Меченный фосфором-32 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат - ингибитор репликации ВИЧ, его получение и метаболизм в клетке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат химических наук Январёв, Дмитрий Васильевич

• Январёв, Дмитрий Васильевич
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Январёв, Дмитрий Васильевич

1. Список сокращений.стр.

2. Литературный обзор. "Методы получения нуклеозид 5'-монофосфатов и их применение для синтеза [32Р]-меченых нуклеотидов"

2.1 Прямое фосфорилирование действием фосфорной кислоты и её солей.стр.

2.2 Фосфорилирование через активацию гидроксильной группы

2.2.1 Активация арилсульфохлоридами.стр.

2.2.2 Активация металлорганическими соединениями.стр.

2.3 Этерификация моноэфирами фосфорной кислоты.стр.

2.4 Триалкилфосфиты как фосфорилирующие агенты.стр.

2.5 Галогениды фосфора.стр.

2.6 Агенты, активирующие фосфорную компоненту:

2.6.1 Карбодиимиды.стр.

2.6.2 Арилсульфохлориды.стр.

2.7 Другие фосфорилирующие реагенты.стр.

2.8 Биосинтетические и ферментативные методы фосфорилирования.стр.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Синтез 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-5'-(холин-[ Р]-фосфата).стр.

3.2 Изучение внутриклеточного метаболизма

3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-(холин-[32Р]-фосфата).стр.

3.3 Оценка ферментативной стабильности.стр.

4. Экспериментальная часть.стр.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Январёв, Дмитрий Васильевич

выводы

1. Показано, что 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфат является депо-формой АЗТ, а образовавшийся в процессе внутриклеточного гидролиза холинфосфат участвует в клеточном метаболизме, включаясь в липиды.

2. Сравнительный анализ динамики проникновения в клетки НЬ-60 З'-азидо-З'-дезокситимидин-5'-холинфосфата и АЗТ показал, что после 8 ч инкубации внутриклеточная концентрация АЗТ, образовавшегося из З'-азидо-З'дезокситимидин-5'-холинфосфата, выше, чем при проникновении самого АЗТ.

3. Выявлены различия в динамике проникновения 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата в микромолярных и наномолярных концентрациях.

4. Повышение анти-ВИЧ активности 3'-азидо-3'-дезокситимидин-5'-холинфосфата, очевидно, обусловлено не спецификой внутриклеточного метаболизма, а особенностью динамики проникновения в клетку.

5а. Разработан эффективный метод фосфорилирования первичных спиртов Рфосфорной кислотой с использованием ВгСК.

5Ь. Разработан метод синтеза 32Р-меченых фосфодиэфиров АЗТ.

4. Экспериментальная часть Материалы и методы

В работе использовали 5 М BrCN в ацетонитриле, МСС и Н3РО4 (Merck), DCC, TCN, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота (Fluka). [32Р]-ортофосфорная кислота получена из Института реакторных материалов (Заречный, Свердловская обл.), AZT любезно предоставлен ассоциацией AZT (Москва). [3H]-AZT был синтезирован в Институте Молекулярной Генетики РАН (Москва). Сыворотка крови человека любезно предоставлена Гематологическим Научным Центром РАМН (Москва). Фосфолипазу С змеиного яда (Crotalus adamanteus), фосфодиэстеразу змеиного яда (Crotalus attrox) и 5'-нуклеотидазу змеиного яда (Crotalus attrox) (Sigma).

