Микроорганизмы, ассоциированные с оранжерейными орхидными тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Цавкелова, Елена Аркадьевна

• Цавкелова, Елена Аркадьевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Цавкелова, Елена Аркадьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Биологические особенности тропических орхидей

1.1. Некоторые особенности корневой системы эпифитных орхидей

1.2. Размножение орхидных и прорастание их семян

ГЛАВА 2. Микроорганизмы, ассоциированные с растениями

2.1. Бактерии

2.1.1. Представители ассоциативных бактерий

2.2. Грибы. Микориза орхидных

2.2.1. Представители ассоциативных микромицетов

2.3. Цианобактерии

2.3.1. Цианобактерии - доминирующая составляющая консорциумов микроорганизмов

2.3.2. Цианобактерии - симбионты растений

ГЛАВА 3. Фитогормоны. Распространение среди микроорганизмов

3.1. Ауксины

3.2. Гиббереллины

3.3. Цитокинины

3.4. Практическое применение фитогормонов 43 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Объекты и методы исследования

1.1. Орхидеи, взятые для исследований

1.2. Выделение микроорганизмов, ассоциированных с орхидными

1.2.1. Выделение бактериального комплекса орхидей

1.2.1.1. Определение количества бактериальных клеток ризопланы орхидей

1.2.1.2. Получение чистых бактериальных культур

1.2.2. Выделение микобиоты орхидных

1.2.3. Выделение цианобактериального сообщества орхидных 56 1.2.3.1. Получение чистых культур цианобактерий

1.3. Идентификация микроорганизмов

1.3.1.Определение родовой принадлежности бактерий

1.3.2. Идентификация грибов

1.3.3. Идентификация цианобактерий

1.4. Хранение микроорганизмов

1.5. Оценка роста и развития микроорганизмов

1.6. Микроскопирование

1.7. Определение потенциальной азотфиксирующей активности воздушных корней эпифитных орхидей

1.8. Изучение состава капсул и межклеточного матрикса бактерий

1.8.1. Качественный экспресс-метод определения углеводной природы капсулы и межклеточного матрикса с 2,3,5-трифенилтетразолием

1.8.2. Качественный экспресс-метод определения кислой (полианионной) природы капсулы и межклеточного матрикса с цетавлоном

1.8.3. Определение содержания белка и углеводов в капсуле и матриксе бактерий

1.8.4. Осаждение внеклеточных полисахаридов из кулмуральной жидкости

1.9. Определение количества индолилуксусной кислоты в культуральной жидкости

1.10. Исследование фитогормонов с помощью тонкослойной хроматографии

1.10.1. Идентификация индолилуксусной кислоты (ИУК) и веществ гиббереллиновой природы

1.10.2. Идентификация веществ цитокининовой природы

1.11. Методы биологических проб

1.11.1. Биотест по определению влияния ауксинов на рост клеток в фазе растяжения

1.11.2. Стимулирование корнеобразования у черенков фасоли

1.11.3. Биотест по определению влияния гиббереллина на рост гипокотилей салата

1.11.4. Биотест, основанный на задержке пожелтения срезанных листьев в присутствии цитокининов

1.12. Симбиотическое проращивание семян орхидных

1.12.1. Изучение влияния бактериальных культур на прорастание семян орхидных

1.12.2. Изучение влияния культур микромицетов на прорастание семян орхидных

1.13. Среды для культивирования микроорганизмов

1.14. Математическая обработка результатов

ГЛАВА 2. Изучение состава микроорганизмов, ассоциированных с корнями тропических орхидей

2.1. Особенности локализации микроорганизмов на корнях орхидных

2.2. Выделение и идентификация микроорганизмов, ассоциированных с орхидными

2.2.1. Цианобактерии 82 2.2.1.1. Определение потенциальной азотфиксирующей активности чехла-оболочки воздушных корней

Phalaenopsis amabilis

2.2.2. Грибы

2.2.3. Бактерии

ГЛАВА 3. Образование фитогормонов микроорганизмами, ассоциированными с корнями тропических орхидей

3.1. Образование фитогормонов микобиотой орхидных

3.2. Образование фитогормонов бактериями

ГЛАВА 4. Симбиотическое проращивание семян орхидей

4.1. Использование бактериальных культур в симбиотическом проращивании семян орхидей

