аминопептидазная, пролилдипептидазная, эндопептидазная, дипептидазная и трипептидазная пролин-специфичные активности. L. plantarum CRL 775 и P. pentosaceus CRL 792 проявляли

19

высокую три- и дипептидазную активности соответственно. Штаммы L. plantarum гидролизовали более 60% а-глиадиновых пептидов, соответствующих фрагментам 31-43 (LGQQQPFPPQQPY) и 62-75 (PQPQLPYPQPQSFP). Ни один из штаммов молочнокислых бактерий не расщеплял фрагмент 57-89 (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF), но смесь L. plantarum CRL 775 и P. pentosaceus CRL 792 гидролизовала этот пептид на 57% за 8 ч.

Таблица 4. Активности пептидаз из различных штаммов молочнокислых бактерий [26].

Aminopeptidases Dipeptidases PDA Tripeptidases Endopeptidases

LAB L-p-NA P-p-NA Q-p-NA L-L L-P GP L-L-L L-G-G, L-G-F SF QF

L brevis

CRL 781 47f ± 2 3-6 ± 0 3-0 ± 0 133 ± 10 00 ± 0 23'3 ± 1 142 ± 9 150 ± 11 33 ± 8 3-1 ± 0 3-6 ± 0

L. curvatus

CRL 760 14 ± 3 6-1 ± ' 2-2 ± 0 71 ± 6 0-0 ± 0 10-4 ± 1 345 ± 9 326 ± 9 101 ±5 0-0 ± 0 4-8 ± 0

L. plantarum

CRL 769 28 ± 0 0-9 ± 0 5-9 ± 0 44-4 ± 7 O'O ± 0 35-2 ± 1 130 ± 1 1 245 ± 12 52 ± 15 1-7 ± 0 0 8 ± 0

CRL 775 39 ± 0 1-7 ± 0 8-6 ± 0 174 ± 16 0 ± 0 30 3 ± 3 459 ± 10 476 ± 29 214 ± 5 4-7 ± 0 7-0 ± 0

P. pentosaceus

CRL 761 89 ± 3 3-7 ± ' 0-6 ± 0 77 ± 6 0-0 ± 0 274 ± 1 217 ± 14 290 ± 0 79 ± 0 0-0 ± 0 0-0 ± 0

CRL 792 64 ± 2 4-1 ± 20 6 ± 0 183 ± 6 7-0 ± 3 33'9 ± 7 298 ± 8 438 ± 10 126 ± 2 1-5 ± 0 10-6 ± 1

CRL 793 25 ± 1 0-0 ± 0 1-5 ± 0 64 ± 2 O'O ± 0 30'2 ± 1 149 ± 7 200 ± 15 67 ± 1 0-0 ± 0 3-7 ± 0

CRL 797 10 ± 2 11 ± 0 1 2 ± 0 58 ± 4 O'O ± 0 25 6 ± 3 168 ± 10 120 ± 7 36 ± 6 0-4 ± 0 0 0 ± 0

L reuten

CRL 1098 32 ± 0 4-5 ± ' 4-4 ± 0 10 ± 0 5-5 ± 2 25'6 ± 0 33 ±4 127 ± 8 33 ±3 2-5 ± 0 1-2 ± 0

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Терещенкова Валерия Феликсовна, 2018 год

Список литературы

1. Shewry P.R., Tatham A.S. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evolution. // Biochem. J. - 1990. - V. 267. - P. 1-12.

2. Shewry P.R., Halford N.G. Cereal seed storage proteins: structures, properties and role in grain utilization. // J. Exp. Bot. - 2002. - V. 53. - No. 370. - P. 947-958.

3. Shan L., Molberg O., Parrot I., Hausch F., Filiz F., Gray G.M., Sollid L.M., Khosla C. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. // Science. - 2002. - V. 297. - No. 5590. -P. 2275-2279.

4. Shan L., Qiao S.W., Arentz-Hansen H., Molberg O., Gray G.M., Sollid L.M., Khosla C.J. Identification and analysis of multivalent proteolytically resistant peptides from gluten: implications for celiac sprue. // Proteome Res. - 2005a. - V. 4. - No. 5. - P. 1732-1741.

5. Farrell R.J., Kelly C.P. Celiac sprue. // N. Engl. J. Med. - 2002. - V. 346. - No. 3. - P. 180-188.

6. Cappello M., Morreale G.C., Licata A. Elderly Onset Celiac Disease: A Narrative Review. // Clin. Med. Insights Gastroenterol. - 2016. - V. 9. - P. 41-49.

7. Barak S., Mudgil D., Khatkar B.S. Biochemical and functional properties of wheat gliadins: a review. // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. - 2015. - V. 55. - No. 3. - P. 357-368.

8. Biesiekierski J R. What is gluten? // J. Gastroenterol. Hepatol. - 2017. - V. 32. - Suppl 1.

- P. 78-81.

9. Haush F., Shan L., Santiago N.A., Gary G.M., Khosla C. Intestinal digestive resistance of immunodominant gliadin peptides. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. - 2002. - V. 283.- P. 996-1003.

10. Schuppan D., Junker Y., Barisani D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. // Gastroenterology. - 2009. - V. 137. - No. 6. - P. 1912-1933.

11. Wieser H. The precipitating factor in coeliac disease. // Baillieres Clin. Gastroenterol. -1995. - V. 9. - P. 191-207.

12. Loponen J. Prolamin degradation in sourdoughs (PhD thesis). // Helsinki. - 2006.

13. Lionetti E., Catassi C. New clues in celiac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment. // International Reviews of Immunology. - 2011. - V. 30. - No. 4.

- P. 219-231.