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Shimadzu УФ-1201 (Япония). 'Н-ЯМР-спектры получены на спектрометре Bruker АМХ III-400 (400 МГц). 31Р-ЯМР-спектры - на том же приборе с рабочей частотой 162 МГц при подавлении фосфор-протонного спин-спинового взаимодействия с 85% Н3РО4 в качестве внешнего стандарта. ВЭЖХ осуществляли на хроматографе Gilson (Франция), с УФ-детектором тип 115 и проточным детектором радиоактивности тип 170, используя колонку (4 х 150 мм) Lichrosorb RP-18 (5 мкм), с градиентной элюцией в ион-парном режиме. Раствор А: 50 мМ ТЕАВ, раствор В: 75% этанол, скорость элюции 0,5 мл/мин. Элюция по программе: 0-5 мин (0% В), 5-10 мин (0->20% В), 10-30 мин (20-^30% В). Время удерживания соединения (2) - 14 мин, AZT - 20 мин, дифосфата (4) - 23 мин. Для ТСХ использовали пластинки Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) и элюирующие системы хлороформ-метанол 9 :1 (система А), диоксан-iPrOН-вода-25% водный NH3 3:3:3:1 (система В). Детектирование радиоактивных продуктов реакции проводили авторадиографически и с помощью Instant Imager Electronic Autoradiography (Packard Instrument Company, США). Количественный анализ реакционных смесей на пластинках ТСХ осуществляли на этом же приборе с использованием прилагаемого программного обеспечения.

Электрофорез выполняли в камере для горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле (60 х 30 мм), толщина геля 3-4 мм, электродный буфер 20 мМ однозамещенный фосфат натрия (рН 4,3). Напряжение 400 В, время разделения 10-12 мин. Выделение целевого продукта (2) проводили замораживанием геля при -18°С с последующим оттаиванием и отбором слоя жидкости. Соединения идентифицировали методом ВЭЖХ в условиях, описанных выше.

Общая методика синтеза 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-[5,-32Р]-фосфата { [32Р]-(2)} при активации ТРБСЛ, ТСГ*, БСС и МСС.

Раствор 10 мКи Нз32Р04 в 0,05 М НС1 (20-50 мкл в зависимости от объемной активности

Нз РО4) вносили в 10 мМ водный раствор фосфорной кислоты (10 мкл), растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине, раствор упаривали досуха и дважды переупаривали с абсолютным пиридином (2 х 20 мкл). Полученный остаток растворяли в 20 мкл абсолютного пиридина, добавляли 10 мкл 1 М раствора'А2Т в абсолютном пиридине и 10 мкл 0,1 М раствора соответствующего конденсирующего агента в пиридине. По окончании реакции (детекция ТСХ), растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды, и продукт [ Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выходы продукта (2): 28% в случае ТР8С1 (после повторной хроматографии), 15% в случае ТОЧ, 18% в случае БСС, 30% в случае МСС. Молярная радиоактивность 100 Ки/ммоль.

Н-ЯМР (Б20; 5, м.д.; У, Гц): 7,43 д (1 Н, У1, Н 6), 6,27 т (1 Н, /7,5, НГ), 4,4 (1 Н, м, НЗ'), 4,2 м (2 Н, Н5'), 4,07 м (1 Н, Н4'), 2,25 м (2 Н, Н2'), 1,88 д (3 Н, 31, 5-СН3).

31Р-ЯМР (Б20): 0,54 с.

Данные ЯМР-спектров приведены для образца соединения (2) с молярной радиоактивностью 0,1 Ки/моль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин-[5'-32Р]-фосфата { [32Р]-(2) } при активации ВКЖ

Раствор

10 мКи Н3 РО4 в 0,05 М НС1 (20-50 мкл в зависимости объемной активности) вносили в 1 мМ раствор Н3РО4 (10 мкл), раствор упаривали в вакууме, остаток растворяли в 50% водном пиридине (20 мкл) и растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (15 мкл), далее добавляли 2 М раствор К1Х в 5 М растворе БМАР в воде (10 мкл), затем вносили 2 мкл 5 М раствора ВгСИ в абсолютном ацетонитриле. По окончании реакции растворитель удаляли в вакууме, остаток дважды соупаривали с 50 мкл воды, растворяли в 50 мкл воды и продукт [32Р]-(2) выделяли с помощью ВЭЖХ. Выход составил 46%. Молярная радиоактивность 1000 Ки/ммоль.

Синтез 3'-азидо-2'3'-Дидезокситимидин- [5'-32Р]-холинфосфата {[32Р]- (1)}.

