Наноструктурированные материалы на основе серебра для биомедицинской диагностики методом гигантского комбинационного рассеяния тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.21, кандидат химических наук Семенова, Анна Александровна

• Семенова, Анна Александровна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Семенова, Анна Александровна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Оптические свойства наноструктур на основе серебра.

1.1.1. Плазмонный резонанс и моделирование оптических свойств наночастиц различной морфологии.

1.1.2. Основные физические принципы гигантского комбинационного рассеяния.

1.2. Методы получения наночастиц серебра и наноструктурированных материалов на их основе.

1.2.1. Химические методы.

1.2.2. Физические методы.

1.2.3. Методы «зелёной» химии.

1.2.4. Методы нанесения наноструктурированных покрытий на основе серебра.

1.2.5. Методы получения серебросодержащих композитов.

1.3. Биологические и медицинские применения спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Наноструктурированные материалы на основе серебра для биомедицинской диагностики методом гигантского комбинационного рассеяния»

Одним из перспективных направлений современных исследований является разработка способов синтеза наночастиц для важнейших биомедицинских приложений, таких как диагностика, визуализация, терапия и доставка лекарств [1-4]. В последнее время значительно вырос интерес к спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) как универсальному методу для анализа биологических молекул и живых клеток [5-8]. К основным преимуществам метода относят высокую чувствительность, качественное определение молекул по характеристическим спектрам, простоту пробоподготовки, уникальную возможность усиления сигнала комбинационного рассеяния (КР) до 1014 раз [8, 9]. В случае исследования живых клеток возникает ряд существенных и пока еще не решенных проблем, связанных с поиском эффективных, неинвазивных и воспроизводимых методов исследования, обладающих высокой селективностью и информативностью. В основе метода ГКР лежит способность эффект плазмонного резонанса, которым обладают наночастицы и наноструктурированные материалы на основе ряда металлов, поэтому ключевыми в данной, практически важной, проблеме являются материаловедческие аспекты. В связи с этим, актуальным является создание новых ГКР-активных наноматериалов для исследования биомолекул в составе живых клеток.

Среди наночастиц металлов особое место занимают наночастицы благородных металлов (например, серебра и золота), которые эффективно рассеивают и поглощают свет и, обладая плазмонным резонансом, позволяют наиболее эффективно усиливать сигнал КР и регистрировать ГКР-спектры. Дополнительным важным фактором, обусловливающим широкое практическое применение наночастиц благородных металлов и наноструктур на их основе, является их достаточно высокая химическая инертность, что влечет за собой возможность продолжительного существования наночастиц в биологически совместимых средах, водных растворах электролитов, а также их хорошую биосовместимость. Самым востребованным металлом для плазмоники и метода ГКР является серебро, имеющее наибольшую интенсивность полосы плазмонного резонанса и обладающее высоким коэффициентом экстинкции в максимуме этой полосы [10, 11]. Положение полосы плазмонного резонанса наночастиц серебра (НЧС) можно варьировать в широких пределах от видимой до ближней инфракрасной области путем изменения морфологии и размера частиц, создания их агрегатов и более сложных наноструктур, изменения диэлектрической проницаемости окружающей их среды [12]. Контролируемое изменение параметров позволяет «настраивать» наночастицы для конкретных задач практического применения, поэтому, с точки зрения химии, ключевую роль играет разработка новых методов синтеза НЧС и наноструктур на их основе с заданными геометрическими параметрами, агрегатной структурой и, соответственно, требуемыми оптическими свойствами.

Целью настоящей работы является поиск и разработка новых наноструктурированных материалов на основе металлического серебра с заданными морфологией и оптическими свойствами для исследования эритроцитов методом ГКР-спектроскопии.

Для достижения цели решались следующие задачи: на основе серебра для ГКР-спектроскопии биологических объектов в водной среде; моделирования их оптических свойств методом дискретно-дипольного приближения (ДДП);

10-100 нм), морфологией (сферы, нити, пластинки, частицы сложной формы и наноструктуры), положением полосы плазменного резонанса (380-700 нм) и стабильностью в растворах электролитов, используемых для анализа биологических объектов; анализ биосовместимости полученных наноматериалеа;основе серебра и эффективности их использования для исследования эритроцитов с использованием спектроскопии ГКР; материалов на основе серебра, позволяющими получить коэффициенты усиления сигнала КР более 103.

Для решения поставленных в работе задач в качестве объектов исследования были выбраны наночастицы серебра различной морфологии (сферической, нитевидной, кубической, пластинчатой и более сложной), композитные частицы на основе диоксида кремния и наночастиц серебра; наноструктуирированные покрытия на основе металлического серебра. В качестве модельных биологических систем для ГКР рассматривался один из самых важных типов клеток человеческого организма - красные кровяные тельца, а также гемоглобин в составе эритроцитов или выделенный из них.

Исследование полученных наноструктурированных материалов и их взаимодействия с клетками крови проводили с использованием ряда физико-химических методов:

- растровая и просвечивающая электронная микроскопия,

- оптическая микроскопия,

- УФ-, видимая и ИК-спектроскопия,

- спектроскопия КР и ГКР,

- дифракция рентгеновских лучей,

- локальный рентгеноспектральный анализ,

- динамическое рассеяние света,

- атомно-силовая микроскопия,

- термический анализ,

- капиллярная конденсация азота.

Научная новизна работы может быть сформулирована в виде следующих положений, выносимых на защиту:

1. Впервые разработан метод синтеза НЧС и наноструктурированных покрытий на основе серебра путем разложения аммиачного комплекса гидроксида серебра (I) в водном растворе и в виде аэрозоля.

2. Впервые систематически изучено влияние морфологии, размера НЧС (в виде сфер, пластинок, нитей и кубиков), состояния их поверхности на оптические свойства и ГКР-активность при анализе живых эритроцитов.

3. Впервые экспериментально исследовано влияние эффектов старения золей серебра на их ГКР-активность в отношении живых клеток.