14. Fasano A., Catassi C. Current approaches to diagnosis and treatment of celiac disease: an evolving spectrum. // Gastroenterology. - 2001. - V. 120. - P. 636-651.

15. Grossman G. Neurological complications of coeliac disease: what is the evidence? // Pract. Neurol. - 2008. - V. 8. - P. 77-89.

16. Ford R.P. The gluten syndrome: a neurological disease. // Med. Hypotheses. - 2009. - V. 73. - P. 438-440.

17. Verdu E.F., Armstrong D., Murray J.A. Between celiac disease and irritable bowel syndrome: the "no man's land" of gluten sensitivity. // Am. J. Gastroenterol. - 2009. - V. 104. -P. 1587-1594.

18. Wieser H., Koehler P. Detoxification of gluten by means of enzymatic treatment. // J. AOAC Int. - 2012. -V. 95. -No. 2. - P. 356-363.

19. Gass J., Ehren J., Strohmeier G., Isaacs I., Khosla C. Fermentation, purification, formulation, and pharmacological evaluation of a prolyl endopeptidase from Myxococcus xanthus: implications for celiac sprue therapy. // Biotechnol. Bioeng. - 2005. - V. 92. - P. 674684.

20. Marti T., Molberg O., Li Q., Gray G.M., Khosla C., Sollid L.M. Prolyl endopeptidase-mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten: chemical and immunological characterization. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2005. - V. 312. - P. 19-26.

21. Pyle G.G., Paaso B., Anderson B.E., Allen D.D., Mart, T., Li Q., Siegel M., Khosla C., Gray G.M. Effect of pretreatment of food gluten with prolyl endopeptidase on gluteninduced malabsorption in celiac sprue. // Clin. Gastroenterol. Hepatol. - 2005. - V. 3. - P. 687-694.

22. Shan L., Marti T., Sollid L.M., Gray G.M., Khosla C. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl endopeptidases: implications for coeliac sprue. // Biochem. J. - 2004. -V. 383. - No. Pt 2. - P. 311-318.

23. Shan L., Mathews I., Khosla C. Structural and mechanistic analysis of two prolylendopeptidases: Role of interdomain dynamics in catalysis and specificity. // PNAS. -2005b. - V. 102. - P. 3599-3604.

24. Piper J.L., Gray G.M., Khosla C. Effect of Prolyl Endopeptidase on Digestive-Resistant Gliadin Peptides in vivo. // J. Pharm. Exp. Ther. - 2004. - V. 311. - P. 213-219.

25. Shetty R., Vestergaard M., Jessen F., Hagglund P., Knorr V., Koehler P., Prakash H.S., Hobley T.J. Discovery, cloning and characterisation of proline specific prolyl endopeptidase, a gluten degrading thermo-stable enzyme from Sphaerobacter thermophiles. // Enzyme Microb. Technol. - 2017. - V. 107. - P. 57-63.

26. Gerez C.L., Font de Valdez G., Rollan G.C. Functionality of lactic acid bacteria peptidase activities in the hydrolysis of gliadin-like fragments. // Lett. Appl. Microbiol. - 2008. - V. 47. -No. 5. - P. 427-432.

27. Gerez C.L., Dallagnol A., Rollan G., Font de Valdez G. A combination of two lactic acid bacteria improves the hydrolysis of gliadin during wheat dough fermentation. // Food Microbiol. - 2012. - V. 32. - No. 2. - P. 427-430.

28. De Angelis M., Cassone A., Rizzello C., Gagliardi F., Minervini F., Calasso M., Di Cagno R., Francavilla R., Gobbetti M. Mechanism of degradation of immunogenic gluten epitopes from Triticum turgidum L. var. durum by sourdough lactobacilli and fungal proteases. // Appl. Enviroment. Microbiol. - 2010. - V. 76. - P. 508-518.

29. Alvarez-Sieiro P., Redruello B., Ladero V., Martin M.C., Fernandez M., Alvarez M.A. Screening sourdough samples for gliadin-degrading activity revealed Lactobacillus casei strains able to individually metabolize the coeliac-disease-related 33-mer peptide. // Can. J. Microbiol. -

2016. - V. 62. - No. 5. - P. 422-430.

30. Stefanska I., Piasecka-Jozwiak K., Kotyrba D., Kolenda M., Stecka K.M. Selection of lactic acid bacteria strains for the hydrolysis of allergenic proteins of wheat flour. // J. Sci. Food Agric. - 2016. - V. 96. - No. 11. - P. 3897-3905.

31. Blinkovsky A., Byun T., Brown K., Golightly E., Klotz A. A non-specific aminopeptidase from Aspergillus. // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. - V. 1480. - P. 171-181.

32. Byun T., Kofod L., Blinkovsky A. Synergistic action of an X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase and a non-specific aminopeptidase in protein hydrolysis. // J. Agric. Food Chem. - 2001. - V. 49. - P. 2061-2063.

33. Eugster P.J., Salamin K., Grouzmann E., Monod M. Production and characterization of two major Aspergillus oryzae secreted prolyl endopeptidases able to efficiently digest proline-rich peptides of gliadin. // Microbiology. - 2015. - V. 161. - No. 12. - P. 2277-2288.

34. Stepniak D., Spaenij-Dekking L., Mitea C., Moester M., de Ru A., Baak-Pablo R., van Veelen P., Edens L., Koning F. Highly efficient gluten degradation with a newly identified prolyl endoprotease: implications for celiac disease. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. -2006. - V. 291. - No. 4. - P. G621-629.

35. Konig J., Holster S., Bruins M.J., Brummer R.J. Randomized clinical trial: Effective gluten degradation by Aspergillus niger-derived enzyme in a complex meal setting. // Sci. Rep. -

2017. - V. 7. - No. 1. - P. 13100.