К 10 мКи Нз32Р04 в 0,5 мМ НС1 добавляли Н3Р04 (10 мкл 1 мМ раствора в воде) вносили 40 мкл ацетонитрила, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе прирдина в воде (15 мкл), добавляли холиний иодид (1 мкмоль, 231 мкг) и реакционную смесь термостатировали 10 мин при 0°С. Добавляли раствор 50 мМ ВгСЫ в ацетонитриле (6 мкл), и после 20 мин при 0°С удаляли растворитель в вакууме. Остаток растворяли в 5 М растворе ОМАР в воде (20 мкл), вносили А.ЪТ

1 мкмоль, 267 мкг) и 50 мМ раствор ВгСК в ацетонитриле (6 мкл). Через 10 мин добавляли 30% водный аммиак (10 мкл), через 20 мин раствор упаривали, а остаток переупаривали с водой (50 мкл). Остаток растворяли в 50 мМ ТЕАВ (50 мкл) и продукт выделяли методом ВЭЖХ. Выход продукта 18-20%, радиохимическая частота 99%, молярная активность 1000 Ки/ммоль. Я/(ТСХ, система В,): 0,6.

УФ: >.тах 266,3 нм (е = 8440) (рН 7,0, вода), Хта}Дтт 3,3.

Н-ЯМР (Б20; 8, м.д.; 7, Гц): 7,63д (1Н, 71 Гц, Н-6); 6,20т (1Н, У 6,5 Гц, Н-Г); 4,43 дт (1Н, 76,5 и 11 Гц, Н-3'); 4,25 м (2Н, СНгО холин); 4,12-4,04 м (ЗН, 2Н-5'+Н-4'); 3,61 м (2Н, СЩМ холин); 3,16с (9Н, Ме3 холин) 2,47 т (2Н, У 6,5 Гц, Н-2'); 1,86 с (ЗН, Ме-ТЬу). 31Р-ЯМР (Б20; 5, м.д.; 7, Гц): -0,16 с.

13С-ЯМР(020; 5, м.д.; 7, Гц): 166,8, 151,9 (С-2 + С-4); 137,7 (С-6); 111,9 (С-5); 85,4 (С-Г); 83,1 д (7 8,5, С-4'); 66,3 тс (7МС 3,9, СН2К холин); 65,4д (7 5,2, С-5'); 60,5 (С-3'); 59,8д (74,9, СН20 холин); 54,3 тс (Тыс 3,7, Ме3 холин); 36,5 (С-2'); 12,0 (Ме-ТЬу).

Синтез образцов сравнения:

Синтез 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-фосфата (2):

Продукт (2) получали конденсацией 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидина с РОС1з в среде БМГ аналогично [73]. Выход 92%.

Синтез фосфамидов (5а) и (5Ь):

Фосфамиды (5) получали реакцией ОМАР или М1ш и ортофосфорной кислоты в Б МБ в присутствии избытков дипиридинилдисульфида и трифенилфосфина, как описано в [79]. Выход (5а) - 66%, (5Ь) - 51% в пересчете на ортофосфорную кислоту.

Синтез бис-(3'-азидо-2'3'- дидезокситимидин)-5'-дифосфата (4):

К раствору 10 мг (28,8 мкмоль) 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин-5'-фосфата в 2 мл безводного Б МБ добавшш 12 мг (57,6 мкмоль) БСС, через 7 часов в реакционную массу добавили 2 мл воды и оставили на 2 ч при 0°С. Выпавший осадок отфильтровали, супернатант упарили в вакууме, растворили в 0,5 мл воды и продукт выделяли методом ВЭЖХ в условиях, идентичных выделению монофосфата (2) используя колонку (25 х 300 мм) ЬюЬгоэогЬ ЯР-18 (5 мкм). Выход 68%.

Ферментативные эксперименты

Нерадиоактивный диэфир (1) (50 мг) наносили на Бо\уех 50 в Н+ форме (колонка 50x200 мм), элюировали 10% водным аммиаком. Растворитель удаляли в вакууме и полученный нуклеотид растворяли в воде получая 114 мкМ раствор.

