Генгмная организация и регуляция экспрессии генов теплового шока у организмов с различной термоустойчивостью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Астахова Любовь Николаевна

• Астахова Любовь Николаевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Астахова Любовь Николаевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды

1.2. Классификация и функции БТШ

1.3. Структура и эволюция генов ТШ

1.4. Экспрессия генов ТШ и ее регуляция

1.5. Участие БТШ в адаптации к экстремальным условиям

1.6. БТШ в медицине 42 Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Геномная фаговая библиотека

2.1.2. Насекомые, условия обитания и теплового шока

2.1.3. Штаммы E. coli

2.1.4. Ферменты рестрикции

2.1.5. Зонды

2.1.6. Линии эукариотических клеток, условия культивирования и

ТШ

2.2. Методы:

2.2.1. Скрининг геномной фаговой библиотеки

2.2.2. Выделение ДНК бактериофага X

2.2.3. Расщепление ДНК рестрицирующими эндонуклеазами

2.2.4. Электрофорез ДНК

2.2.5. Построение рестриктных карт рекомбинантных фагов

2.2.6. Включение радиоактивной метки в ДНК

2.2.7. Перенос и гибридизация по Саузерну

2.2.8. ПЦР-анализ

2.2.9. Выделение фрагментов ДНК из геля

2.2.10. Клонирование фрагментов ДНК

2.2.11. Трансформация компетентных клеток

2.2.12. Выделение плазмидной ДНК

2.2.13. Секвенирование ДНК

2.2.14. Анализ последовательностей

2.2.15. Выделение фракции лимфоцитов из крови верблюда

2.2.16. Выделение тотальной РНК

2.2.17.5'- и 3'-RACE анализ и ПЦР с обратной транскрипцией

2.2.18. Электрофорез РНК

2.2.19. Нозерн-гибридизация

2.2.20. Двумерный электрофорез белков по О'Фарреллу

2.2.21. Диск-электрофорез белков с ДДС-Na (по Лэммли) и окрашивание гелей по Кумасси G-250

2.2.22. Идентификация белков методом пептидного фингерпринтинга

2.2.23. Экспрессия и очистка белка GAF

2.2.24. Получение белковых экстрактов

2.2.25. Анализ связывания факторов транскрипции с элементами теплового шока (EMSA)

2.2.26. Получение репортерных конструкций

2.2.27. Трансфекция плазмид и измерение интенсивности люминесценции

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp70A1 у верблюда Camelus dromedarius

3.2. Дифференциальный анализ экспрессии генов hsplA, hspAlB и hspAlL

3.3. Клонирование и анализ структуры кластера генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina

3.4. Сравнение последовательностей генов hsp83 и hsp70 у Stratiomys singularior и Stratiomys japónica

3.5. Анализ экспрессии генов hsp83 у S. singularior и O. pardalina

3.6. Сравнительный анализ структуры промоторных областей

генов группы hspAl верблюда и других видов млекопитающих

3.7. Сравнение активности промоторов hsp70 C. dromedarius и H.

sapiens в культуре клеток HEK293

3.8. Сравнительный анализ структуры промоторных областей

генов hsp70 и hsp83 S. singularior и O. pardalina

3.9. Сравнение активности промоторов hsp70 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider2

3.10. Эффект вставки GAGA-сайтов в промотор гена hsp70S3

3.11. Сравнение активности промоторов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток Schneider2

Глава 4. Обсуждение результатов

Выводы

Список литературы

Приложение

Благодарности

Список сокращений

а.о. аминокислотные остатки

АДФ аденозиндифосфат

АТФ аденозинтрифосфат

БОЕ Бляшкообразующая единица

БТШ (HSP) белки теплового шока (heat shock proteins)

ДДС-Na додецилсульфат натрия

дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат

Д^ дитиотреитол

ИЛ Интерлейкин

кБТШ (HSC) конститутивные белки теплового шока (cognate heat shock proteins)

п.о. (bp) пара оснований (base pair)

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР (PCR) полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

т. п. о. (kb) тысяча пар оснований (kilobase)

Трис (Tris) трис(гидроксиметил)аминометан

ТШ тепловой шок

ФНО Фактор некроза опухоли

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ЭР эндоплазаматический ретикулум

BiP immunoglobulin heavy chain-binding protein

GAF GAGA-фактор

GRP glucose-regulated protein

HR hydrophobic repeats

HSE Heat shock element

HSF Heat Shock Factor

MHC major histocompatibility complex

ORF Open reading frame

RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction

TEMED N,N,N' ,N' -тетраметилэтилендиамид

UTR untranslated region (нетранслируемая область)

Введение

Белки теплового шока (БТШ или Hsp - Heat shock proteins) являются одним из основных факторов, обеспечивающих адаптацию организмов к неблагоприятным условиям среды обитания. Эти белки обеспечивают фолдинг новосинтезированных полипептидов, транспорт белков через мембраны, а также участвуют в регуляции сигнальных путей, контролируя активность многих протеинкиназ и факторов транскрипции. Защитная функция БТШ в условиях стресса основана на их способности восстанавливать структуру денатурированных белков и препятствовать образованию белковых агрегатов. БТШ делятся на группы в соответствии с их молекулярными массами. Гены, кодирующие БТШ, были названы генами теплового шока (далее "гены ТШ"). Условно выделяют две группы этих генов: индуцируемые и конститутивные. В нормальных условиях экспрессия индуцируемых генов находится, как правило, на низком уровне, а при стрессе возрастает многократно (в десятки и сотни раз). Конститутивные гены по структуре гомологичны индуцируемым на 50 -75%, они стабильно транскрибируются в нормальных условиях, а при стрессе уровень их экспрессии увеличивается незначительно.

Индуцируемый характер экспрессии генов ТШ у всех исследованных в этом плане эукариот определяется наличием в составе регуляторной области выше ТАТА-бокса консервативных последовательностей, названных HSE (heat shock elements) (Tian, 2010). С этими последовательностями связывается транскрипционный фактор HSF (Heat Shock Factor), активирующийся при различных видах стресса (Morimoto, 1998). Таким образом считается, что в плане структуры генов и регуляции экспрессии система ответа на тепловой шок характеризуется значительной эволюционной консервативностью. При этом основные работы, позволяющие сделать такой вывод, проводились на небольшом количестве модельных лабораторных видов. На природных популяциях, обитающих в условиях, контрастных по температурному режиму, данный вопрос изучен недостаточно. У млекопитающих особый интерес в плане структуры и регуляции экспрессии представляет кластер генов hsp70 (группа hspAl), находящийся в локусе главного комплекса гистосовместимости (MHC - major histocompatibility complex) и состоящий из трех генов: двух индуцируемых и одного с конститутивным характером экспрессии. Представляло интерес провести сравнение структуры и уровня активности промоторов кластера генов hspAl у видов

млекопитающих, живущих в разных климатических зонах и в разной степени

и и т-\

подверженных стрессовым воздействиям окружающей среды. В качестве вида, наиболее устойчивого к неблагоприятным климатическим условиям, был выбран верблюд Сате1ш dromedarius (дромадер). Отличия в структуре и уровне экспрессии генов Ъ&р70 верблюда и других млекопитающих могут иметь важное адаптивное значение.

Значительный интерес представляет сравнение структуры и характера экспрессии генов ТШ у насекомых, обитающих в неблагоприятных условиях окружающей среды. К настоящему моменту достаточно полно изучен ответ на ТШ у видов семейства иго&орЫ\а. Данных по адаптации диких популяций видов двукрылых, обитающих в контрастных условиях окружающей среды, гораздо меньше. Объектами нашего исследования стали два вида семейства 81га1юту1дае, ^1гайоту8 singularior и Охусега раЫаНпа. Личинки Б. singularior разиваются в прибрежной зоне гиперсалинных озер Крыма, температура которых летом может достигать 40оС. Средой обитания личинок О. раЫаИпа являются холодные родниковые воды (4 - 5оС). Сопоставление данных, полученных на этих видах, может дать информацию об эволюционных изменениях структуры и регуляции экспрессии генов ТШ в ходе адаптации организмов к неблагоприятным условиям среды обитания.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генгмная организация и регуляция экспрессии генов теплового шока у организмов с различной термоустойчивостью»

Цель работы

Определение закономерностей в эволюционных изменениях структуры и геномной организации генов, относящихся к группам Ъ&р70 и Ъ&р83, у организмов с различным уровнем термальной адаптации. Сравнительный анализ структуры промоторов и поиск регуляторных последовательностей и транскрипционных факторов, отвечающих за различия в регуляции экспрессии генов Ъ&р70 и Ъ&р83 у организмов, относящихся к разным филогенетическим группам и обитающих в контрастных климатических условиях.

Задачи исследования

1. Исследовать структуру кластера MHC-ассоциированных генов hsp70 верблюда C. dromedarius. Провести сравнительный анализ структуры и геномной организации генов hsp70 C. dromedarius и других видов млекопитающих.

2. Клонировать и секвенировать гены hsp83 и описать их геномную организацию у двух контрастных в отношении условий обитания видов двукрылых -S. singularior и O. pardalina. Сравнить структуру генов hsp83 S. singularior, O. pardalina и других видов двукрылых.

3. Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsp70 верблюда C. dromedarius и других видов млекопитающих. Сравнить активность промоторов генов группы hspAl C. dromedarius и H. sapiens в культуре клеток HEK293.

4. Проанализировать структуру, характер взаимодействия с транскрипционными факторами и уровень транскрипционной активности регуляторных областей генов hsp70 S. singularior и D. melanogaster.

5. Провести сравнительный анализ структуры регуляторных областей генов hsp83 S. singularior, O. pardalina и других видов двукрылых. Сравнить активность промоторов генов hsp83 S. singularior и D. melanogaster в культуре клеток D. melanogaster Schneider 2.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Основные аспекты адаптации организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды

Адаптация организмов к неблагоприятным условиям окружающей среды происходит на разных уровнях. На организменном проявляется за счет поведенческих реакций, морфологических и физиологических изменений. На молекулярном и клеточном уровнях одним из наиболее изученных механизмов адаптации стала система генов теплового шока. Эта система активизируется при повышении температуры на 5 - 15°С выше физиологической нормы (тепловой шок, ТШ) (Heat Shock: from Bacteria to Man, 1982). Продукты экспрессии этих генов - белки теплового шока (сокращённо БТШ или HSP - heat shock proteins) - при воздействии различных стрессовых факторов выполняют в клетке защитные функции, препятствуя денатурации и агрегации белков. Синтез БТШ был показан для разных классов организмов: дрожжей, моллюсков, насекомых, рыб, амфибий, пресмыкающихся и др. (Feder, 1999).