4.2. Использование микромицетов в симбиотическом проращивании семян орхидей

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микроорганизмы, ассоциированные с оранжерейными орхидными»

Семейство орхидных, крупнейшее среди однодольных, объединяет 650 родов и 25000 - 30000 видов. Этот список дополняют десятки тысяч полученных гибридов, а открытие новых видов продолжается и в настоящее время. Однако хорошо изучены только около 100 родов этих растений, несмотря на то, что орхидеи - космополиты. Обладая хорошо развитым цветком и вегетативными частями, орхидеи приспособились к жизни от экваториальных лесов, в зонах умеренного климата, до самых границ полярных областей (Гладкова, 1982; Риттершаузен, 1998). Самое большое разнообразие видов встречается в тропической и субтропической зонах Восточной Азии, Центральной и Южной Америки.

Некоторые виды орхидей до сих пор используют в пищу и применяют в народной медицине многих стран мира (Бразилия, Перу, Индия, Китай, Мексика, страны Северной Америки и Европы, Гаммерман и др., 1975; Семенова, 1999; Трофимова, 1999). Одной из основных биологических особенностей эпифитных тропических орхидных является ослабленная геотропическая реакция их корней - они способны ориентироваться в пространстве в разных направлениях, что и используют в космической ботанике (Черевченко, Кушнир, 1986).

Именно тропические орхидеи представляют интерес для флористики и комнатного садоводства. Многие из них, однако, истреблены и не встречаются в дикой природе, а особенности их биологии, связанные с опылением, прорастанием семян и условиями роста и развития взрослых растений, создают сложности в агротехнике орхидей в искусственных условиях (Риттершаузен, 1998; Коломейцева, 2001). В настоящее время вопрос сохранения генофонда редких орхидей и их реинтродукции в природу стоит наиболее остро. Ботанические сады прилагают максимальные усилия для увеличения численности и разнообразия тропических и субтропических орхидей, используя их семенное и вегетативное размножение.

В природе мельчайшим семенам орхидей для прорастания необходим гриб-микоризообразователь, который, нередко, оказывается видоспецифичным. В искусственных условиях иногда микобионта удается заменить специальными питательными средами. Однако их состав не является универсальным для проращивания многих представителей орхидей. Непредсказуемость взаимодействия симбиотическон пары орхидея-гриб, когда невозможно контролировать установление экологического равновесия между партнерами, зачастую приводит к гибели растения. Многие из орхидей плохо или совсем не прорастают в стерильных условиях. Возникает необходимость поиска и разработки более 6 универсальных методов для проращивания семян различных представителей семейства орхидных.

Таким методом может стать бактеризация семян. Подобные исследования уже проводят на сельскохозяйственных и промышленно важных растениях в целях повышения их выживаемости, приспособляемости и урожайности (Белимов и др., 1999). Известно, что благодаря своей высокой биохимической активности микрофлора оказывает существенное и во многих случаях положительное комплексное влияние на рост и развитие растений, улучшая минеральное питание, повышая резистентность растений к различным фитопатогенам, а также обладая рост стимулирующими свойствами (Мишке, 1988).

Цель настоящей работы заключалась в изучении состава консорциума микроорганизмов, ассоциированных с оранжерейными тропическими орхидеями, а также в выделении бактерий, способствующих прорастанию семян орхидных в искусственных условиях.

Для достижения указанной цели были определены следующие задачи.

1. Выделение и родовое определение комплекса микроорганизмов (грибов, цианобактерий, бактерий), ассоциированных с воздушными и субстратными корнями эпифитных и субстратными корнями наземной тропических орхидей, выращиваемых в оранжерейных условиях.

2. Выяснение особенностей локализации микроорганизмов на корнях орхидных.

3. Определение способности бактериальной и грибной микрофлоры орхидных к синтезу фитогормонов, обладающих рост стимулирующей активностью. Выявление наиболее активных продуцентов индолил-3-уксусной кислоты (ИУК).