Гидролиз клеточным лизатом:

12-106 клеток НЬ60 суспендировали в 500 мкл 5 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5). После 4 циклов замораживания-оттаивания жидким азотом, суспензию осветляли центрифугированием (5 мин, 1000 §). В 50 мкл осветлённого клеточного лизата внесли 5 мкл 55 мМ раствора М§СЬ в 500 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,5), смесь термостатировали до температуры 37°С и вносили 114 мкМ (1) (3,2 Ки/ммоль, 2 мкл). Итоговые концентрации: 4 мкМ (1) в 44 мМ ТРИС-НС1 буфере (рН 7,5) в присутствии 5 мМ М§2+. Для анализа отбирали 2,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали в системе А и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз гомогенатом клеточных мембран:

Осадок, образовавшийся при центрифугировании криолизованных 12-106 клеток НЬ60, суспендировали ультразвуком в 50 мМ ТРИС-НС1, содержащего 5 мМ М§2+(100 мкл, рН 7,5). Суспензию термостатировали до 37°С и вносили 114 мкМ (1) (4 мкл). Для анализа отбирали 5 мкл аликвоты с молярной активностью 3,7 Ки/ммоль, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз сывороткой крови человека:

100 мкл нормальной сыворотки крови человека термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 4 мкл 114 мкМ (1) с молярной активностью 2,9 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, добавляли к 10 мкл метанола и суспензию осаждали центрифугированием 2 мин при 14000 g. Супернатант концентрировали до объёма 4-5 мкл в вакууме, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз ферментами змеиного яда:

0,25 мг препарата змеиного яда растворяли в 50 мМ ТРИС НС1 буфера, содержащего 10 мМ Mg2+(200 мкл, рН 8,0). Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (8 мкл) с молярной активностью 3,2 Ки/ммоль. Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз фосфодиэстеразой змеиного яда:

- 0,5 ед. активности фермента (по ди(п-нитрофенил)фосфату) растворяли в 50 мкл 50 мМ ТРИС-НС1 буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 2,8 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Гидролиз 5'-нуклеотидазой змеиного яда:

Фермент (1 ед. активности по л-нитрофенилфосфату) растворяли в 50 мМ ТРИС-НС1 буфере (50 мкл, рН 8,0), содержащего 10 мМ Mg2+ и 0,11 М NaCl. Раствор термостатировали до 37°С в течение 5 мин и вносили 114 мкМ (1) (2 мкл раствора в воде, 3,2 Ки/ммоль). Для анализа отбирали 0,5 мкл аликвоты, наносили на пластинку с силикагелем, элюировали системой растворителей (А) и анализировали с помощью фосфоимиджера.

Клеточные эксперименты

Клетки промиелоцитарного лейкоза человека (promyelocytic leukemia cells) HL-60 культивировали в среде RPMI - 1640 содержащей 2 мМ L-глутамин и 10% эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СОг. При плотности

1 млн.клеток/мл в культуральную жидкость добавляли исследуемый радиоактивный (1) с молярной активностью 4-5 Ки/ммоль и проводили отбор 2 параллельных аликвот по 3 мл через 0, 1, 3, 7, 24 часа. Клетки центрифугировали при 180 g и 4°С 4 мин, супернатант анализировали отдельно, клетки дважды промывали 5 мл охлажденного до 5°С PBS и суспендировали в 5 мМ ТРИС-НС1 (200 мкл, рН 7,5). Клетки разрушали четырёхкратным замораживанием-оттаиванием в среде жидкого азота, вносили 400 мкл метанола, осаждали образовавшуюся суспензию центрифугированием (2 мин при 14000 g), надосадочную жидкость пипетировали и удаляли растворитель в вакууме при 37°С. Остаток растворяли в 25 мкл 50 мМ ТЕАВ и анализировали ВЭЖХ.

