Методы моделирования наднуклеосомной структуры хроматина и расчета спектров малоуглового рассеяния нейтронов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Илатовский, Андрей Владимирович

• Илатовский, Андрей Владимирович
• кандидат физико-математических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Илатовский, Андрей Владимирович

Содержание

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Структура нуклеосомы

1.2 Компактизация хроматина

1.3 Структура нити хроматина

1.4 Структура хроматина на уровне ядра

1.5 Малоугловое рассеяние нейтронов

2 Методы 3-4

2.1 Геометрическая модель нуклеосомы

2.2 Алгоритм анализа СС-состава сайтов образования нуклеосом . 4-1

2.2.1 Определение последовательностей

сайтов образования нуклеосом

2.2.2 Биномиальный тест

2.2.3 и-тест Манна — Уитни

2.3 Геометрическая модель наднуклеосомной структуры

2.3.1 Параметризация межнуклеосомного интерфейса

2.3.2 Режим одноцепочечной генерации

наднуклеосомной структуры

2.3.2.1 Подрежим локально-регулярной генерации

2.3.3 Режим фрактальной генерации

2.4 Полишаровая физическая модель нуклеосомы

2.5 Полноатомная физическая модель нуклеосомы

2.5.1 Построение списка атомов нуклеосомы

2.5.1.1 Регуляризированная модель нуклеосомы

2.5.2 Построение списка остатков нуклеосомы

2.5.3 Монте-Карло моделирование распределения парных расстояний и двумерная гистограмма

2.5.4 Параметризация плотности длин рассеяния

2.5.5 Одномерная гистограмма и расчёт спектров малоуглового рассеяния нейтронов

2.6 Модель однородного шара в методе Монте-Карло

3 Результаты и обсуждение

3.1 Анализ геометрии мононуклеосомных структур из банка РБВ

3.2 Анализ СС-состава сайтов образования нуклеосом

3.3 Расчёты спектров малоуглового рассеяния нейтронов

с использованием полишаровой модели нуклеосомы

3.3.1 Расчёты с помощью формулы Дебая

3.3.1.1 Мононуклеосома

3.3.1.2 Наднуклеосомные структуры

3.3.1.3 Анализ применения формулы Дебая

3.3.2 Переход к методу Монте-Карло

3.3.2.1 Мононуклеосома

3.3.2.2 Наднуклеосомные структуры

3.3.2.3 Анализ применения метода Монте-Карло

3.4 Расчёты спектров малоуглового рассеяния нейтронов

с использованием полноатомной модели нуклеосомы

3.4.1 Мононуклеосома

3.4.2 Наднуклеосомные структуры, полученные в режиме од-

ноцепочечной генерации

3.4.2.1 Наднуклеосомные структуры, полученные в

подрежиме локально-регулярной генерации

3.4.3 Наднуклеосомные структуры, полученные в режиме фрактальной генерации

Основные результаты и выводы

Список опубликованных работ по теме диссертации 1Ц

Литература

Список сокращений

ACM атомно-силовая микроскопия

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

днДНК двунитевая ДНК

КУН коэффициент углового наклона

МК Монте-Карло

МУРН малоугловое рассеяние нейтронов

о. е. относительные единицы

ПДР плотность длин рассеяния

п. н. пара нуклеотидов

ПР парное расстояние

ФРПР функция распределения ПР

ФРПРОЧ ФРПР однородной частицы

ЭМ электронная микроскопия

FRAP fluorescence recovery after photobleaching, восстановление флуоресценции после фотовыжигания RMSD root mean square deviation, среднеквадратичное отклонение; для двух векторов и {х2,i}i=i определяется как

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы моделирования наднуклеосомной структуры хроматина и расчета спектров малоуглового рассеяния нейтронов»

Введение

Актуальность исследования

Современный арсенал экспериментальных биофизических методов исследования позволяет отвечать на многие вопросы о функционировании живой клетки. Тем не менее, наши знания о структурной организации биологических объектов по-прежнему недостаточны. Например, длина ДНК генома человека составляет около 2 м, в то время как характерный размер клеточных ядер — порядка 10 мкм, что означает весьма высокую степень упаковки ДНК.

Ядерная ДНК в геномах эукариот представляет собой нуклеопротеиновый комплекс — хроматин. Для компактного хранения генетической информации и обеспечения доступа к ней требуется его определённая организация. В середине 1970-х гг. было известно, что хроматин состоит из ДНК и гистонов HI, Н2А, Н2В, НЗ и Н4 (Kornberg and Thomas, 1974). На основании имеющихся биохимических данных Корнбергом (Kornberg, 1974) была выдвинута гипотеза о существовании структурного элемента хроматина, которая позднее была подтверждена экспериментально (Oudet et al., 1975). Обнаруженные частицы назвали нуклеосомами. В 1997 г. была получена полноатомная структура нуклеосомы (Luger et al., 1997).

Достигаемая с помощью нуклеосомной организации степень компак-тизации хроматина является недостаточной для объяснения наблюдаемой плотности упаковки ДНК в ядре, что указывает на наличие наднуклеосомных структур хроматина (Woodcock and Ghosh, 2010). Наблюдаемые при помощи электронной микроскопии 30-нанометровые нити хроматина считаются следующим уровнем компактизации ДНК (Oudet et al., 1975; Finch and Klug, 1976). За прошедшие десятилетия нити хроматина исследовались

множеством экспериментальных методов, однако полученные результаты не позволяют сделать однозначных выводов об их структуре, а ряд исследователей ставит под сомнение само существование регулярной упаковки нуклеосом в 30-нанометровые нити (van Holde and Zlatanova, 1995; Tremethick, 2007; Fussner et al., 2011).

Определённый прогресс достигнут в исследовании структуры хроматина в масштабе целого ядра. Применение биофизических и биохимических методов позволило установить двухуровневую фрактальную организацию хроматина (McNally and Mazza, 2010) и, в ряде случаев, построить трёхмерные модели исследуемых геномов (Duan et al., 2010). Тем не менее единая молекулярная модель структурной организации хроматина, охватывающая все уровни компактизации ДНК, от нуклеосомного до геномного, пока не создана.

В нашей лаборатории получены данные о малоугловом рассеянии нейтронов (МУРН) на различных клеточных ядрах (Lebedev et al., 2005; Исаев-Иванов и dp., 2010). Графики экспериментальных спектров МУРН имеют линейные участки в двойном логарифмическом масштабе для широкого интервала значений величины векторов рассеяния, что указывает на фрактальную организацию хроматина (Schmidt, 1989).

МУРН обладает рядом преимуществ перед другими экспериментальными методами исследования наднуклеосомной структуры хроматина. Во-первых, он позволяет получить данные о структуре хроматина в нативном ядре без применения биохимических техник выделения отдельных нитей хроматина. Во-вторых, при использовании метода вариации контраста возможно наблюдать рассеяние нейтронов на различных частях нуклеопротеидных комплексов, например, при концентрации тяжёлой воды в растворе порядка 65 % спектр МУРН будет обусловлен преимущественно белковой компонентой. В-третьих, спектры МУРН охватывают практически полный интервал размеров наднуклеосомных структур хроматина, от нуклеосомных до геномных.

Указанные преимущества использования МУРН для исследования структуры хроматина и других биомакромолекулярных комплексов обуславливают большое число нейтронных экспериментов для изучения биологических объектов (Harroun et al, 2006).

Существует несколько методов расчёта спектров малоуглового рассеяния нейтронов и рентгеновского излучения для молекулярных моделей, разработаны соответствующие компьютерные программы.

В рамках аналитического подхода может быть использовано полишаровое представление объекта, расчёт спектров МУРН в таком случае осуществляется при помощи формулы Дебая (Debye, 1915; Свергун и Фейгин, 1986). Такой метод расчёта спектров рассеяния применяется в ряде программ: DALAI_GA (Chacón et al., 1998, 2000), SAXS3D (Walther et al., 2000).

Другим приближением является представление однородного объекта в виде радиальной оболочки, которая аппроксимируется сферическими функциями, что позволяет непосредственно вычислить спектр рассеяния (Stuhrmann, 1970). Этот подход используются в программе SASHA (Svergun et al., 1996, 1997). Аналогично приближению радиальной оболочки, в программах DAMMIN, CRYSOL и CRYSON используется представление форм-факторов отдельных атомов в виде разложения по сферическим функциям, что позволяет вычислять спектры рассеяния для полноатомных моделей (Svergun et al., 1995, 1998; Svergun, 1999).

Кроме того, в ряде работ разработаны методы непосредственного вычисления функции распределения парных расстояний (ФРПР) и получения спектров МУРН с помощью Фурье-преобразования (Hammermann et al., 2000).

Общим недостатком этих методов является их неприменимость для систем большого размера, таких как сложные биомакромолекулярные комплексы, состоящие из миллионов атомов.

Таким образом, разработка методов молекулярного моделирования наднуклеосомной структуры хроматина геномного размера (порядка 106 нуклеосом или Ю10 атомов) и соответствующих методов расчёта спектров МУРН, применимых для систем такого размера, является актуальной биофизической задачей. Её решение позволит рассчитывать спектры МУРН и другие свойства моделей наднуклеосомной структуры хроматина для исследования влияния различных геометрических и физических параметров на экспериментально наблюдаемые характеристики хроматина.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка методов молекулярного моделирования наднуклеосомной структуры хроматина геномного размера и расчёта спектров МУРН для получаемых моделей нуклеопротеидных комплексов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод построения физической модели нуклеосомы и соответствующий метод расчёта спектров МУРН, применимый для нуклеопротеидных комплексов геномного размера;

2. определить геометрические параметры межнуклеосомного интерфейса и разработать методы построения геометрических моделей наднуклеосомных структур геномного размера;

3. разработать методы построения фрактальных наднуклеосомных структур с заданным значением фрактальной размерности;

4. рассчитать спектры МУРН для построенных моделей наднуклеосомной структуры хроматина и сопоставить с полученными экспериментально.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанный метод расчёта спектров МУРН, основанный на методе Монте-Карло, применим для нуклеопротеидных комплексов, состоящих из ~ Ю10 атомов.

2. Разработанный алгоритм фрактальной генерации наднуклеосомных структур позволяет создавать фрактальные структуры с заданной фрактальной размерностью в интервале 2 < < 3.