36. Goptar I.A., Filippova I.Y., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Vinokurov K.S., Zhuzhikov D.P., Bulushova N.V., Zalunin I.A., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A., Oppert B., Elpidina E.N. Localization of post-proline cleaving peptidases in Tenebrio molitor larval midgut. // Biochimie. - 2008. - V. 90. - No. 3. - P. 508-514.

37. Гоптарь И.А., Кулемзина И.А., Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Жужиков Д.П., Дунаевский Я.Е., Белозерский М.А., Элпидина Е.Н. Свойства постпролинрасщепляющих ферментов из Tenebrio molitor. // Биоорганическая химия. -2008. - V. 32. - No. 3. - P. 310-316.

38. Goptar I.A., Shagin D.A., Shagina I.A., Mudrik E.S., Smirnova Y.A., Zhuzhikov D.P., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Oppert B., Filippova I.Y., Elpidina E.N. A digestive prolyl carboxypeptidase in Tenebrio molitor larvae. // Insect Biochem. Mol. Biol. - 2013. - V. 43. -No. 6. - P. 501-509.

39. Bethune M.T., Strop P., Tang Y., Sollid L.M., Khosla C. Heterologous expression, purification, refolding, and structural-functional characterization of EP-B2, a self-activating barley cysteine endoprotease. // Chem. Biol. - 2006. - V. 13. - P. 637-647.

40. Vora H., McIntire J., Kumar P., Deshpande M., Khosla C. A scalable manufacturing process for pro-EP-B2, a cysteine protease from barley indicated for celiac sprue. // Biotechnol. Bioeng. - 2007. - V. 98. - No. 1. - P. 177-185.

41. Gass J., Vora H., Bethune M.T., Gray G.M., Khosla C. Effect of barley endoprotease EP-B2 on gluten digestion in the intact rat. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2006. - V. 318. - No. 3. - P. 1178-1186.

42. Gass J., Bethune M.T., Siegel M., Spencer A., Khosla C. Combination enzyme therapy for gastric digestion of dietary gluten in patients with celiac sprue. // Gastroenterology. - 2007. -V. 133. - No. 2. - P. 472-480.

43. Tye-Din J.A., Anderson R.P., Ffrench R.A., Brown G.J., Hodsman P., Siegel M., Botwick W., Shreeniwas R. The effects of ALV003 pre-digestion of gluten on immune response and symptoms in celiac disease in vivo // Clin. Immunol. - 2010. - V. 134. - P. 289-290.

44. Siegel M., Garber M.E., Spencer A.G., Botwick W., Kumar P., Williams R.N., Kozuka K., Shreeniwas R., Pratha V., Adelman D.C. Safety, tolerability, and activity of ALV003: results from two phase 1 single, escalating-dose clinical trials. // Dig. Dis. Sci. - 2012. - V. 57. - No. 2 - P. 440-450.

45. Lahdeaho M.L., Kaukinen K., Laurila K., Vuotikka P., Koivurova O.P., Karja-Lahdensuu T., Marcantonio A., Adelman D.C., Maki M. Glutenase ALV003 attenuates gluten-induced mucosal injury in patients with celiac disease. // Gastroenterology. - 2014. - V. 146. - No. 7. - P. 1649-1658.

46. Savvateeva L.V., Gorokhovets N.V., Makarov V.A., Serebryakova M.V., Solovyev A.G., Morozov S.Y., Reddy V.P., Zernii E.Y., Zamyatnin A.A. Jr, Aliev G. Glutenase and collagenase activities of wheat cysteine protease Triticain-a: feasibility for enzymatic therapy assays. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2015. - V. 62. - P. 115-124.

47. Helmerhorst E.J., Sun X., Salih E., Oppenheim F.G. Identification of Lys-Pro-Gln as a novel cleavage site specificity of saliva-associated proteases. // J. Biol. Chem. - 2008. - V. 283. -P. 19957-19966.

48. Messana I., Cabras T., Pisano E., Sanna M.T., Olianas A., Manconi B., Pellegrini M., Paludetti G., Scarano E., Fiorita A., Agostino S., Contucci A.M., Calo L., Picciotti P.M., Manni A., Bennick A., Vitali A., Fanali C., Inzitari R., Castagnola M. Trafficking and postsecretory events responsible for the formation of secreted human salivary peptides: a proteomics approach. // Mol. Cell. Proteomics. - 2008. - V. 7. - No. 5. - P. 911-926.

49. Helmerhorst E.J., Zamakhchari M., Schuppan D., Oppenheim F.G. Discovery of a novel and rich source of gluten-degrading microbial enzymes in the oral cavity. // PLoS One. - 2010. -V. 5. - No. 10. - P. e13264.

50. Zamakhchari M., Wei G., Dewhirst F., Lee J., Schuppan D., Oppenheim F.G., Helmerhorst E.J. Identification of Rothia bacteria as gluten-degrading natural colonizers of the upper gastro-intestinal tract. // PLoS One. - 2011. - V. 6. - No. 9. - P. e24455.

51. Fernandez-Feo M., Wei G., Blumenkranz G., Dewhirst F.E., Schuppan D., Oppenheim F.G., Helmerhorst E.J. The cultivable human oral gluten-degrading microbiome and its potential implications in coeliac disease and gluten sensitivity. // Clin. Microbiol. Infect. - 2013. - V. 19. -No. 9. - P. E386-E394.

52. Tian N., Faller L., Leffler D.A., Kelly C.P., Hansen J., Bosch J.A., Wei G., Paster B.J., Schuppan D., Helmerhorst E.J. Salivary gluten degradation and oral microbial profiles in healthy individuals and celiac disease patients. // Appl. Environ. Microbiol. - 2017. - V. 83. - No. 6. - P. e03330-e03316.