Известно, что при тепловом шоке и многих других видах стресса (гипоксии, воздействии на клетку тяжелых металлов и др.) клеточные белки подвергаются денатурации. При этом гидрофобные области белковых молекул, в норме обращённые внутрь их структуры, экспонируются в водную среду цитоплазмы. Белки «слипаются» друг с другом гидрофобными участками, образуя нерастворимые агрегаты. Это приводит к нарушению функций большинства клеточных систем и гибели клетки. Было показано, что некоторые БТШ неспецифически взаимодействуют с гидрофобными участками денатурированных белков, способствуя восстановлению их нормальной вторичной и третичной структуры. Благодаря способности связываться с гидрофобными участками денатурированных и вновь синтезируемых белков БТШ (и в первую очередь БТШ70) получили название «молекулярные шапероны» (от французского «chaperone» - компаньонка, дуэнья) (Lindquist, 1986).

Так же при стрессе происходит фрагментация комплекса Гольджи и эндоплазматического ретикулума (ЭР), уменьшение числа митохондрий и лизосом (Welch, 1985), нарушение белок-липидного соотношения из-за повреждения мембранных структур (Vigh, 2007), падение уровня АТФ (Patriarca,1990). В

цитоскелете наблюдается агрегация формирующих филаменты белков. Это приводит к делокализации органелл и нарушению внутриклеточного транспорта (Toivola, 2010; Richter, 2010) (рис 1). При значительных повреждениях наблюдается остановка клеточного цикла (Lindquist, 1980) и даже гибель клетки по пути апоптоза или некроза.

Рис 1. Влияние теплового шока на эукариотическую клетку. Нормальная эукариотическая клетка (слева) в сравнении с клеткой, подвергнутой тепловому шоку (справа).

При тепловом шоке и некоторых других видах стресса одновременно с активацией генов ТШ в клетках происходит репрессия практически всех остальных генов (Лозовская, 1984). Однако не происходит репрессия рибосомных и гистоновых генов (хотя сплайсинг их РНК подавляется при ТШ). С той же интенсивностью, что и до начала воздействия, продолжается транскрипция тРНК и РНК, кодируемых митохондриальным геномом (Rubin, 1975).

При тепловом шоке подавляется сборка малых ядерных рибонуклеопротеидов (sn-RNP) и, следовательно, сплайсинг пре-мРНК. Это не сказывается на экспрессии генов ТШ, т.к. большинство из них не содержит интронов, и их транскрипты не подвергаются сплайсингу (Southgate, 1985). БТШ после ТШ поступают в ядро клетки и частично связываются с хроматином, особенно с областью ядрышкового организатора, предохраняя его от повреждений (Velazquez, 1984).

При ТШ блокируется трансляция клеточных матриц за счёт изменений в аппарате инициации трансляции: происходит активация протеинкиназы R (PKR, double stranded RNA-activated protein kinase) и протеинкиназы HRI (heme regulated

inhibitor of translation). Они фосфорилируют а-субъединицу эукариотического фактора инициации трансляции eIF2 (Sheikh, 1999). После фосфорилирования eIF2a оказывается неспособной к обмену ГДФ на ГТФ с участием фактора eIF2B, образуя с ним прочный комплекс. Уровень фосфорилирования eIF2a во время ТШ повышается в 2 - 3 раза (Menon, 1995). Также проиходит дефосфорилирование eIF4E-связывающих белков, которые блокируют взаимодействие кэп-узнающего фактора eIF4E с eIF4G (но не с кэпом) (Vries, 1997).

Через 5 - 10 минут после повышения температуры разрушаются присутствующие в цитоплазме старые полисомы, а на поступивших из ядра мРНК ТШ формируются новые. Некоторые дошоковые полисомы сохраняются в цитоплазме, однако трансляция на них блокируется. При снижении температуры до физиологической нормы на них возобновляется синтез нормальных белков (Kruger, 1981). Избирательность трансляции при тепловом шоке обусловливается изменениями в белковом аппарате трансляции и структурой 5'-нетранслируемого лидера мРНК генов ТШ.

Давно известно, что БТШ позволяют клеткам адаптироваться к действию высокой температуры (до определённого предела), а также других повреждающих факторов. Было показано, что предварительный умеренный ТШ позволяет клеткам в дальнейшем переносить более жёсткое тепловое воздействие, без предварительного шока являющееся летальным. Этот феномен получил название индуцируемой термоустойчивости (Patriarca, 1990). Ряд экспериментальных данных свидетельствует в пользу того, что индуцируемая термотолерантность развивается за счёт накопления БТШ (Ульмасов, 1993; Bettencourt, 2008).

1.2. Классификация и функции БТШ

Общепринятой является классификация БТШ по их молекулярной массе. Это обосновано тем, что электрофоретические фракции БТШ разных организмов приблизительно соответствуют друг другу по молекулярной массе. Каждое семейство БТШ является продуктом группы родственных генов, поэтому степень гомологии между отдельными представителями семейства часто весьма высока. Многие члены БТШ консервативны, однако их спектр значительно варьирует в зависимости от вида организма и от действующего фактора (Маргулис, 2000). На данный момент

выделяют следующие семейства БТШ: низкомолекулярные БТШ (нмБТШ), семейство БТШ40, БТШ60, БТШ70 - самое многочисленное семейство, БТШ90, БТШ100 (Lindquist, 1986).

Низкомолекулярные БТШ (нмБТШ)

К нмБТШ относят БТШ с молекулярной массой от 12 до 43 кДа, а-А- и а-В-кристаллины. Гомология между белками этой группы составляет около 40%. Они имеют консервативный а-кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 а.о. в С-концевой области, образующих 9 ß-складчатых структур (Hu, 2007). На N-конце многих нмБТШ найден консервативный SRLFDQFFG-регион, играющий большую роль в стабильности структуры а- и ß-кристаллинов (Pasta, 2003).

Взаимодействуя своими ß-складчатыми структурами, нмБТШ способны образовывать с соседними мономерами гомо- и гетероолигомерные комплексы с молекулярными массами 200-400 кДа, обладающие шаперонной активностью (Ganea, 2001). При повышении температуры эти комплексы диссоциируют и в виде димеров нмБТШ взаимодействуют с денатурированными белками, образуя массивные гранулы. При этом они экранируют гидрофобные участки денатурированных белков, препятствуя их от агрегации, и передают их БТШ70 (Гусев, 2002).

Основной функцией нмБТШ считается стабилизация поврежденного стрессом актинового цитоскелета фосфорилированной формой белка БТШ27 (Гусев, 2002). Благодаря своей способности образовывать массивные мультимерные структуры а-кристаллины формируют основу хрусталика глаза (Horwitz, 1976). Для нмБТШ характерен высокий уровень экспрессии на определенных стадиях развития и в определенных тканях (Гусев, 2002).

Конститутивно повышенный уровень синтеза нмБТШ защищает клетки от TNFа-индуцированного апоптоза и окислительного стресса. Кроме того, нмБТШ способны блокировать апоптоз, индуцированный другими путями, как, например, активацией рецепторов клеточной поверхности FAS/APO-1, являющихся медиаторами апоптоза, так и ингибитором протеинкиназы С - стауроспорином (Mehlen, 1996).

Считается, что основная защитная роль принадлежит БТШ22, БТШ23, БТШ26 и БТШ27. Эти белки локализованы внутри клетки следующим образом: БТШ22 - в митохондриях, БТШ23 и БТШ26 - в цитозоле, БТШ27 - в ядрах (Маргулис, 2000).

Семейство БТШ40

БТШ40 относят к семейству так называемых J - белков, благодаря гомологии с белком E. coli DnaJ (Kelley, 1998). Характерной особенностью этой группы является наличие N-концевого J-домена, построенного из четырех а-спиралей и содержащего консервативный трипептид HPD (Frydman, 2001). С-концевым шаперонным доменом БТШ40 могут связываться с денатурированными белками, предотвращая их агрегацию (Kampinga, 2010; Mayer, 2010). Кроме того, эти белки являются кошаперонами БТШ70, связываясь с ними посредством N-концевого J-домена. БТШ40 стимулирует АТФазную активность БТШ70 и стабилизирует его комплекс с субстратом (Chun-Yang, 2003). Различные представители семейства J-белков функционируют в цитозоле, эндоплазматической сети и митохондриях, выступая кофакторами для цитозольных БТШ70 и HSC70, эндоплазматического HSPA5/BiP и митохондриального HSPA9/GRP75 (Christis, 2008).

У человека семейство БТШ40 представлено 44 белками (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/). У D. melanogaster на сегодня обнаруживаются 5 белков, имеющих в своем составе J-домен, по мере дальнейшего анализа информации, имеющейся в геномных базах данных, это число может увеличиться.

Семейство БТШ60

Это семейство стрессовых белков выделяют в отдельную группу шаперонинов. Шаперонины в отличие от шаперонов формируют сложные структуры в виде стопки из двух колец, каждое из которых состоит из семи мономеров массой 60кДа (Horwich, 2006). В центре кольца между мономерами имеется внутренняя пора, в которой происходит фолдинг белков. В аминокислотной последовательности каждого из мономеров присутствует несколько остатков гидрофобных аминокислот, обращённых внутрь поры. С этими гидрофобными остатками взаимодействуют белки-субстраты, фолдинг которых требует гидролиза АТФ.

Шаперонины делятся на две группы. К первой относятся белки-гомологи бактериальных БТШ60 и БТШ10, обозначающихся как GroEL и GroES соответственно. GroES выступает в роли кофактора для GroEL. У человека охарактеризованы два белка (гомолог GroEL и HSPE - гомолог GroES), кодируемых единичными генми HSPD, которые функционируют в митохондриях. Белки,

относящиеся ко второй группе, обозначаются как CCT или TRiC, функционируют в цитозоле эукариот (а также у архей) и формируют олигомеры из 8-и субъединиц, каждая из которых кодируется собственным геном. Они имеют 30% гомологию друг с другом и 15 - 20% гомологию с GroEL, что говорит об их общем эволюционном происхождении (Brackley, 2009).

Тогда как система GroEL-GroES работает у бактерий и в митохондриях, CCT обнаружен у архей и в цитозоле эукариот. У последних он участвует в фолдинге основных компонентов цитоскелета, актина и тубулина, а также некоторых белков, участвующих в регуляции клеточного цикла (Brackley, 2009). Для взаимодействия белков-субстратов с ССТ необходимо их предварительное взаимодействие с белком-переносчиком, получившим название префолдин, который маркирует субстраты ССТ (Vainberg, 1998). В отличие от GroEL, CCT не имеет кофакторов, подобных GroES. Закрытие центральной полости, формируемой октамером CCT, происходит за счет изменения конформации апикальных частей субъединиц самого CCT (Mayer, 2010).

Семейство БТШ70

Это семейство является главным элементом защитного аппарата клетки. Молекула БТШ70 состоит из N-концевого консервативного домена молекулярной массой 44кДа, обладающего АТФ-связывающей и (в присутствии БТШ40) АТФ-азной активностью (Flaherty, 1990). C-концевой вариабельный домен является субстрат-связывающим участком и имеет молекулярную массу 18 кДа (Frydman, 2001). Этот домен состоит из двух а-спиралей, узнающих гидрофобные области денатурированных белков. Субстрат-связывающий участок БТШ70 по структуре очень напоминает пептид-связывающий домен молекул MHC, в особенности MHC II, но характеризуется более «открытой» структурой, что позволяет ему взаимодействовать с более длинными полипептидами (Flajnik, 1991). Было высказано предположение, что гены MHC дивергировали из генов БТШ70 на ранних этапах эволюции позвоночных. N- и C-домены разделены короткой последовательностью, в которой расположен сайт узнавания белка протеолитическими ферментами (Маргулис, 2000).