4. Изучен процесс формирования наноструктурированных пленок на основе серебра с иерархической структурой и впервые показана их высокая эффективность в ГКР-спектроскопии живых эритроцитов.

5. Предложена модель, объясняющая эффективность трансмембранной диагностики живых эритроцитов с использованием наноструктурированных материалов на основе серебра, и разработаны методики исследования живых клеток методом ГИР-спектроскопии на примере живых эритроцитов.

Практическая значимость работы состоит в том, что в результате исследований:

1. Даны рекомендации по выбору методов и условий получения наночастиц серебра различной морфологии для ГКР-спектроскопии. Показано, что частицы, полученные в оптимальных условиях, стабильны в течение, по крайней мере, нескольких месяцев и характеризуются коэффициентами усиления сигнала КР гемоглобина до 104.

2. Предложено использование нитратного буфера для анализа биологических объектов методом ГКР с использованием НЧС анизотропной формы с целью предотвращения спонтанной рекристаллизации наночастиц в присутствии хлорид-ионов, присутствующих в стандартных буферных растворах.

3. Предложена новая методика получения НЧС без примесей посторонних ионов и поверхностно-активных веществ путем термического разложения аммиачного комплекса гидроксида серебра (I).

4. Предложен новый масштабируемый метод нанесения островковых пленок наноструктурированного металлического серебра на различные поверхности методом аэрозольного осаждения. Показана принципиальная возможность использования полученных подложек для исследования красных кровяных телец методом ГКР.

5. Обнаружены корреляции, между параметрами кривых распределения, спектрами поглощения и коэффициентом усиления сигнала ГКР, что позволяет оптимизировать процесс синтеза НЧС для изучения биомолекул и живых клеток методом ГКР.

Работа выполнена в рамках проектов РФФИ №№ 10-03-00976-а, 11-03-00761-а, 09-03-12221-офим, 11-03-09244-мобз, 12-03-09326-мобз, а также П649 в рамках ФЦП развития инфраструктуры наноиндустрии, программ Президиума РАН 2010-2012 года и Программы развития МГУ имени М.В. Ломоносова.

В диссертационной работе представлены результаты научных исследований, выполненных лично автором в период 2009-2012 гг. на кафедре наноматериалов факультета наук о материалах и в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Личный вклад автора заключается в разработке основных методик и проведении экспериментальной работы по получению и анализу образцов, обработке и обобщении полученных результатов и литературных данных, подготовке публикаций. Инструментальное исследование образцов методом РЭМ проведено при участии В.К. Иванова, А.Е. Баранчикова (Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова), М.А. Шехирева, Д.М. Иткиса (ФНМ МГУ); методом ПЭМ - C.B. Савилова, A.B. Егорова (химический факультет МГУ), С.С. Абрамчука (физический факультет МГУ); методом РФА -Т.В. Филипповой, A.B. Гаршева (ФНМ МГУ); методом ДТА - Т.Б. Шаталовой (химический факультет МГУ); методом ИК-спектроскопии -И.В. Колесник (ФНМ МГУ); методом АСМ - В.А.Лебедева (ФНМ МГУ); методом капиллярной конденсации азота - A.C. Вячеславова (ФНМ МГУ); исследование эритроцитов методом ГКР - H.A. Браже, Е.Ю. Паршиной, В.В. Хабатовой, Г.В. Максимова (биологический факультет МГУ), A.A. Елисеева (ФНМ МГУ). Часть экспериментальной работы проведена в рамках дипломной работы студентки ФНМ Р.Г. Сеидовой, соруководителем которой являлся автор.

По результатам проведенных исследований опубликовано 19 работ, включая 5 статей в рецензируемых российских и международных журналах и 14 тезисов докладов на всероссийских и международных научных конференциях. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: II Международная научная конференция «Наноструктурные материалы-2010: Беларусь-Россия-Украина» (НАНО-2010) (Киев, 2010), Четвертая Всероссийская конференция по наноматериалам (Москва, 2011), E-MRS 2011 Spring Meeting & Bilateral Energy Conference (Ницца, 2011), Пятая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2011), 8th EBSA European Biophysics Congress (Будапешт, 2011), 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011), XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), Nanotechnology international forum «Rusnanotech 2011» (Москва, 2011), 17th International Biophysics Congress (Пекин, 2011), 17 ежегодное совещание представителей России, Украины и Республики Беларусь по актуальным проблемам создания новых материалов в рамках расширенного заседания Президиума Международной Ассоциации Академий Наук (Киев, 2012), Первый Байкальский материаловедческий форум (Улан-Удэ, 2012), International Conference of Young Researchers on Advanced Materials - ICYRAM 2012 (Сингапур, 2012), Международная молодежная конференция «Тенденции развития планарных нанотехнологий на основе современного полиграфического оборудования» (PrintNanotech 2012) (Москва, 2012),

Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012).

Диссертационная работа изложена на 199 страницах машинописного текста, иллюстрирована 85 рисунками и 9 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 221 наименование. Работа состоит из введения, трех глав (литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения), выводов, списка литературы и приложений.

Заключение диссертации по теме «Химия твердого тела», Семенова, Анна Александровна

3.6. Выводы

1. Впервые разработан метод получения наночастиц серебра от 2 до 100 нм и наноструктурированных покрытий на основе серебра путем разложения аммиачного комплекса гидроксида серебра (I) в водном растворе (при температурах 25-90°С) и в виде аэрозоля (200-900 °С). Показано, что при аэрозольном осаждении серебра на нагретые выше 60 °С подложки процесс протекает через образование оксида серебра (I) и приводит к формированию иерархически организованных кольцеобразных структур с полосой плазмонного резонанса в области 390-410 нм. Установлено, что созданные наноструктурированные покрытия не вызывают гемолиза эритроцитов и позволяют осуществлять их неинвазивную диагностику методом ГКР.