53. Gordon S R., Stanley E.J., Wolf S., Toland A., Wu S.J., Hadidi D., Mills J.H., Baker D., Pultz I.S., Siegel J.B. Computational design of an a-gliadin peptidase. // J. Am. Chem. Soc. -2012. - V. 134. - No. 50. - P. 20513-20520.

54. Goptar I.A., Semashko T.A., Danilenko S.A., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Zhuzhikov D.P., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Oppert B., Filippova I.Yu., Elpidina E.N. Cysteine digestive peptidases function as post-glutamine cleaving enzymes in tenebrionid stored-product pests. // Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. - 2012. - V. 161. - No. 2. - P. 148-154.

55. Ehren J., Moron B., Martin E., Bethune M.T., Gray G.M., Khosla C. A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. // PLoS ONE - 2009. - V. 4. -No. 7. - P. e6313.

56. Cornell H.J., Doherty W., Stelmasiak T. Papaya latex enzymes capable of detoxification of gliadin. // Amino Acids. - 2010. - V. 38. - No. 1. - P. 155-165.

57. Buddrick O., Cornell H.J., Small D.M. Reduction of toxic gliadin content of wholegrain bread by the enzyme caricain. // Food Chem. - 2015. - V. 170. - P. 343-347.

58. Cornell H.J., Stelmasiak T., Small D.M., Buddrick O. Application of the rat liver lysosome assay to determining the reduction of toxic gliadin content during breadmaking. // Food Chem. - 2016. - V. 192. - P. 924-927.

59. Brinckmann J. Collagens at a glance. // Top. Curr. Chem - 2005. - V. 247. - P. 1-6.

60. Veit G., Kobbe B., Keene D.R., Paulsson M., Koch M., Wagener R. Collagen XXVIII, a novel von Willebrand factor A domain-containing protein with many imperfections in the collagenous domain. // J. Biol. Chem. - 2006. - V. 281. - P. 3494-3504.

61. Shoulders M.D., Raines R.T. Collagen structure and stability. // Annu. Rev. Biochem. -2009. - V. 78. - P. 929-958.

62. Mika N., Zorn H., Ruhl M. Prolyl-specific peptidases for applications in food protein hydrolysis. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - V. 99. - No. 19. - P. 7837-7846.

63. Ibrahim-Granet O., Bertrand O., Debeaupuis J.P., Planchenault T., Diaquin M., Dupont B. Aspergillus fumigatus metalloproteinase that hydrolyzes native collagen: purification by dye-binding chromatography. // Protein Expr. Purif. - 1994. - V. 5. - P. 84-88.

64. Ibrahim-Granet O., Hernandez F.H., Chevrier G., Dupont B. Expression of PZ-peptidases by cultures of several pathogenic fungi. Purification and characterization of a collagenase from Trichophyton schoenleinii. // Med. Mycol. - 1996. - V. 34. - P. 83-90.

65. Ding G.W., Zhou N.D., Tian Y.P. Over-expression of a proline specific aminopeptidase from Aspergillus oryzae JN-412 and its application in collagen degradation. // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2014. - V. 173. - P. 1765-1777.

66. Murai A., Tsujimoto Y., Matsui H., Watanabe K. An Aneurinibacillus sp. strain AM-1 produces a proline specific aminopeptidase useful for collagen degradation. // J. Appl. Microbiol. - 2004. - V. 96. - P. 810-818.

67. Kim M., Hamilton S.E., Guddat L.W., Overall C.M. Plant collagenase: unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger. // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - V. 1770. - P. 1627-1635.

rd

68. Handbook of Proteolytic Enzymes, 3 Edn. in Rawlings N.D., Salvesen G. Eds. // Elsevier. - 2013.

69. NCBI Resource Coordinators. Database Resources of the National Center for Biotechnology Information. // Nucleic Acids Res. - 2017. - V. 45. - No. D1. - P. D12-D17. https://www.ncbi.nlm.nih.gov

70. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. // Nucleic Acids Res. - 2017. - V. 45. - No. D1. - P. D158-D169. http://www.uniprot.org

71. Rawlings N.D., Waller M., Barrett A.J., Bateman A. MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors. // Nucleic Acids Res. - 2014. - V. 42(Database issue). - P. D503-D509. https://www.ebi.ac.uk/merops/

72. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. - 1990. - V. 215. - No. 3. - P. 403-410. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

73. Polgar L. The prolyl oligopeptidase family. // Cell Mol. Life Sci. - 2002. - V. 59. - No. 2.

- P. 349-362.

74. Rea D., Fulop V. Structure-function properties of prolyl oligopeptidase family enzymes. // Cell Biochem. Biophys. - 2006. - V. 44. - No. 3. - P. 349-365.

75. Szeltner Z., Polgar L. Structure, function and biological relevance of prolyl oligopeptidase. // Curr. Protein Pept. Sci. - 2008. - V. 9. - No. 1. - P. 96-107.

76. Aertgeerts K., Ye S., Tennant M.G., Kraus M.L., Rogers J., Sang B.C., Skene R.J., Webb D.R., Prasad G.S. Crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV in complex with a decapeptide reveals details on substrate specificity and tetrahedral intermediate formation. // Protein Sci. - 2004. - V. 13. - No. 2. - P. 412-421.

77. Aertgeerts K., Ye S., Shi L., Prasad S.G., Witmer D., Chi E., Sang B.C., Wijnands R.A., Webb D.R., Swanson R.V. N-linked glycosylation of dipeptidyl peptidase IV (CD26): effects on enzyme activity, homodimer formation, and adenosine deaminase binding. // Protein Sci. - 2004.