3. Спектры МУРН, рассчитанные для фрактальных моделей наднуклеосомной структуры хроматина высоких порядков упаковки, имеющих две фрактальные размерности, удовлетворительно описывают экспериментально наблюдаемые спектры МУРН, а именно имеют степенной характер зависимости интенсивности рассеяния от величины вектора рассеяния (I ос

и точку кроссовера, определяющую переход от одной фрактальной размерности (¿/ к другой.

Научная новизна

1. Разработан метод построения фрактальных моделей наднуклеосомной структуры хроматина с заданным значением фрактальной размерности или двумя различными значениями фрактальной размерности (структуры с кроссовером).

2. Разработан метод расчёта спектров МУРН для молекулярных моделей, применимый для нуклеопротеидных комплексов геномного размера (порядка 106 нуклеосом « Ю10 атомов).

3. Построена фрактальная молекулярная модель наднуклеосомной структуры хроматина геномного размера 106 мононуклеосомных частиц) с двумя фрактальными размерностями, описывающая двухуровневую фрактальную организацию хроматина.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанные методы построения молекулярных моделей наднуклеосомной структуры хроматина могут быть использованы при расчёте спектров МУРН и других экспериментально наблюдаемых характеристик хроматина, таких как карта контактов удалённых по цепи участков геномной ДНК и диффузионное поведение маркеров, для исследования роли различных геометрических и физических параметров.

Разработанные методы расчёта спектров МУРН могут применяться как для моделей наднуклеосомной структуры хроматина, полученных в данной работе, так и для вычисления спектров МУРН для полноатомных моделей любых биомакромолекулярных или полимерных комплексов с большим количеством атомов, где невозможно применение других методов.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на VIII Национальной конференции «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» РСНЭ-НБИК

2011 (Курчатовский институт, Москва, 2011), на XV Международной Пущинской школ е-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2011), на XI Международной конференции по рассеянию рентгеновского излучения и нейтронов на поверхностях БХИБ-П (СевероЗападный университет, Эванстон, Иллинойс, США, 2010), на XX и XXI Совещаниях по использованию рассеяния нейтронов в исследованиях конденсированного состояния РНИКС-2008 и РНИКС-2010 (ПИЯФ, Гатчина, 2008, Курчатовский институт, Москва, 2010), на Санкт-Петербургском семинаре по компьютерной биологии (СПбГПУ, Санкт-Петербург, 2009), на IX конференции молодых учёных Отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН (ПИЯФ, Гатчина, 2008), на XVI и XVII Политехнических симпозиумах «Молодые учёные — промышленности Северо-Западного региона» (СПбГПУ, Санкт-Петербург, 2007, 2008).

Начальный этап работы (диссертация на соискание степени магистра) был отмечен медалью «За лучшую научную студенческую работу» по итогам Всероссийского открытого конкурса на лучшую научную работу студентов вузов по естественным, техническим и гуманитарным наукам в 2008 г.

Публикации и личный вклад автора

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 в рецензируемых научных журналах из перечня изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для публикации материалов диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук (полный список приведён на страницах 1Ц—115).

Автор принимал непосредственное участие как в постановке задач, так и в их решении и обсуждении полученных результатов. Личный вклад автора в получение результатов, выносимых на защиту, является определяющим. Вклад автора в совместных публикациях с научным руководителем и/или другими сотрудниками лаборатории является основным (анализ литературы, разработка, апробация и применение методов, расчёты и анализ результатов, написание статей), за исключением публикаций [3, 6, 9], в которых автором была выполнена лишь часть исследования.

Объём и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста и включает введение, три главы (обзор литературы, методы, результаты и обсуждение) и выводы. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель содержит 120 источников.

Финансовая поддержка

Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук (комплексная программа Президиума РАН «Физика элементарных частиц», подпрограмма «Нейтронная физика», направление «Исследование структуры, динамики и неординарных свойств вещества нейтронными методами», проект 4.7: «Изучение структуры и динамики молекулярных и надмолекулярных биологических комплексов методами рассеяния нейтронов»), Правительства Санкт-Петербурга (персональный грант № 2.6/25-04/05), Министерства образования и науки Российской Федерации (РНП 2.2.1.1.4663, Государственные контракты № 02.740.11.5223 и № 11.519.11.2002) с использованием научного оборудования ЦКП «Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ».

1. Обзор литературы

1.1 Структура нуклеосомы

Одни из первых доказательств существования структурного элемента хроматина были получены с помощью экспериментов по электрофорети-ческому разделению смесей гистоновых белков и исследования спектров рассеяния рентгеновских лучей на смесях днДНК и гистонов (Romberg and Thomas, 1974; Kornberg, 1974). На электрофореграммах смеси гистонов НЗ + Н4 наблюдалось 8 полос, сохраняющихся в широком интервале концентраций. После соотнесения молекулярных масс и подвижности частиц стало ясно, что в растворе присутствует гетеротетрамер (НЗ)2(Н4)2 и продукты его диссоциации вплоть до отдельных гистоновых белков. Аналогичным образом было установлено, что гистоны Н2А и Н2В образуют гетеродимер. Следующим этапом исследования стало получение спектров рассеяния рентгеновского излучения для растворов днДНК в присутствии тех или иных гистонов и их сравнение со спектрами для образцов хроматина, выделенных из клеток (Kornberg and Thomas, 1974). Оказалось, что для воспроизведения спектров (и, соответственно, структуры) хроматина необходимо присутствие четырёх гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, но не HI.

На основании имевшихся цитологических, биохимических и биофизических данных была выдвинута гипотеза о том, что четыре гистона образуют комплекс с днДНК в виде гетерооктамера (состоящего из двух субъединиц каждого гистона), причём один такой комплекс содержит порядка 200 пар нуклеотидов (п. н.) (Kornberg, 1974).

Применение электронной микроскопии (ЭМ) для визуализации структуры хроматина было ограничено высокой плотностью упаковки ДНК в ядре, которая не позволяла непосредственно наблюдать предсказанные

частицы. В 1975 г. на основе имеющихся биохимических данных о свойствах гистоновых белков удалось разработать методы неразрушающего выделения отдельных элементов хроматина из целого ядра (Oudet et al, 1975). Первый способ заключался в постепенном повышении ионной силы раствора (до 700 mM NaCl), при этом из хроматина удаляются все белки за исключением гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, хроматин деконденсируется и возможно наблюдать детали его структуры. Во втором методе для удаления гистона HI выделенный хроматин обрабатывают трипсином. Результат применения этих различных методов оказался одинаковым — на электронных микрофотографиях были чётко видны изолированные нити хроматина, образованные отдельными частицами диаметром около 13 нм, организованными в структуру типа «бусины-на-нити» (рисунок 1). Авторы назвали обнаруженные частицы нуклеосомами. Биохимический анализ показал, что эти частицы состоят из четырёх коровых гистонов и днДНК. Таким образом, хроматин состоит из нуклеосом, соединённых линкерными сегментами днДНК.

Путём дальнейшего повышения ионной силы раствора (до 2 М NaCl) авторам удалось добиться диссоциации нуклеосом на белок и днДНК; при понижении ионной силы осуществлялась реассоциация, в результате которой получались ранее наблюдаемые структуры. Подобные эксперименты проводили с вирусной ДНК и гистонами млекопитающих. При этом образовывались рекомбинантные нуклеосомы, имеющие характерную структуру. Из этих наблюдений был сделан вывод о том, что специальных последовательностей ДНК для сборки нуклеосом не требуется, механизм образования нуклеосом является универсальным (Oudet et al, 1975).

Данные эксперименты установили основные принципы устройства хроматина, однако детали структурной организации нуклеосом оставались неизвестными. Мощным методом исследования структуры сложных биомакромолекул является метод дифракции рентгеновского излучения на кристаллах. С помощью этого метода были установлено, что нуклеосома имеет цилиндрическую форму и размеры 110 х 110 х 57 А, при этом днДНК образует около 1,75 витка суперспирали (с шагом 28 А) вокруг гистонового кора (Finch et al, 1977). Также было показано наличие некристаллической

Рисунок 1 (Oudet et al., 1975, рис. 4). Микрофотография хроматина, выделенного из клеток печени курицы и обработанного трипсином. Размер линейки 0,5 мкм

оси псевдосимметрии второго порядка (диады). Долгое время не удавалось вырастить кристаллы достаточного качества, позволившие бы установить детали структуры. Первым успехом на этом пути стала структура нуклеосомы, полученная с разрешением 7 A (Richmond et al., 1984). В этой работе было установлено местоположение каждого гистона в центральной области нуклеосомы. Оказалось, что ось псевдосимметрии совпадает с осью симметрии ге-теротетрамера (НЗ)2(Н4)2 и проходит через центральную пару нуклеотидов.

Заменой нативной ДНК на высокорегулярную последовательность в

о

1997 году удалось получить структуру с разрешением 2,8 A (Luger et al., 1997). Координаты доступны в международной базе данных PDB (Berman et al, 2003) под индексом 1AOI. В качестве ДНК был взят сегмент длиной 73 п. н. из ск-сателлитных повторов хромосомы X человека (Yang et al., 1982),

из которого был сконструирован палиндром длиной соответственно 146 п. н. Коровые гистоны были взяты из Xenopus laevis (африканская шпорцевая лягушка) и экспрессированы в Escherichia coli. При этом гены, кодирующие гистоны, были подвергнуты модификации в соответствие с профилем использования кодонов Е. coli. Четыре коровых гистона — Н2А, Н2В, НЗ и Н4 — образуют октамер (белковый кор), состоящий из двух копий каждого из четырёх гистонов (рисунок 2). днДНК уложена таким образом, что на гистоновый кор намотано примерно 1,7 витка её суперспирали. Позднее была получена аналогичная структура, но с более высоким разрешением 1,9 А (PDB:1KX5) (Davey et al., 2002). Для этого в палиндром была добавлена ещё одна пара оснований вблизи центра последовательности.

Необходимо отметить, что при экспрессии в Е. coli гистоны не подвергаются модификациям, в то время как в реальных условиях наблюдается множество посттрансляционных модификаций (Khorasanizadeh, 2004): аце-тилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование и т. д.