2. Впервые систематически изучено влияние морфологии, размера НЧС (средний размер частиц в виде сфер - 2 - 90 нм, пластинок - 10 - 50 нм х 5 -15 нм, нитей -50-100 нмх 30-50 мкм, кубов - ЮОнм-Змкм), состояния их поверхности на оптические свойства и ГКР-активность при анализе живых эритроцитов. Установлено, что, в зависимости от предыстории получения, положение полосы ППР может контролируемо варьироваться в диапазоне 380-690 нм. Однако использование полученных наночастиц для ГКР-диагностики возможно лишь при отсутствии на их поверхности посторонних органических молекул и минимизации взаимного влияния наночастиц, живых клеток и компонентов культуральной среды.

3. Исследовано влияние температуры синтеза (25-60°С) и времени старения золей (1-60 дней) НЧС сферической формы на их функциональные свойства. Показано, что частицы, полученные при комнатной температуре, стабильны в течение нескольких месяцев и в наибольшей степени усиливают КР-сигнал гемоглобина.

4. Исследовано влияние компонентов физиологических буферов на стабильность НЧС анизотропной формы. Обнаружено значительное смещение полосы ППР (на 100300 нм) за течение 1-5 мин в присутствии хлорид-ионов, входящих в состав стандартных буферных раствороы, что коррелирует с повышением изотропности частиц в процессе их спонтанной рекристаллизации. В связи с этим, предложено использование нитратного буфера для анализа биологических объектов методом ГКР с использованием НЧС анизотропной формы.

5. Обнаружены систематические корреляции между параметрами кривых распределения наночастиц, спектрами поглощения и коэффициентом усиления сигнала ГКР. Предложена модель, объясняющая эффективность трансмембранной диагностики живых эритроцитов с использованием наноструктурированных материалов на основе серебра и предполагающая, что необходим прямой контакт наноструктур и живых клеток для реализации эффекта усиления КР-сигнала до 104 раз за счет локального электромагнитного поля.

Благодарности

Автор выражает благодарность и признательность академику Ю.Д.Третьякову за проявленный интерес, внимание к работе и ценные обсуждения результатов.

Благодарность за исследование образцов и научные консультации автор выражает H.A. Браже (биологический факультет МГУ), В.К. Иванову, А.Е. Баранчикову (Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова). За помощь в проведении экспериментов и подготовке ряда образцов автор признателен В.В. Хабатовой, Е.Ю. Паршиной (биологический факультет МГУ), Р.Г. Сеидовой (ФНМ МГУ); за проведение инструментальных исследований и обсуждение результатов - C.B. Савилову, A.B. Егорову, Т.Б. Шаталовой (химический факультет МГУ), Т.В. Филипповой, A.B. Гаршеву, И.В. Колесник, M .А. Шехиреву, A.B. Вячеславову, Д.М. Иткису, В.А. Лебедеву (ФНМ МГУ), О.С. Ивановой (Институт общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова), С.С. Абрамчуку (физический факультет МГУ); за моральную поддержку, интерес к работе и помощь -Е.А. Ереминой, А.Е. Гольдт. Автор благодарит Шляхтина O.A. и Гаськова A.M. за ценные указания при подготовке текста работы и научные консультации.

За интерес к работе, ценные замечания и обсуждение результатов автор выражает благодарность рецензенту М.Н. Румянцевой (химический факультет МГУ).

Автор благодарит весь коллектив лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии химического факультета, кафедры наноматериалов факультета наук о материалах и кафедры биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Особую благодарность автор выражает родителям, сестре и близким друзьям.

1.4. Заключение

Анализ литературных данных однозначно свидетельствует о том, что контролируемый синтез НЧС и разработка новых методов получения наноматериалов на основе серебра является актуальной задачей в области химии твердого тела в применении к неинвазивной биомедицинской диагностике. В то же время, для обеспечения практического использования подходов по анализу биологических объектов с использованием ГКР необходимо решить целый ряд остающихся проблем. В частности, необходима оптимизация стандартных способов и разработка новых методик получения НЧС с контролируемым размером, морфологией, модификация оксидных микрочастиц НЧС для получения нано- и микрокомпозитов, изучение их стабильности в растворах электролитов, используемых для анализа биологических объектов. Теоретически, важным средством для решения данной проблемы является поиск оптимальных размеров и морфологии ГКР-активных наночастиц путем моделирования их оптических свойств. Не менее сложной является проблема разработки биосовместимых наноструктурированных подложек на основе серебра с использованием физических и химических методов. В качестве другой проблемы выступает поиск корреляций состава, структуры и оптических свойств наноматериалов на основе серебра для их эффективного использования в неразрушающем анализе биологических объектов, из которых самыми перспективным является ГКР интактных клеточных структур. Решение данных задач позволит разработать новые подходы в биомедицинской диагностике для скрининга и персональной медицины с использованием новых материалов на основе наноструктурированного серебра.

2. Экспериментальная часть 2.1. Методы получения материалов

В настоящей работе проводился поиск оптимальных методов получения НЧС и материалов на основе наноструктурированного серебра с использованием как химических, так и физических методов для их потенциального использования в биомедицинской диагностике. В отличие от большинства обычных подходов неорганического синтеза, в данной работе оптимизация и поиск новых методов синтеза были вынуждены, безусловно, учитывать дополнительные критерии, в частности, учет поверхностной модификации НЧ, их биосовместимость и высокую активность в ГКР-спектроскопии.

Получение НЧС различной морфологии при химическом восстановлении

Для получения сферических НЧС использовали методику, предложенную Леопольдом и Лендлом [58]. Для этого к 90 мл раствора, содержащего 1.7-10'3 М (NH3OH)Cl и 3.3-10" 3 М гидроксида натрия, добавляли 10 мл 10"2 М свежеприготовленного раствора нитрата серебра при постоянном перемешивании. Перемешивание прекращали через 30 мин после начала реакции. Синтез проводили при 25°С, 40°С и 60°С. Полученные золи хранили при 4°С в течение 1-6 месяцев.