- V. 13. - No. 1. - P. 145-154.

78. Hiramatsu H., Yamamoto A., Kyono K., Higashiyama Y., Fukushima C., Shima H., Sugiyama S., Inaka K., Shimizu R. The crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) complex with diprotin A. // Biol. Chem. - 2004. - V. 385. - No. 6. - P. 561-564.

79. Park JE., Lenter M.C., Zimmermann R.N., Garin-Chesa P., Old L.J., Rettig W.J. Fibroblast activation protein: A dual-specificity serine protease expressed in reactive human tumor stromal fibroblasts. // J. Biol. Chem. - 1999. - V. 274. - P. 36505-36512.

80. Aertgeerts K., Levin I., Shi L., Snell G.P., Jennings A., Prasad G.S., Zhang Y., Kraus M.L., Salakian S., Sridhar V., Wijnands R., Tennant M.G. Structural and kinetic analysis of the substrate specificity of human fibroblast activation protein a. // J. Biol. Chem. - 2005. - V. 280, -P. 19441-19444.

81. Meadows S.A., Edosada C.Y., Mayeda M., Tran T., Quan C., Raab H., Wiesmann Ch., Wolf B.B. Ala657 and Conserved Active Site Residues Promote Fibroblast Activation Protein Endopeptidase Activity via Distinct Mechanisms of Transition State Stabilization. // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - P. 4598-4605.

82. Yokotani N., Doi K., Wenthold R.J., Wada K. Non-conservation of a catalytic residue in a dipeptidyl aminopeptidase IV-related protein encoded by a gene on human chromosome 7. // Hum. Mol. Genet. - 1993. - V. 2. - P. 1037-1039.

83. Qi S.Y., Riviere P.J., Trojnar J., Junien J.-L., Akinsanya K.O. Cloning and characterization of dipeptidyl peptidase 10, a new member of an emerging subgroup of serine proteases. // Biochem. J. - 2003. - V. 373. - P. 179-189.

84. Soisson S.M., Patel S.B., Abeywickrema P.D., Byrne N.J., Diehl R.E., Hall D.L., Ford R.E., Reid J.C., Rickert K.W., Shipman J.M., Sharma S., Lumb K.J. Structural definition and substrate specificity of the S28 protease family: the crystal structure of human prolylcarboxypeptidase. // BMC Struct. Biol. - 2010. - V. 10. - P. 16.

85. Li X., Lou Z., Zhou W., Ma M., Cao Y., Geng Y., Bartlam M., Zhang X.C., Rao Z. Structure of human cytosolic X-prolyl aminopeptidase: a double Mn(II)-dependent dimeric enzyme with a novel three-domain subunit. // J. Biol. Chem. - 2008. - V. 283. - P. 22858-22866.

86. Cottrell G.S., Hyde R.J., Lim J., Parsons M.R., Hooper N.M., Turner A.J. Identification of critical residues in the active site of porcine membrane-bound aminopeptidase P. // Biochemistry. - 2000. - V. 39. - P. 15129-15135.

87. Graham S.C., Lilley P.E., Lee M., Schaeffer P.M., Kralicek A.V., Dixon N.E., Guss J.M. Kinetic and crystallographic analysis of mutant Escherichia coli aminopeptidase P: insights into substrate recognition and the mechanism of catalysis. // Biochemistry. - 2006. - V. 45. - P. 964975.

88. Walter R. Partial purification and characterization of PPCE: enzymatic inactivation of neurohypophyseal hormones by kidney preparations of various species. // Biochim. Biophys. Acta. - 1976. - V. 422. - P. 138-158.

89. Alfalah M., Jacob R., Naim H.Y. Intestinal dipeptidyl peptidase IV is efficiently sorted to the apical membrane through the concerted action of N- and O-glycans as well as association with lipid microdomains. // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - P. 10683-10690.

90. Ghersi G., Zhao Q., Salamone M., Yeh Y., Zucker S., Chen W.T. The protease complex consisting of dipeptidyl peptidase IV and seprase plays a role in the migration and invasion of human endothelial cells in collagenous matrices. // Cancer Res. - 2006. - V. 66. - P. 4652-4661.

91. Abbott C.A., Yu D.M.T., Woollatt E., Sutherland G.R., McCaughan G.W., Gorrell M.D. Cloning, expression and chromosomal localization of a novel human dipeptidyl peptidase (DPP) IV homolog, DPP8. // Eur. J. Biochem. - 2000. - V. 267. - P. 6140-6150.

92. Ajami K., Abbott C.A., McCaughan G.W., Gorrell M.D. Dipeptidyl peptidase 9 has two forms, a broad tissue distribution, cytoplasmic localization and DPIV-like peptidase activity. // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - V. 1679. - P. 18-28.

93. Yu D.M., Ajami K., Gall M.G., Park J., Lee C.S., Evans K.A., McLaughlin E.A., Pitman M.R., Abbott C.A., McCaughan G.W., Gorrell M.D. The in vivo expression of dipeptidyl peptidases 8 and 9. // J. Histochem. Cytochem. - 2009. - V. 57. - No. 11. - P. 1025-1040.

94. Allen M., Heinzmann A., Noguchi E., Abecasis G., Broxholme J., Ponting C.P., Bhattacharyya S., Tinsley J., Zhang Y., Holt R., Jones E.Y., Lench N., Carey, A., Jones H., Dickens N.J., Dimon C., Nicholls R., Baker C., Cookson W.O.C.M. Positional cloning of a novel gene influencing asthma from chromosome 2q14. // Nat. Genet. - 2003. - V. 35. - P. 258-263.

