Сфинголипиды нормальной и опухолевой ткани яичника человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Рылова, Светлана Николаевна

• Рылова, Светлана Николаевна
• кандидат химических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат химических наук Рылова, Светлана Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Биосинтез, структура и функции церамидов."

Глава 1. Структура церамидов

Глава 2. Биосинтез церамидов

Глава 3. Сфингомиелиновый цикл

Глава 4. Биологические функции церамидов

4.1. Роль церамидов в супрессии роста клеток.

4.1.1. Индукция клеточной дифференцировки

4.1.2. Ингибирование роста клеток

4.1.3. Торможение клеточного цикла

4.1.4. Активация ЯЬ-белка - супрессора ракового роста

4.1.5. Подавление протоонкогена с-тус

4.1.6. Дряхление клеток

4.2. Роль церамидов в индукции апоптоза

4.3. Роль церамидов в иммунном ответе

4.3.1. Образование цитокинов

4.3.2. Генерация эйкозаноидов

4.3.3. Активация фактора ОТ-кВ

4.4. Зависимость биологического эффекта церамидов

от их структуры

4.5. Роль внутриклеточной локализации образования

церамидов в их биологических эффектах

4.6. Роль церамидов в координации клеточных

ответов на стресс

4.7. Церамиды - супрессоры опухолей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Содержание церамидов и ганглиозидов в опухолях яичника человека и сыворотке крови пациентов-

опухоленосителей

5.1. Содержание ганглиозидов в опухолях

5.2. Содержание церамидов и молярное отношение

церамиды : ганглиозиды в опухолях

5.3. Содержание ганглиозидов в сыворотке крови пациентов-опухоленосителей

5.4. Содержание церамидов и молярные отношения церамиды : ганглиозиды в сыворотке крови

пациентов-опухоленосителей

5.5. Заключение

Глава 6. Структура церамидов и сфингомиелинов

опухолей яичника человека

6.1. Жирные кислоты

6.2. Сфингоидные основания

6.3. Заключение

Глава 7. Антипролиферативная активность церамидов

опухолей яичника человека

Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Сокращения

ДАТ - диацилглицерин ПКС - протеинкиназа С Сег - церамид

Сг-Сег - Ы-ацетил-сфингенин

Сб-Сег - Ы-гексаноил-сфингенин

Сз-Сег - 1М-октаноил-сфингенин

САРР - церамид-активируемая протеинфосфатаза 2А

1Ш-у - интерферон-у

РАЛР - (поли-АДФ-рибоза) полимераза

РБМР - 1-фенил-2-деканоиламино-3-морфолино-1-пропанол

БМ - сфингомиелин

ЮТ-а - фактор некроза опухолей-а

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сфинголипиды нормальной и опухолевой ткани яичника человека»

Введение

В последние два десятилетия большое внимание исследователей привлекают сфинголипиды, которые являются обязательными компонентами мембран всех эукариот. Многолетними исследованиями установлено, что они участвуют в рецепции гормонов, токсинов, факторов роста, являются клеточными антигенами и иммуномодуляторами [1-4].

Показано также, что при малигнизации клеток происходят нарушения биосинтеза и катаболизма сфинголипидов, в результате чего изменяется их состав и содержание [1, 3, 5, 6]. При изучении изменений, происходящих в составе и структуре сфинголипидов при злокачественном росте, основное внимание было обращено на углеводную цепь гликосфинголипидов, в то время как церамиды - липидная основа всех сфинголипидов - явно игнорировались. Между тем в 1989 году было открыто существование ранее неизвестного пути сигнальной трансдукции - "сфингомиелинового цикла", в котором церамиды являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигналов различных внешних агентов внутрь клетки [7]. В настоящее время имеется большое количество обзоров, рассматривающих участие церамидов в регуляции различных клеточных процессов [8-21].Установлено, что церамиды обладают антипролиферативной активностью, стимулируют апоптоз, способствуют дифференцировке, участвуют в иммунном ответе.

На основе этого было высказано предположение, что церамиды являются супрессорами опухолевого роста [14]. При этом было обнаружено, что супрессорная активность церамидов зависит от структуры сфингоидного основания, входящего в их состав. Указанные биологические эффекты оказывали только церамиды, содержащие Б-эритро-сфингенин, в котором имеется транс-4,5-двойная связь. Дигидроцерамиды, содержащие сфинганин, в котором отсутствует двойная связь, были неактивны [14].

В то же время показано, что сложные сфинголипиды - ганглиозиды -угнетают бласттрансформацию Т- и В-лимфоцитов и цитотоксическую активность естественных киллеров, способны связывать лимфокины, образуя неактивные комплексы. В результате этого ганглиозиды угнетают противоопухолевый иммунитет и способствуют развитию опухолевого процесса [1-4].