Для получения НЧС полиольным методом 5 мл раствора этиленгликоля нагревали до 160 °С в течение часа и смешивали с 3 мл 0.375 М раствора поливинилпирролидона (ПВП) (Mw = 40000) в этиленгликоле. Через 10 мин к смеси по каплям добавляли 3 мл раствора AgN03 в этиленгликоле со скоростью 375 мкл/с. Концентрация AgN03 в серии экспериментов составляла 0.05, 0.10, 0.25, 0.75 и 1.25 М, соответственно. После 0, 15, 45, 60, 240 и 870 мин после добавления AgN03 отбирали аликвоты раствора объемом 1 мл и смешивали их с 25 мл дистиллированной воды. Полученные образцы центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин (центрифуга Sartorius Sigma 3-30 К), промывая водой 3 раза, и хранили при 4°С.

Поверхностно-декорированные НЧС получали с использованием НЧС с полиольной предысторией в 10% водном растворе аммиака в присутствии ПВП или без ПВП. Аликвоту свежеприготовленных НЧС смешивали с 10% раствором аммиака в объемном соотношении 2:3 и различными количествами ПВП (0, 1, 5 мг на 10 мл раствора). В качестве контрольного рассматривали образец, полученный в результате смешивания аликвоты свежеприготовленных НЧС с водой в объемном соотношении 2:3 без добавления ПВП. Пробирки с образцами закрывали крышками и хранили при комнатной температуре в течение 27 дней, при этом дважды в день проводили аэрацию образцов и отбирали промежуточные пробы для исследования.

Анизотропные НЧС в форме нанопластинок получали двухстадийным методом, описанном в работе [155]. На первой стадии проводили восстановление нитрата серебра боргидридом натрия в присутствии цитрата натрия с образованием наночастиц -затравок. Для этого к 11 мл водного раствора, содержащего 0.11 мМ AgN03 и 2.05 мМ цитрата натрия, добавляли 0.3 мл 5 мМ водного раствора NaBH4 при перемешивании. Перемешивание останавливали через 10 мин после прекращения выделения водорода. Полученный золь выдерживали в течение 5 часов при комнатной температуре. На второй стадии к смеси водных растворов 0,25 мл 5 мМ AgN03, 0.75 мл 30 мМ цитрата натрия, 0.75 мл 0.7 мМ (в пересчете на повторяющееся звено) ПВП и 9.25 мл воды добавляли аликвоту затравок определенного объема (160, 480, 640, 960, 1280, 2560, 3840, 5120, 7680, 10240, 19200 мкл2) и 6.25 мл 1 мМ аскорбиновой кислоты. Изменение цвета раствора происходило сразу после добавления аскорбиновой кислоты, и спустя 15 мин цвет раствора устанавливался постоянным. Полученные коллоиды центрифугировали при 19900 об/мин в течение 10 мин (центрифуга Sartonus Sigma 3-30 К), промывали водой 3 раза и хранили при 4°С. Дополнительно НЧС в форме пластинок наносили на целлюлозный носитель (беззольный фильтр). Образцы получали путем накалывания и высушивания 1,5 мл предварительно полученной смеси затравок и пластинок всех форм и размеров (по 100 мкл каждого образца) на подложки из фильтровальной бумаги диаметром 2 см.

Получение НЧС методом «зеленой» химии

В рамках подхода «зеленой» химии НЧС получали восстановлением нитрата серебра экстрактом листьев крапивы (Urtica úrens) при комнатной температуре. Для приготовления экстракта 25 г листьев крапивы настаивали в 250 мл дистиллированной воды, доведенной до кипения, в течение 45 мин. Аликвоту профильтрованного экстракта разбавляли водой в 5 раз. Полученный раствор пропускали через мембраны с размерами пор 0,45 мкм (Millex-LCR, Millipore). Свежеприготовленный 10~2 М раствор нитрата серебра и разбавленный крапивный экстракт смешивали в соотношении 5 :1 по объему,

2 Объемная доля затравочного раствора составляла 1, 4, 6, 8,10,19, 26, 32, 41, 48 и 64%, соответственно. чтобы суммарная концентрация ионов серебра была сопоставима со случаем использования производных гидроксиламина. Изменение цвета раствора на коричневый, типичный для золей серебра, наблюдали через 10 мин после смешения.

Получение композитов Ай^БЮ?

Композиты и наноструктурированные подложки на основе микросфер диоксида кремния и НЧС получали физическими и химическими методами в несколько этапов.

Синтез микросфер диоксида кремния проводили по методу Штёбера путем щелочного гидролиза тетраэтоксисилана (ТЭОС) в среде этилового спирта и водного раствора аммиака [136]. Для этого гомогенизировали смесь, содержащую этанол, концентрированный раствор аммиака и дистиллированную воду, при постоянном перемешивании в течение 45 минут при 40°С. Не прекращая перемешивание, в реакционную среду добавляли ТЭОС и полученную смесь выдерживали 12 ч. Мольное соотношение реагентов составляло С2Н5ОН : МН3 : Н20 : ТЭОС = 63,33 :12,96 : 4,07 :1.

Для получения наноструктурированных подложек А§@БЮ2 физическим методом получали мультислои микросфер диоксида кремния на стеклянных подложках методом вертикального осаждения, для чего подложки погружали в полученную суспензию с микросферами диоксида кремния и оставляли при комнатной температуре до полного испарения жидкости. Следующий этап заключался в нанесении кластеров серебра на полученные мультислои методом распыления ионным пучком. Распыление мишеней серебра пучком ускоренных ионов аргона проводили с использованием ионно-лучевой электровакуумной установки [156] (предельное давление 10'3-10"2 Па, ускоряющее напряжение 8 кВ, ток ионного пучка 1 мА). Учитывались временные и пространственные факторы процесса: время напыления (0.5; 1; 3; 5 или 10 мин) и направленность распыления, то есть взаимная пространственная ориентация ростовой и распыляемой поверхностей под углом 90° (серия 1), 45° (серия 2) и 0° (серия 3). Считается [156], что поток частиц («облако» серебра), уносимых с мишени, состоит в основном из атомов, в т. ч. возбужденных и ионизованных, кластеров и электронов. Эффективность распыления мишени характеризуется коэффициентом распыления, средним числом атомов, выбиваемых одним падающим ионом. Для серебра коэффициент распыления, определяющий число атомов вещества, выбитых из мишени одним ионом, сравнительно высокий, составляет ~10. В связи с этим, малые скорости нанесения серебра на микросферы диоксида кремния обеспечивались кратковременным воздействием пучка ионов на мишень.