В 2000 году была получена структура, содержащая гистоны из эритроцитов курицы (PDB:1EQZ) (Harp et al., 2000). ДНК, как и ранее, была сконструирована на основе генома человека. В целом, технология приготовления кристаллов с биологическими макроструктурами, такими как нуклеосомы, использует нетривиальные подходы. Например, данная структура была получена в условиях микрогравитации на борту космического корабля «Space Shuttle» (NASA).

Так как в этом случае белки выделяли из нативных ядер, гистоны могли подвергаться модификациям. Действительно, анализ гистона НЗ из эритроцитов курицы с помощью масс-спектрометрии показал, что лизины 9, 14, 27, 36 и 79 метилированы, а 18 и 23 ацетилированы (Zhang et al, 2002). Тем не менее, существенных отличий от ранее известных пространственных структур нуклеосом обнаружено не было.

Кроме этих структур в базе PDB есть около десятка структур, полученных из Sin мутантов дрожжей (Muthurajan et al, 2004). В дрожжах присутствует ремоделирующий фактор SWI/SNF, функция которого заключается в перемещении нуклеосомы по цепи днДНК. Этот фактор жизненно важен, при его инактивации клетка погибает.

10 HAI 6 IM

Рисунок 2. Структура пуклеосомы (PL)В: 1 ЛОТ). Показаны дна изображения одной структуры, по, [ученные поворотом па 90 в плоскости, перпеп. щкулярной плоскости рисунка. Гпстоиы (показаны шариками рпзпых цветов) образуют белковый кор. вокруг которою на,мотало около 1.7 витка суперепирали диДПК. С"rpe.fiкоп (слова) отмочено направление осп псевдосиммефпи второго порядка. также1 выделены две центральные пары нуклеотидов, через которую проходит тта ось. В пцжпей части рисунка Показаны характерные размеры нукдеосомы

Существую! дрожжи, имеющие мутации в гпетонах. способные выживать Цсз с]эш<шра SW Г SNF (SWI SNF indeperidonl. или Sin. мутанты). Были получены структуры пуклеосом с этими мутациями, которые, как оказалось, локализованы в области контакта гиетонов ИЗ и Н4 о дпДНК. RM|fD -mix структур порядка 0.1 0.6 А по сравнению с лнким типом, т.е. значительные отличия, затрагивающие нею структуру, отсутствуют.

При более детальном анализе структур пуклеосом пз Sin мутантов выявляется ряд отличий. Например. Thr 1 18 НЗ образуем водородную связь

с Arg45/H4. При замене треонина на изолейцин или гистидин Arg45/H4 смещается в малую канавку, что приводит к сдвигу фосфатного остова и невозможности образования водородных связей между гистоном НЗ и днДНК. Возможно, такой сдвиг аргинина связан со стерическими причинами, так как изолейцин и гистидин имеют большие боковые группы. Есть и другие Sin мутанты по этому положению, в том числе с заменой на аланин. При этом также наблюдается сдвиг Arg45/H4. Таким образом, ключевую роль в образовании контакта гистон—днДНК играет водородная связь между Thrll8/H3 и Arg45/H4, стабилизирующая положение последнего.

Всего таких контактов разрушается от 2 до 6 из общего количества ~ 120. Таким образом, малые изменения во взаимодействии днДНК и коровых гистонов могут оказать существенное влияние на стабильность и подвижность нуклеосом (Muthurajan et al., 2004).

Недавно в центромерах, где вместо гистона НЗ присутствует специальный гистон СепНЗ, были in vivo обнаружены субнуклеосомные структуры (Dalai et al., 2007). По данным ЭМ хроматин в центромерах упакован менее плотно, длина линкерных участков значительно превышает обычные значения. Кроме того, измерения высоты частиц с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) показали, что нуклеосомы с гистоном СепНЗ имеют меньшую высоту по сравнению с обычными нуклеосомами. Биохимические эксперименты продемонстрировали, что длина днДНК в составе субнуклеосомной частицы около 100—120 п. н., в то время как обычно она составляет 150—170 п. н. По результатам всех исследований авторы сделали вывод о том, что при участии гистона СепНЗ образуется не октамер, а тетрамер коровых гистонов, и, соответственно, в частице присутствует только один виток суперспирали днДНК.

Кроме мутаций и модификаций гистонов, на стабильность нуклеосом может влиять последовательность ДНК (Segal et al., 2006). Были исследованы относительные частоты встречаемости динуклеотидов АА/ТТ/ТА и GC в зависимости от их положения в структуре нуклеосомы. Данные получены по экспериментам как с синтетическими последовательностями, так и с нуклеосомами из клеток дрожжей. Авторы обнаружили, что динуклеотиды распределены с периодом порядка 10 п. н., что отвечает

витку спирали днДНК. При этом встречаемость динуклеотидов GC смещена на половину периода. Одним из объяснений обнаруженных преференций может быть зависимость механических свойств днДНК от конкретной последовательности, в частности, способности изгибаться, что важно для стабильности нуклеосом (Garcia et al, 2006). В результате проведённых исследований была создана модель нуклеосомы с характерным периодическим расположением динуклеотидов АА/ТТ/ТА и GC. С использованием этой модели был разработан алгоритм для предсказания положения нуклеосом в последовательности генома. Оказалось, что примерно половина экспериментально установленных сайтов образования нуклеосом может быть предсказана данным методом (Segal et al., 2006).

В 2008 году было осуществлено картирование сайтов образования нуклеосом в Т-клетках человека, что позволило определить 438 652 таких сайтов (Schönes et al, 2008; Zhang et al, 2008). Оказалось, что все определённые сайты соответствуют весьма схожим последовательностям ДНК, обладающим рядом характерных свойств. В частности, GC-состав (относительное содержание гуанина и цитозина в молекуле ДНК) сайтов образования нуклеосом совпадает со средним по геному значением для линкерных участков и является повышенным для днДНК в составе нуклеосомы (Reynolds et al., 2010). Авторами был разработан алгоритм поиска сайтов образования нуклеосом в последовательности ДНК, который успешно распознавал данные сайты. Оказалось, что наиболее мощным критерием распознавания сайтов образования нуклеосом являлись частоты встречаемости мононуклеотидов G/C.

Таким образом, принципиальная структура нуклеосомы, как уровня организации генетического материала, более или менее изучена. Из гистонов и днДНК собирается комплекс, который обладает достаточной гибкостью для обеспечения необходимых клеточных процессов и в то же время является исходным материалом для следующего уровня компактизации.

1.2 Компактизация хроматина

Компактизация хроматина достигается за счёт взаимодействия днДНК, гистоновых белков, как коровых, так и линкерных, а также определённого

молекулярного окружения. Одним из факторов, влияющих на организацию нуклеосом, является соотношение гистонов и днДНК (Nikova et al, 2004). В данном эксперименте при помощи атомно-силовой микроскопии (АСМ) наблюдали реассоциацию коровых гистонов и регулярной днДНК, содержащей 12 копий одной и той же последовательности длиной 208 п. н. При соотношении гистонов и днДНК 1:1 наблюдали регулярную структуру, а при соотношении 0,75:1 — нерегулярную. Распределение высот во втором случае имеет несколько пиков, которые соответствуют димерам гистонов Н2А—Н2В, субнуклеоеомным частицам (тетрамерам или гексамерам гистонов) и целым нуклеосомам. При соотношении 1,5:1 образуется плотно упакованная структура, в которой отдельные нуклеосомы неразличимы. Тем не менее, как показали наблюдения изолированной молекулы ДНК в жидкой фазе, эта структура является подвижной. На ряде АСМ-изображений, полученных с временным интервалом 30 с, видны признаки как выпетливания, так и конденсации днДНК.

Другим фактором, влияющим на компактизацию хроматина, является ионная сила раствора (Zlatanova et al., 1998). При её повышении наблюдается увеличение плотности упаковки хроматина. Из сравнения АСМ-изображений следует, что влияние двухзарядных ионов в процессе конденсации значительно выше, чем однозарядных.

Кроме того, известно, что ремоделирующие факторы, в частности, белки ISWI семейства SWI/SNF (раздел 1.1), могут организовывать регулярные массивы нуклеосом (Längst and Becker, 2001; Eberharter and Becker, 2004).

Наконец, присутствие линкерного гистона также может влиять на формирование нитей хроматина (Thoma and Koller, 1977; Thoma et al, 1979). Многочисленные исследования дают различные оценки роли линкерного гистона — от незначительной (Wittig and Wittig, 1977; Yao et al, 1991; Kruithof et al, 2009; Schlick and Perisic, 2009) до существенной (Fujiwara et al, 1989; Bednar et al, 1995, 1998; Leuba et al, 1998; Robinson and Rhodes, 2006).

В 1993 г. была решена структура глобулярного домена гистона Н5 (PDB:1HST) (Ramakrishnan et al, 1993). Белок курицы был экспрессирован в клетках Е. coli, которые росли на среде с селенометионином. Включение селенометионина в состав белка позволило решить фазовую проблему

Lys73, Arg74 и Lys85) связывается с днДНК в области центральной пары нуклеотидов, сайт 2 (Arg42, Arg94 и Lys97) — с линкерной днДНК.

Более поздние исследования структурной организации хроматосомы с использованием метода определения сайтов линкерной ДНК, доступных для растворителя, позволили сопоставить различные молекулярные модели хроматосомы (Meyer et al, 2011). Выяснилось, что, в отличие от модели, предложенной в работе (Brown et al, 2006), глобулярный домен линкерного гистона имеет три сайта связывания с ДНК, взаимодействуя как с ДНК в составе нуклеосомы (в области центральной пары нуклеотидов), так и с обоими линкерными сегментами на протяжении первых (от нуклеосомы) 10 п. н. линкерных ДНК. При этом С-концевой домен образует дополнительные контакты с линкерными ДНК, увеличивая полную длину сайта взаимодействия до 20 п.н. Кроме того, оба линкерных сегмента находятся в контакте друг с другом на протяжении ещё 20 п.н., таким образом, длина полулинкера составляет 40 п. н.

Получение кристаллов комплексов нуклеосом и белков, позволившее бы пролить свет на структуру хроматосомы, представляет собой сложную задачу, и к настоящему моменту решена только одна такая структура, комплекс нуклеосомы (коровые гистоны лягушки Xenopus и последовательность Widom 601 длиной 147 п.н.) и фактора RCC1 из дрозофилы (Makde et al., 2010); детальная организация хроматосомы пока остаётся нерешённой проблемой.