Таким образом можно предположить, что в организме существует определенное равновесие, по крайней мере между двумя типами сфинголипидов, церамидами и ганглиозидами, оказывающими противоположное влияние на опухолевый процесс. Сдвиг равновесия в сторону ганглиозидов может способствовать развитию опухолей.

К началу настоящей работы о ганглиозидах опухолей было известно достаточно много, в то время как о церамидах опухолей данные практически отсутствовали. Поэтому представляло интерес выяснить:

1) как изменяется содержание и структура церамидов в опухолевых тканях по сравнению с нормой;

2) как изменяется содержание и состав ганглиозидов в этих же опухолях;

3) имеются ли различия в антипролиферативной активности церамидов, выделенных из опухолей и гомологичной нормальной ткани.

С этой целью в настоящей работе проведено сравнительное изучение сфинголипидов доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолей и нормального яичника человека. Поскольку известно, что опухолевые клетки "сбрасывают" во внеклеточную среду (и в кровоток) мембранные фрагменты, в том числе ганглиозиды, было изучено содержание церамидов и ганглиозидов в крови пациентов с указанными опухолями по сравнению с кровью здоровых доноров.

В ходе проделанной работы было установлено, что в опухолях (по сравнению с нормой) понижается содержание церамидов, изменяется их строение (появляется значительное количество дигидроцерамидов), изменяется состав и содержание ганглиозидов, результатом чего является сдвиг молярного отношения церамиды/ганглиозиды в сторону ганглиозидов. Помимо этого было обнаружено, что "опухолевые" церамиды обладают более низкой антипролиферативной активностью, чем "нормальные". Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что в изученных опухолях происходят такие изменения сфинголипидов, которые могут способствовать развитию опухолевого процесса.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Биосинтез, структура и функции церамидов"

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Рылова, Светлана Николаевна

выводы

1. Изучено содержание церамидов, а также содержание и состав ганглио-зидов в серозных и муцинозных злокачественных и доброкачественных опухолях яичника человека. Установлено, что хотя содержание церамидов, являющихся опухолевыми супрессорами, и ганглиозидов, способствующих росту опухолей, во всех изученных опухолях понижается по сравнению с нормой, их молярное отношение сдвигается в сторону ганглиозидов, что, видимо, может быть одним из факторов, способствующих опухолевому росту.

2. Установлено, что в сыворотке крови пациентов с указанными опухолями по сравнению с нормой содержание церамидов не изменяется, но увеличивается количество ганглиозидов, особенно в случае злокачественных опухолей; молярное отношение Сег : Б1а в сыворотке крови всех опухоленосителей сдвигается в сторону ганглиозидов. При этом обнаружено, что уровень сиалогликосфинголипидов в сыворотке крови опухоленосителей возрастает за счет увеличения содержания ганглиозида ОБз.

3. Найдено, что церамиды и сфингомиелины опухолей яичника человека отличаются по составу жирных кислот друг от друга и от церамидов и сфингомиелинов нормального яичника.

4. Установлено, что в церамидах опухолей яичника человека появляется значительное количество сфинганина, причем в злокачественных опухолях оно больше, чем в соответствующих кистомах. В сфингомиелинах злокачественных опухолей содержание сфинганина меньше, чем в церамидах.

5. Показано, что церамиды, выделенные из нормальной ткани яичника, обладают большей антипролиферативной активностью, чем церамиды, выделенные из доброкачественных или злокачественных опухолей яичника человека. Не исключено, что пониженная антипролиферативная активность "опухолевых " церамидов может способствовать росту опухоли.

Заключение

Полученные результаты дают возможность ответить на поставленные в настоящей работе вопросы. Во-первых, исследование показало, что в эпителиальных опухолях яичника человека по сравнению с нормой уменьшается содержание церамидов и ганглиозидов и происходит сдвиг молярного отношения церамиды : ганглиозиды в сторону ганглиозидов, т.е. в сторону сфинголипидов, способствующих опухолевому росту. Кроме того, наблюдавшееся в результате шеддинга ганглиозидов с поверхности опухолевых клеток повышение их содержания (особенно ганглиозида ОБз) в сыворотке крови пациентов-опухоленосителей оказывает негативное влияние на противоопухолевый иммунитет, поскольку ганглиозиды являются иммуносупрессорами. Во-вторых, изменение состава сфингоидных оснований в церамиде и сфингомиелине, что, по-видимому, является результатом нарушения их биосинтеза и катаболизма, приводит к накоплению в опухолях 1М-ацилсфинганинов, которые в отличие от Ы-ацилсфингенинов, биологически не активны и не оказывают супрессорного эффекта на опухолевый рост. Следствием этого является наблюдаемое снижение антипролиферативной активности "опухолевых" церамидов по сравнению с "нормальными".