Для создания композитов Ag@Si02 методом пропитки с последующим восстановлением полученные по методу Штёбера микросферы диоксида кремния центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин (центрифуга Sartorius Sigma 3-30 К), промывали 2 раза этанолом и 3 раза водой и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Далее порошок Si02 отжигали при 110°С и 300°С в течение часа. К 50 мг полученных частиц добавляли 2 мл 1М водного раствора AgN03 и подвергали ультразвуковой обработке в течение часа (ультразвуковая ванна Elmasonic S30H). Суспензии оставляли на ночь, далее промывали 5 раз водой и добавляли 2 мл восстановителя - 100 мМ раствора ГЭПЭС (рН = 7.4) или 1 М аскорбиновой кислоты. Изменение цвета микросфер с белоснежно-белого на оливково-зеленый в течение пары минут свидетельствовало об образовании НЧС в результате восстановления AgN03, абсорбированного в поры микросфер и находящихся на поверхности микросфер. Образцы выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре, фильтровали, промывая водой, и высушивали на воздухе.

Для создания композитов Ag@Si02 путем иммобилизации НЧС на поверхности модифицированных аминогруппами микросфер 500 мг порошка Si02, полученного описанным выше способом, помещали в 50 мл толуола и подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин (ультразвуковая ванна Elmasonic S30H). К полученной суспензии добавляли 2.5 мл 3-аминопропилтриметоксисилана (АПТМС) и выдерживали в течение суток при интенсивном перемешивании. Образец центрифугировали 3 раза (6000 об/мин, 10 мин), промывали спиртом, водой и высушивали. Высушенный образец модифицированных аминогруппами микросфер диоксида кремния смешивали с 30 мл спирта и 5 мл НЧС, полученными по методике Леопольда и Лендла вышеописанным способом. Далее подвергали ультразвуковой обработке, выдерживали в течение суток при интенсивном перемешивании, центрифугировали, промывали спиртом и водой, как описано выше.

Получение наночастиц серебра термическим разложением водных растворов аммиачного комплекса гидроксида серебра (I)

К 20 мл 0.1 М свежеприготовленного водного раствора нитрата серебра по каплям добавляли 0.5 М водный раствор гидроксида натрия до выпадения черно-коричневого

73 осадка оксида серебра (I). Полученный осадок промывали водой 3 раза и растворяли в 5 мл 10% водного раствора аммиака. Прозрачный раствор комплекса [А§(1МНз)2]ОН пропускали через мембраны с размером пор 0.45 мкм (МШех-ЬСЯ, МППроге). Аликвоту полученного раствора объемом 0.1, 0.5 или 2.5 мл добавляли в 50 мл кипящей дистиллированной воды. Спустя 20, 30 и 60 мин после начала разложения комплекса отбирали пробы золей НЧС и переносили в эппендорфы с холодной водой. Полученные образцы хранили при 4°С.

Получение подложек методом аэрозольного осаждения

Для получения подложек готовили раствор аммиачного комплекса гидроксида серебра (I) аналогично методике, описанной выше, и помещали в небулайзер (Альбедо) с ультразвуковым генератором аэрозоля, обеспечивающим отсутствие прямого контакта распыляемого раствора с поверхностью ультразвукого источника. Для этого использовали предусмотренный конструкцией водный затвор-волновод и химически инертную тефлоновую мембрану. Капли аэрозоля размером 1-5 мкм распыляли на нагретые до 60-270°С подложки различного типа: стекло, оксид алюминия или микросферы диоксида кремния, нанесенные методом вертикального осаждения на стеклянные подложки (методика получения последних описана выше). Стеклянные подложки предварительно промывали сначала смесью концентрированной Н2504 и Н202 (3:1), затем - дистиллированной водой. Время, необходимое для получения подложек с пленкой наноструктурированного серебра, составляло 30 - 60 мин.

Для получения более сложных структур на основе серебра проводили пиролиз аммиачного комплекса гидроксида серебра (I) в виде аэрозоля при температурах 750 -950 °С. Комплекс ^(1\1Н3)2]ОН получали аналогично методике, описанной выше, используя в качестве исходного водный раствор нитрата серебра различных концентраций: 0.03, 0.1, 0.3 М. В ходе пиролиза капли аэрозоля размером 1-5 мкм попадали в горячую зону (750-950°С) трубчатой печи. На выходе из горячей зоны происходила конденсация продуктов разложения комплекса в раствор или осаждение серебра на нагретые до 200-250 °С подложки из стекла или поликристаллического оксида алюминия.

Подготовка биологических образцов

Эритроциты выделяли из артериальной крови самцов крыс линии Wistar. Разбавленные до 5000 раз суспензии эритроцитов получали путем двухстадийного разведения крови стандартным физиологическим буфером Алена с рН = 7.2 - 7.4 (145 мМ NaCI, 5 мМ KCI, 4мМ Na2HP04, 1 мМ NaH2P04, 1 мМ MgS04, 1 мМ СаС12) с различной осмолярностью, позволяющего сохранить целостность отдельных клеток для анализа (детальное описание методики приведено в работе [157]). Для разведения крови использовали также нитратный буфер, в котором, в отличие от буфера Алена, все хлориды заменены на соответствующие нитраты.

Подготовка и фиксация эритроцитов для АСМ включала разведение образца крови в 200 раз с использованием буфера Алена с рН = 7.4 и последующую фиксацию в 0.5% растворе глутарового альдегида в течение часа. Далее образцы центрифугировали 4 раза (1500 об/мин, 5 мин) и промывали водой. Слой эритроцитов наносили на предметное стекло и высушивали в течение 24 часов.