Семейство БТШ70 включает в себя множество членов, выполняющих различную роль в отдельных клеточных компартментах. В клетке млекопитающих в цитозоле обнаружены белки БТШ68, БТШ72, БТШ73, а также конститутивный

БТШ70 (HSC70) (Morimoto, 1990); в митохондриях постоянно присутствует гомолог БТШ70 - Grp75 (glucose-regulated protein 75); в ЭР - Grp78, или BiP (белок, связывающий тяжелые цепи иммуноглобулинов, Immunoglobulin heavy chain binding protein); а в лизосомах - конститутивный Hsc73 (Terlecky, 1992). В бактериях имеется всего один ген семейства БТШ70, кодирующий белок массой 69,1 кДа - DnaK (Ульмасов, 1993).

Впервые подробно изучено было взаимодействие шаперонов семейства БТШ70 с субстратом на DnaK. Пептид-связывающий сайт содержит впадину, в которой и происходит связывание полипептида в неправильной конформации. БТШ70 узнает линейные полипептидные последовательности, богатые гидрофобными аминокислотами, которые в норме должны находиться внутри белковой глобулы (Frydman, 2001).

Весь процесс носит циклический характер. DnaK, находясь в АТФ-связанной форме, взаимодействует с белком-субстратом. Потом с DnaK связывается белок DnaJ, стимулирующий гидролиз АТФ и стабилизирующий комплекс DnaK-субстрат. Сродство DnaK к продукту реакции - АДФ - выше, чем к АТФ, поэтому для диссоциации АДФ требуется фактор обмена нуклеотидов. У E. coli им является белок, называемый GrpE. После диссоциации комплекса DnaK-АДФ происходит высвобождение субстрата и присоединение новой молекулы АТФ. Как правило, фолдинг белков с участием DnaK и БТШ70 требует нескольких циклов присоединения - диссоциации с гидролизом АТФ. Некоторые белки приобретают с участием DnaK или БТШ70 только промежуточную конформацию и для формирования конечной структуры они должны провзаимодействовать с другими БТШ (Houry, 2001).

В эукариотических клетках цикл реакций БТШ70 имеет некоторые специфические особенности. При гидролизе АТФ присутствует J-белок, а диссоциация АДФ стимулируется белками Hip (HSP70-interacting protein) и р60 или Hop (HSC70/HSP90-organising protein). Связывание БТШ70 с АТФ и субстратом стимулируется белком Hap (HSP70- and HSC70-associating protein) (Gebauer, 1998).

В нормальных условиях БТШ70 выполняют и другие важные функции. Они необходимы для фолдинга вновь синтезируемых белков при отделении их от рибосомы (Nelson, 1992). Практически все клеточные белки хотя бы временно

взаимодействуют с БТШ70. Шапероны необходимы для транспорта белков в эндоплазматический ретикулум и митохондрии. В цитозоле белки связаны с HSPA1L и HSPA2, и при транспортировке клеточных белков через мембрану митохондрий они освобождаются от БТШ, причём этот процесс требует гидролиза АТФ. БТШ72/73 поддерживают полипептидную цепь в развёрнутом состоянии, препятствуя образованию третичной структуры, что необходимо для её прохождения через трансмембранную пору. После прохождения через мембрану и отщепления N-концевой сигнальной последовательности полипептидная цепь связывается с БТШ70 матрикса (HSPA9 или GRP75 в комплексе с митохондриальными БТШ40), от которого затем также освобождается с гидролизом АТФ и связывается с БТШ60, обусловлавливающим правильный фолдинг и/или олигомеризацию транспортируемых белков (Neupert, 1990).

В некоторых случаях денатурированный белок в комплексе с БТШ70 вместо восстановления нативной конформации подвергается деградации в протеасомах, что происходит не только при ТШ, но также и в нормальных условиях. Показано участие HSC70 в убиквитин-зависимой деградации многих клеточных белков: актина, а-кристаллинов, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и гистона 2А (Bercovich, 1997).

У человека БТШ70, обозначаемые как HSPA кодируются 13 генами. Наиболее выраженная индукция при действии ТШ была показана для белков HSPA1A, HSPA1B и HSPA6, они локализуются в цитозоле и при ТШ транспортируются в ядро. HSPA1L и HSPA2 являются тканеспецифичными белками, синтезирующимися на высоком уровне в семенниках и некоторых других тканях. HSPA5 (ранее обозначался как GRP78 или BiP) локализуется в эндоплазматической сети и необходим для фолдинга белков, поступающих в эндоплазматическую сеть, в т.ч. иммуноглобулинов. Совсем недавно был обнаружен белок, кодируемый геном HSPA 7 (считавшимся псевдогеном) и обладающий высокой гомологией с белком HSPA6 (Kampinga, 2009). HSPA8, ранее обозначавшийся как HSC70 или HSP73, является основным "house-keeping" белком семейства БТШ70, локализуется в цитозоле и задействован в котрансляционном фолдинге белков и их транспорте через внутриклеточные мембраны. HSPA9 представляет митохондриальный белок (ранее обозначался как морталин/mtHSP70/GRP75). HSPA13 или Stch локализуется в микросомах. HSP12A,

HSP12B и HSP14 - эволюционно более отдаленные представители семейства БТШ70, о функциях которых на сегодня нет достоверной информации (Kampinga, 2009).

Семейство БТШ90

Семейство БТШ90 - это конститутивно синтезируемые белки, достаточно хорошо представленные в пуле клеточных белков. В нормальных условиях количество БТШ90 составляет до 1% от суммы всего цитозольного белка, однако незначительная их часть присутствует и в ядре (Козеко, 2010). При ТШ и других стрессовых воздействиях его синтез возрастает (Welch, 1982; Picard, 2002). БТШ90 находится в димерной форме. Каждый мономер состоит из трех доменов: N-терминального домена (Freeman, 2002), который осуществляет связывание нуклеотидов, среднего домена, необходимого для гидролиза АТФ и С-терминального домена, необходимого для димеризации (Harris, 2004).

Показано, что в каждом из доменов имеются гидрофобные элементы, участвующие в формировании центральной борозды и необходимые для узнавания белка-партнера (Shiau, 2006). По своей структуре БТШ90 близок к ДНК-гиразам бактерий, что говорит об их общем происхождении, и вместе с ними, а также некоторыми рибосомальными белками относится к так называемому классу GHKL-белков (Chen, 2006).

БТШ90 не связывается с вновь синтезируемыми белками. Он не участвует в процессе рефолдинга денатурированных белков. Но он предотвращает неправильное сворачивание денатурированных белков и передает эти белки для восстановления нативной структуры шаперонному комплексу БТШ70 (Nollen, 2002). БТШ90 играет центральную роль в свертывании, активации и транспорте широкого круга важных белков (Picard, 2002). Белков-субстраты БТШ90 нестабильны и могут находиться в разных конформациях. Взаимодействие белков-партнеров с БТШ90 предотвращает их деградацию и изменяет конформацию для взаимодействия с другими белками. Для связывания и высвобождения белков из комплекса с БТШ90 необходимы кошапероны Hop и р23, а также АТФ (Obermann, 1998; Pearl, 2006; Li, 2011; Taipale, 2010).

БТШ90 принимают участие в регуляции ответа на ТШ, образуя комплекс с HSF, а также сигнальных путей клетки и клеточного цикла. Они являются необходимым регулятором активности сигнальных протеинкиназ, NO-синтетаз,

теломераз, аминоацил-тРНК-синтетаз, рецепторов стероидных гормонов, транскрипционных факторов и противоопухолевого белка р53 (Abravaya, 1992; Xu, 1993; Whitesell, 1998; Kosano, 1998; Sato, 2000). Изучение взаимодействия между шаперонами и ядерными рецепторами было проведено в биохимических экспериментах на глюкокортикоидных и прогестероновых рецепторах. Сначала белки БТШ70 и БТШ40/И4)1 узнают рецепторы прогестерона и с помощью белка Hop переносят на БТШ90, что сопровождается гидролизом АТФ. Конечный комплекс содержит димер БТШ90, р23 и иммунофилины, при этом конформация рецептора становится оптимальной для взаимодействия с лигандом (Nollen, 2002). Подобным образом БТШ90 поддерживает в оптимальной конформации другие белки для приема и передачи сигнала.

При стрессе, повреждающем структуру белков, БТШ90 вовлекается в процесс предотвращения агрегации белков и уходит из взаимодействия с другими белками-партнерами, высвобождая все возможные варианты белков, в том числе и мутантных. Таким образом, увеличивается вероятность каких-либо изменений в ходе развития, и появляется возможность для возникновения и канализации новых сигнальных путей (Rutherford, 1998; Queitsch, 2002; Sangster, 2008). Таким образом, БТШ90 может играть роль в эволюции, сохраняя и накапливая генетические варианты и высвобождая их при стрессе (Cowen, 2005).

Известно, что БТШ90, после начала синтеза и накопления в цитоплазме, в больших количествах транспортируется в ядро, где взаимодействует с гистонами, способствуя их связыванию с ДНК. Он взаимодействует и непосредственно с ДНК, приводя к суперспирализации хроматина и способствуя репрессии генов во время ТШ (БТШ90 имеет на N-терминальном домене АТФ/АДФ-связывающий сайт, гомологичный ДНК-связывающим сайтам ДНК-топоизомераз и ДНК-гираз бактерий) (Prodromou, 1997). Если этого не происходит, то структура хроматина нарушается за счёт агрегации гистонов, а также инактивации ДНК-топоизомераз, поддерживающих пространственную организацию хромосом. Соответственно, не происходит деспирализации ДНК, необходимой для синтеза мРНК после снятия стрессового воздействия.

Семейство БТШ90 человека представлено пятью генами, обозначаемыми как HSPC1 - 5. HSPC1, HSPC2 и HSPC3 кодируют цитозольные белки БТШ90а и

БТШ90ß, HSPC4 (ранее обозначавшийся как GRP94) - эндоплазматический белок, и HSPC5 (TRAP1, HSP90L) - митохондриальный (Kampinga, 2009). В геноме D. melanogaster обнаружен единственный ген для цитозольного белка, продукт которого имеет молекулярную массу 83 кДа и обозначается как БТШ83, а также единичные гены, кодирующие эндоплазматический и митохондриальный белки (Sorger, 1987). У бактерий БТШ90 представлены группой белков, обозначаемых как HtpG (Chen, 2006).