1.3 Структура нити хроматина

Из имеющихся экспериментальных данных более или менее определённо известна только общая структурная информация о нитях хроматина. Методом ЭМ установлен их диаметр — около 10 и 30 нм (Oudet et al, 1975; Finch and Klug, 1976). 10-нанометровая нить хроматина представляет собой цепочку нуклеосом с относительной линейной плотностью (количество нуклеосом в нити по отношению к диаметру нуклеосомы) равной 1, как было найдено с помощью малоуглового рассеяния рентгеновского излучения (Sperling and Tardieu, 1976). 30-нанометровая нить хроматина

имеет переменную линейную плотность, которая по данным малоуглового рассеяния нейтронов и сканирующей просвечивающей ЭМ составляет от 1 до 6 при концентрации NaCl 0 и >80 мМ, соответственно (Gerchman and Ramakrishnan, 1987). При этом переходных состояний между 10- и 30-нанометровыми нитями не наблюдали. Детальная организация 30-нанометровой нити хроматина является предметом дискуссии.

Нуклеосомы имеют много степеней свободы, что позволяет конструировать из них множество разнообразных структур (Engelhardt, 2007). Если зафиксировать размеры гистонового кора и длину днДНК, то остаются 3 незафиксированных угла: углы а и г] между входящей и исходящей днДНК в плоскости П, параллельной основанию цилиндра, описывающего нуклеосому, и в перпендикулярной плоскости, соответственно, а также угол ß между плоскостями П соседних нуклеосом. Меняя значения этих параметров, можно получить всевозможные структуры. Так, при a G {36°; 108°} получаются структуры с пятикратной симметрией, вариант а = 108° требует большей длины днДНК на нуклеосому (205 п.н.) по сравнению с а — 36° (196 п.н.), при этом область разрешённых углов ß расширяется почти до полных 27Г за исключением значений вблизи 324°. Данный стерический запрет преодолевается при увеличении длины днДНК на нуклеосому до 210 п. н. Ещё большее разнообразие в рамках получившихся структур привносит угол г}. Необходимо отметить, что во всех этих случаях структуры представляют собой регулярные спирали, различающиеся только по количеству нуклеосом на виток и шагу спирали. Диаметр спиралей варьирует в гораздо меньшей степени и составляет от 25 до 40 нм.

Кроме стерических запретов, существуют и другие ограничения, например, в работе Scipioni et al. (2010) были проанализированы возможные варианты укладки нуклеосом в плотную структуру с минимальными отклонениями структуры линкерной днДНК от энергетически выгодной кон-формации. Оказалось, что, в зависимости от длины днДНК на нуклеосому, разрешённым является ограниченное число классов спиральных структур. Тем не менее, спектр возможных структур избыточен по отношению к известным граничным условиям, так, спирали класса 13/5 (количество нуклеосом на виток/количество витков в периодическом

элементе структуры) имеют диаметр около 34 нм для 177, 187 и 197 п. н. днДНК на нуклеосому, что не позволяет сделать однозначных выводов об организации 30-нанометровой нити хроматина.

Способы укладки нуклеосом в плотную нить хроматина широко обсуждаются в литературе с момента получения первых электронных микрофотографий (Finch and Klug, 1976; Thoma and Koller, 1977; Butler, 1984; Woodcock et al, 1984; Gerchman and Ramakrishnan, 1987; Bartolomé et al, 1994; Bednar et al, 1995, 1998; Robinson and Rhodes, 2006; Woodcock, 2006; Wong et al, 2007; Woodcock and Ghosh, 2010; Fussner et al, 2011). Основными являются две модели — модель «соленоид» (Finch and Klug, 1976; McGhee et al, 1983) и модель «зигзаг» (Thoma et al, 1979; Woodcock et al, 1984). В модели «соленоид» цепочка нуклеосом закручена в суперспираль, на один виток которой приходится 6 нуклеосом, при этом шаг спирали составляет 11 нм. Структура стабилизируется за счёт белок-белковых взаимодействий коровых гистонов. В модели «зигзаг» входящие и выходящие нити днДНК образуют контакт, стабилизируемый линкерным гистоном, в результате чего получается плотная спиралеобразная упаковка, характеризующаяся большим расстоянием между соседними по цепи нуклеосомами по сравнению с расстояниями между нуклеосомами, разделёнными одной (или более) нуклеосомой.

В ряде экспериментов с помощью крио-ЭМ исследовали нити хроматина из эритроцитов курицы (Bednar et al, 1995, 1998). В методике крио-ЭМ образец в водном растворе подвергается сверхбыстрой заморозке, вода переходит в твёрдое аморфное состояние и фиксирует образец. Новая техника приготовления образцов позволила улучшить разрешение примерно на порядок, по сравнению со снимками 1970-х годов, которые положили начало исследованиям структуры хроматина. Получаемые данные позволяют определить относительное местоположение нуклеосом в образце, тем не менее, их недостаточно, чтобы узнать детали механизма компактизации отдельных цепочек нуклеосом в плотные нити. Авторами была предложена следующая модель нити хроматина. В зависимости от ионной силы раствора меняется угол между входящими и исходящими линкерными сегментами, что приводит к различным зигзагообразным структурам. Параметры

Таблица 1 (Bednar et al, 1998, табл. 1). Сравнение значений линейной плотности хроматина, полученных различными методами

Ионная сила, мМ (М+) Среднее значение угла между линкерами, полученное из анализа микрофотографий Расчётное значение линейной плотности хроматина, о. е. Значение линейной плотности хроматина, полученное экспериментально (Gerchman and Ramakrishnan, 1987), o.e.

5 85° 1,6 1,5

15 45° со 3,2

80 35° 5,9 6,0

этих структур согласуются с данными, полученными экспериментальными методами (таблица 1), что говорит в пользу модели «зигзаг». Важным свойством такой модели является то, что она допускает различные уровни компактизации без существенных структурных перестроек.

В работе Hammermann et al (2000) с помощью малоуглового рассеяния нейтронов и седиментационных исследований были определены меж-нуклеосомные расстояния в ди- и тринуклеосомных частицах, выделенных из ядер эритроцитов курицы и клеточной линии из почек обезьяны, при различных концентрациях NaCl. Было установлено, что для динуклеосом при увеличении концентрации с 5 до 100 мМ NaCl межнуклеосомные

о о

расстояния уменьшаются с 220 до 150 А и со 180 до 140 А, соответственно. Тринуклеосомы имеют несколько отличный механизм компактизации: при концентрации NaCl менее 20 мМ расстояния между соседними по цепи нуклеосомами остаются постоянными, но уменьшается угол между входящим и исходящим линкерными сегментами при центральной нуклеосоме. При увеличении концентрации NaCl (более 20 мМ) начинают уменьшаться и межнуклеосомные расстояния.

Для изучения влияния ионной силы раствора на упаковку нуклеосом была построена квазимолекулярная модель нуклеосомы (Beard and Schlick, 2001). Каждая нуклеосома, а также линкерная днДНК были представлены в виде совокупности заряженных шариков, создающих такой же электростатический потенциал, как и более детальная полноатомная модель. Затем были проведены in silico эксперименты по молекулярной динамике ди- и тринуклеосом для различных значений ионной силы, в

результате были получены характерные структурные мотивы упаковки нуклеосом, в которых линкер был изогнут, но соседние нуклеосомы не контактировали друг с другом. Оказалось, что степень изгиба линкера пропорциональна ионной силе, при высоких её значениях нуклеосомы максимально сближены.

При использовании полученных мотивов в качестве периодических элементов образуются структуры диаметром около 30 нм, соответствующие модели «зигзаг». Рассчитанные для этих структур спектры малоуглового рассеяния рентгеновского излучения находятся в согласии с полученными экспериментально (Fujiwara et al, 1989; Fujiwara, 1992). Более того, рассчитанные для динуклеосом коэффициенты диффузии оказались близки к определённым в работе Bednar et al. (1995), авторы которой также интерпретируют полученные данные в пользу модели «зигзаг». Однако, это противоречит более ранним экспериментам по определению коэффициентов диффузии динуклеосом (Yao et al, 1990, 1991), поддерживающим модель «соленоид», в которой соседние нуклеосомы образуют контакт.

Молекулярно-динамические исследования, проведённые для существенно более длинных структур (12 и 24 нуклеосомы) с использованием расширенной модели, включающей линкерный гистон, показали, что при длине днДНК 173 п. н. на нуклеосому получаются только упаковки типа «зигзаг», в то время как для длины 209 п. н. возможны оба типа упаковки (Schlick and Perisic, 2009), что, по мнению авторов, обеспечивает большую гибкость при компактизации хроматина.

Были проведены эксперименты по измерению динамических характеристик нити хроматина методом силовой спектроскопии единичных молекул с помощью лазерной ловушки (Cui and Bustamante, 2000). Суть эксперимента состояла в том, что к нити хроматина (выделенного из ядер эритроцитов курицы) присоединяют шарик из полистирола, затем один из шариков захватывают микропипеткой, а второй — лазерным пинцетом. Смещение микропипетки приводит к деформации нити хроматина. В эксперименте измеряли профиль растяжения и восстановления хроматина в координатах сила/растяжение. Анализ полученных данных говорит в пользу модели «зигзаг», при этом энергия связывания нуклеосом в структуре хроматина

составляет порядка 3,4 кТ на нуклеосому.

Аналогичные эксперименты с применением магнитного пинцета для нитей хроматина показали, что профили растяжения/восстановления в области малых сил (до 3 пН) могут быть интерпретированы в рамках простейшего приближения упругой пружины, описываемого законом Гука (Kruithof et al, 2009). Сопоставление характерных свойств с профилем растяжения, рассчитанным для различных моделей нити хроматина, поддерживало модель «соленоид», при этом длина днДНК на нуклеосому составляла 197 п. н., а линейная плотность — 1,6—2,0 нм на нуклеосому. Дополнительные эксперименты с добавлением линкерного гистона не изменили общей картины упругого растяжения, оказывая влияние на стабильность нити хроматина только в области болыпйх сил (свыше 6 пН). Анализ профилей растяжения также позволил оценить энергию взаимодействия нуклеосом в нити хроматина, которая оказалась равной 14 кТ.