Анализ липидного состава мембранной фракции осуществляли на ТСХ (силикагель), в качестве образцов сравнения выступали аутентичные нерадиоактивные образцы соответствующих липидных компонентов.

32

Идентификация Р меченых метаболитов (1), выделенных из липидной фракции клеток.

Идентификацию проводили двумерной хроматографией на силикагеле. Система 1 (хлороформ-метанол- 25% водный аммиак 65:35:5), пластинку тщательно высушивали, далее хроматографировали в системе 2 (хлороформ:МеОН:АсОН:ацетон:вода 10:2:4:2:1). Детекцию нерадиоактивных фосфолипидов проводили по методу Васьковского и Костевского [83]. Липиды содержащие 32Р детектировали с помощью фосфоимиджера.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Январёв, Дмитрий Васильевич, 2007 год

1. Honjo, М., Fumkawa, Y. Kobayashi, К. Studies on phosphorylation. Phosphorylation of nucleosides with organic amine salts of phosphoric acid, Chem. Pharm. Bull.;1. V 14,1966,1061-1065

2. Holy A., Smrt J. Synthesis of a GpUpU analogue containing 5'-deoxyuridine 5'-phosphonic acid and its effect upon the binding of I4C]valyl- and [14C]alanyl-tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun.; V 31,1963,128-130

3. Ztverteczky J. Szabo P., Szabo L. Phosphorylated Sugars. XIII. A new synthesis of D-arabinose-5-dilitium phosphate. J.Chem.Soc. Perkin Trans.; V 1,1973, 872-879

4. Sakakura A., Katsukawa M., Ishihara K. Selective Synthesis of Phosphate Monoesters by Dehydrative Condensation of Phosphoric Acid and Alcohols Promoted by Nucleophilic Bases, Organic Letters; V 7 (10), 2005,1999-2002

5. Ishihara K., Kosugi Y., Akakura M. Rational design of an L-histidine-derived minimal artificial acylase for the kinetic resolution of racemic alcohols, J. Am. Chem. Soc., 126 (39), 2004,12212-12213

6. De Graaf R. and Schwartz A. Thermal synthesis of nucleoside H-phosphonates under mild conditions, OrigLife EvolBiosph., 35(1), 2005,1-10

7. Biebricher K., A simple procedure for the synthesis of a-32P-nucleoside triphosphates, Anal BiochemV 95 (2), 1979,429-432

8. Stock J. Synthesis of phosphonate analogs of thymidine di- and triphosphate from 5'-0-toluenesulfonylthymidine, J. Org. Chem; V 44 (22), 1979,3997-4000

9. Davisson V., Davis R., Dixit V. and Poulter C. Synthesis of nucleotide 5'-diphosphates from 5*-0-tosyl nucleosides, J. Org. Chem.; V 52, 1987,1794-1801

10. Davisson V., Woodside A., Neal Т., Stremler K., Muehlbacher M., Poulter C.; Phosphorylation of isoprenoid alcohols, J. Org. Chem.; V 51, 1986,4768-4779

11. Davisson V., Woodside A., Poulter C., Methods Enzymol.; V 110,1984,130-144

12. O-Selective Phosphorylation of Nucleosides without N-protection; Uchiyama M., Aso Y., Noyori R., Hayakawa Y., J. Org. Chem; V 58,1993, 373-379

13. Howes P.D., Slater M.J., Wareing K. The Regiospecific One-Pot Phosphorylation of Either the 5'- or 2'-Hydroxyl in З'-Deoxytimidines Without Protection: Critical Role of the Base, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acids; V 22(5-8), 2003,687-689

14. Hata Т., Chong K. Synthesis of thiamine diaikyl phosphate disulfide. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 45,1972,654-661

15. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-acylthyamine disulfides. J. Org. Chem. V 40, 1975,2310-2317

16. Taguchi Y., Mushika Y., Synthesis of O-benzoylthiamine disulfide. Tetrahedron Lett. 1975,1913-1918

17. Taguchi Y., Mushika Y., Studies on biologically active haloganenated compounds. III. Synthesis and antibacterial activity of 7-fluoromethyl-l,8-naphthyridine and quinoline derivatives. Bull. Chem. Soc. Jpn.; F48,1975,1528-1536