4. Изучение возможности совместного проращивания семян орхидей с выделенными микромицетами и бактериями в культуре in vitro.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТРОПИЧЕСКИХ ОРХИДЕЙ

Орхидным присуще большое разнообразие экологических и физиологических групп. Все орхидеи являются многолетними травянистыми растениями. Среди них есть эпифиты, поселяющиеся на деревьях и образующие воздушные корни, родственные им литофиты, наземные виды с подземными корневищами или клубнями, а также группа орхидей, полностью утратившая способность к фотосинтезу - микотрофные орхидеи (Pridgeon, 1986а, Benzing, 1986).

Стебли наземных и большинства эпифитных орхидей чаще всего характеризуются симподиальным ростом (Гладкова, 1982). Растение представляет собой систему многолетних побегов, горизонтальные части которых образуют корневище, покрытое обычно чешуевидными листьями, а вертикальные части с нормальными и чешуевидными листьями возвышаются над субстратом. Наземные орхидеи во время роста формируют под землей клубневидно-утолщенные корни и розетку листьев на поверхности, из которой вырастает стебель с цветком. Рост прекращается после цветения и возобновляется в начале каждого сезона. Реже встречаются орхидеи с моноподиальным ростом, у которых главный побег постоянно растет вверх, образуя сверху новые листья, цветы, корни, а нижняя часть побега медленно засыхает и отмирает. Многие из них не способны сохранять вертикальное положение и переходят к лазающему образу жизни (Рёлльке, 1998).

Орхидеи занимают практически все экологические ниши - они произрастают повсюду: от склонов самых высоких гор до лесных просторов равнин, от болот и водоемов до сухих степей и пустынных оазисов, в нетающих снегах гор и под землей. Наземные орхидеи встречаются по всему миру и особенно пышно разрастаются в умеренном поясе. Тем не менее, тропические виды орхидей составляют 90-95 % (Garay, 1960) от общего числа видов растений одноименного семейства, причем 70-75 % из них - эпифиты. Они поселяются на других растениях, преимущественно в развилинах и кронах высоких деревьев; литофиты предпочитают для своего обитания камни и скалы. Эпифиты не являются растениями-паразитами, деревья им нужны в качестве опоры, чтобы подняться с поверхности земли в воздух, где больше света и меньше растений-конкурентов (Уоллес, 1956). Отрицательное воздействие на деревья связано с деятельностью грибного симбионта орхидей, который, разрушая древесину, доставляет питательные вещества орхидеям (Ruinen, 1953; Селиванов, 1981).

Эпифитные орхидеи обладают рядом особенностей, позволяющим им выжить. Многие из них имеют утолщения стеблей, так называемые псевдобульбы или туберидии, в которых накапливается вода, необходимая для жизни растений во время долгих засушливых периодов (Гладкова, 1982). Эпифиты образуют многочисленные толстые, мясистые, воздушные корни, часть которых обычно погружается в гумус, накапливающийся в трещинах коры, или внедряются в почву, если орхиди находятся на низкорослых кустарниках (Sanford, Adanlawo, 1973; Рёлльке, 1998).

Большинство наземных и эпифитных орхидей являются автотрофными растениями с зелеными фотосинтезирующими листьями. У некоторых эпифитов фотосинтезируют также и зеленые стебли, цветки и нередко воздушные корни (Dycus, Knudson, 1957). Но среди наземных и эпифитных орхидей существует немалое количество видов, полностью утративших способность к фотосинтезу. Такие микотрофные орхидеи поселяются на гниющих органических остатках, из которых извлекают необходимые им вещества с помощью микоризных грибов (Селиванов, 1981; Гладкова, 1982).

Кроме некоторых физиологических отличий между тропическими орхидеями, ведущими эпифитный и наземный образ жизни, Т.М. Черевченко и др. (2000) отмечен ряд отличий в биохимическом составе растительных тканей этих растений. Так, наземный вид Calanthe vestita характеризуется значительно более высокой ферментативной активностью цитохромоксидазы, аскорбатоксидазы, каталазы, содержанием в листьях хлорофиллов, а также макро- и микроэлементов (азота, фосфора, калия, кальция, магния, железа и марганца), по сравнению с другими изучаемыми видами - эпифитом Phalaenopsis amabilis и занимающим промежуточное положение Cymbidiwn tracyanum. Этими авторами выявлены существенные отличия в концентрации ДНК и в показателе РНК/ДНК, что отражает интенсивность синтетических процессов в органах орхидей в зависимости от экотипа растений. Другими авторами (Маракаев, Титова, 1999) показано, что содержание пигментов в листьях наземных орхидей зависит не только от родовой, но и от видовой принадлежности орхидей (на примере Calanthe masuca и Calanthe triplicata).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Цавкелова, Елена Аркадьевна