В совокупности, изменения, обнаруженные в составе и структуре изученных сфинголипидов опухолей яичника человека, по-видимому, могут быть одним из факторов, способствующих развитию опухолевого процесса.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Общие методы исследования.

1.1. Растворители.

Для экстракции, хроматографического разделения и анализа сфинголипидов использовали очищенные по обычным методикам [192, 193] растворители: хлороформ, метанол, н-бутанол, бензол, бутилацетат, пиридин, эфир, гексан.

1.2. Адсорбенты. а) Силикагель КСК

Силикагель марки КСК (Воскресенский завод) размалывали на шаровой мельнице и просеивали. Фракцию 150-200 меш использовали для препаративной хроматографии на пластинках. б) Сефадекс.

Для очистки ганглиозидов сыворотки крови от нелипидных примесей использовали сефадекс G-50 фирмы «Pharmacia» (Швеция). 100 г сефадекса дважды промывали 2 л ацетона, фильтровали и высушивали в течение ночи на воздухе. 25 г сухого сефадекса заливали 250 мл дистиллированной воды, оставляли набухать на ночь и использовали для заполнения колонок.

1.3. Приготовление пластинок. а) Для аналитической хроматографии ганглиозидов и церамидов использовали HPTLC-пластинки фирмы «Мегск» (5x5 см и 5x10 см). б) Для препаративной хроматографии церамидов и сфингомиелинов использовали стеклянные пластинки с тонким слоем силикагеля, приготовленные следующим образом: на пластинку (13x18 см) наносили суспензию 5 г силикагеля (150-200 меш), 200 мг гипса и 10 мл дистиллированной воды, высушивали в течение ночи на воздухе и активировали 1 ч при 110°С.

1.4. Реагенты для обнаружения и идентификации веществ при хроматографии а) Фосфорномолибденовая кислота [194] (для обнаружения всех липидов).

5 г фосфорномолибденовой кислоты растворяли в 95 мл этилового спирта.

После обрызгивания пластинку нагревали при 80-100°С в течение 3 мин £ Липиды обнаруживались в виде темно-синих пятен на бледно-зеленом фоне. б) Реагент Драгендорфа (для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов) [195].

К 1 мл 40%-го водного раствора К1 приливали 4 мл 1,7% раствора основного азотнокислого висмута в 20% уксусной кислоте и 20 мл дистиллированной воды. Выпавший осадок отфильтровывали. Обрызгивали, холинсодержащие фосфолипиды проявлялись в виде оранжевых пятен на светло-желтом фоне. в) Резорциновый реагент (для качественного и количественного определения сиаловых кислот) [196].

200 мг резорцина растворяли в 10 мл дистиллированной воды, добавляли 80 мл концентрированной соляной кислоты и 0,25 мл 0,1 М раствора сульфата меди и доводили объем раствора до 100 мл дистиллированной водой. После обрызгивания резорциновым реагентом пластинку накрывали стеклом и нагревали 5-10 мин при температуре 180-200°С. Ганглиозиды и сиаловые кислоты обнаруживались в виде синих пятен на белом фоне. г) Антроновый реагент (для обнаружения гликосфинголипидов и Сахаров) [197].

Раствор 1: 200 мг антрона растворяли в 100 мл бензола.

Раствор 2: к 95 мл воды добавляли 2,7 мл концентрированной серной кислоты.

Хроматограмму тщательно обрызгивали раствором 1, а затем раствором 2, после чего пластинку нагревали при 100-110°С в течение 5 мин. Гликосфинголипиды обнаруживались в виде сине-зеленых пятен на белом фоне. д) Нингидрин ( для обнаружения фосфолипидов, содержащих свободные аминогруппы) [194].

200 мг нингидрина растворяли в 100 мл бутанола, содержащего 1% уксусной кислоты. После обрызгивания пластинки нагревали при 100-110°С в течение 3-5 мин. Липиды, содержащие аминогруппы, обнаруживались в виде розово-сиреневых пятен на белом фоне.

2. Выделение сфинголипидов.

2. Выделение сфинголипидов из тканей опухолей и нормального яичника человека.

Для исследования использовали ткани морфологически различающихся (серозный и муцинозный тип) злокачественных (рак) и доброкачественных (кистома) эпителиальных опухолей, а также гранулезоклеточный рак яичника человека, извлеченных при операции, и нормального яичника женщин, погибших от несчастных случаев. Все образцы хранили при -70°. Всего использовано 24 образца нормальной ткани, 23 серозных кистомы, 14 муцинозных кистомы, 21 образец серозного рака, 12 образцов муцинозного рака и 3 образца гранулезоклеточного рака.