95. Kakimoto T., Oshima G., Yeh H.S.J., Erdos E.G. Purification of lysosomal prolycarboxypeptidase angiotensinase C. // Biochim. Biophys. Acta. - 1973. - V. 302. - P. 178182.

96. Odya C.E., Marinkovic D.V., Hammon K.J., Stewart T.A., Erdos E.G. Purification and properties of prolylcarboxypeptidase (angiotensinase C) from human kidney. // J. Biol. Chem. -1978. - V. 253. - P. 5927-5931.

97. Tan F., Morris P.W., Skidgel R.A., Erdos E.G. Sequencing and cloning of human prolyl carboxypeptidase angiotensinase C: similarity to both serine carboxypeptidase and prolyl endopeptidase families. // J. Biol. Chem. - 1993. - V. 268. - P. 16631-16638.

98. Chiravuri M., Agarraberes F., Mathieu S.L., Lee H., Huber B.T. Vesicular localization and characterization of a novel post-proline-cleaving aminodipeptidase, quiescent cell proline dipeptidase. // J. Immunol. - 2000. - V. 165. - P. 5695-5702.

99. Maes M.B., Lambeir A.M., Gilany K., Senten K., Van der Veken P., Leiting B., Augustyns K., Scharpe S., De Meester I. Kinetic investigation of human dipeptidyl peptidase II (DPPII)-mediated hydrolysis of dipeptide derivatives and its identification as quiescent cell proline dipeptidase (QPP)/dipeptidyl peptidase 7 (DPP7). // Biochem. J. - 2005. - V. 386. - P. 315-324.

100. Venema R.C., Ju H., Zou R., Venema V.J., Ryan J.W. Cloning and tissue distribution of human membrane-bound aminopeptidase P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - V. 1354. - P. 45-48.

101. Czirjak G., Burkhart W.A., Moyer M.B., Antal J., Shears S.B., Enyedi P. Cloning and functional expression of the cytoplasmic form of rat aminopeptidase P. // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - V. 1444. - P. 326-336.

102. O'Toole J.F., Liu Y., Davis E.E., Westlake C.J., Attanasio M., Otto E.A., Seelow D., Nurnberg G., Becker C., Nuutinen M., Karppa M., Ignatius J., Uusimaa J., Pakanen S., Jaakkola E., van den Heuvel L.P., Fehrenbach H., Wiggins R., expand/collapse author list Hildebrandt F. Individuals with mutations in XPNPEP3, which encodes a mitochondrial protein, develop a nephronophthisis-like nephropathy. // J. Clin. Invest. - 2010. - V. 120. - P. 791-802.

103. Kohno H., Kanno T. Properties and activities of aminopeptidases in normal and mitogen-stimulated human lymphocytes. // Biochem. J. - 1985. - V. 226. - No. 1. - P. 59-65.

104. Teufel M., Saudek V., Ledig J.P., Bernhardt A., Boularand S., Carreau A., Cairns N.J., Carter C., Cowley D.J., Duverger D., Ganzhorn A.J., Guenet C., Heintzelmann B., Laucher V., Sauvage C., Smirnova T. Sequence identification and characterization of human carnosinase and a closely related non-specific dipeptidase. // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - No. 8. - P. 65216531.

105. Durinx C., Lambeir A.M., Bosmans E., Falmagne J.B., Berghmans R., Haemers A., Scharpe S., De Meester I. Molecular characterization of dipeptidyl peptidase activity in serum: soluble CD26/dipeptidyl peptidase IV is responsible for the release of X-Pro dipeptides. // Eur. J. Biochem. - 2000. - V. 267. - P. 5608-5613.

106. Ajami K., Abbott C.A., Obradovic M., Gysbers V., Kaehne T., McCaughan G.W., Gorrell M.D. Structural requirements for catalysis, expression, and dimerization in the CD26/DPIV gene family. // Biochemistry. - 2003. - V. 42. - P. 694-701.

107. Terra W.R., Ferreira C., Bastos F. Phylogenetic consideration of insect digestion. Disaccharidases and the spatial organization of digestion in the Tenebrio molitor larvae. // Insect Biochem. - 1985. - V. 15. - P. 443-449.

108. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert B., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A. Diversity of digestive proteinases in Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) larvae. // Comp. Biochem. Physiol. - 2006a. - 145B. - P. 126-137.

109. Elpidina E.N., Goptar I.A. Digestive peptidases in Tenebrio molitor and possibility of use to treat celiac disease. // Entomol. Res. - 2007. - V. 37. - P. 139-147.

110. Vinokurov K.S., Elpidina E.N., Oppert B., Prabhakar S., Zhuzhikov D.P., Dunaevsky Y.E., Belozersky M.A. Fractionation of digestive proteinases from Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) larvae and role in protein digestion. // Comp. Biochem. Physiol. - 2006b. - V. 145B. - P. 138-146.

111. Silk D.B.A. Digestion and absorption of dietary protein in man. // Proc. Nutr. Soc. - 1980. - V. 39. - P. 61-70.

112. Shen H., Smith D.E., Brosius F.C. 3rd. Developmental expression of PEPT1 and PEPT2 in rat small intestine, colon, and kidney. // Pediatr. Res. - 2001. - V. 49. - P. 789-795.

113. Roman G., Meller V., Wu K.H., Davis R.L. The opt1 gene of Drosophila melanogaster encodes a proton-dependent dipeptide transporter. // Am. J. Physiol. - 1998. - V. 275. - P. 857869.

114. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M. Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. // Electrophoresis.

- 1999. - V. 20. - No. 18. - P. 3551-3567. http://www.matrixscience.com

115. Chich J.F., Rigolet P., Nardi M., Ribadeau-Dumas B., Gripon J.C., Brunie S. Purification, crystallisation and preliminary X-ray analysis of PepX, a dipeptidyl aminopeptidase from Lactococcus lactis. // Proteins. - 1995. - V. 23. - P. 278-281.