Семейство БТШ100

К нему относят эукариотические БТШ104, БТШ110 и Grp150, а также прокариотические белки Clp. В присутствии АТФ БТШ100/Clp способны образовывать кольцевые гексамеры, а в случае БТШ104 - с наличием внутренней поры, вокруг которой находятся шесть активных центров (Lindquist, 1996). Такие структуры напоминают шаперонины GroEL, однако слишком маленькие размеры поры (2,5 нм против 4,5 нм у GroEL) не позволяют предположить, что они функционируют аналогично, используя захват субстрата внутрь олигомера.

БТШ110, имеющие 30% гомологию и сходную общую структуру с БТШ70. Основное отличие заключается в большей длине С-концевого пептидсвязывающего домена и линкерной области между N-концевым АТФ-связывающим и C-концевым доменами (Lee-Yoon, 1995; Kampinga, 2009). Можно предположить, что БТШ110 и БТШ70 дивергировали на ранних этапах эволюции (Lee-Yoon, 1995).

БТШ100 эукариот играет важную роль в адаптации клетки к экстремальным условиям. Выяснилось, что БТШ100 эукариот необходимы для реактивации аппарата сплайсинга, чувствительного к повышению температуры (Lindquist, 1996; Vogel, 1995). Недавние исследования показали, что БТШ110 выступают как фактор обмена нуклеотидов для БТШ70 (Dragovic, 2006; Raviol, 2006).

Прокариотические белки Clp функционируют как молекулярные шапероны в комплексе с протеазой, подготавливая субстраты к протеолизу путём диссоциации четвертичных и третичных структур по АТФ-зависимому механизму (Vogel, 1995). Другие члены группы БТШ100 (ClpB бактерий, БТШ104 дрожжей) в ассоциации с БТШ70 выполняют функцию по растворению белковых агрегатов (Mayer, 2010; Zolkiewski, 2012).

У Drosophila БТШ100 не обнаружены, поэтому предполагают, что их функции выполняют БТШ83 и БТШ70 (Schirmer, 1996). У человека обнаружены три

цитозольных белка HSPH1 - 3, и один цитоплазматический HSPH4 (GRP170) (Kampinga, 2009).

Следует отметить, что не все белки, индуцирующиеся при стрессе, являются шаперонами. Среди стресс-идуцируемых белков - оксигеназа гема, коллагеназа, ферменты гликолиза, регуляторные белки (например, eIF-2a). Самым примечательным из так называемых «нестандартных» БТШ является убиквитин. При повышении температуры количество мРНК убиквитина возрастает в клетках в 4 - 5 раз, поскольку требуется утилизация большого количества повреждаемых стрессом белков. Промоторная область его генов содержит HSE-последовательность, являющуюся регуляторным цис-элементом генов ТШ (Fornace, 1989).

1.3. Структура и эволюция генов ТШ

Гены ТШ делят на большие группы по характеру экспрессии: индуцибельные и когнатные (или конститутивные, обозначаются как HSC). Гены индуцибельных БТШ в нормальных условиях экспрессируются на очень низком уровне (например, у D. melanogaster мРНК БТШ70 в отсутствие стресса обнаруживается только высокочувствительной RT-PCR), а при ТШ их экспрессия вырастает за несколько минут в несколько сотен раз. Гены, кодирующие когнатные БТШ и имеющие как правило 50 - 75% гомологию с индуцибельными генами, активны также и при нормальных условиях, причём уровень их экспрессии может повышаться и при стрессе (Rubin, 1993). В каждом семействе БТШ как правило имеется несколько индуцибельных и несколько конститутивных членов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Астахова Любовь Николаевна, 2014 год

Список литературы:

Гарбуз Д.Г., Молодцов В.Б., Великодворская В.В., Евгеньев М.Б., Зацепина О.Г. 2002. Эволюция ответа на тепловой шок внутри рода иго8орЫ\а. Генетика. 38 (8): 1097-1109.

Гужова И.В., Ласунская Е.Б., Нильссон К., Дариева З.А., Маргулис Б.А. 2000. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках Ц-937. Цитология. 42 (7): 653 - 657.

Гужова И.В., Новоселов С.С., Маргулис Б.А. 2005. Шаперон ШР70 и перспективы его использования в противоопухолевой терапии. Цитология. 3: 187 -199.

Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. 2002. Структура и свойства малых белков теплового шока и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия.

67 (5): 613-623.

Евгеньев М.Б., Шейнкер В.Ш., Левин А.В. 1987. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. I. Синтез белков теплового шока в клетках культуры различных видов шелкопряда и гусеницах. Молекулярная биология. 21: 484 - 494.

Козеко Л.Е. 2010. Белки теплового шока 90 кДа: разнообразие, структура и функции. Цитология. 52 (11): 893-910.

Лозовская Е.Р., Евгеньев М.Б. 1984. Тепловой шок у дрозофилы и регуляция активности генома. Молекулярная биология. 20: 142-185.

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., «Мир». 480.

Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2000. Белки стресса в эукариотической клетке. Цитология. 42(4): 323-342.

Ульмасов Х.А., Каррыева Б.Ч., Караев К. 1993. Стрессовые белки и адаптация. Ашхабад, «Ылым». 212.

Ульмасов Х.А., Овезмухаммедов А., Караев К.К., Евгеньев М.Б. 1988. Молекулярные механизмы адаптации к гипертермии у высших организмов. III. Индукция белков теплового шока у двух видов лейшманий. Молекулярная биология. 22 (6): 1583 - 1589.

Abravaya K., Myers M.P., Murphy S.P., Morimoto R.I. 1992. The human heat shock protein hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression. Genes Dev. 6 (7): 1153-1164.

Agoff S.N., Hou G., Linzer D.I., Wu B. 1993. Regulation of the Human HSP70 Promoter by p53. Science. 259 (5091): 84 - 87.

Akerfelt M., Trouillet D., Mezger V., Sistonen L. 2007. Heat shock factors at a crossroad between stress and development. Ann N Y Acad Sci. 1113: 15-27.

Ali A., Bharadwaj S., O'Carroll R., Ovsenek N. 1998. Hsp90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenpous oocytes. Mol. Cell. Biol. 18 (9): 4949-4960.

Arthur A.L., Weeks A.R., Sgro C.M. 2008. Investigating latitudinal clines for life history and stress resistance traits in Drosophila simulans from eastern Australia. J Evol Biol. 6: 1470 - 1479.

Atkinson P.W., O'Brochta D.A. 1992. In vivo expression of two highly conserved Drosophila genes in Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina. Insect Biochem Mol Biol. 22: 423-431.

Ayme A., Tissieres A. 1985. Locus 67B of Drosophila melanogaster contains seven, not four, closely related heat shock genes. EMBO J. 4 (11): 2949-2954.

Basu S., Binder R., Suto R., Anderson K., Srivastava P. 2000. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kB pathway. International Immunology. 12 (11): 1539 -1546.

Belikov S.V., Karpov V.L. 1996. Mapping Protein-DNA Interaction with CIS-DDP: Chromatine Structure of Promoter Region of D. melanogaster HSP70 Gene. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (5): 997 - 1002.

Benedict M.Q., Cockburn A.F., Seawright J.A. 1993. The Hsp70 heat-shock gene family of the mosquito Anopheles albimanus. Insect. Mol. Biol. 2 (2): 93-102.

Benedict M.Q., Levine B.J., Ke Z.X., Cockburn A.F., Seawright J.A. 1996. Precise limitation of concerted evolution to ORFs in mosquito Hsp82 genes. Insect. Mol. Biol. 5 (1): 73-79.

Bercovich B., Stancovski I., Mayer A., Blumenfeld N., Laszlo A., Schwartz A. L., Ciechanover A. 1997. Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70. J Biol Chem. 272 (14): 9002 - 9010.

Berger E.M., Marino G., Torrey D. 1985. Expression of Drosophila hsp 70-CAT hybrid gene in Aedes cells induced by heat shock. Somat Cell Mol Genet. 11: 371-377.

Bettencourt B.R., Hogan C.C., Nimali M., Drohan B.W. 2008. Inducible and constitutive heat shock gene expression responds to modification of Hsp70 copy number in Drosophila melanogaster but does not compensate for loss of thermotolerance in Hsp70 null flies. BMC Biol. 6: 5.

Bevilacqua A., Fiorenza M. T., Mangia F. 1997. Developmental Activation of an Episomic HSP70 Gene Promoter in Two-cells Mouse Embryos by Transcription Factor Sp1. Nucleic Acids Res. 25 (7): 1333 - 1338.

Bienz M., Pelham H.R.B. 1982. Expression of a Drosophila heat-shock protein in Xenopus oocytes: conserved and divergent regulatory signals. EMBO J. 1: 1583-1588.

Brackley K.I., Grantham J. 2009. Activities of the chaperonin containing TCP-1 (CCT): implications for cell cycle progression and cytoskeletal organisation. Cell Stress Chaperones. 14(1): 23-31.

Brammer C.A., von Dohlen C.D. 2007. The evolutionary history of Stratiomyidae (Insecta: Diptera): the molecular phylogeny of a diverse family of flies. Mol. Phylogenet. Evol. 43: 660-673.

Buckley B.A., Gracey A.Y., Somero G.N. 2006. The cellular response to heat stress in the goby Gillichthys mirabilis: a cDNA microarray and protein-level analysis. J Exp Biol. 209 (Pt 14): 2660-2677.

Buckley B.A., Hofmann G.E. 2002. Thermal acclimation changes DNA-binding activity of heat shock factor 1 (HSF1) in the goby Gillichthys mirabilis: implications for plasticity in the heat-shock response in natural populations J Exp Biol. (Pt 20): 3231 - 3240.

Buckley B.A., Owen M.E., Hofmann G.E. 2001. Adjusting the thermostat: the threshold induction temperature for the heat-shock response in intertidal mussels (genus Mytilus) changes as a function of thermal history. J Exp Biol. 204 (Pt 20): 3571 - 3579.

Burke J.E. Ish-Horowicz D. 1982. Expression of Drosophila heat-shock genes is regulated in Rat-1 cells. Nucleic Acids Res. 10: 3821-3830.

Chen B., Jia T., Ma R., Zhang B., Kang L. 2011. Evolution of hsp70 gene expression: a role for changes in AT-richness within promoters. PLoS One. 6(5):e20308.

Chen B., Zhong D., Monteiro A. 2006. Comparative genomics and evolution of the HSP90 family of genes across all kingdoms of organisms. BMC Genomics. 7: 156.

Christis C., Lubsen N.H., Braakman I. 2008. Protein folding includes oligomerization - examples from the endoplasmic reticulum and cytosol. FEBS J. 275(19): 4700-4227.

Clos J., Rabindran S., Wisniewski J., Wu C. 1993. Induction temperature of human heat shock factor is reprogrammed in a Drosophila cell environment. Nature. 364 (6434): 252-255.

Cowen L.E., Lindquist S. 2005. Hsp90 potentiates the rapid evolution of new traits: drug resistance in diverse fungi. Science. 309 (5744): 2185-2189.