18. Tener G. 2-Cyanoethyl phosphate and its use in the synthesis of phosphate ester. J.Am.Chem. Soc.; K83,1961,159-170

19. Hillers S. Popova T., Shanshtein Z., Analogs of pyrimidine mono- and polynucleotides. V. Synthesis of models of di- and trinucleotides by thermal polycondensation, Khim. ' Geterotsikl. Soed., 1975, 401-411

20. Kappler K., Hampton A., Synthesis of 5'-C-acylaminomethyl derivatives of adenosine 5'-phosphate and adenosine 5'-triphosphate. J.Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides.1. V 2,1975,109-117

21. Carpenter J., Shaw G. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. J.Chem. Soc., 1970,2016-2022

22. Kulikowski T., ZmudzkaB., Shugar D., Acta Biochim. Pol; V 16,1969,201-209

23. Holy A., Sorm F., Effect of 5'-substitution on the template activity of oligo-nucleotides for the binding of valine and alanine tRNA to ribosomes. Collect. Czech. Chem. Commun.,1. V 36,1971,3282-3299

24. Schoffstal A., Cyclopropylmethyl dihydrogen phosphate. Preparation and use in the phosphorylation of nucleosides, J. Org. Chem.-, V 40,1975,3444-3451

25. Moffat A. Chemical synthesis of specifically a-, (3-, and y-32P-labeled ucleoside-5'-triphosphates. Methods Enzymol., Part A; V 12,1967,182-199

26. Holy A. Oligonucleotidic compounds. XI. Synthesis of ribonucleoside-2',3'-cyclophosphates from nucleosides via nucleoside-2',3'-phosphites. Smrt J., Collect. Czech. Chem. Commun.-, V 31(4), 1966,1528-1530

27. Holy A., Sorm F. Oligonucleotidic compounds. XXXIV. Preparation of some 0-L-ribonucleosides, and 2',3'-cyclic phosphates. Collect. Czech. Chem. Commun.;1. V 34(11), 1969, 3383-3385

28. Frezit W., Schattka K., Cramer F., Jastorff B. Neue darstellungsmethode von nucleotide-analogen der 5'-amino-5'-deoxy-nucleotide. Chem. Ber.; V 105(3), 1972,991-996

29. Takaku H., Shimada Y., Studies of phosphorylation. IV A selective phosphorylation of 5'-hydroxy group of nugleosides by means of tris(8-quinolyl) phosphate, Tetrahedron Lett. 1974,1279-1282

30. Takaku H., Shimada Y., Studies.of phosphorylation. III. Effect of metallic compound on the phosphorylation of alcohols, phosphates, and nucleosides by 8-quinolyl phosphates; Chem Pharm Bull {Tokyo). V 22,1974, 1743-1747

31. SchiffH., Diarylamines and their derivatives, Justus Liebigs Ann. Chem-,1. V 102,1857,337-342

32. Levene P., Tipson R., The Synthesis of Ribose-S-phosphoric Acid. J. Biol. Chem.,1. V 106,1934,113-117

33. Levene P., Tipson R., conversion of uronic acids into corresponding hexoses. J. Biol. Chem.', V 111, 1935,313-319

34. Yoshikava M., Kato T., A novel method for phosphorylation of nucleosides to 5'-nucleotides. Tetrahedron Lett-, 1967,5065-5068

35. Yoshikava M., Kato T., Studies of phosphorylation. I. Phosphorylation of 2',3'-o-isopropylidene nucleoside by phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn,1. V 42,1969,3505-3511

36. Kasashio K., Yoshikava M., Studies of phosphorylation. II. Reaction of 2',3'-0-isopropylideneinosine and -guanosine with phosphoryl chloride. Bull. Chem. Soc. Jpn. V 41, 1968,142-151