116. Kabashima T., Yoshida T., Ito K., Yoshimoto T. Cloning, sequencing, and expression of the dipeptidyl peptidase IV gene from Flavobacterium meningosepticum in Escherichia coli. // Arch. Biochem. Biophys. - 1995. - V. 320. - No. 1. - P. 123-128.

117. Rigolet P., Mechin I., Delage M.M., Chich J.F. The structural basis for catalysis and specificity of the X-prolyl dipeptidyl aminopeptidase from Lactococcus lactis. // Structure. -2002. - V. 10. - No. 10. - P. 1383-1394.

118. Rea D., Lambeir A.M., Kumagai Y., De Meester I., Scharpe S., Fulop V. Expression, purification and preliminary crystallographic analysis of dipeptidyl peptidase IV from Porphyromonas gingivalis. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. - 2004. - V. 60. - No. Pt 10.

- P. 1871-1873.

119. Jobin M.C., Martinez G., Motard J., Gottschalk M., Grenier D. Cloning, purification, and enzymatic properties of dipeptidyl peptidase IV from the swine pathogen Streptococcus suis. // J. Bacteriol. - 2005. - V. 187. - No. 2. - P. 795-799.

120. Baer J.W., Gerhartz B., Hoffmann T., Rosche F., Demuth H.U. Characterization of human DP IV produced by a Pichiapastoris expression system. // Adv. Exp. Med. Biol. - 2003.

- V. 524. - P. 103-108.

121. Thoma R., Löffler B., Stihle M., Huber W., Ruf A., Hennig M. Structural basis of proline-specific exopeptidase activity as observed in human dipeptidyl peptidase-IV. // Structure.

- 2003. - V. 11. - No. 8. - P. 947-959.

122. Hu C.X., Huang H., Zhang L., Huang Y., Shen Z.F., Cheng K.D., Du G.H., Zhu P. A new screening method based on yeast-expressed human dipeptidyl peptidase IV and discovery of novel inhibitors. // Biotechnol. Lett. - 2009. - V. 31. - No. 7. - P. 979-984.

123. Dobers J., Zimmermann-Kordmann M., Leddermann M., Schewe T., Reutter W., Fan, H. Expression, purification, and characterization of human dipeptidyl peptidase IV/CD26 in Sf9 insect cells. // Protein Expr. Purif. - 2002. - V. 25. - No. 3. - P. 527-532.

124. Leiting B., Pryor K.D., Wu J.K., Marsilio F., Patel R.A., Craik C.S., Ellman J.A., Cummings R.T., Thornberry N.A. Catalytic properties and inhibition of proline-specific dipeptidyl peptidases II, IV and VII. // Biochem. J. - 2003. - V. 371. - No. Pt 2. - P. 525-532.

125. Rasmussen H.B., Branner S., Wiberg F.C., Wagtmann N. Crystal structure of human dipeptidyl peptidase IV/CD26 in complex with a substrate analog. // Nat. Struct. Biol. - 2003. -V. 10. - No. 1. - P. 19-25.

126. Lee B., Shi L., Kassel D.B., Asakawa T., Takeuchi K., Christopher R.J. Pharmacokinetic, pharmacodynamic, and efficacy profiles of alogliptin, a novel inhibitor of dipeptidyl peptidase-4, in rats, dogs, and monkeys. // Eur. J. Pharmacol. - 2008. - V. 589. - No. 1-3. - P. 306-314.

127. Hong W.J., Piazza G.A., Hixson D.C., Doyle D. Expression of enzymatically active rat dipeptidyl peptidase IV in Chinese hamster ovary cells after transfection. // Biochemistry. -1989. - V. 28. - No. 21. - P. 8474-8479.

128. Dobers J., Grams S., Reutter W., Fan H. Roles of cysteines in rat dipeptidyl peptidase IV/CD26 in processing and proteolytic activity. // Eur. J. Biochem. - 2000. - V. 267. - No. 16. -P. 5093-5100.

129. Lorey S., Faust J., Mrestani-Klaus C., Kahne T., Ansorge S., Neubert K., Buhling F. Transcellular proteolysis demonstrated by novel cell surface-associated substrates of dipeptidyl peptidase IV (CD26). // J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277. - No. 36. - P. 33170-33177.

130. Yu D M., Slaitini L., Gysbers V., Riekhoff A.G., Kahne T., Knott H.M., De Meester I., Abbott C.A., McCaughan G.W., Gorrell M.D. Soluble CD26/dipeptidyl peptidase IV enhances human lymphocyte proliferation in vitro independent of dipeptidyl peptidase enzyme activity and adenosine deaminase binding. // Scand. J. Immunol. - 2011. - V. 73. - No. 2. - P. 102-111.

131. Klimova M.A., Vorotnikova E.A., Tereshchenkova V.F. Recombinant cathepsin L from Tribolium castaneum: isolation and properties. // Abstracts of the IX International chemistry conference "Mendeleev 2015", St. Petersburg. - 2015. - P. 243.

132. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR. // Nucleic Acids Res. - 1999. - V. 27. - No. 6. - P. 1558-1560.

133. Cunningham D.F. and O'Connor B. Proline specific peptidases. // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - V. 1343. - No. 2. - P. 160-186.

134. Nabeno M., Akahoshi F., Kishida H., Miyaguchi I., Tanaka Y., Ishii S., Kadowaki T. A comparative study of the binding modes of recently launched dipeptidylpeptidase 4 inhibitors in the active site. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2013. - V. 434. - P. 191-196.