Dong Y., Miller L.P., Sanders J.G., Somero G.N. 2008. Heat-shock protein 70 (Hsp70) expression in four limpets of the genus Lottia: interspecific variation in constitutive and inducible synthesis correlates with in situ exposure to heat stress. Biol Bull. 2: 173 -181.

Dragon E., Sias S., Kato E., Gabe J. 1978. The genome of Trypanosoma cruzi containes a constitutively expressed, tandemly arranged multicopy gene homologous to a major heat shock protein. Mol. Cell. Biol. 7 (3): 1271-1275.

Dragovic Z., Broadley S.A., Shomura Y., Bracher A., Hartl F.U. 2006. Molecular chaperones of the Hsp110 family act as nucleotide exchange factors of Hsp70s. EMBO J. 25(11): 2519-2528.

Drosopoulou E., Chrysopoulou A., Nikita V., Mavragani-Tsipidou P. 2009. The heat shock 70 genes of the olive pest Bactrocera oleae: genomic organization and molecular characterization of a transcription unit and its proximal promoter region. Genome. 52 (2): 210-214.

Evgenev M.B., Zatsepina O.G., Garbuz D.G., Lerman D.N., Velikodvorskaia V.V., Zelentsova E.S., Feder M.E. 2004. Evolution and arrangement of the hsp70 gene cluster in two closely related species of the virilis group of Drosophila. Chromosoma. 113 (5): 223 -232.

Gallo G. J., Schuetz T. J., Kingston R. E. 1991. Regulation of heat shock factor in Schizosaccharomyces pombe more closely resembles regulation in mammals than in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 11 (1): 281 - 288.

Ganea E. 2001. Chaperone-like activity of alpha-crystallin and other small heat shock proteins. Curr Protein Pept Sci. 2(3): 205-225.

Garbuz D.G., Yushenova I.A., Zatsepina O.G., Przhiboro A.A., Bettencourt B.R., Evgen'ev M.B. 2011. Organization and evolution of hsp70 clusters strikingly differ in two species of Stratiomyidae (Diptera) inhabiting thermally contrasting environments. BMC Evol Biol. 11:74.

Garbuz D.G., Zatsepina O.G., Przhiboro A.A., Yushenova I., Guzhova I.V. Evgen'ev M.B. 2008. Larvae of related Diptera species from thermally contrasting habitats exhibit continuous up-regulation of heat shock proteins and high thermotolerance. Mol Ecol 17: 4763-4777.

Gebauer M., Zeiner M., Gehring U. 1998. Interference between proteins Hap46 and Hop/p60, which bind to different domains of the molecular chaperone hsp70/hsc70. Mol. Cell. Biol. 18 (11): 6238-6244.

Gehring W.J., Wehner R. 1995. Heat shock protein synthesis and thermotolerance in Cataglyphis, an ant from the Sahara desert. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(7): 29942998.

Georgel P.T. 2005. Chromatin potentiation of the hsp70 promoter is linked to GAGA-factor recruitment. Biochem. Cell Biol. 83(4): 555-565.

Glass D.J., Polvere R.I., Van der Ploeg L.H. 1986. Conserved sequences and transcription of the hsp70 gene family in Trypanosoma brucei. Mol. Cell. Biol. 6 (12): 4657-4666.

Glinski W., Gershwin M.E., Steinberg A.D. 1976. Fractionation of cells on a discontinuous Ficoll gradient. Study of subpopulations of human T cells using anti-T-cell antibodies from patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 57: 604-614.

Gray N.K., Wickens M. 1998. Control of translation initiation in animals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14: 399-458.

Gross T.L., Myles K.M., Adelman Z.N. 2009. Identification and characterization of heat shock 70 genes in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 46 (3): 496-504.

Fan C.Y., Lee S., Cyr D.M. 2003. Mechanisms for regulation of hsp70 function by hsp40. Cell stress and Chaperones. 8 (4): 309-316.

Feder M. 1997. Necrotic fruit: a novel model system for thermal ecologists. J. Therm. Biol. 22 (1): 1 - 9.

Feder M.E., Hofmann G.E. 1999. Heat-Shock Proteins, Molecular Chaperones, and the Stress Response, Evolutionary and Ecological Phisiology. Annual Review of Physiology. 61: 243 - 282.

Fernandes M., Xiao H., Lis J.T. 1994. Fine structure analyses of the Drosophila and Saccharomyces heat shock factor-heat shock element interactions. Nucleic Acids Res. 22 (2): 167-173.

Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C., McKay D. B. 1990. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein. Nature. 346 (6285): 623 - 628.

Flajnik M.F., Canel C., Kramer J., Kasahara M. 1991. Which came first, MHC class I or class II? Immunogenetics. 33 (5-6): 295-300.

Fornace A.J. Jr., Alamo I. Jr., Hollander M.C., Lamoreaux E. 1989. Ubiquitin mRNA is a major stress-induced transcript in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 17 (3): 1215-1230.

Freeman B.C., Yamamoto K.R. 2002. Disassembly of transcriptional regulatory complexes by molecular chaperones. Science. 296 (5576): 2232 - 2235.

Frydman J. 2001. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem. 70: 603-649.

Jedlicka P., Mortin M.A., Wu C. 1997. Multiple functions of Drosophila heat shock transcription factor in vivo. EMBO Journal. 16: 2452-2462.

Hansen J.J., Bross P., Westergaard M., Nielsen M.N., Eiberg H., Borglum A.D., Mogensen J., Kristiansen K., Bolund L., Gregersen N. 2003. Genomic structure of the human mitochondrial chaperonin genes: HSP60 and HSP10 are localised head to head on chromosome 2 separated by a bidirectional promoter. Hum. Genet. 112 (1): 71-77.

Harris S.F., Shiau A.K., Agard D.A. 2004. The crystal structure of the carboxy-terminal dimerization domain of htpG, the Escherichia coli Hsp90, reveals a potential substrate binding site. Structure. 12 (6): 1087-97.

He B., Meng Y.H., Mivechi N.F. 1998. Glycogen Synthase Kinase 3ß and Extracellular Signal-Regulated Kinase Inactivate Heat Shock Transcription Factor 1 by Facilitating the Disappiarence of Transcriptionally Active Granules After Heat Shock. Molecular and Cellular Biology. 18 (11): 6624 - 6633.

Heat Shock: from Bacteria to Man. 1982. Editors Schlesinger M.J. et al; New York, Cold Spring Harbor Lab 440.

Heino R., Lumme J. 1989. Inheritance of cold shock tolerance in hybrids of Drosophila virilis and Drosophila lummei. Genetica. 79: 17 - 25.

Heschl M.F., Baillie D.L. 1989. Characterization of the hsp70 multigene family of Caenorhabditis elegans. DNA. 8 (4): 233-243.

Heschl M.F., Baillie D.L. 1990. The HSP70 multigene family of Caenorhabditis elegans. Comp. Biochem. Physiol. B. 96 (4): 633-637.

Hoffmann A.A., Weeks A.R. 2007. Climatic selection on genes and traits after a 100 year-old invasion: a critical look at the temperate-tropical clines in Drosophila melanogaster from eastern Australia. Genetica. 129 (2): 133 - 147.

Holmgren R., Livak K., Morimoto R.I., Frend R., Meselson M. 1979. Studies of cloned sequences from four Drosophila heat shock loci. Cell. 18 (4): 1359-1370.

Hong Y., Rogers R., Matunis M.J., Mayhew C.N., Goodson M.L., Park-Sarge O.K., Sarge K.D. 2001. Regulation of heat shock transcription factor 1 by stress-induced SUMO-1 modification. J. Biol. Chem. 276 (43): 40263 - 40267.

Horwitz J. 1976. Some properties of the low molecular weight alpha-crystallin from normal human lens: comparison with bovine lens. Exp Eye Res. 23(5):471-481.

Horwich A.L., Farr G.W., Fenton W.A. 2006. GroEL-GroES-mediated protein folding. Chem. Rev. 106 (5): 1917-1930.

Houry W. A. 2001. Chaperone-assisted protein folding in the cell cytoplasm. Curr. Protein Pept. Sci. 2 (3): 227 - 244.

http: //www .ncbi. nlm .nih.gov/genome/guide/human/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/

Hu Z., Chen L., Zhang J., Li T., Tang J., Xu N., Wang X. 2007. Structure, function, property, and role in neurologic diseases and other diseases of the sHsp22. J Neurosci Res. 85(10): 2071-2079.

Hunt C., Morimoto R.I. 1985. Conserved features of eukaryotic hsp70 genes revealed by comparison with the nucleotide sequence of human hsp70. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (19): 6455-6459.

Hunt C.R., Gasser D.L., Chaplin D.D., Piers J.C., Kozak C.A. 1993. Chromosomal localization of five murine HSP70 gene family members: Hsp70-1, Hsp70-2, Hsp70-3, Hsp70t and Grp78. Genomics. 16 (1): 193-198.

Inoue H., Nojima H., Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96: 23-28.

Kalosaka K., Chrysanthis G., Rojas-Gill A.P., Theodoraki M., Gourzi P., Kyriakopoulos A., Tatari M., Zacharopoulou A., Mintzas A.C. 2006. Evaluation of the activities of the medfly and Drosophila hsp70 promoters in vivo in germ-line transformed medflies. Insect Mol Biol. 15(3): 373-382.

Kampinga H.H., Craig E.A. 2010. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (8): 579-592.

Kampinga H.H., Hageman J., Vos M.J., Kubota H., Tanguay R.M., Bruford E.A., Cheetham M.E., Chen B., Hightower L.E. 2009. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones. 14(1): 105-111.

Karpov V.L., Preobrazhenskaya O.V., Mirzabekov A.D. 1984. Chromatin structure of hsp70 genes, activated by heat shock: selective removal of histones from the coding region and their absence from the 5' region. Cell. 36 (2): 423-431.

Kelley W. L. 1998. The J-domain family and the recruitment of chaperone power. Trends Biochem. Sci. 23: 222 - 227.

Kosano H., Stensgard B., Charlesworth M.C., McMahon N., Toft D. 1998. The assembly of progesterone receptor-hsp90 complexes using purified proteins. J. Biol. Chem. 273 (49): 32973-32979.

Kostyuchenko M., Savitskaya E., Koryagina E., Melnikova L., Karakozova M., Georgiev P. 2009. Zeste can facilitate long-range enhancer-promoter communication and insulator bypass in Drosophila melanogaster. Chromosoma. 118(5): 665-674.

Kourtidis A., Drosopoulou E., Nikolaidis N., Hatzi V.I., Chintiroglou C.C., Scouras Z.G. 2006. Identification of several cytoplasmic HSP70 genes from the Mediterranean mussel (Mytilus galloprovincialis) and their long-term evolution in Mollusca and Metazoa. J Mol Evol. 62 (4): 446-459.

Krebs R.A., Feder M.E. 1998. Hsp70 and larval thermotolerance in Drosophila melanogaster: how much is enough and when is more too much? J Insect Physiol. 44 (11): 1091 - 1101.