37. Ludwig J., A new route to nucleoside 5'-triphosphates. Acta Biochim., Biophys., Acad., Set, Hung; V 16,1981,131-137

38. Levene P., Tipson R., catalytic reduction and deacetylation of the methyl ester of 2,3,4-triacetyl a-methyl-d-galacturonide. J. Biol. Chem. V 111, 1937,185-188

39. Khorana H. G. and Todd A. R. Studies on phosphorylation. Part XI. The reaction between carbodi-imides and acid esters of phosphoric acid. A new method for the preparation of pyrophosphates. J. Chem. Soc. 1953,2257 2260

40. Kennedy E.P. The synthesis of cytidine diphosphate choline, cytidine diphosphate ethanolamine, and related compounds. J. Biol. Chem. 1956. V 222(1), 185-191

41. Smith, M., Moffatt, J.G. and Khorana, H.G. Carbodiimides. VIII. Observations on the reactions of carbodiimides with acids and some new applications in the synthesis of phosphoric acid esters. J. Amer. Chem. Soc. 1958; V 80,6204-6212

42. Hughes, N. A., Kenner, G. W. & Todd, A. Part III. A synthesis of diphosphopyridine nucleotide (cozymase), and some observations on the synthesis of triphosphopyridine nucleotide. J. Chem. Soc. 1957,3733-3778.

43. G.W. Kenner G.W. Phosphoric esters and related compounds; report of a symposium held at the Chemical Society anniversary meeting, Cambridge, on April 9-12th, London, 1957,99-101

44. Tener G. M., Khorana H. G., Markham R., Pol E. H. Studies on Polynucleotides. II. The Synthesis and Characterization of Linear and Cyclic Thymidine Oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80(23), 6223-6230

45. Weimann, G. and Khorana, H.G. Studies on polynucleotides XVII. On the Mechanism of Internucleotide Bond Synthesis by the Carbodiimide Method. J. Am. Chem. Soc. 1962,1. V 84,4329-4341

46. Jacob, T. M., and H. G. Khorana. Studies on polynucleotides. XXX. A comparative study of reagents for the synthesis of the CsA35f intemucleotidic linkage. J. Am. Chem. SOC. 1964; V 86,1630-1635.

47. B. D. Mehrotra and H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides XL. Synthetic deoxyribopolynucleotides as templates for ribonucleic acid polymerase: the influence of temperature on template function. J Biol Chem. 1965; V 240,1750-1753.

48. Letsinger RL, Caruthers MH, Miller PS, Ogilvie KK. Oligonucleotide syntheses utilizing beta-benzoylpropionyl, a blocking group with a trigger for selective cleavage. J Am Chem Soc. 1967 Dec 20; 89(26), 7146-7147

49. Katagiri N, Itakura K, Narang SA. The use of arylsulfonyltriazoles for the synthesis of oligonucleotides by the triester approach. J Am Chem Soc. 1975. Dec 10; 97(25). 7332-7337

50. Seth AK, Jay E. A study of the efficiency and the problem of sulfonation of several condensing reagents and their mechanisms for the chemical synthesis of deoxyoligoribonucleotides. Nucleic Acids Res. 1980, 8(22), 5445-5459

51. Todd A. Some Aspects of Phosphate Chemistry. PNAS. 1959,45,1389-1397

52. Michelson A.M. Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Academic Press, London and New York, 1963, 412-417

53. DG Knorre and VF Zarytova. The mechanism of the chemical synthesis of oligonucleotides and its synthetic consequences. Nucl. Acids Res. 1976. 3. 2709-2729

54. The role of metaphosphate in the activation of the nucleotide by TPS and DCC in the oligonucleotide synthesis. Nucleic Acids Res. 1986,25-14(6), 2699-2706

55. T.M . Chapman, D.G . Kleid, Activated Phosphate Triesters. The Synthesis and Reactivity of N-Hydroxysuccinimide and N-Mercaptosuccinimide Esters