Сравнивая полученные результаты с данными более ранних работ, авторы указали (Kruithof et al, 2009), что в исследовании (Cui and Bustamante, 2000) использовали нити хроматина, обладающими другими характеристиками (длина днДНК на нуклеосому была 167 п.н.), наблюдаемые в отличных от данного эксперимента условиях, а именно, при низкой ионной силе и в отсутствие двухвалентных ионов, которые существенным образом влияют на компактизацию хроматина. Были проведены измерения для нитей хроматина с длиной днДНК на нуклеосому, равной 167 п. н. Полученные профили также описываются законом Гука, однако первоначальная длина нитей оказалась больше, а относительное удлинение — меньше, чем в первой серии экспериментов, при этом коэффициент жёсткости вырос в 2,7 раза. Авторы интерпретировали эти данные в пользу модели «зигзаг», заключая, что основным фактором, влияющим на организацию нити хроматина, является длина днДНК на нуклеосому.

В 2005 году методом рентгеноструктурного анализа была получена структура тетрануклеосомы с разрешением 9 A (PDB:1ZBB) (Schalch et al, 2005). днДНК в этой структуре представляет собой 4 копии специальной последовательности длиной 147 п. н. с линкерными участками длиной 20 п.н., линкерный гистон отсутствовал, компактизация была достигнута

за счёт высокой концентрации двухзарядных катионов. Из копий исходной структуры была построена спиральная модель укладки тетрануклеосом в регулярную структуру, которая соответствует модели «зигзаг» с диаметром спирали 25 нм.

Были построены и альтернативные модели нити хроматина на основе кристаллической структуры тетрануклеосомы, но для 177 п. н. на нуклео-сому (Robinson et al., 2006). Из сравнения этих моделей с микрофотографиями структур, полученных для высокорегулярной днДНК и полного набора гистонов с помощью крио-ЭМ, был сделан вывод о том, что модель «соленоид» описывает наблюдаемую структуру лучше.

Итак, большинство экспериментальных данных говорит в пользу модели «зигзаг», хотя в ряде экспериментальных и теоретических исследований (Kruithof et al., 2009; Schlick and Perisic, 2009) получены доказательства существования структур, описываемых обеими моделями. Тем не менее, в работе Castro-Hartmann et al. (2010) методом трансмиссионной ЭМ были исследованы частично денатурированные хромосомы клеток HeLa и авторы не обнаружили признаков какой-либо регулярной упаковки нуклеосом. По мнению ряда исследователей (van Holde and Zlatanova, 1995; Tremethick, 2007; Fussner et al, 2011), накапливающиеся данные свидетельствуют об отсутствии регулярной структуры 30-нанометровой нити хроматина, а все наблюдения могут быть интерпретированы с использованием модели нерегулярной упаковки 10-нанометровой нити хроматина.

Таким образом, несмотря на многолетнее изучение структуры нити хроматина с использованием богатого арсенала экспериментальных и теоретических методов и прогресс в понимании её устройства, вопрос об организации нити хроматина всё ещё остаётся открытым.

1.4 Структура хроматина на уровне ядра

Основными объектами исследования при изучении структуры хроматина являются отдельные нуклеосомы и нити хроматина. Исследование же целых ядер представляет собой нетривиальную задачу, и в настоящее время имеется весьма ограниченная информация о структуре хроматина на уровне ядра.

Сейчас считается, что организация хромосом в ядре неслучайна и характеризуется наличием так называемых хромосомных территорий — наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии областей ядра диаметром около 2 мкм (для хромосом человека), в которых преимущественно локализованы определённые хромосомы (Meaburn and Misteli, 2007). Функциональная роль и внутренняя структура хромосомных территорий являются предметом дискуссии, предложено несколько теоретических моделей их строения. Однако, экспериментальные исследования могут дать лишь общую структурную информацию.

Так, методом флуоресцентной гибридизации in situ для интерфазных хромосом человека в трёхмерном пространстве были измерены средние значения расстояний между флуоресцентными маркерами, находящимися на расстояниях в цепи ДНК от 1,5 х 105 до 1,9 х 108 п.н. (Yokota et al., 1995; Miinkel et al, 1999). При построении полученных среднеквадратичных расстояний в двойном логарифмическом масштабе оказалось, что график этой зависимости описывается двумя линейными аппроксимациями с коэффициентами углового наклона, равными 0,46 и 0,32 для меньших и больших размеров соответственно, при этом точка кроссовера была около 1 мкм (2 х 106 п.н. « 104 нуклеосом). Эти данные были интерпретированы в рамках двух различных геометрических моделей: до точки кроссовера хроматин ведёт себя как случайная цепь, а после — как плотная глобула.

В последнее время получила развитие техника фиксации конформации хромосом (методы ЗС, 4С, 5С), позволяющая установить взаимодействие близкорасположенных участков геномной днДНК. В сочетании с массивным секвенированием данная методика позволила установить контакты внутри гаплоидного генома одного из простейших эукариот Saccharomyces cerevisiae (геном состоит из 16 хромосом общим размером 12x106 п.н.) с разрешением порядка 103 п.н. и построить его трёхмерную модель (Duan et al, 2010).

Недавние исследования внутренней структуры ядра выявили фрактальную организацию хроматина (McNally and Mazza, 2010). В одной из работ применили новую экспериментальную технику фиксации конформации генома (метод Hi-C) к ядрам лимфобластной клеточной линии человека (Lieberman-Aiden et al, 2009). Суть метода заключается в фиксации ядерной

днДНК при помощи формальдегида, последующей обработке нуклеазой с образованием «липких» концов, лигировании разрывов биотинированными нуклеотидами (с образованием молекул днДНК, содержащих гибридные последовательности близкорасположенных в пространстве участков генома), выделении и нарезке днДНК на небольшие фрагменты с использованием другой нуклеазы, экстракции фрагментов с биотином и их секвенировании. После сопоставления полученной библиотеки сшитых последовательностей с эталонной последовательностью генома человека, была составлена карта внутри- и межхромосомных контактов с разрешением порядка 106 п. н. На основе этой карты была вычислена вероятность контакта как функция от расстояния а в цепи ДНК; оказалось, что вероятность контакта пропорциональна 1 /а для интервала значений а от 0,5 до 7,0 х 106 п. н. Такое поведение согласуется с моделью фрактальной глобулы (Grosberg et al, 1993), которая предсказывает значение фрактальной размерности, равное 3.

Наблюдения за диффузией флуоресцентных меток in vivo в ядрах клеток почки крысы и фибробластов мыши также поддерживают гипотезу о фрактальной организации хроматина (Bancaud et al, 2009). Полученные с помощью методов флуоресцентной корреляционной спектроскопии для диффузии олигомеров зелёного флуоресцентного белка, прямого наблюдения за перемещениями одиночной квантовой точки и локальной фотоактивации взаимодействующих с хроматином белковых маркеров данные были интерпретированы в рамках теории аномальной диффузии, описывающей поведение частиц во фрактальной среде. Авторы рассчитали фрактальные размерности эухроматина (2,6) и гетерохроматина (2,2), которые оказались близки к оценкам фрактальной размерности (2,3—2,4), сделанным на основе древовидной фрактальной модели второго порядка (Takahashi, 1989).

В нашей лаборатории были получены спектры МУРН для нативных ядер из эритроцитов курицы (Lebedev et al, 2005) и других типов клеток (Исаев-Иванов и др., 2010). Спектры МУРН имели линейные участки в двойном логарифмическом масштабе для широкого интервала размеров (от 15 нм до 1,5 мкм), что говорит о фрактальной природе исследованной системы (Schmidt, 1989). Фрактальная размерность хроматина (рассчитанная как коэффициент углового наклона линейных участков спектров МУРН,

(М) 0

о 2 -

0-

-2

-О'к г/з

Г|-1-1-1-1—I I II |-1-1-1-1—I I I I |

-|-1-1-1—I I III

1Е-4

1Е-3

0.01

0.1

О, А

-1

Рисунок 3 (ЬеЬес1еу еЬ а1, 2005, рис. 2). Спектр МУРН для ядер эритроцитов курицы в тяжёлой воде ЭгО. Символами □ отмечены экспериментальные точки, сплошными линиями показаны линейные участки и область Гинье. Вычисленный радиус гирации составил 1,1 мкм, что соответствует диаметру сферической частицы, равному 2,8 мкм

взятый с обратным знаком) составила 2,4 для размеров менее 420 нм и ~ 3 для больших размеров (рисунок 3). Интересно, что фрактальная размерность белковой компоненты ядра (64 % Б20) была равной 2,5 практически для всего интервала размеров, в то время как фрактальная размерность ДНК (40 % БгО) изменялась скачкообразно с 2,2 для размеров менее 250 нм до ~ 3 для больших размеров.

Таким образом, имеющиеся экспериментальные данные говорят о двухуровневой фрактальной организации хроматина. В области малых размеров фрактальная размерность составляет 2,2—2,6 (случайная цепь с преобладанием притяжения над отталкиванием звеньев), в области болынйх — близка к 3 (плотная глобула).

1.5 Малоугловое рассеяние нейтронов

Спектр МУРН — это зависимость интенсивности рассеяния I от величины вектора рассеяния 5 = |. Для получения информации о структуре объекта на основе такого спектра вычисляются функция автокорреляции 7(г) и функция распределения парных расстояний (ФРПР) Р(г)^ (Свергун и Фейгин, 1986):

с»

(1Л)

Р(г) = 7 (г)г2.

Обратно, если известны функция автокорреляции или ФРПР, то можно вычислить спектр МУРН:

оо

ОД = 4тг [ Р(г)=^ск. (1.2)

и вт

о

Для сравнения двух спектров МУРН используется интегральный фактор расходимости (Свергун и Фейгин, 1986):

Г"" Пз)>2 а«

Аналитическое вычисление /(з) возможно лишь для простейших геометрических тел. Для объектов со сложной структурой применяют различные модели. Наиболее простым способом моделирования является представление объекта совокупностью N однородных шаров, имеющих определённые радиус Ш и плотность длин рассеяния (ПДР) р°:

Л , |г-г1|>^;

N

р(г) = ^рЦг),

1=1

* Строго говоря, ФРПР имеет явный геометрический смысл только для объектов с однородной плотностью длин рассеяния, т.н. ФРПР однородной частицы (ФРПРОЧ).