2.1.1. Экстракция.

Для извлечения липидов ткань гомогенизировали трижды в 10 объемах смеси хлороформ-метанол (2:1), а затем трижды в 10 объемах смеси хлороформ-метанол (1:2) по 30 мин каждый раз.

Объединенные экстракты упаривали досуха, осадок растворяли в 10 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) и раствор промывали 0,2 объемами воды для извлечения ганглиозидов. После разделения органического и водного слоев верхний (водно-метанольный) слой отбирали, а нижний (органический) -упаривали, остаток растворяли в смеси хлороформ-метанол (2:1) и промывали водой. Эту операцию проводили до полного перехода ганглиозидов из органической фазы в водную (5-7 раз). Контроль за полнотой извлечения проводили с помощью ТСХ в системе хлороформ-метанол-вода (60:40:9), содержащей 0,02% СаСЬ. Органический слой, содержащий церамиды, и водно-метанольные промывки, содержащие ганглиозиды, упаривали досуха.

2.1.2. Очистка липидного экстракта от глицеролипидов [198].

Для очистки липидного экстракта от глицеролипидов сухой остаток растворяли в 0,2 мл (на 1 г исходной ткани) смеси хлороформ-0,21 N NaOH/СНзОН (2:1) и выдерживали 18 ч при комнатной температуре или 1 ч при 37°С. Затем щелочной раствор нейтрализовали 0,35 N уксусной кислотой в метаноле до рН 5 и оставляли на 1 ч при периодическом встряхивании.

2.1.3. Выделение церамидов и сфингомиелинов из липидного экстракта.

Церамиды и сфингомиелины выделяли и очищали с помощью препаративной тонкослойной хроматографии [199]. Липиды органической фазы после удаления глицеролипидов наносили на пластинки (13x18 см), покрытые тонким слоем силикагеля КСК (150-200 меш), приготовленные как описано выше. Хроматографию проводили последовательно: сначала в эфире до верхнего края пластинки (при этом образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот уходили с фронтом растворителя), затем после высушивания пластинку проявляли в системе хлороформ-метанол (9:1, по объему) на 3А высоты пластинки (для отделения церамидов). Разделенные зоны обнаруживали парами йода. Зону, соответствующую церамиду-стандарту, выскребали (сфингомиелин остается на старте). После этого пластинку оставляли на воздухе и после улетучивания йода проявляли в системе хлороформ-метанол-вода (65:25:4) до верхнего края слоя силикагеля. Разделенные зоны вновь проявляли парами йода. Зону, соответствующую сфингомиелину-стандарту, выскребали. Полученные таким образом церамид и сфингомиелин элюировали с силикагеля смесью хлороформ-метанол (2:1) и хлороформ-метанол-вода (50:50:15) соответственно до их полного извлечения. Контроль за полнотой элюирования проводили с помощью ТСХ на пластинках фирмы "Merck" (Германия) в системах хлороформ-метанол (9:1) и хлороформ-метанол-вода (65:25:4) соответственно.

2.2. Выделение сфинголипидов из сыворотки крови доноров и опухоленосителей.

Для исследования использовали кровь здоровых женщин и пациенток с опухолями яичника. Всего изучена кровь 11 здоровых женщин, 10 пациенток с серозной кистомой, 8 пациенток с муцинозной кистомой, 8 пациенток с серозным раком, 4 пациенток с муцинозным раком.

2.2.1. Экстракция.

Для экстракции липидов из сыворотки крови к 2-3 мл сыворотки добавляли 15 мл смеси хлороформ-метанол (1:2), встряхивали 5 мин и центрифугировали при 800 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость отделяли, а осадок экстрагировали смесью хлороформ-метанол (2:1) (2x15 мл) и (1:2) (5x15 мл) до полного извлечения ганглиозидов (контроль проводили с помощью тонкослойной хроматографии). Объединенные экстракты упаривали досуха, остаток растворяли в 15 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) и встряхивали с 3 мл воды в течение 5 мин, нижний (органический) слой отделяли, упаривали досуха и операцию повторяли до полного перехода ганглиозидов из органической фазы в водную. В органическом слое определяли содержание церамидов, а в водно-метанольном - ганглиозидов.

2.2.2. Очистка ганглиозидов сыворотки крови от нелипидных примесей.

Очистку ганглиозидов сыворотки крови от нелипидных примесей проводили гель-фильтрацией на колонке с сефадексом 050 (1,1x9 см) [200]. Для этого ганглиозидный экстракт сыворотки крови (водно-метанольная фаза) упаривали и растворяли в 0,3 мл воды, затем наносили на колонку с сефадексом и элюировали водой. Собирали две фракции водного элюата: 5 мл и 2 мл. Элюаты упаривали на роторном испарителе, каждый остаток растворяли в 50 мкл смеси хлороформ-метанол (2:1) и определяли содержание липидносвязанных сиаловых кислот с помощью денситометрии.