56. J. Org. Chem., 1973; V 38(2), 250-252

57. Tri-t-butyl Phosphite and Some of Its Reactions; Mark V and J.R. Van Wazer, J. Org. Chem-, V 29,1964,1006-1008.

58. R. W. Taft, D. Gurka, L. Joris, P. v. R. Schleyer and J. W. Rakshys; zbad.,1. V 91,1969,1801

59. Arnett E. M. Quantitative comparisons of weak organic bases, Progr. Phgs. Org. Chem.-,1. V 1,1963,223-403

60. Biosynthetic Preparation of 32P-Labaled Nucleoside 5'-Phosphates and Derivatives; R. Hurlbert, N. Furlong, Nucleic Acids Components, 193-202

61. Вояковская E.E., Захарова Л.Ю., Зуева E.B., Кулене В.В., Карпавичене Д.П., Цветков B.C., Титкова Е.Г. Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами, II Симпозиум стран-членов СЭВ, Ленинград, 1981. ЦНИИ Атоминформ, Москва, 1982,141

62. Скоблов Ю.С., Королёв А.Э., Маслова Р.Н.Синтез 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, Успехи химии, 64(8), 1995, 850-858

63. Франк-Каменская М.Д., Книжниева Г.В., Мясоедов М.Ф.; Биоорганическая химия, 10,1984,515-518

64. R. Hurlbert, Furlong N. Methods Enzymol,Part A, 12,1967,193-198

65. Феофанов C.A.; дис.канд.хим.наук. НИБХ CO АН СССР, Новосибирск, 1985

66. Ch.K. Biebricher. A simple procedure for the synthesis of alpha-32P-nucleoside triphosphates, Anal. Biochem., 1979; V 95,429-432

67. Скоблов Ю.С., Королев А.Э., Маслова P.H. Синтез нуклеозид 5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора. Успехи химии. Т. 64,1995, 850-858.

68. Walseth T.F., Johnson R.A. Biochim. Biophys. Acta. V 526,1979,11-16

69. Шипицый A.B., Ясько M.B., Широкова E.A., Куханова М.К., Проняева Т.Р., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Госслен Ж., Периго К., "Холинфосфат З'-азидо-З'-дезокситимидина как антивирусный агент", Заявка на изобретение2002119748 от 26.06.2002 г

70. Turcotte J.G., Pivarnik Р.Е., JShirali S.S., Preparative-scale high-performance liquid chromatographic separation and purification of 3 '-azido-3 '-deoxythymidine-5 '-phosphate.

71. J. Chromatography, 1990; V 499,55-61

72. Suesy P., Zagarny M. A biosynthetic method for the preparation of high specific activity 32P- labeled phospholipids, Chem. Phys. Lipids. 1969. V 56,9-13

73. Symons R.H. Synthesis of a-32P-ribo- and deoxyribonucleoside 5'-triphosphate. Methods Enzymology, 1974; V 29, 102-108

74. Fedorova O.A., Gottikh M.B., Oretskaya T.S., Shabarova Z.A. Cyanogen Bromide-induced Chemical Ligation: Mechanism and Optimization of the Reaction Conditions, Nucleosides Nucleotides., 1996; V 15,1137-1147

75. E. Kanaya and H. Yanagava, Template-Directed Polymerization of Oligoadenylates Using Cyanogen Bromide, Biochemistry, 1986; V 25,7423-7430

76. Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Промежуточные реакции при синтезе олигонуклеотидов по данным спектроскопии Я.М.Р. на ядрах Р31, Доклады академии наук, 1973, Т 212,630-633

77. Годовикова Т.С., Зарытова В.Ф., Халимская Jl. М., Реакционноспособные фосфамиды моно- и динуклеотидов. Биоорганическая Химия, 1986,12(4), 475-481

78. Лебедев А.В., Резвухин А.И. Закономерности изменений химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р-ЯМР производных нуклеотидов, Биоорганическая химия, 1983, Т 9 (2), 149-185

79. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; V 226,497-501

80. Vaskovsky V.E., Kostevsky E.Y. Modified spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms, J.Lipid Res.-, V 9,1968, 396