где fi — координаты г-го шара. В этом случае спектр МУРН можно рассчитать по формуле Дебая (Debye, 1915; Свергун и Фейгин, 1986):

N N . / N

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Илатовский, Андрей Владимирович

Основные результаты и выводы

1. Разработан новый метод расчёта спектров малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН), основанный на Монте-Карло моделировании распределения парных расстояний.

2. Установлено, что разработанный метод расчёта спектров МУРН применим для систем, состоящих из ~ Ю10 атомов.

3. Разработан алгоритм генерации фрактальных структур на основе преобразования самоподобия.

4. Показано, что разработанный алгоритм фрактальной генерации над-нуклеосомных структур позволяет создавать фрактальные структуры с заданным значением фрактальной размерности в интервале 2 < с18 < 3 или с двумя различными значениями фрактальной размерности (структуры с кроссовером).

5. Создан ряд моделей наднуклеосомной структуры хроматина геномного размера, полученных в режимах одноцепочечной и фрактальной генерации.

6. Показано, что спектры МУРН, рассчитанные для фрактальных моделей наднуклеосомной структуры хроматина с кроссовером, удовлетворительно описывают особенности экспериментально наблюдаемых спектров МУРН для целых ядер.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. A. Ilatovskiy, D. Lebedev, M. Filatov, M. Petukhov and V. Isaev-Ivanov, 2012. SANS Spectra of the Fractal Supernucleosomal Chromatin Structure Models. Journal of Physics: Conference Series, 351, 012007 (9 pp.).

2. A. Ilatovskiy, D. Lebedev, M. Filatov, M. Grigoriev, M. Petukhov, V. Isaev-Ivanov, 2011. Modeling and Small-Angle Neutron Scattering Spectra of Chromatin Supernucleosomal Structures at Genome Scale. Journal of Applied Physics, 110, 102217 (9 pp.).

3.E. Руденко, А. Сабанцев, А. Швецов, А. Илатовский, Д. Червякова, M. Григорьев, M. Петухов, 2011. Анализ молекулярных механизмов растяжения коротких фрагментов двухнитевых ДНК. Научно-технические ведомости СПбГПУ, 134: 147-154.

4. A. Ilatovskiy and M. Petukhov, 2009. Genome-Wide Search for Local DNA Segments with Anomalous GC-Content. Journal of Computational Biology, 16: 555-564.

5. А. Илатовский, Д. Лебедев, M. Филатов, M. Петухов, В. Исаев-Иванов, 2011. Спектры МРН для локально-регулярных моделей супернуклеосомных структур хроматина хромосомного размера / / VIII Национальная конференция «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов». Сборник тезисов. — Москва - С. 445.

6. Д. Лебедев, Ю. Гармай, А. Швецов, А. Илатовский, М. Филатов, М. Петухов, В. Исаев-Иванов, 2011. Использование методов нейтронного рассеяния в изучении структуры и динамики нуклеопротеидных комплексов VIII Национальная конференция «Рентгеновское, синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов». Сборник тезисов. — Москва — С. 31.

7. А. Илатовский, Д. Лебедев, М. Филатов, М. Григорьев, М. Петухов, В. Исаев-Иванов, 2011. Расчёт спектров МРН для моделей супернуклео-сомной структуры хроматина // «Биология — наука XXI века»: 15-я Международная Пугцинская школа-конференция молодых учёных. Сборник тезисов. — Пугцино — С. 118.

8. A. Ilatovskiy, D. Lebedev, М. Petukhov, V. Isaev-Ivanov, 2010. SANS Spectra and Modeling of Chromatin Supernucleosomal Structures at Genome Scale // The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11. Abstracts. Evanston, IL, USA. PO-A-45

9. A. Ilatovskiy, Y. Garmaj, A. Shvetsov, D. Lebedev, M. Petukhov, V. Isaev-Ivanov, 2010. Molecular Dynamics and Large-Seale Conformational Flexibility of DNA-binding Proteins // The Eleventh International Conference on Surface X-ray and Neutron Scattering SXNS-11. Abstracts. Evanston, IL, USA. PO-A-46

10. А. Илатовский, 2008. Моделирование супернуклеосомной структуры хроматина // 13 Санкт-Петербургская Ассамблея молодых учёных и специалистов. Сборник аннотаций. — Санкт-Петербург — С. 37.

11. А. Илатовский, М. Петухов, 2008. Расчёт спектров МРН для супернуклеосомной структуры хроматина // «Молодые учёные — промышленности Северо-Западного региона»: Материалы конференций политехнического симпозиума. — Санкт-Петербург —С. 115—116.

12. A. Ilatovskiy, D. Lebedev, М. Petukhov, V. Isaev-Ivanov, 2008. Modelling of the Supernucleosomal Chromatin Structure // Workshop on Neutron Scattering Application for Condensed Matter Investigations. Abstracts. Gatchina, Russia. P. 165.

13. А. Илатовский, M. Петухов, 2007. Моделирование супернуклеосомной структуры хроматина // «Молодые учёные — промышленности Северо-Западного региона»: Материалы конференций политехнического симпозиума. — Санкт-Петербург — С. 119—120.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Илатовский, Андрей Владимирович, 2012 год

Литература

Сергей Валентинович Божокин и Дмитрий Алексеевич Паршин. Фракталы и мулътифракталы. Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2001. - 128 с.

Владимир В. Исаев-Иванов, Дмитрий В. Лебедев, Ханс Лаутер, Римма А. Пантина, Александр И. Куклин, Ахмет X. Исламов, и Михаил В. Филатов. 2010. Сравнительный анализ нуклеосомной структуры клеточных ядер — малоугловое нейтронное рассеяние. Физика твёрдого тела, 52:996-1005.

Дональд Эрвин Кнут. Искусство программирования. Т. 3. Сортировка и поиск : Перевод с английского/ Дональд Э. Кнут; под общей редакцией Ю. В. Козаченко. — 2-е изд. М.: Издательский дом «Вильяме», 2000. — 832 с.

Дмитрий Иванович Свергун и Лев Абрамович Фейгин. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. М.: Наука, 1986. — 280 с.

Илья Меерович Соболь. Численные методы Монте-Карло. М.: Наука, 1973. - 312 с.

Ruben Abagyan and Maxim Totrov. 1994. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. Journal of Molecular Biology, 235:983-1002.

Ruben Abagyan, Maxim Totrov, and Dmitry Kuznetsov. 1994. ICM—A new method for protein modeling and design: Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation. Journal of Computational Chemistry, 15:488-506.

Aurélien Bancaud, Sébastien Huet, Nathalie Daigle, Julien Mozziconacci, Joël Beaudouin, and Jan Ellenberg. 2009. Molecular crowding affects diffusion and binding of nuclear proteins in heterochromatin and reveals the fractal organization of chromatin. EMBO Journal, 28:3785-3798.

Yunhe Bao, Cindy L. White, and Karolin Luger. 2006. Nucleosome core particles containing a poly(da-dt) sequence element exhibit a locally distorted dna structure. Journal of Molecular Biology, 361:617-624.

Salvador Bartolomé, Antonio Bermúdez, and Joan-Ramon Daban. 1994. Internal structure of the 30 nm chromatin fiber. Journal of Cell Science, 107:2983-2992.

Daniel A. Beard and Tamar Schlick. 2001. Computational modeling predicts the structure and dynamics of chromatin fiber. Structure, 9:105-114.

Jan Bednar, Rachel A. Horowitz, Jacques Duboehet, and Christopher L. F. Woodcock. 1995. Chromatin conformation and salt-induced compaction: Three-dimensional structural information from cryoelectron microscopy. Journal of Cell Biology, 131:1365-1376.

Jan Bednar, Rachel A. Horowitz, Sergei A. Grigoryev, Lenny M. Carruthers, Jeffrey C. Hansen, Abraham J. Koster, and Christopher L. F. Woodcock. 1998. Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:14173-14178.

Helen Berman, Kim Henrick, and Haruki Nakamura. 2003. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural & Molecular Biology, 10:980.

M. M. Srinivas Bharath, Nagasuma R. Chandra, and M. R. S. Rao. 2003. Molecular modeling of the chromatosome particle. Nucleic Acids Research, 31: 4264-4274.

Ben E. Black, Melissa A. Brock, Sabrina Bédard, Virgil L. Woods, Jr., and Don W. Cleveland. 2007. An epigenetic mark generated by the incorporation of CENP-A into centromeric nucleosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104:5008-5013.

Gordon F. Bonifacio, Tom Brown, Graeme L. Conn, and Andrew N. Lane. 1997. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophysical Journal, 73:1532-1538.

David T. Brown, Tina Izard, and Tom Misteli. 2006. Mapping the interaction surface of linker histone Hl° with the nucleosome of native chromatin in vivo. Nature Structural & Molecular Biology, 13:250-255.

P. J. G. Butler. 1984. A defined structure of the 30 nm chromatin fibre which accommodates different nucleosomal repeat lengths. EM BO Journal, 3:25992604.

Pablo Castro-Hartmann, Maria Milla, and Joan-Ramon Daban. 2010. Irregular orientation of nucleosomes in the well-defined chromatin plates of metaphase chromosomes. Biochemistry, 49:4043-4050.

Pablo Chacón, Federico Morán, J. Fernando Díaz, E. Pantos, and José M. Andreu. 1998. Low-resolution structures of proteins in solution retrieved from X-ray scattering with a genetic algorithm. Biophysical Journal, 74:2760-2775.

Pablo Chacón, J. Fernando Díaz, Federico Morán, and José M. Andreu. 2000. Reconstruction of protein form with X-ray solution scattering and a genetic algorithm. Journal of Molecular Biology, 299:1289-1302.

Srinivas Chakravarthy and Karolin Luger. 2006. The histone variant macro-H2A preferentially forms "hybrid nucleosomes". Journal of Biological Chemistry, 281: 25522-25531.

Srinivas Chakravarthy and Karolin Luger. Comparative analysis of nucleosome structures from different species, unpublished.