Kruger C., Benecke B.J. 1981. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 23 (2): 595-603.

Latchman D.S. 2001. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res. 51: 637-646.

Lebedeva L.A., Nabirochkina E.N., Kurshakova M.M., Robert F., Krasnov A.N., Evgen'ev M.B., Kadonaga J.T., Georgieva S.G., Tora L. 2005. Occupancy of the Drosophila hsp70 promoter by a subset of basal transcription factors diminishes upon transcriptional activation. PNAS. 102 (50): 18087-18092.

Lee C., Li X., Hechmer A., Eisen M., Biggin M.D., Venters B.J., Jiang C., Li J., Pugh B.F., Gilmour D.S. 2008. NELF and GAGA factor are linked to promoter-proximal pausing at many genes in Drosophila. Mol Cell Biol. 28(10): 3290-3300.

Lee-Yoon D., Easton D., Murawski M., Burd R., Subjeck J.R. 1995. Identification of a Major Subfamily of Large hsp70-like Proteins through the Cloning of the Mammalian 110-kDa Heat Shock Protein. J Biol Chem. 270(26): 15725-15733.

Lepore D.A., Knight K.R., Anderson R.L., Morrison W.A. 2001. Role of priming stresses and Hsp70 in protection from ischemia-reperfusion injury in cardiac and skeletal muscle. Cell Stress Chaperones. 6: 93-96.

Li J., Liang V.C., Sedgwick T., Wong, J. Shi Y.B. 1998. Unique organization and involvement of GAGA factors in transcriptional regulation of the Xenopus stromelysin-3 gene. Nucleic Acids Res. 26: 3018-3025.

Li J., Richter K., Buchner J. 2011. Mixed Hsp90-cochaperone complexes are important for the progression of the reaction cycle. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1): 61-66.

Lindquist S. 1980. Translational efficiency of heat-induced messages in Drosophila melanogaster cells. J. Mol. Biol. 137 (2): 151-158.

Lindquist S. 1986. The heat-shock response. Annu. Rev. Biochem. 55: 1151 - 1191.

Lindquist S., Craig E.A. 1988. A heat shock proteins. Ann. Rev. Genet. 22: 631667.

Lindquist S., Kim G. 1996. Heat-shock protein 104 expression is sufficient for thermotolerance in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (11): 5301 - 5306.

Liu D., Brockman J.M., Dass B., Hutchins L.N., Singh P., McCarrey J.R. MacDonald C.C., Graber J.H. 2006. Systematic variation in mRNA 3'-processing signals during mouse spermatogenesis. Nucleic Acids Res. 35: 234-246.

Loones M.T., Rallu M., Mezger V., Morange M. 1997. HSP Gene Expression and HSF2 in Mouse Development. Cell. Mol. Life Science. 53 (2): 179-190.

Marchler G., Wu C. 2001. Modulation of Drosophila heat shock transcription factor activity by the molecular chaperone DROJ1. EMBO J. 20 (3): 499-509.

Mayer MP. 2010. Gymnastics of Molecular Chaperones. Molecular Cell. Molecular Cell Mol Cell. 39(3): 321-331.

McMahon A.P., Novak T.J., Britten R.J., Davidson, E.H. 1984. Inducible expression of a cloned heat shock fusion gene in sea urchin embryos. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 81: 7490-7494.

Mehlen P., Schulze-Osthoff K., Arrigo A.P. 1996. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death. J Biol Chem. 271 (28): 16510-16514.

Menon V., Thomason D.B. 1995. Heat-down Tilt Increases Rat Cardiac Muscle eIF2a Phosphorilation. American Journal of Physiology. 269 (3): 802-804.

Mercier P.A., Winegarden N.A., Westwood J.T. 1999. Human heat shock factor 1 is predominantly a nuclear protein before and after heat stress. J Cell Sci. 112 (Pt 16): 276574.

Milner C.M., Campbell R.D. 1992. Polymorphic analysis of three MHC-linked HSP70 genes. Immunogenetics. 36 (6): 357-362.

Minota S., Cameron B., Welch W. J., Winfield J. B. 1988. Autoantibodies to the constitutive 73-kD member of the hsp70 family of heat shock proteins in systemic lupus erythematosus. J Exp Med. 168: 1475-1480.

Mirault M.-E., Southgate R., Delwart E. 1982. Regulation of heat shock genes: a DNA sequence up-stream of Drosphila hsp70 genes is essential for their induction in monkey cells. EMBO J. 1: 1279-1285.

Morange M. 2006. HSFs in development. Handb Exp Pharmacol. 172: 153-169.

Morgan W.D., Williams G.T., Morimoto R.I., Greene J., Kingston R.E., Tjian R. 1987. Two Transcriptional Activators, CCAAT-Box-Binding Transcription Factor and Heat Shock Factor, Interact with a Human HSP70 Gene Promoter. Molecular and Cellular Biology. 7 (3): 1129 - 1138.

Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C. 1990. The Stress Response, Function of the Proteins, and Perspectives. Stress Proteins in Biology and Medicine. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-32.

Morimoto R.I. 1998. Regulation of heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones and negative regulators. Genes and Development. 12 (24): 3788-3796.

Morita M.T., Tanaka Y., Kodama T.S., Kyogoku Y., Yanagi H., Yura T. 1999. Translational Induction of Heat Shock Transcription Factor a-32: Evidence for a Built-in RNA Thermosensor. Genes Dev. 13(6):655-665.

Morrow G., Heikkila J.J., Tanguay R.M. 2006. Differences in the chaperone-like activities of the four main small heat shock proteins of Drosophila melanogaster. Cell. Stress Chaperones. 11 (1): 51-60.

Muchowski P.J., Schaffar G., Sittler A., Wanker E.E., Hayer-Hartl M.K., Hartl F.U. 2000. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 7841-7846.

Muhich M., Boothroyd J. 1989. Synthesis of Trypanosome hsp70 mRNA is resistant to disruption of trans-splicing by heat shock. J. Biol. Chem. 264 (13): 7107-7110.

Nelson R.J., Ziegelhoffer T., Nicolet C., Werner-Washburne M., Craig E.A. 1992. The Translation Machinery and 70kd Heat Shock Protein Cooperate in Protein Synthesis. Cell. 71 (1): 97-105.

Neupert W., Hartl F.U., Craig E.A., Pfanner N. 1990. How Do Polypeptides Cross the Mitochondrial Membranes? Cell. 63: 447 - 450.

Nikolaidis N., Nei M. 2004. Concerted and nonconcerted evolution of the Hsp70 gene superfamily in two sibling species of nematodes. Mol Biol Evol. 21 (3): 498-505.

Nollen E.A., Morimoto R.I. 2002. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci. 115 (Pt 14): 2809-2816.

Novoselova T.V., Margulis B.A., Novoselov S.S., Sapozhnikov A.M., van der Spuy J., Cheetham M.E., Guzhova I.V. 2005. Treatment with extracellular HSP70/HSC70 protein can reduce polyglutamine toxicity and aggregation. J Neurochem. 94: 597-606.

Obermann W.M., Sondermann H., Russo A.A., Pavletich N.P., Hartl F.U. 1998. In vivo function of Hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J Cell Biol. 143 (4): 901-910.

Omelina E.S., Baricheva E.M., Oshchepkov D.Y., Merkulova T.I. 2011. Analysis and recognition of the GAGA transcription factor binding sites in Drosophila genes. Comput Biol Chem. 35(6): 363-370.

Orosz A., Wisniewski J., Wu C. 1996. Regulation of Drosophila heat shock factor trimerisation: global sequence requirements and independence of nuclear localization. Mol. Cell. Biol. 16 (12): 7018 - 7030.

Ostling P., Björk J.K., Roos-Mattjus P., Mezger V., Sistonen L. 2007. Heat shock factor 2 (HSF2) contributes to inducible expression of hsp genes through interplay with HSF1 J Biol Chem. 282 (10): 7077-7086.

O'Farrell P. H. 1975. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250: 4007-4021.

Panjwani N.N., Popova L., Srivastava P.K. 2002. Heat shock proteins gp96 and hsp70 activate the release of nitric oxide by APCs. J Immunol. 168: 2997-3003.

Papadimitriou E., Kritikou D., Mavroidis M., Zacharopoulou A., Mintzas A.C. 1998. The heat shock 70 gene family in the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Insect Mol Biol. 7 (3): 279-290.

Pasta S.Y., Raman B., Ramakrishna T., Rao Ch.M. 2003. Role of the conserved SRLFDQFFG region of alpha-crystallin, a small heat shock protein. Effect on oligomeric size, subunit exchange, and chaperone-like activity. J Biol Chem. 278(51): 51159-51166.

Patriarca E.J., Maresca B. 1990. Acquired thermotolerance following heat shock protein synthesis prevents impairment of mitochondrial ATPase activity at elevated temperatures in Saccharomyces cerevisiae. Exp. Cell Res. 190: 57-64.

Pearl L.H., Prodromou C. 2006. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annu. Rev. Biochem. 75: 271-294.

Petesch S.J., Lis J.T. 2008. Rapid, transcription-independent loss of nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci. Cell. 134 (1): 74-84.

Picard D. 2002. Heat-shock protein 90, a chaperone for folding and regulation. Cell. Mol. Life Sci. 59 (10): 1640-1648.

Pierce, S. K. 1994. Molecular chaperones in the processing and presentation of antigen to helper T cells. Experientia. 50: 1026-1030.

Place SP., Zippay M.L., Hofmann GE. 2004. Constitutive roles for inducible genes: evidence for the alteration in expression of the inducible hsp70 gene in Antarctic notothenioid fishes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287: 429 - 436.

Podrabsky J.E., Somero G.N. 2007. An inducible 70 kDa-class heat shock protein is constitutively expressed during early development and diapause in the annual killifish Austrofundulus limnaeus. Cell Stress Chaperones. 12 (3): 199 - 204.

Prodromou C., Roe S.M., O'Brien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. 1997. Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone. Cell. 90 (1): 65-75.

Queitsch C., Sangster T.A., Lindquist S. 2002. Hsp90 as a capacitor of phenotypic variation Nature. 417 (6889): 618-624.

Rabindran S.K., Haroun R.I., Clos J., Wisniewski J., Wu C. 1993. Regulation of heat shock factor trimer formation: role of a conserved leucine zipper. Science. 259(5092): 230-234.

Radons J., Multhoff G. 2005. Immunostimulatory functions of membrane-bound and exported heat shock protein 70. Exerc. Immunol. Rev. 11: 17-33.

Raska M., Weigl E. 2005. Heat shock proteins in autoimmune diseases. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky. Olomouc. Czech. Repub. 149: 243-249.

Raviol H., Sadlish H., Rodriguez F., Mayer M.P., Bukau B. 2006. Chaperone network in the yeast cytosol: Hsp110 is revealed as an Hsp70 nucleotide exchange factor. EMBO J. 25(11): 2510-2518.