Для исследований методом РЭМ и для осуществления ГКР-картирования эритроцитов на подложке с кольцевыми наноструктурами серебра образец цельной крови центрифугировали (3000 об/мин, 10 мин) и удаляли супернатант. Каплю сконцентрированной после центрифугирования суспензии наносили на подложки с наноструктурами.

Изолированный гемоглобин выделяли с использованием фосфатного буфера (Na2HP04 : NaH2P04- 2Н20 = 4 :1) с низкой осмолярностью и рН = 7.2. Гемолиз эритроцитов протекаете разрушением плазматической мембраны и выделением цитоплазматического гемоглобина в буферный раствор. Для этого эритроцитарную массу разбавляли в 10 раз буфером, центрифугировали в течение 10 мин (5000 об/мин) и отбирали полученный супернатант, который применяли для регистрации спектров КР гемоглобина. Концентрация гемоглобина в супернатанте, оцененная по спектрам поглощения, составляла Ю-4 М.

Для получения «теней» эритроцитов плазму крови отделяли от эритроцитов центрифугированием крови (440 об/мин, 10 мин) в фосфатном буфере (рН = 7.4) при 4 °С.

Центрифугирование повторяли 3 раза. Количество эритроцитов подсчитывали в камере

Горяева. Используя фосфатный буфер, доводили количество эритроцитов до 107 клетов/мкл. Полученную суспензию эритроцитов разводили в 20 раз ледяным фосфатным буфером (рН = 7.4) и центрифугировали при 4°С (4000 об/мин, 40 мин). Супернатант,

75 содержащий цитоплазматический гемоглобин, отделяли. Осадок, содержащий тени эритроцитов, ресуспендировали в свежеприготовленном ледяном фосфатном буфере (pH = 7.4) и центрифугировали при 4°С (4000 об/мин, 40 мин). Процедуру повторяли 5 раз. Далее проводили концентрирование теней эритроцитов в буфере Алена (pH = 7.4) путем центрифугирования образца (10 000 об/мин, 30 мин). Полученные тени эритроцитов имели розоватый цвет ввиду наличия мембранносвязанного гемоглобина, прикрепленного к АЕ1 обменнику (белку полосы 3) мембраны.

Тени эритроцитов с низким содержанием мембранносвязанного гемоглобина получали по аналогичной методике, заменяя фосфатный буфер с pH = 7.4 на буфер с pH = 8.0. Щелочная среда способствовала отделению большего числа молекул мембранносвязанного гемоглобина от белка АЕ1. В отличие от предыдущих, тени без мембранносвязанного гемоглобина имеют белесый цвет. Для ГКР-экспериментов суспензию с тенями эритроцитов разбавляли в 1000 раз.

2.2. Методы исследования материалов

Рентгенофазовый анализ (РФА) образцов проводили на дифрактометре с вращающимся анодом Rigaku D/MAX 2500 (Rigaku, Япония) в геометрии Брегга - Брентано с использованием СиКа излучения (Лср = 1,5406 Á) и графитового монохроматора. Набор спектров осуществляли в режиме непрерывного 6-29 сканирования при скорости движения детектора 2 °/мин и параметром усреднения 0.02° по шкале 26. Интервал съемки составлял 5 - 80° по шкале 29.

Изображения образцов методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) получали на микроскопах Carl Zeiss NVision 40 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 0.5-7 кВ и LEO Supra 50 VP (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющим напряжением 10 кВ.

Исследование полученных образцов методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и электронной дифракции проводили с использованием электронного микроскопа Leo 912 AB Omega (Carl Zeiss, Германия). Ускоряющее напряжение - 100 кВ. Гистограммы распределения частиц по размерам получали путем измерения среднего диаметра частиц по ПЭМ-изображениям (объем выборки в каждом случае - N > 450 частиц). Исследование образцов методом просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) и определение элементного состава определенных участков методом локального рентгеноспектрального анализа (ЛРСА) осуществляли с использованием микроскопа Jeol JEM 2100F (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ.

Для получения спектров поглощения образцов проводили исследования методом УФ-видимой спектроскопии с использованием спектрофотометров Lambda 35 и Lambda 950 (PerkinElmer, Англия). Измерения проводили в спектральном диапазоне 190-900 нм с шагом сканирования 1 нм. Образцы в виде коллоидных растворов помещали в кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве образца сравнения использовали деионизированную воду Milli-Q (Millipore, Франция). Спектры твердых образцов регистрировали с помощью приставки диффузного отражения.

ИК-спектры образцов регистрировали с использованием Фурье-спектрометра Spectrum One (PerkinElmer, Англия) в диапазоне 400-4000 см"1 с шагом сканирования 1 см"1.

Методом динамического светорассеяния (ДРС) с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Англия) получали кривые распределения частиц по размерам и измеряли потенциал частиц в коллоидных растворах. Измерения проводили при 25 °С, в качестве источника света использовали гелий-неоновый лазер (длина волны - 632.8 нм, мощность лазера - 4 мВт, диаметр пучка - 0.63 нм). Образцы помещали специальные в U-образные, капиллярные кюветы, предназначенные для измерения Ç - потенциала.

Термогравиметрический (ТГА) и дифференциально-термический анализ проводили с использованием термоаналитической установки Netzsch STA 409 PC/PG (Netzsch, Германия) на воздухе в платиновых тиглях в температурном диапазоне 30-900°С со скоростью нагрева 3 °С/мин (масса навески 20 - 40 мг).

Исследования образцов методом капиллярной конденсации азота при Т = 77 К осуществляли на приборе Nova 4200e (Quantachrome Instruments, CUJA). Площадь поверхности и общий объем пор рассчитывали на основании изотерм адсорбции -десорбции с помощью программного обеспечения NovaWin-2.1, используя методики БЭТ (Брунауэр - Эмметт-Теллер) и БДХ (Баррет-Джойнер-Халенда), соответственно.