Srinivas Chakravarthy, Sampath Kumar Y. Gundimella, Cecile Caron, PierreYves Perche, John R. Pehrson, Saadi Khochbin, and Karolin Luger. 2005. Structural characterization of the histone variant macroH2A. Molecular and Cellular Biology, 25:7616-7624.

Cedric R. Clapier, Srinivas Chakravarthy, Carlo Petosa, Carlos Fernández-Tornero, Karolin Luger, and Christoph W. Müller. 2008. Structure of the

Drosophila nucleosome core particle highlights evolutionary constraints on the H2A-H2B histone dimer. Proteins, 71:1-7.

International Chicken Genome Sequencing Consortium. 2004a. Sequence and comparative analysis of the chicken genome provide unique perspectives on vertebrate evolution. Nature, 432:695-716.

International Human Genome Sequencing Consortium. 2004b. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature, 431:931-945.

Yujia Cui and Carlos Bustamante. 2000. Pulling a single chromatin fiber reveals the forces that maintain its higher-order structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97:127-132.

Yamini Dalai, Hongda Wang, Stuart Lindsay, and Steven Henikoff. 2007. Tetrameric structure of centromeric nucleosomes in interphase Drosophila cells. PLoS Biology, 5:e218.

Curt A. Davey, David F. Sargent, Karolin Luger, Armin W. Maeder, and Timothy J. Richmond. 2002. Solvent mediated interactions in the structure of

o

the nucleosome core particle at 1.9 A resolution. Journal of Molecular Biology, 319:1097-1113.

Peter Debye. 1915. Zerstreuung von rontgenstrahlen. Annalen der Physik, 351: 809-823.

Zhijun Duan, Mirela Andronescu, Kevin Schutz, Sean Mcllwain, Yoo Jung Kim, Choli Lee, Jay Shendure, Stanley Fields, C. Anthony Blau, and William Stafford Noble. 2010. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature, 465: 363-367.

Anton Eberharter and Peter B. Becker. 2004. ATP-dependent nucleosome remodelling: Factors and functions. Journal of Cell Science, 117:3707-3711.

Rajeswari S. Edayathumangalam, Philipp Weyermann, Joel M. Gottesfeld, Peter B. Dervan, and Karolin Luger. 2004. Molecular recognition of the nucleosomal "supergroove". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101:6864-6869.

Mogens Engelhardt. 2007. Choreography for nueleosomes: the conformational freedom of the nucleosomal filament and its limitations. Nucleic Acids Research, 35:el06.

J. T. Finch and A. Klug. 1976. Solenoidal model for superstructure in chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 73:1897-1901.

J. T. Finch, L. C. Lutter, D. Rhodes, R. S. Brown, B. Rushton, M. Levitt, and A. Klug. 1977. Structure of nucleosome core particles of chromatin. Nature, 269: 29-36.

Satoru Fujiwara. 1992. Interpretation of the X-ray scattering profiles of chromatin at various NaCl concentrations by a simple chain model. Biophysical Chemistry, 43:81-87.

Satoru Fujiwara, Yoji Inoko, and Tatzuo Ueki. 1989. Synchrotron X-ray scattering study of chromatin condensation induced by monovalent salt: Analysis of the small-angle scattering data. Journal of Biochemistry, 106:119-125.

Eden Fussner, Reagan W. Ching, and David P. Bazett-Jones. 2011. Living without 30 nm chromatin fibers. Trends in Biochemical Sciences, 36:1-6.

Hernan G. Garcia, Paul Grayson, Lin Han, Mandar Inamdar, Jane Kondev, Philip C. Nelson, Rob Phillips, Jonathan Widom, and Paul A. Wiggins. 2006. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers, 85:115-130.

S. E. Gerchman and V. Ramakrishnan. 1987. Chromatin higher-order structure studied by neutron scattering and scanning transmission electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84:7802-7806.

A. Grosberg, Y. Rabin, S. Havlin, and A. Neer. 1993. Crumpled globule model of the three-dimensional structure of DNA. Europhysics Letters, 23:373-378.

Markus Hammermann, Katalin Toth, Claus Rodemer, Waldemar Waldeck, Roland P. May, and Jorg Langowski. 2000. Salt-dependent compaction of di- and

trinucleosomes studied by small-angle neutron scattering. Biophysical Journal, 79:584-594.

Joel M. Harp, Bryant Leif Hanson, David E. Timm, and Gerard John Bunick.

o

2000. Asymmetries in the nucleosome core particle at 2.5 A resolution. Acta Crystallographica. Section D: Biological Crystallography, 56:1513-1534.

Thad Alan Harroun, George D. Wignall, and John Katsaras. Neutron Scattering for Biology. Neutron Scattering in Biology, edited by Jorg Fitter, Thomas Gutberlet and John Katsaras. Springer, Heidelberg, 2006. Chapter 1, pp. 118.

Sepideh Khorasanizadeh. 2004. The nucleosome: From genomic organization to genomic regulation. Cell, 116:259-272.

Roger D. Kornberg. 1974. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science, 184:868-871.

Roger D. Kornberg and Jean O. Thomas. 1974. Chromatin structure: Oligomers of the histones. Science, 184:865-868.

Maarten Kruithof, Fan-Tso Chien, Andrew Routh, Colin Logie, Daniela Rhodes, and John van Noort. 2009. Single-molecule force spectroscopy reveals a highly compliant helical folding for the 30-nm chromatin fiber. Nature Structural & Molecular Biology, 16:534-540.

Sandeep Kumar and Manju Bansal. 1996. Structural and sequence characteristics of long a helices in globular proteins. Biophysical Journal, 71:1574-1586.

Gemot Langst and Peter B. Becker. 2001. Nucleosome mobilization and positioning by ISWI-containing chromatin-remodeling factors. Journal of Cell Science, 114:2561-2568.

Dmitry V. Lebedev, Michael V. Filatov, Aleksandr I. Kuklin, Akhmed Kh. Islamov, Emmanuel Kentzinger, Rimma A. Pantina, Boris P. Toperverg, and Vladimir V. Isaev-Ivanov. 2005. Fractal nature of chromatin organization in interphase chicken erythrocyte nuclei: DNA structure exhibits biphasic fractal properties. FEBS Letters, 579:1465-1468.

Sanford H. Leuba, Carlos Bustamante, Jordanka Zlatanova, and Kensal van Holde. 1998. Contributions of linker histones and histone H3 to chromatin structure: Scanning force microscopy studies on trypsinized fibers. Biophysical Journal, 74:2823-2829.

Erez Lieberman-Aiden, Nynke L. van Berkum, Louise Williams, Maxim Imakaev, Tobias Ragoczy, Agnes Telling, Ido Amit, Bryan R. Lajoie, Peter J. Sabo, Michael O. Dorschner, Richard Sandstrom, Bradley Bernstein, M. A. Bender, Mark Groudine, Andreas Gnirke, John Stamatoyannopoulos, Leonid A. Mirny, Eric S. Lander, and Job Dekker. 2009. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science, 326:289293.

Xu Lu, Matthew D. Simon, Jayanth V. Chodaparambil, Jeffrey C. Hansen, Kevan M. Shokat, and Karolin Luger. 2008. The effect of H3K79 dimethylation and H4K20 trimethylation on nucleosome and chromatin structure. Nature Structural & Molecular Biology, 15:1122-1124.

Karolin Luger, Armin W. Mader, Robin K. Richmond, David F. Sargent, and Timothy J. Richmond. 1997. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature, 389:251-260.

Ravindra D. Makde, Joseph R. England, Hemant P. Yennawar, and Song Tan. 2010. Structure of RCC1 chromatin factor bound to the nucleosome core particle. Nature, 467:562-566.

Benoit B. Mandelbrot. The Fractal Geometry of Nature. W. H. Freeman and Co., New York, 1982.

H. B. Mann and D. R. Whitney. 1947. On a test of whether one of two random variables is stochastically larger than the other. Annals of Mathematical Statistics, 18:50-60.

James D. McGhee, Joanne M. Nickol, Gary Felsenfeld, and Donald C. Rau. 1983. Higher order structure of chromatin: Orientation of nucleosomes within the 30 nm chromatin solenoid is independent of species and spacer length. Cell, 33:831-841.

James G MeNally and Davide Mazza. 2010. Fractal geometry in the nucleus. EMBO Journal, 29:2-3.

Karen J. Meaburn and Tom Misteli. 2007. Cell biology: Chromosome territories. Nature, 445:379-381.

Sam Meyer, Nils B. Becker, Sajad Hussain Syed, Damien Goutte-Gattat, Manu Shubhdarshan Shukla, Jeffrey J. Hayes, Dimitar Angelov, Jan Bednar, Stefan Dimitrov, and Ralf Everaers. 2011. From crystal and NMR structures, footprints and cryo-electron-micrographs to large and soft structures: Nanoscale modeling of the nucleosomal stem. Nucleic Acids Research, 39:9139-9154.

Yuko Mitane, Mamoru Nakanishi, Masamichi Tsuboi, Terumi Kohwi-Shigematsu, Takemi Enomoto, and Masa-Atsu Yamada. 1980. Hydrogen-exchange study of a nucleosome. FEBS Letters, 121:130-132.

Yoh-Ichi Miyake, Bunei Syuto, and Hiroshi Kanagawa. 1984. Gene expression of triploidy in six adult intersexual chickens. Japanese Journal of Veterinary Research, 32:143-153.

Christian Miinkel, Roland Eils, Steffen Dietzel, Daniele Zink, Carsten Mehring, Gero Wedemann, Thomas Cremer, and Jörg Langowski. 1999. Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment. Journal of Molecular Biology, 285:1053-1065.

Uma M. Muthurajan, Yunhe Bao, Lawrence J. Forsberg, Rajeswari S. Edayathumangalam, Pamela N. Dyer, Cindy L. White, and Karolin Luger. 2004. Crystal structures of histone Sin mutant nucleosomes reveal altered protein-DNA interactions. EMBO Journal, 23:260-271.

Dessy N. Nikova, Lisa H. Pope, Martin L. Bennink, Kirsten A. van Leijenhorst-Groener, Kees van der Werf, and Jan Greve. 2004. Unexpected binding motifs for subnucleosomal particles revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal, 87:4135-4145.