3. Аналитические методы.

3.1. Определение содержания липидносвязанных сиаловых кислот.

Определение содержания ганглиозидов (липидносвязанных сиаловых кислот) в тканях проводили по модифицированному [201] методу Судзуки [202]. Аликвоту раствора ганглиозидов (20-40 мкл) упаривали досуха, остаток растворяли в 0,3 мл воды, добавляли 0,3 мл резорцинового реагента и смесь нагревали в течение 15 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения к раствору добавляли 0,5 мл смеси бутилацетат- н-бутанол (85:15), смесь энергично встряхивали, помещали на 5 мин в ледяную баню и через 15 мин определяли оптическую плотность в микрокюветах при 580 нм. Содержание сиаловых кислот определяли по калибровочной кривой, построенной для N-ацетилнейраминовой кислоты. Чувствительность метода - 5x10"9 моля сиаловых кислот.

Определение общего содержания ганглиозидов в сыворотке крови проводили с помощью денситометрии на сканиметре CS-920 (Shimadzu, Япония). Для этого 3 мкл раствора наносили на HPTLC-пластинку (5x5 см) (фирма "Merck", Германия), хроматографировали в системе хлороформ-метанол-вода (60:40:9), содержащей 0,02% СаСЬ, обрызгивали резорциновым реагентом, плотно накрывали покровным стеклом и нагревали при 110°С в течение 15 мин, после чего денситометрировали на сканиметре CS-920. В качестве внутреннего стандарта использовали 1 нмоль ганглиозида GMj. Результаты, полученные для 1-ой и 2-ой фракции каждого образца, суммировали. Погрешность метода - 5%

3.2. Определение относительного содержания ганглиозидных фракций.

Определение относительного содержания ганглиозидных фракций проводили с помощью ТСХ на HPTLC-пластнках фирмы "Merck" (10x10 см). Аликвоту ганглиозидного экстракта наносили на пластинку и хроматографировали в системе хлороформ-метанол-вода (60:40:9), содержащей 0,02 % СаСЬ. Разделенные зоны обнаруживали резорциновым реагентом. Относительное содержание ганглиозидных фракций определяли денситометрированием проявившихся пятен при 580 нм на сканиметре CS-920 (Shimadzu, Япония). Для идентификации фракций использовали ганглиозиды мозга.

3.3. Определение белка по Лоури [203].

Аликвоту высушенного остатка ткани (после извлечения липидов) растворяли в 0,1 N NaOH. Затем из полученного раствора отбирали аликвоты по 0,3 мл, добавляли 3 мл свежеприготовленного реактива С, через 15 мин - 0,3 мл реактива Фолина, разбавленного перед использованием в два раза, и через 40 мин определяли оптическую плотность при 500 нм. Контролем служил 0,5% раствор альбумина в 0,1 N NaOH.

3.4. Определение содержания церамидов в тканях и сыворотке крови [199].

Для определения содержания церамидов из органического слоя (после удаления ганглиозидов) отбирали аликвоты по 50 мкл. К ним добавляли 50 мкл 0,2М раствора NaOH/CH3OH и оставляли на ночь. После нейтрализации реакционной смеси 0,35М уксусной кислотой в метаноле, растворитель упаривали, остаток растворяли в 30 мкл смеси хлороформ-метанол (2:1). ТСХ церамидов и последующее денситометрирование проводили на HPTLC-пластинках (10x10 см) фирмы "Merck". На пластинку наносили 1 мкл исследуемого раствора (3 параллельных нанесения) и по 1 мкл (1нмоль/мкл) стандарта церамидов (фирма "Serva") (3 параллельных нанесения). Хроматографию проводили последовательно: сначала в эфире (до верхнего края пластинки), а затем после высушивания - в системе хлороформ-метанол (9:1, по объему) на 0,75 высоты пластинки. После высушивания хроматограмму обрызгивали 5% спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и нагревали при 160вС в течение 10 мин. Проявившиеся пятна денситометрировали при 630 нм на сканиметре CS-920. Расчет количества церамида в опытной пробе проводили на основании данных, полученных для стандарта.

4. Определение структуры сфинголипидов.

4.1. Анализ состава сфингоидных оснований церамидов и сфингомиелинов.