Изображения наноструктурированных подложек методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) получали в полуконтактном режиме при помощи сканирующего зондового микроскопа NTEGRA Aura (НТ-МДТ, Россия) с использованием зондов NSC-15

Mikromasch, Эстония) (резонансная частота - 265-470 кГц, жесткость - 40 Н/м, радиус

77 кривизны наконечника - 20 нм). Размеры области, с которой получали изображение, составляли 50 х 50 мкм (разрешение 256 х 256 точек). Скорость сканирования - 25 мкм/с. Повторное сканирование осуществляли с области размером 3x3 мкм (разрешение 256x256 точек) со скоростью 3 мкм/с. Обработка изображений была проведена с помощью программы Gwyddion.

АСМ-изображения эритроцитов получали в полуконтактном режиме с использованием сканирующего зондового микроскопа NTEGRA SPECTRA (НТ-МДТ, Россия) при помощи зондов NSG 10-А (резонансная частота - 140-390 кГц, жесткость - 11.8 Н/м, радиус кривизны наконечника - 10 нм). Размеры области, с которой получали изображение, составляли 20x20 мкм (разрешение 256x256 точек). Частота развертки -0.5 - 1 Гц. Повторное сканирование осуществляли с области размером 1x1 мкм (разрешение 256x256 точек) с частотой развертки 0.5-1 Гц. Обработка изображений была проведена с помощью программ Nova и Image Analysis 3.5 (НТ-МДТ, Россия).

Исследования методом спектроскопии комбинационного рассеяния (KP) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) проводили при помощи микроскопа InVia Reflex (Renishaw, Англия) в конфокальном режиме с использованием зеленого лазера (Ar, длина волны - 514 нм) и красного лазера (Не / Ne, длина волны - 633 нм). Для получения спектров резонансного ГКР эритроцитов использовали зеленый лазер с длиной волны 532 нм. Спектры регистрировали с использованием объектива х5 (Leica, Германия). Время накопления - 20-120 с. Юстировку прибора проводили с использованием монокрйсталлических пластин кремния в качестве стандарта.

Для проведения ГКР-экспериментов на серебряных подложках образцы крови разбавляли в 3000-5000 раз буфером Алена. 500 мкл разбавленной суспензии эритроцитов наносили на подложки и регистрировали ГКР-спектры с различных участков подложки. KP-спектры эритроцитов регистрировали с капли крови объемом 500 мкл, помещенной на предметное стекло. Для получения ГКР-спектра поврежденных эритроцитов образец крови, разбавленный в 3000 раз, облучали лазером (\ = 514нм) с 20-ти кратной интенсивностью. Регистрацию ГКР-спектров 10"10 М родамина 123 на подложках проводили аналогичным образом.

ГКР-картирование эритроцитов на подложках с кольцевыми наноструктурами серебра осуществляли в режиме сканирования с использованием микроскопа InVia Reflex

Renishaw, Англия) (лазер Л = 532 нм, объектив х50). Размер изображений - 45 вертикальных линий, состоящих из 35 точек с диаметром 1.3 мкм каждая. Мощность

78 лазера на линию - 0.3 мВт, следовательно, в каждой точке ~ 0.01 мВт. Время накопления ГКР-сигнала в каждой линии - 20 с. Вычитание базовой линии проведено с использованием программных инструментов Renishaw.

Эксперименты по исследованию состояния гемоглобина методами КР и ГКР в присутствии НЧС проводили на спектрометре, включающем лазер с длиной волны 473 нм (Ciel, Eurolase), систему регистрации спектров MORS 1/3648 (Троицк), камеру CCD TCD1304DG (Toshiba) и щелевой фильтр LP02473RS50 (Shemrock) [157]. Для регистрации ГКР-спектров изолированного гемоглобина полученный описанным выше способом супернатант разбавляли еще в 104 раз фосфатным буфером. Оптимальное экспериментально подобранное объемное соотношение между НЧС и разбавленным изолированным гемоглобином, при котором достигался максимальный коэффициент усиления (КУ) сигнала ГКР, составляло 3:2 (в случае НЧС, полученных по методу Леопольда и Лендла) и 3:7 (для НЧС, полученных методами «зеленой химии»), соответственно.

Для корректного расчета КУ сигнала КР проводили вычитание базовой линии с использованием программы RamanCooker, разработанной на кафедре биофизики биологического факультета МГУ [157]. Коэффициент усиления определяли по формуле (4), приведенной в разделе 1.1.2.

Моделирование спектров экстинкции НЧС методом дискретно-дипольного приближения (ДДП) осуществляли с использованием ПО DDSCAT7.1, написанного Дрейном и Флато [28] (Приложение 3). Спектры получены для частиц различной морфологии и размеров, находящихся в водной среде. Количество диполей составляло 6-104 - 9-104.

Цитотоксичность подложек по отношению к эритроцитам анализировали путем прямого наблюдения их поведения на подложках в прозрачных герметичных ячейках с помощью оптической микроскопии при увеличениях 200-500 раз (металлографический микроскоп с прямым расположением столика Eclipse 600pol, Nikon, Япония). Время наблюдения составляло 20-60 мин, а количество анализируемых клеток - 100-200 штук.

3. Обсуждение результатов

В настоящее время одним из самых обсуждаемых и критически важных вопросов является механизм усиления сигнала КР в присутствии НЧ металлов, обладающих ллазмонным резонансом. Как отмечалось выше, такие частицы необходимы для возникновения и практического использования самого эффекта ГКР. Несмотря на большое количество литературных источников, для ответа на вопрос о возможных механизмах усиления требуется большая поисковая работа, направленная на создание новых ГКР-активных материалов, а также изучение причин отсутствия такой активности (или пониженной активности) у уже созданных материалов. Существует множество факторов, которые могут оказывать влиять на применимость получаемых наноматериалов для ГКР. К ним, в частности, относятся:

1) размер НЧ;

2) форма НЧ;

3) состояние их поверхности;

4) формирование агрегатов НЧ в растворе;

5) взаимодействие НЧ и отдельных элементов наноструктуры на различных подложках (проводящих и непроводящих, с упорядоченной или разупорядоченной структурой и т.п.);

6) электролитный состав раствора, который контактирует с плазмонными НЧ;

7) диэлектрические свойства среды, контактирующей с плазмонной наноструктурой;

8) длина волны возбуждающего излучения и т.д.