Michelle S. Ong, Timothy J. Richmond, and Curt A. Davey. 2007. DNA stretching and extreme kinking in the nucleosome core. Journal of Molecular Biology, 368:1067-1074.

P. Oudet, M. Gross-Bellard, and P. Chambon. 1975. Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell, 4:281300.

Jerod Parsons, J. Bradley Holmes, J. Maurice Rojas, Jerry Tsai, and Charlie E. M. Strauss. 2005. Practical conversion from torsion space to Cartesian space for in silico protein synthesis. Journal of Computational Chemistry, 26:10631068.

Mohanan Philip, Moideen Jamaluddin, R. Venkata Rama Sastry, and H. Sharat Chandra. 1979. Nucleosome core histone complex isolated gently and rapidly in 2 M NaCl is octameric. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76:5178-5182.

Uberto Pozzoli, Giorgia Menozzi, Matteo Fumagalli, Matteo Cereda, Giacomo P. Comi, Rachele Cagliani, Nereo Bresolin, and Manuela Sironi. 2008. Both selective and neutral processes drive GC content evolution in the human genome. BMC Evolutionary Biology, 8:99.

V. Ramakrishnan, J. T. Finch, V. Graziano, P. L. Lee, and R. M. Sweet. 1993. Crystal structure of globular domain of histone H5 and its implications for nucleosome binding. Nature, 362:219-223.

Sheila M. Reynolds, Jeff A. Bilmes, and William Stafford Noble. 2010. Learning a weighted sequence model of the nucleosome core and linker yields more accurate predictions in Saccharomyces cerevisiae and Homo sapiens. PLoS Computational Biology, 6:el000834.

Timothy J. Richmond, J. T. Finch, B. Rushton, Daniela Rhodes, and A. Klug.

o

1984. Structure of the nucleosome core particle at 7 A resolution. Nature, 311: 532-537.

Philip J. J. Robinson and Daniela Rhodes. 2006. Structure of the '30 nm' chromatin fibre: A key role for the linker histone. Current Opinion in Structural Biology, 16:336-343.

Philip J. J. Robinson, Louise Fairall, Van A. T. Huynh, and Daniela Rhodes. 2006. EM measurements define the dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: Evidence for a compact, interdigitated structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103:6506-6511.

Andrew Routh, Sara Sandin, and Daniela Rhodes. 2008. Nucleosome repeat length and linker histone stoichiometry determine chromatin fiber structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105:8872-8877.

Thomas Schalch, Sylwia Duda, David F. Sargent, and Timothy J. Richmond. 2005. X-ray structure of a tetranucleosome and its implications for the chromatin fibre. Nature, 436:138-141.

Tamar Schlick and Ognjen Perisic. 2009. Mesoscale simulations of two nucleosome-repeat length oligonucleosomes. Physical Chemistry Chemical Physics, 11:10729-10737.

Paul W. Schmidt. Use of Scattering to Determine the Fractal Dimension. The Fractal Approach to Heterogeneous Chemistry: Surfaces; Colloids7 Polymers, edited by David Avnir. John Wiley k Sons Ltd., New York, 1989. Chapter 2.2, pp. 67-79.

Dustin E. Schones, Kairong Cui, Suresh Cuddapah, Tae-Young Roh, Artem Barski, Zhibin Wang, Gang Wei, and Keji Zhao. 2008. Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome. Cell, 132:887-898.

Anita Scipioni, Giulia Turchetti, Stefano Morosetti, and Pasquale De Santis. 2010. Geometrical, conformational and topological restraints in regular nucleosome compaction in chromatin. Biophysical Chemistry, 148:56-67.

Eran Segal, Yvonne Fondufe-Mittendorf, Lingyi Chen, AnnChristine Thastrom, Yair Field, Irene K. Moore, Ji-Ping Z. Wang, and Jonathan Widom. 2006. A genomic code for nucleosome positioning. Nature, 442:772-778.

Sitong Sheng, Daniel M. Czajkowsky, and Zhifeng Shao. 2006. Localization of linker histone in chromatosomes by cryo-atomic force microscopy. Biophysical Journal, 91:L35-L37.

Linda Sperling and Annette Tardieu. 1976. The mass per unit length of chromatin by low-angle X-ray scattering. FEBS Letters, 64:89-91.

Heinrich B. Stuhrmann. 1970. Interpretation of small-angle scattering functions of dilute solutions and gases. A representation of the structures related to a one-particle scattering function. Acta Crystallographica. Section A: Foundations of Crystallography, 26:297-306.

Hiromu Sugeta and Tatsuo Miyazawa. 1967. General method for calculating helical parameters of polymer chains from bond lengths, bond angles, and internal-rotation angles. Biopolymers, 5:673-679.

Robert K. Suto, Michael J. Clarkson, David J. Tremethick, and Karolin Luger. 2000. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural & Molecular Biology, 7:1121-1124.

Robert K. Suto, Rajeswari S. Edayathumangalam, Cindy L. White, Christian Melander, Joel M. Gottesfeld, Peter B. Dervan, and Karolin Luger. 2003. Crystal structures of nucleosome core particles in complex with minor groove DNA-binding ligands. Journal of Molecular Biology, 326:371-380.

Dmitri I. Svergun. 1999. Restoring low resolution structure of biological macromolecules from solution scattering using simulated annealing. Biophysical Journal, 76:2879-2886.

Dmitri I. Svergun and Michel H. J. Koch. 2003. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics, 66: 1735-1782.

Dmitri I. Svergun, V. V. Volkov, M. B. Kozin, and Heinrich B. Stuhrmann. 1996. New developments in direct shape determination from small-angle scattering. 2. Uniqueness. Acta Crystallographica. Section A: Foundations of Crystallography, 52:419-426.

Dmitri I. Svergun, V. V. Volkov, M. B. Kozin, Heinrich B. Stuhrmann, C. Barberato, and M. H. J. Koch. 1997. Shape determination from solution scattering of biopolymers. Journal of Applied Crystallography, 30:798-802.

Dmitri I. Svergun, S. Richard, M. H. J. Koch, Z. Sayers, S. Kuprin, and G. Zaccai. 1998. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95:2267-2272.

Dmitry I. Svergun, C. Barberato, and M. H. J. Koch. 1995. CRYSOL—a program to evaluate X-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. Journal of Applied Crystallography, 28:768-773.

Manabu Takahashi. 1989. A fractal model of chromosomes and chromosomal DNA replication. Journal of Theoretical Biology, 141:117-136.

F. Thoma and Th. Koller. 1977. Influence of histone HI on chromatin structure. Cell, 12:101-107.

F. Thoma, Th. Koller, and A. Klug. 1979. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. Journal of Cell Biology, 83:403-427.

David J. Tremethick. 2007. Higher-order structures of chromatin: The elusive 30 nm fiber. Cell, 128:651-654.

Yasuo Tsunaka, Naoko Kajimura, Shin-ichi Tate, and Kosuke Morikawa. 2005. Alteration of the nucleosomal DNA path in the crystal structure of a human nucleosome core particle. Nucleic Acids Research, 33:3424-3434.

Kensal van Holde and Jordanka Zlatanova. 1995. Chromatin higher order structure: Chasing a mirage? Journal of Biological Chemistry, 270:8373-8376.

Dirk Walther, Fred E. Cohen, and Sebastian Doniach. 2000. Reconstruction of low-resolution three-dimensional density maps from one-dimensional small-angle X-ray solution scattering data for biomolecules. Journal of Applied Crystallography, 33:350-363.

Cindy L. White, Robert K. Suto, and Karolin Luger. 2001. Structure of the yeast nucleosome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions. EMBO Journal, 20:5207-5218.

Burghardt Wittig and Stephanie Wittig. 1977. Nucleosome mono-, di-, tri-, and tetramers from chicken embryo chromatin. Nucleic Acids Research, 4:3901-3917.

Hua Wong, Jean-Marc Victor, and Julien Mozziconacci. 2007. An all-atom model of the chromatin fiber containing linker histones reveals a versatile structure tuned by the nucleosomal repeat length. PLoS ONE, 2:e877.

Christopher L. F. Woodcock. 2006. Chromatin architecture. Current Opinion in Structural Biology, 16:213-220.

Christopher L. F. Woodcock and Rajarshi P. Ghosh. 2010. Chromatin higherorder structure and dynamics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2: a000596.

Christopher L. F. Woodcock, L.-L. Y. Frado, and J. B. Rattner. 1984. The higher-order structure of chromatin: Evidence for a helical ribbon arrangement. Journal of Cell Biology, 99:42-52.

Bin Wu, Peter Droge, and Curt A. Davey. 2008. Site selectivity of platinum anticancer therapeutics. Nature Chemical Biology, 4:110-112.

Thomas P. Yang, Suzanne K. Hansen, Karen K. Oishi, Oliver A. Ryder, and Barbara A. Hamkalo. 1982. Characterization of a cloned repetitive DNA sequence concentrated on the human X chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 79:6593-6597.

J. Yao, P. T. Lowary, and J. Widom. 1990. Direct detection of linker DNA bending in defined-length oligomers of chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 87:7603-7607.

J. Yao, P. T. Lowary, and J. Widom. 1991. Linker DNA bending induced by the core histones of chromatin. Biochemistry, 30:8408-8414.

Hiroki Yokota, Ger van den Engh, John E. Hearst, Rainer K. Sachs, and Barbara J. Trask. 1995. Evidence for the organization of chromatin in megabase pair-sized loops arranged along a random walk path in the human G0/G1 interphase nucleus. Journal of Cell Biology, 130:1239-1249.

Kangling Zhang, Hui Tang, Lan Huang, James William Blankenship, Patrick Ray Jones, Fan Xiang, Peter M. Yau, and Alma L. Burlingame. 2002. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrixassisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry, 306:259-269.

Yong Zhang, Hyunjin Shin, Jun S. Song, Ying Lei, and X. Shirley Liu. 2008. Identifying positioned nucleosomes with epigenetic marks in human from ChlP-Seq. BMC Genomics, 9:537.

Jordanka Zlatanova, Sanford H. Leuba, and Kensal van Holde. 1998. Chromatin fiber structure: Morphology, molecular determinants, structural transitions. Biophysical Journal, 74:2554-2566.