Сфингоидные основания выделяли из церамидов и сфингомиелинов по методу [204]. К упаренному образцу добавляли 0,5 мл смеси метанол-вода-соляная кислота (82:9,4:8,6) и гидролизовали в течение 18 ч при 80°С. После охлаждения к реакционной смеси добавляли 0,5 мл воды и смесь экстрагировали гексаном (5x1 мл) до полного извлечения жирных кислот. Затем водный слой нейтрализовали 10N раствором NaOH в воде до рН 11 и сфингоидные основания экстрагировали диэтиловым эфиром (5x2 мл). Контроль за полнотой извлечения проводили с помощью ТСХ в системе гексан-эфир-уксусная кислота (85:15:1). Полученные сфингоидные основания тщательно высушивали на роторном испарителе. К сухому остатку добавляли 30 мкл смеси пиридин-гексаметилдисилазан-триметилхлорсилан (1,0:1,3:0,8). Через 30-45 мин триметилсилиловые эфиры сфингоидных оснований анализировали с помощью газожидкостной хроматографии.

4.2. Анализ состава жирных кислот церамидов и сфингомиелинов

Метиловые эфиры жирных кислот церамидов и сфингомиелинов получали гидролизом индивидуальных сфинголипидов смесью метанол-вода-соляная кислота (82:9,4:8,6) параллельно со сфингоидными основаниями (см. 4.1.).

Жирные кислоты после извлечения из реакционной смеси метилировали диазометаном. Чистоту полученных метиловых эфиров жирных кислот контролировали с помощью ТСХ в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1). При наличии примесей в образце метиловые эфиры очищали с помощью препаративной хроматографии на стеклянных пластинках с силикагелем (13x18 см) в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (85:15:1). Элюирование с силикагеля осуществляли хлороформом. Полученные эфиры жирных кислот растворяли в 50-100 мкл гексана и анализировали с помощью газожидкостной хроматографии.

4.3. Десиалирование ганглиозидов нейраминидазой из

Vibrio cholerae [205].

Аликвоту суммарных ганглиозидов (5-10 мкг сиаловой кислоты) растворяли в ОД мл 0,2М ацетатного буфера (pH 5,5), к раствору добавляли ОД мл 0,15% раствора альбумина в воде, 10 мкл 1% раствора СаС12 и 5 мкл нейраминидазы из Vibrio cholerae (500 ед/мл) (фирма "Koch-Light", Англия). Смесь инкубировали при 37°С в течение 18 ч. Полученные продукты ферментолиза разделяли на HPTLC-пластинках фирмы "Merck" в системе хлороформ-метанол- вода (60:40:9), содержащей 0,02% СаСЬ. Для обнаружения использовали резорциновый и антроновый реагенты.

5. Физико-химические методы исследования.

5.1. Газожидкостная хроматография.

Сфингоидные основания анализировали в виде триметилсилильных производных в хроматографе " Хром-5 " (Чехия) на колонке (2500x3 мм) с 3% OV-1 на хромосорбе W-HP (100-120 меш) при 220°С и скорости газа-носителя (гелий) 40 мл/мин.

Метиловые эфиры жирных кислот анализировали в том же хроматографе на колонке (2500x3 мм) с 3% OV-1 на хромосорбе W-HP (80-100 меш) при программировании температуры от 160 до 300°С со скоростью 4 град/мин и скоростью газа-носителя (гелий) 40 мл/мин, а также на колонке (2500x3 мм) с 10% Silar ЮС на хромосорбе W-HP (100-200 меш) при программировании температуры от 160 до 240°С со скоростью 4 град/мин и скорости газа-носителя (гелий) 40 мл/мин.

6. Изучение антипролиферативной активности церамидов.

Антипролиферативную активность церамидов нормальной и опухолевых тканей яичника человека определяли in vitro по включению [3Н] тимидина в клетки карциномы яичника человека (линия Са Ov) [206]. 1х105 клеток выращивали во флаконах (объем среды - 2 мл) в монослое на среде 199, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, в течение 24 ч при 37°С, после чего инкубационную среду заменяли на ту же среду, содержащую церамиды в растворе этанол-до декан (98:2) [207] или соответствующее количество смеси этанол-додекан. Конечная концентрация этанола и додекана в инкубационной среде не превышала 0,5 и 0,01% соответственно. Затем клеточную суспензию инкубировали в течение 24 ч, после чего клетки отмывали и добавляли [3Н] тимидин (1,0 мкКи/мл). После инкубации в течение 1 ч клетки отмывали раствором Хенкса, нуклеиновые кислоты экстрагировали 5% НСЮ4 при 80°С в течение 20 мин и измеряли радиоактивность. Жизнеспособность клеток определяли по включению трипанового синего. Все эксперименты проводили трижды по 3 параллели в каждом опыте.

7. Определение цитотоксичности церамидов.