Richter K., Haslbeck M., Buchner J. 2010. The heat shock response: life on the verge of death. Mol Cell. 40 (2): 253-266.

Rubin G.M., Hogness D.S. 1975. Effect of heat shock on the synthesis of low molecular weight RNAs in drosophilia: accumulation of a novel form of 5S RNA. Cell. 6 (2): 207 - 213.

Rubin D.M., Mehta A.D., Zhu J., Shoham S., Chen X., Wells Q.R., Palter K.B. 1993. Genomic structure and sequence analysis of Drosophila melanogaster HSC70 genes. Gene. 128 (2): 155-163.

Rutherford S.L., Lindquist S. 1998. Hsp90 as a capacitor for morphological evolution. Nature. 396 (6709): 336-342.

Sakurai H., Takemori Y. 2007. Interaction between heat shock transcription factors (HSFs) and divergent binding sequences: binding specificities of yeast HSFs and human HSF1. J Biol Chem. 282 (18): 13334-13341.

Salter-Cid L., Kasahara M., Flajnik M.F. 1994. Hsp70 genes are linked to the Xenopus major histocompatibility complex. Immunogenetics. 39 (1): 1-7.

Sambrook J., Russel D.W. 2001. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Sangster T.A., Salathia N., Undurraga S., Milo R., Schellenberg K., Lindquist S., Queitsch C. 2008. HSP90 affects the expression of genetic variation and developmental stability in quantitative traits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (8): 2963-2968.

Sato S., Fujita N., Tsuruo T. 2000. Modulation of Akt kinase activity by binding to Hsp90. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20): 10832-10837.

Satyal S.H., Chen D., Fox S.G., Kramer J.M., Morimoto R.I. 1998. Negative regulation of the heat shock transcriptional response by HSBP1. Genes Dev. 12(13): 19621974.

Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. 1996. HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci. 21 (8): 289 - 296.

Segal R., Ron E.Z. 1996. Regulation and organization of the groE and dnaK operons in Eubacteria. FEMS Microbiol Lett. 138 (1): 1-10.

Shapira M., Pinelli E. 1989. Heat-shock protein 83 of Leishmania mexicana amazonensis is an abundant cytoplasmic protein with a tandemly repeated genomic arrangement. Eur. J. Biochem. 185 (2): 231-236.

Sheikh M.S., Fornace A.J. Jr. 1999. Regulation of Translation Following Stress. Oncogene 18: 6421 - 6128.

Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J.V., Mann M. 2006. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 1: 28562860.

Shi Y., Kroeger P., Morimoto R. 1995. The Carboxyl-Terminal Transcription Domen of Heat Shock Factor 1 Is Negatively Regulated and Stress Responsive. Molecular and Cellular Biology. 15 (8): 4309-4318.

Shi Y., Mosser D.D., Morimoto R.I. 1998. Molecular Chaperones as HSF1-specific Transcriptional Repressors. Genes and Development. 12 (5): 654-666.

Shiau A.K., Harris S.F., Southworth D.R., Agard D.A. 2006. Structural Analysis of E. coli hsp90 reveals dramatic nucleotide-dependent conformational rearrangements. Cell. 127 (2): 329-340.

Shopland L.S., Hirayoshi K., Fernandes M., Lis J.T. 1995. HSF access to heat shock elements in vivo depends critically on promoter architecture defined by GAGA-factor, TFIID, and RNA-polymerase II binding sites. Genes Dev. 9 (22): 2756-2769.

Sorger P.K., Pelham H.R. 1987. The glucose-regulated protein grp94 is related to heat shock protein hsp90. J Mol Biol. 194(2): 341-344.

Southgate R., Mirault M., Ayme A., Tissieres A. 1985. Organization, sequences and induction of heat shock genes. In: Changes in eukaryotic gene expression in response to environmental stress, Academic Press. New-York: 3 - 30.

Stephanou A., Isenberg D.A., Nakajima K., Latchman D.S. 1999. Signal Transducer and Activator of Transcription-1 and Heat Shock Factor-1 Interact and Activate the Transcription of the HSP70 and HSP90P Promoters. The Journal of Biological Chemistry 274 (3): 1723 - 1728.

Stillman J., Somero G. 1996. Adaptation to temperature stress and aerial exposure in congeneric species of intertidal porcelain crabs (genus Petrolisthes): correlation of physiology, biochemistry and morphology with vertical distribution J Exp Biol. 199 (Pt 8): 1845-1855.

Stillman J.H., Somero G.N. 2000. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of eastern Pacific porcelain crabs, genus Petrolisthes: influences of latitude, vertical zonation, acclimation, and phylogeny. Physiol Biochem Zool. 73 (2): 200 - 208.

Stratman R., Markow T. A. 1998. Resistance to thermal stress in desert Drosophila. Functional Ecology. 12: 965 - 970.

Taipale M., Jarosz D.F., Lindquist S. 2010. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (7): 515-528.

Tanabe M., Sasai N., Nagata K., Liu X.D., Liu P.C., Thiele D.J., Nakai A. 1999. The Mammalian HSF4 Gene Generates Both an Activator and a Repressor of Heat Shock Genes by Alternative Splicing. The Journal of Biological Chemistry. 274 (39): 27845 - 27856.

Terlecky S.R., Chiang H.L., Olson T.S., Dice J.F. 1992. Protein and Peptide Binding and Stimulation of In Vitro Lysosomal Proteolysis by the 73-kDa Heat Shock Cognate Protein. The Journal of Biological Chemistry. 267 (13): 9202-9209.

Tian S., Haney R.A., Feder M.E. 2010. Phylogeny disambiguates the evolution of heat-shock cisregulatory elements in Drosophila. PLoS One. 5:e10669.

Toivola D.M., Strnad P., Habtezion A., Omary M.B. 2010. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20: 79-91.

Tomanek L. 2008. The importance of physiological limits in determining biogeographical range shifts due to global climate change: the heat-shock response. Physiol Biochem Zool. 81 (6): 709 - 717.

Tsan M.F., Gao B. 2004. Heat shock protein and innate immunity. Cell Mol Immunol. 1: 274-279.

Uhlirova M., Asahina M., Riddiford L.M. Jindra M. 2002. Heat-inducible transgenic expression in the Silkmoth BombyxMori. Dev. Genes. Evol. 212: 145-151.

Ulmasov H.A., Karaev K.K., Lyashko V.N., Evgen'ev M.B. 1993. Heat-shock response in camel (Camelus dromedarius) blood cells and adaptation to hyperthermia. Comp. Biochem. Physiol. B. 106 (4): 867 - 872.

Ulmasov K.A., Shammakov S., Karavaev K., Evgen'ev M.B. 1992. Heat shock proteins and thermoresistance in lizards. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 1666 - 1670.

Vainberg I.E., Lewis S.A., Rommelaere H., Ampe C., Vandekerckhove J., Klein H.L., Cowan N.J. 1998. Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 93(5): 863-873.

Velazquez J.M., Lindquist S. 1984. Hsp70 nuclear concentration during environmental stress and cytoplasmic storage during recovery. Cell. 36 (3): 655-662.

Velikodvorskaia V.V., Lyozin G.T., Feder M.E., Evgen'ev M.B. 2005. Unusual arrangement of the hsp68 locus in the virilis species group of Drosophila implicates evolutionary loss of an hsp68 gene. Genome. 48 (2): 234-240.

Vigh L., Nakamoto H., Landry J., Gomez-Munoz A., Harwood J.L., Horvath I. 2007. Membrane regulation of the stress response from prokaryotic models to mammalian cells. Ann. NY Acad. Sci. 1113: 40-51.

Vries R.G., Flynn A., Patel J.C., Wang X., Denton R.M., Proud C.G. 1997. Heat Shock Increases the Assotiation of Binding Protein-1 with Initiation Factor 4E. The Journal of Biological Chemistry. 272 (52): 32779 - 32784.

Voellmy R. 2004. On mechanisms that control heat shock transcription factor activity in metazoan cells. Cell Stress Chaperones. 9 (2): 122-133.

Vogel J.L., Parsell D.A., Lindquist S. 1995. Heat-shock proteins Hsp104 and Hsp70 reactivate mRNA splicing after heat inactivation. Curr Biol. 5 (3): 306-317.

Walter L., Rauh F., Gunther E. 1994. Comparative analysis of the three major histocompatibility complex-linked heat shock protein 70 (hsp70) genes of the rat. Immunogenetics. 40 (5): 325-330.

Welch W.J., Suhan J.P. 1985. Morphological study of the mammalian stress response: characterization of changes in cytoplasmic organelles, cytoskeleton, and nucleoli, and appearance of intranuclear actin filaments in rat fibroblasts after heat-shock treatment. J. Cell Biol. 101 (4): 1198-1211.

Westwood J.T., Wu C. 1993. Activation of Drosophila heat shock factor: conformational change associated with a monomer-to-trimer transition. Mol Cell Biol. 13 (6): 3481-3486.

Wilkins R.C., Lis J.T. 1997. Dynamics of potentiation and activation: GAGA factor and its role in heat shock gene regulation. Nucleic Acids Res. 25 (20): 3963-3968.

Wilkins R.C., Lis J.T. 1998. GAGA factor binding to DNA via a single trinucleotide sequence element. Nucleic Acids Res. 26 (11): 2672-2678.

Wilkerson D.C., Skaggs H.S., Sarge K.D. 2007. HSF2 binds to the Hsp90, Hsp27, and c-Fos promoters constitutively and modulates their expression. Cell Stress Chaperones. 12 (3): 283-290.

Wisniewski J., Orosz A., Allada R., Wu C. 1996. The C-terminal region of Drosophila heat shock factor (HSF) contains a constitutively functional transactivation domain. Nucleic Acids Res. 24 (2): 367-374.

Whitesell L., Sutphin P.D., Pulcini E.J., Martinez J.D., Cook P.H. 1998. The physical Assotiation of Multiple Molecular Chaperone Proteins with Mutant p53 Is Altered

by Geldanamycin, an HSP90-binding Agent. Molecular and Cellular Biology. 18 (3): 15171524.

Wu C. 1995. Heat Shock Transcription Factors: Structure and Regulation. Annual Review of the Cellular and Development Biology. 11: 441-469.

Wu C.H., Yamaguchi Y., Benjamin L.R., Horvat-Gordon M., Washinsky J., Enerly E., Larsson J., Lambertsson A., Handa H., Gilmour D. 2003. NELF and DSIF cause promoter proximal pausing on the hsp70 promoter in Drosophila. Genes Dev. 17(11): 14021414.

Xu Y., Lindquist S. 1993. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (15): 7074-7078.

Yao J., Munson K.M., Webb W.W., Lis J.T. 2006. Dynamics of heat shock factor association with native gene loci in living cells. Nature. 442 (7106): 1050-1053.

Yueh A., Schneider R.J. 2000. Translation by ribosome shunting on adenovirus and hsp70 mRNAs facilitated by complementarity to 18S rRNA. Genes Dev. 14 (4): 414-421.