Практически все они должны учитываться при разработке новых ГКР-активных материалов и методик их использования (рис. 3.1 и табл. 3.1).

Напомним (см. также раздел 1.1), что эффект ГКР проявляется на расстояниях не более 30-40 нм от поверхности НЧ или наноструктур. Кроме того, следует ожидать существенных различий в экспериментальных методиках, а также в возможных механизмах возникновения эффекта ГКР при анализе отдельных молекул и живых клеток. Последнее видится совершенно новой и существенно более сложной задачей, по сравнению с распространенными методиками обнаружения отдельных молекул, поскольку к вышеприведенному списку добавляется ряд дополнительных важных критериев, определяющих биосовместимость наноматериала и возможность использования выбранного типа лазерного или другого излучения. В частности, среди таких критериев можно выделить:

1) отсутствие у наноматериала выраженного токсического эффекта на биологические объекты;

2) отсутствие изменения свойств самих НЧ при контакте с биологическим материалом и средой, в которой этот материал находится;

3) возможность иммобилизации клеток на поверхности наноматериала или возможность обеспечения близкого контакта между НЧ и клетками;

4) перекрывание диапазонов полосы ППР НЧ, положения максимума поглощения биологического объекта и длины волны лазерного излучения.

Последнее важно не только с точки зрения интенсивности аналитического сигнала и коэффициента его усиления, но также для повышения селективности методики и учета возможного повреждающего эффекта лазерного излучения на живую клетку. Только те решения многопараметрической задачи анализа биологических объектов методом ГКР, которые удовлетворяют необходимому сочетанию данных критериев, могут обеспечить неинвазивность и рекордно высокую чувствительность анализа. Это определяет возможность получения достоверного оптического спектра интактных клеточных структур, который, в свою очередь, подобно «отпечаткам пальцев», автоматически обеспечивает селективность метода в отношении специфических молекул, входящих в биологические структуры.

В связи с этим, в рамках настоящей работы образцы НЧС и наноматериалов на основе серебра получали с использованием различных описанных в литературе предыстории (рис. 3.1): 1) стандартной («химической»), т.е. с применением неорганических восстановителей (метод Леопольда и Лендла), 2) с использованием подходов «зеленой химии», 3) в рамках полиольного метода, 4) цитратным методом, 5) физическими и химическими методами создания композитных частиц. Кроме этого, в данной работе разработан метод, основанный на разложении аммиачного комплекса гидроксида серебра (I) (рис. 3.1). В ходе проведенных экспериментов и оптимизации существующих методик были получены НЧС сферической, пластинчатой, нитевидной морфологий. Основные результаты, полученные в ходе воспроизведения литературных методик, описаны в следующем разделе 3.1, кроме этого, отдельное внимание уделено созданию наноматериалов на основе серебра на примере декорирования микросфер диоксида кремния НЧС с использованием химических и физических подходов.

Схема синтеза

0 игет зелёный»

Рис. 3.1. Основные синтетические приемы, использованные в работе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Семенова, Анна Александровна, 2012 год

1. De М., Ghosh P.S., Rotello V.M. Applications of nanoparticles in biology // Advanced Materials. 2008. Vol. 20(22). P. 4225-4241.

2. Hao R., Xing R., Xu Z., Hou Y., Gao S., Sun S. Synthesis, functionalization, and biomedical applications of multifunctional magnetic nanoparticles // Advanced Materials. 2010. Vol. 22(25). P. 2729-2742.

3. Fortina P., Kricka L.J., Graves D.J., Park J., Hyslop Т., Tarn F., Halas N., Surrey S., Waldman S.A. Applications of nanoparticles to diagnostics and therapeutics in colorectal cancer// Trends in Biotechnology. 2007. Vol. 25(4). P. 145-152.

4. Conde J., Doria G., Baptista P. Noble metal nanoparticles applications in cancer // Journal of Drug Delivery. 2012. Vol. 2012. P. 1-12.

5. Kneipp J., Wittig В., Bohr H., Kneipp К. Surface-enhanced Raman scattering: a new optical probe in molecular biophysics and biomedicine // Theoretical Chemistry Accounts. 2009. Vol. 125(3/6). P. 319-327.

6. Huh Y.S., Chung A.J., Erickson D. Surface enhanced Raman spectroscopy and its application to molecular and cellular analysis // Microfluidics and Nanofluidics. 2009. Vol. 6(3). P. 285-297.

7. Bantz K.C., Meyer A.F., Wittenberg N.J., Im H., Kurtulu§ Ö., Lee S.H., Lindquist N.C., Oh S.-H., Haynes C.L. Recent progress in SERS biosensing // Physical Chemistry Chemical Physics. 2011. Vol. 13(24). P. 11551-11567.

8. Wustholz K.L., Brosseau C.L., Casadio F., Van Duyne R.P. Surface-enhanced Raman spectroscopy of dyes: from single molecules to the artists' canvas // Physical Chemistry Chemical Physics. 2009. Vol. 11(34). P. 7350-7359.

9. Rycenga M., Cobley C.M., Zeng J., Li W., Moran C.H., Zhang Q., Qin D., Xia Y. Controlling the synthesis and assembly of silver nanostructures for plasmonic applications // Chemical Reviews. 2011. Vol. 111(6). P. 3669-3712.

10. Крутяков Ю.А., Кудринский A.A., Оленин А.Ю., Лисичкин Г.В. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы // Успехи химии. 2008. Т. 77. № 3. С. 242-269.12