1. Впервые проведено микроскопическое исследование микроорганизмов, находящихся на корнях оранжерейных тропических орхидей. Цианобактерии, бактерии и микромицеты активно заселяют ризоплану и внутренние ткани воздушных и субстратных корней орхидных.2. Изучена родовая принадлежность ассоциативных микромицетов, цианобактерии и бактерий. Состав микроорганизмов различается у эпифитных и наземной орхидей.Наиболее характерными представителями микрофлоры являются; среди цианобактерии - род Nostoc, среди бактерий - род Pseudomonas, среди грибов - рода Trichoderma и Fusarium.3. В коровой паренхиме не проникающих в субстрат воздучиных корней Р. amabilis обнаружены целые и полупереваренные грибные гифы. Рост микобионта возможен за счет наличия на корнях мощного чехла-оболочки.4. Выявлена азотфиксирующая активность микроорганизмов, входяпщх в состав чехла-оболочки воздушных корнейamabi l i s .5. Все исследованные ассоциативные микромицеты и бактерии образуют индолил-3-

уксусную кислоту (ИУК). Триптофан значительно увеличивает синтез ИГУК у микроорганизмов: добавление в среду культивирования 100 мкг/мл триптофана повышает ее выход у микромицетов в 5 - 130 раз, а у бактерий - в 1,5 - 130 раз.6. Впервые показано, что ассоциативные бактерии, выделенные с корней генеративно-зрелых оранжерейных орхидей, стимулируют прорастание семян различных родов этих растений. Бактеризация семян орхидных позволяет в искусственных условиях прорапщвать трудно прорастающие семена орхидей из тропической и умеренной климатических зон.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Цавкелова, Елена Аркадьевна, 2003 год

1. Александрова А.В., Великанов J1.JL, Сидорова И.И., Сизова Т.П. Влияние гриба Trichoderma harzianum на почвенные микромицеты // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34. Вып. 3. С. 68-77.

2. Андреюк Е.И., Коптева Ж.П., Занина В.В. Цианобактерии. Киев: Наукова Думка. 1990. 199 С.

3. Бажина Е.В., Штина Э.А. Взаимосвязи некоторых почвенных водорослей и грибов // Тр. Киров, с.-х. ин-та. 1967. Т. 20. № 40. С. 233-240.

4. Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., Ильина Г.М., Чубатова Н.В. Основы микротехнических исследований в ботанике. Справочное руководство. М.: "Гриф и К0". 2000. 127 С.

5. Батыгина Т.Б., Андронова Е.В. Есть ли семядоля у орхидных? // Докл. Академии наук СССР. 1988. Т. 302. №4. С. 1017-1019.

6. Билай В. И. Фузарии. Киев: Наук, думка, 1977. 442 с.

7. Блинова И.В. Особенности онтогенеза некоторых корнеклубневых орхидных (Orchidaceae) крайнего Севера // Бот. журн. 1998. Т. 83. № 1. С. 85-94.

8. Ботвинко И.В. Экзополисахариды бактерий // Успехи микробиол. 1985. Т. 20. С. 79116.

9. Вахрамеева М.Г., Денисова J1.B., Никитина С.В., Самсонов С.К. Орхидеи нашей страны. М.: Наука. 1991. 219 с.

10. Великанов Л. JI. Роль грибов в формировании мико- и микробиоты почв естественных и нарушенных биоценозов и агроценозов // Дис. на соиск. уч. ст. д.б.н. Москва. 1997. 547 с.

11. Великанов Л.Л., Сидорова И.И. Экологические проблемы защиты растений от болезней. Итоги науки и техники. Сер. Защита растений. М.:ВИНИТИ. 1988. Т. 6. 143 с.

12. Виноградова Т.Н. Морфология и биология некоторых бореальных орхидных (Orchidaceae Juss.) на ранних стадиях их развития // Дис. на соиск. уч. ст. к.б.н. Москва. 1999. 200 с.14.