Цитотоксичность исследуемых церамидов определяли на промиелоидных лейкемических клетках НЬ-60. 1х106 клеток инкубировали в 24-луночных планшетах в 1 мл среды ЯРМ1-1640, содержащей 7% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и различные количества церамидов в смеси этанол-додекан (98:2), в течение 24 ч при 37 С. По окончании инкубации жизнеспособность клеток тестировали по включению трипанового синего. Все эксперименты проводили трижды по 3 параллели в каждом опыте.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Рылова, Светлана Николаевна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Hakomori S. Glycosphingolipids in cellular interaction, differentiation, and oncogenesis. - Annu. Rev. Biochem., 1981, v. 50, p.733-764.

2. Hannun Y.A., Bell R.M. Functions of sphingolipids and sphingolipid breakdown products in cellular regulation. - Science, 1989, v. 243, p. 500506.

3. Hakomori S. Bifunctional role of glycosphingolipids. - J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 18713-18716.

4. Merrill A.H., Jr. Cell regulation by sphingosine and more complex sphingolipids. - J. Bioenerg. Biomembr., 1991, v. 23, p. 83-104.

5. Dyatlovitskaya E.V., Bergelson L.D. Glycosphingolipids and antitumor immunity. - Biochim. Biophys. Acta., 1987, v. 907, p. 125-143.

6. Дятловицкая Э.В. Сфинголипиды и злокачественный рост. - Биохимия, 1995, т. 60, с. 843-851.

7. Okazaki Т., Bell R.M., Hannun Y.A. Sphingomyelin turnover induced by vitamin D3 in HL-60 cells. Role in cell differentiation. - J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 19076-19080.

8. Ballou L.R. Sphingolipids and cell function. - Immunology Today, 1992, v. 13, p. 339-341.

9. Kolesnick R. Ceramide: a novel second messenger. - Trends Cell Biol., 1992, v. 2, p. 232-236.

10. Hannun Y.A., Bell R.M. The sphingomyelin cycle: a prototypic sphingolipid signalling pathway. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 25, p. 27-41.

11. Hannun Y.A., Obeid L.M., Wolff R.A. The novel second messenger ceramide: identification, mechanism of action and cellular activity. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 25, p. 43-64.

12. Kan C.-C., Kolesnick R. Signal transduction via the sphingomyelin pathway. -Trends Glycoscience Glycotechnology, 1993, v. 5, p. 99-106.

13. Kolesnick R., Golde D.W. The sphingomyelin pathway in tumor necrosis factor and interleukin-1 signaling. - Cell, 1994, v. 77, p. 325-328.

14. Hannun Y.A. The sphingomyelin cycles and the second messenger function of ceramide. - J. Biol.Chem., 1994, v. 269, p. 3125-3128.

15. Hannun Y.A., Obeid L.M. Ceramide: an intracellular signal for apoptosis. -TIBS, 1995, v. 20, p. 73-77.

16. Obeid L.M., Hannun Y.A. Ceramide: a stress signal and mediator of growth suppression and apoptosis. - J. Cell Biochem, 1995, v. 58, p. 191-198.

17. Pushkareva M., Obeid L.M., Hannun Y.A. Ceramide: an endogenous regulator of apoptosis and growth suppression. - Immunology Today, 1995, v. 16, p. 294-297.

18. Ballou L.R., Laulederkind S.J.F., Rosloniec E.F., Raghow R. Ceramide signalling and the immune response. - Biochim. Biophys Acta, 1996, v. 1301, p. 273-287.

19. Hannun Y.A. Ceramide. A novel second messenger and lipid mediator. -Handbook Lipid Res., 1996, v. 8, p. 177-204.

20. Smyth M.J., Obeid L.M., Hannun Y.A. Ceramide: a novel lipid mediator of apoptosis. - Adv. Pharmacol., 1997, v. 41, p. 133-154.

21. Gomez-Munoz A. Modulation of cell signalling by ceramides. - Biochim. Biophys. Acta, 1998, v. 1391, p. 92-109.

22. Karlsson K.-A. On the chemistry and occurrence of sphingolipid long-chain bases. - Lipids, 1970, v. 5, p. 6-43.

23. Kolesnick R. Sphingomyelin and derivatives in cellular signal. - Prog. Lipid Res., 1991, v. 30, p. 1-38.

24. Merrill A.H., Jr., Schmelz E.-M., Wang E., Schroeder J.J., Dillehay D.L., Riley R.T. Role of dietary sphingolipids and inhibitors of sphingolipid metabolism in cancer and other diseases. - J. Nutr., 1995, v. 125, p. 16771682.

25. Shayman J.A. Sphingolipids: their role in intracellular signalling and renal growth. - J. Am. Soc. Nephrology, 1996, v. 7, p. 171 -182.