135. Bella A.M. Jr, Erickson R.H., Kim Y.S. Rat intestinal brush border membrane dipeptidyl-aminopeptidase IV: kinetic properties and substrate specificities of the purified enzyme. // Arch. Biochem. Biophys. - 1982. - V. 218. - No. 1. - P. 156-162.

136. Stockel-Maschek A., Stiebitz B., Born I., Faust J., Mogelin W., Neubert K. Potent inhibitors of dipeptidyl peptidase IV and their mechanisms of inhibition. // Adv. Exp. Med. Biol.

- 2000. - V. 477. - P. 117-123.

137. Trott O., Olson A.J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. // Journal of Computational Chemistry. - 2010. - V. 31. - P. 455-461.

138. Darmoul D., Voisin T., Couvineau A., Rouyer-Fessard C., Salomon R., Wang Y., Swallow D.M., Laburthe M. Regional expression of epithelial dipeptidyl peptidase IV in the human intestines. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - V. 203. - No. 2. - P. 12241229.

139. Suzuki Y., Erickson R.H., Sedlmayer A., Chang S.-K., Ikehara Y., Kim Y.S. Dietary regulation of rat intestinal angiotensin-converting enzyme and dipeptidyl peptidase IV. // Am. J. Physiol. - 1993. - V. 264. - P. G1153-G1159.

140. Adamkova A., Mlcek J., Kourimska L., Borkovcova M., Busina T., Adamek M., Bednarova M., Krajsa J. Nutritional Potential of Selected Insect Species Reared on the Island of Sumatra. // Int. J. Environ. Res. Public Health. - 2017. - V. 14. - No. 5. - P. E521.

141. Houben-Weyl Methods of Organic Chemistry: Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, 4th edition. In M. Goodman, C. Toniolo, L. Moroder, A. Felix (Eds.). // Stuttgart, New York: Thieme. - 2004. - V. E22a. - P. 785.

142. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н., Филиппова И.Ю., Маркарян А.Н., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. п-Нитроанилиды пироглутамилпептидов

- хромогенные субстраты сериновых протеиназ. // Биоорган. химия. - 1987. - V. 13. - P. 748-753.

143. Степанов В.М., Лысогорская Е.Н., Филиппова И.Ю., Оксенойт Е.С., Люблинская Л.А. п-Нитроанилид L-пироглутамил-L-фенилаланил-L-аланина - хромогенный субстрат тиоловых протеиназ. // А. с. 1198082 (СССР). Заявл. 02. 07. 84 № 3762288/23-04. Опубл. в Б.И. - 1985. - No. 46.

144. Frugoni J.A.C. Tampone universale di Britton e Robinson a forza ionica constante. // Gazz. Chem. Ital. - 1957. - V. 87. - P. 403-407.

145. Fields R. The rapid determination of amino groups with TNBS. // Methods Enzymol. -1972. - V. 25. - P. 464-468.

146. McLellan, T., Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH. // Anal. Biochem. - 1982. - V. 126. - P. 94-99.

147. Martynov A.G., Elpidina E.N., Perkin L., Oppert B. Functional analysis of C1 family cysteine peptidases in the larval gut of Тenebrio molitor and Tribolium castaneum. // BMC Genomics. - 2015. - V. 16. - No. 1. - P. 75.

148. Wagner R.A., Fischer M.J. The String-to-String Correction Problem. // J. ACM. - 1974. -V. 21. - No. 1. - P. 168-173.

149. Katoh K., Kuma K., Toh H., Miyata T. MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment. // Nucleic Acids Res. - 2005. - V. 33. - No. 2. - P. 511-518.

150. Li W., Cowley A., Uludag M., Gur T., McWilliam H., Squizzato S., Park Y.M., Buso N., Lopez R. The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework. // Nucleic Acids Res. - 2015. - V. 43. - No. W1. - P. W580-584. https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

151. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetic Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. // Molecular Biology and Evolution. - 2011. - V. 28. - P. 27312739. http://www.megasoftware.net/

152. Mortazavi A., Williams B.A., McCue K., Schaeffer L., Wold B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. // Nat. Methods. - 2008. - V. 5. - No. 7. -P. 621-628.

153. Nicholas K.B., Nicholas H.B. Jr., Deerfield D.W. II. GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation. // EMBNEW. NEWS. - 1997. - V. 4. - P. 14. http://www.psc.edu/biomed/genedoc

154. Petersen T.N., Brunak S., Heijne G., Nielsen H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. // Nature Methods. - 2011. - V. 8. - P. 785-786. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

155. Krogh A., Larsson B., von Heijne G., Sonnhammer E.L.L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden Markov model: Application to complete genomes. // Journal of Molecular Biology. - 2001. - V. 305. - No. 3. - P. 567-580. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

156. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. // Nucleic Acids Res. - 2003. -V. 31. - No. 13. - P. 3784-3788. http://web.expasy.org/compute_pi/

157. Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E.. The Protein Data Bank. // Nucleic Acids Research. - 2000. - V. 28. - P. 235242. www.rcsb.org

158. Stewart J.J. Optimization of parameters for semiempirical methods VI: more modifications to the NDDO approximations and re-optimization of parameters. // J. Mol. Model. - 2013. - V. 19. - P. 1-32. http://openmopac.net/MOPAC2012.html

159. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7 Schrodinger, LLC. https://pymol.org/2/

160. Biasini M., Bienert S., Waterhouse A., Arnold K., Studer G., Schmidt T., Kiefer F., Cassarino T.G., Bertoni M., Bordoli L., Schwede T. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. // Nucleic Acids Res. - 2014. - V. 42. -No. W1. - P. W252-W258. https://swissmodel.expasy.org