Zolkiewski M., Zhang T., Nagy M. 2012. Aggregate reactivation mediated by the Hsp100 chaperones. Arch Biochem Biophys. 520(1): 1-6.

Zou J., Guo Y., Guettouche T., Smith D.F., Voellmy R. 1998. Repression of heat shock transcription factor HSF1 activation by Hsp90 (Hsp90 complex) that forms a stresssensitive complex with HSF1. Cell. 94 (4): 471-480.

Приложение

Таблица 1. Список основных праймеров и олигонуклеотидов, использованных в анализе генов ЪзрЮ и Ъ&р83

Последовательность праймера Описание праймера

слтсааслтсалсстааасл С. dromedarius 5'^рЛ1Л/В внутрь

слсталталтааааттлслслс С. dromedarius 3' ^рЛ1Л/В внутрь

алтсллсалсаалалтлласса С. dromedarius 5'^рЛ1Л/В внутрь

асатллалстсслааасаттс С. dromedarius 3' ^рЛ1Л/В внутрь

ллласлаатслааалаласал С. dromedarius 5'-конец hspЛ1L внутрь второго экзона

аалааалттсслатслаатсл С. dromedarius З'-конец hspЛ1L внутрь второго экзона

сататтстасаааттсласа С. dromedarius 5'^рЛ1Л/В наружу

таатасааттассстаатса

стаалатсттлсассттсллсл С. dromedarius 3' ^рЛ1Л/В наружу

ссалсллаллалллатастаал

тслатлсслтлаллалалтттсст С. dromedarius 5'-конец hspЛ1L наружу из второго экзона

лссттааасттасстссттсл

лталлалатастаталаталтал С. dromedarius З'-конец hspЛ1L наружу из второго экзона

ллааасллалттлаталатстал

алалллааллттааласлаата

лтттсстасалттсслслсстс О. pardalina 5'- hsp83P1/P2 внутрь

ллттатааатсатсаласала О. pardalina 3'- hsp83P1/P2 внутрь

тслтслстаасаллласллаал Б. singularior 5'- hsp83S1/S2 внутрь

аалаасаталлсттатааат Б. singularior 3'- hsp83S1/S2 внутрь

слласлсллсалсалсаласл О. pardalina 5'- hsp83P1/P2 внутрь

ллттатааатсатсаласала О. pardalina 3'- hsp83P1/P2 внутрь

атлссллалттататтаслслт S. singularior 5'- hsp83S1/S2 внутрь

алласлтсстслаллтсатса S. singularior 3'- hsp83S1/S2 внутрь

ллсалассасслассалсал О. pardalina hsp83 5'-ЯлсБ-1

алталлтлаллассслсасса О. pardalina hsp83 5'-ЯлсБ-2

Последовательность праймера Описание праймера

GAACCTGGAAGTCAACCCCGA O. pardalina hsp83 3'-RACE-1

ACTTGGTCGTGCTCCTGTTCG O. pardalina hsp83 3'-RACE-2

CAGCAGCCTTGTTCGGGA S. singularior hsp83 5'-RACE-1

CTTGCTGGCGTCTGTGAGTGA S. singularior hsp83 5'-RACE-2

GACCTCATTGCTCTCGTCAGG S. singularior hsp83 3'-RACE-1

CTGAAATGCCACCACTAGTCGA S. singularior hsp83 3'-RACE-2

ATCCGAGCGCGCCTCGAATGTTCTAGAA D. melanogaster hsp70Aa EMSA с HSF

CCTTTTCTAGAACATTCGAGGCGCGCTC

TTTTCGAAGTCTCGACTCTTCTCCAGAG TTCCAACAGAATGTTCCCG S. singularior hsp70S3 EMSA с HSF

TAAATCGTCGGGAACATTCTGTTGGAAC TCTGGAGAAGAGTCGAGAC

CGTTCGAAGCTTCTCGATACATCTACAG AGTTCCAACAGAATGTTCCCG S. singularior hsp70S4 EMSA с HSF

TAAATCGTCGGGAACATTCTGTTGGAAC TCTGTAGATGTATCGAG

AAACGTTCGAAGCTTCTCGA S. singularior hsp70S4 EMSA с рекомбинантным GAF

TGAACTCATGTTGGCCGACTG

TATATTTGCCGAGAGCAGCGCGAGAC S. singularior hsp83S2 EMSA с рекомбинантным GAF

ACTGTGTCTCGCGCTGCTCTCGGC

TTTATATCCGCCAGAAGCGTCGCGCC O. pardalina hsp83S2 EMSA с рекомбинантным GAF

TGTGCGGCGCGACGCTTCTGGCGG

CTGTTCTCGTTGCTTCGAGAGAG D. melanogaster hsp70Aa EMSA с рекомбинантным GAF

TTGACTCTCCGTCGACGAAG

CGAAGTCTCGACTCTTCTCCAG S. singularior hsp70S3 и hsp70S3-GAGA+/- EMSA с рекомбинантным GAF

GAACTCATGTTGGCCGACTG

Таблица 2 Список праймеров, используемых для создания конструкций под

рамкой считывания люциферазы.

N Конструкция Праймеры Ген

1 1Н Б: ллаатлссалсаастссллстслатллтст я: лллласттстслаастлассаттлтсса А1А

1Н1/2 Б: ллаатлсслсссттссслссасслстс я: лллласттстслаастлассаттлтсса

2 2Н Б: ллаатлссалсаастссллстслатллтст я: лллласттааттссстастстстатсаа л1л

3 1Н-1пуе11:ед б : лтлласттлттталалсаастссллстсла я: ллаатлсслатсатслсаалалсссасст л1Ь

4 1Н-1иуег1ед-2 Б: талластттлатстсссалсассттсас я: ллаатлсслатсатслсаалалсссасст л1Ь

5 Ш-туеГМ-100 Б1: лтлласттлттталалсаастссллстсла Б2: ттсстаслаалслсссттссслссасслстс я1: ллаатлсслатсатслсаалалсссасст я2: ттсстаслааааастаатасааааласаа л1Ь

6 Ш-туеГМ (-ШБ) Б: лтлласттлттталалсаастссллстсла я: ттаатлссааалттслстаалаааалслааа л1Ь

7 3Н Б: асаатлссслстастссслттлсс я: лллласттлссстсасласластсстсл л1В

8 4Н Б: асаатлссслстастссслттлсс я: лтлластттастстатааастссастст л1В

9 1С Б: ттаатлсссаасттслатсстлт я: лллласттсасллстсссатстсла А1А

1С1/2 Б: ллаатлссссттсслсстссссст я: лллласттсасллстсссатстсла

10 2С Б: ттаатлсссаасттслатсстлт я: лтлласттттстссассссаслл А1А

N Конструкция Праймеры Ген

11 2с-лта/ тта Б1: ттаатлсссаасттслатсстлт Б2: ттстаслалссслстасттссалаал Я1: лтлласттттстссассссаслл Я2:аатстаслалластатсстслсаалстлсллллс асллс А1А

12 Ю-Шуейеё Б: ттлласттстсталсссаасттслатсс я: ттаатлссттсттслтааласссстсст л1Б

13 1с-1пуеПеа-2 Б: талласттсстлатлтсссассассттса я: ттаатлссттсттслтааласссстсст л1Б

14 Ю-туейеё (-И8Б) Б: ттлласттстсталсссаасттслатсс я: ттаатлссаааасттастааастаааслс л1Б

15 3с Б: ттаатлссталттасттстсттттал я: лтлласттасаатттстсталаа л1В

16 4с Б: ттаатлссталттасттстсттттал я: лтлласттттстссассссасллтал л1В

17 ла Б: лтаатлссслатталсллсллслатсттал я: лллласттаталаттсттсттсстсаатл №р 70ла

18 83 Б: ттаатлсслатастталтаслтлттаттссл я: аалласттстттттстттттслаттллттсттслл №р 7083

19 83-алал+ Б1: ттаатлсслатастталтаслтлттаттссл я1: аалласттстттттстттттслаттллттсттслл Б2:тссстссАслслссаттссллслаллтаттссса лсал я2: тллстсалатаалаллалатсалалсттсал №р 7083

N Конструкция Праймеры Ген

2Q S3-GAGA+/- F1: TTGGTACCAGTGCTTGATGCATATTGTTCCA R1 : GGAAGCTTCTTTTTCTTTTTCAGTTAATTCTTCAA F2: ATCATATGGAGTATTCAAAACACTCA R2:TCCATATGAGAGAGCTACATAAGGGTTGGATGTT TGGG Hsp 7QS3

21 S3-GAGA+/-2 F1: TTGGTACCAGTGCTTGATGCATATTGTTCCA R1:GAAGTGGAATACAGAGTGAGAGAGCGTTTTGAAT ACTCCATATG F2:CATATGGAGTATTCAAAACGCTCTCTCACTCTGT ATTCCACTTC R2 : GGAAGCTTCTTTTTCTTTTTCAGTTAATTCTTCAA Hsp 7QS3

22 S3-GAGA+/-3 F1: TTGGTACCAGTGCTTGATGCATATTGTTCCA R1:GAAGTGGAATACAGAGTGAGAGAGCGTTTTGAAT ACTCCATATG F2:CATATGGAGTATTCAAAACGCTCTCTCACTCTGT ATTCCACTTC R2 : GGAAGCTTCTTTTTCTTTTTCAGTTAATTCTTCAA Hsp 7QS3

23 S4 F: TTGGTACCTTCACAATAGAAATGGTATC R: TTAGATCTCTTTTCTTTGAGAGTTAATTCTTCAA Hsp 7QS4

Благодарности

Выражаю благодарность моему научному руководителю Давиду Григорьевичу Гарбузу за всестороннюю помощь в данной работе и всегда чуткое, внимательное отношение.

Не менее глубокую благодарность хочу выразить заведующему Лабораторией молекулярных механизмов биологической адаптации Михаилу Борисовичу Евгеньеву за возможность выполнения данной работы, а также за ценные советы и консультации на всех этапах выполнения работы.

Безграничную благодарность выражаю Ольге Георгиевне Зацепиной за неоценимый вклад в данную работу.

Отдельно благодарность выражаю Андрею Александровичу Пржиборо за неоценимую помощь в получении редкого биологического материала и работе с ним.

Хочу поблагодарить Ирину Архипову за сотрудничество на этапе биоинформатической обработки полученных данных.

От всей души хочу поблагодарить всех сотрудников Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации: Елену Сергеевну Зеленцову, Наталью Григорьевну Шостак, Сергея Юрьевича Фуникова, Викторию Юрьевну Шилову, - а также Группу постгеномных исследований: Анну Викторовну Кудрявцеву, Анастасию Владимировну Снежкину, Асию Фаязовну Садритдинову - за необычайно теплую и сердечную рабочую атмосферу, располагающую к плодотворной научной деятельности.

Кроме того, благодарю мужа Дмитрия Сергеевича Чувакова, родителей и близких за безграничное терпение и понимание на протяжении всего периода выполнения диссертационной работы.