26. Mandon E.C., Ehses J., Rother J., Van Echten G., Sandhoff K. Subcellular localization and membrane topology of serine palmitoyltransferase, 3-dehydrosphinganine reductase and sphinganine N-acyltransferase in mouse liver.-J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 11144-11148.

27. Merrill A.H., Jr., Jones D.D. An update of the enzymology and regulation of sphingomyelin metabolism. - Biochim. Biophys Acta., 1990, v. 1044, p. 1 -12.

28. Merrill A.H., Jr., Sweeley C.C. Sphingolipids: metabolism and cell signalling, in Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes (Vance D.E., Vance J.E., eds.) Elsevier, Amsterdam, 1996, pp. 309-339.

29. Merrill A.H.,Jr., Wang E. Biosynthesis of long-chain (sphingoid) bases from serine by LM cells. - J. Biol. Chem., 1986, v. 261, p. 3764 - 3769.

30. Norred W.P., Wang E., Yoo H., Riley R.T., Merrill A.H., Jr. In vitro toxicology of fumonisins and the mechanistic implications. - Mycopathologia, 1992, v. 117, p. 73-78.

31. Hirschberg K., Rodcer J., Futerman A.H. The long-chain sphingoid base of sphingolipids is acylated at the cytosolic surface of the endoplasmic reticulum in rat liver. - Biochem. J., 1993, v. 290, p. 751-757.

32. Radin N.S. Biosynthesis of the sphingoid bases: a provocation. - J. Lipid Res., 1984, v. 25, p. 1536-1540.

33. Wang E., Norred W.P., Bacon C.W., Riley R.T., Merrill A.H., Jr. Inhibition of sphingolipid biosynthesis by fumonisin. - J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 14486 - 14490.

34. Rother J., Echten G., Schwarzmann G., and Sandhoff K. Biosynthesis of sphingolipids: dihydroceramide and not sphinganine is desaturated by cultured cells. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, v. 189, p. 14 - 20.

35. Geeraert L., Mannaerts G.P., Vanveldhoven P.P. Conversion of dihydroceramide into ceramide: involvement of a desaturase. - Biochem. J., 1997, v. 327, p. 125-132.

36. Michel C., Vanechtendeckert G., Rother J., Sandhoff K., Wang E., Merrill A.H., Jr. Characterization of ceramide synthesis - A dihydroceramide desaturase introduces the 4,5- trans- double bond of sphingosine at the level of dihydroceramide. - J Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 22432-22437.

37. Spiegel S., Olivera A., Carlson R.O. The role of sphingosine in cell growth regulation and transmembrane signalling. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 25, p. 105-129.

38. Voelker D.R., Kennedy E.P. Cellular and enzymic synthesis of sphingomyelin. - Biochemistry, 1982, v. 21, p. 2753-2759.

39. Spence M.W., Cook H.W., Byes D.M., Palmer B.C. The roles of sphingomyelin in phosphatidylcholine metabolism in cultured human fibroblasts from control and sphingomyelin lipidosis patients and in Chinese hamster ovary cells - Biochem. J., 1990, v. 268, p. 719-724.

40. Jeckel D., Karrenbauer A., Birk R., Schmidt R.R., Wieland F. Sphingomyelin is synthesized in the cis Goldgi. - FEBS Lett., 1990, v.261, p. 155-157.

41. Futerman A.H., Stiegel B., Habbard A.L., Pagano R.E. Sphingomyelin synthesis in rat liver occurs predominantly at the cis and medial cisternae of the Goldgi apparatus. - J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 8650-8657.

42. Bell R.M., Hannun Y.A., Merrill A.H., Jr. Sphingolipids Part B: Regulation and function of metabolism. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 26, p. 360-384.

43. Hoekstra D.(ed.). - Current topics in membranes: Cell lipids, Academic press, San Diego, C.A. 1994, v. 40, pp. 638.

44. Vanhelvoort A., Stoorvogel W., Vanmeer G., Burger K.N.I. Sphingomyelin synthase is absent from endosomes. - J. Cell Science, 1997, v. 110, p. 781788.

45. Linardic C.M., Hannun Y.A. Identification of a distinct pool of sphingomyelin involved in the sphingomyelin cycle. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 2353023537.

46. Kolesnick R.N., Hemez M.R. Characterization of a ceramide kinase activity from human leukemia (HL-60) cells. - J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 1880318808.

47. Dressier K.A., Kolesnick R.N. Ceramide-1 phosphate: a novel phospholipid in human leukemia (HL-60) cells. - J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 1491714921.

48. Bajjalieh S.M., Martin T.F.G., Floor E. Synaptic vesicle ceramide kinase. - J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 14354-14360.

49. Dennis E.A., Rhee S.G., Billah M.M., Hannun Y.A. Role of phospholipases in generating lipid second messengers in signal transduction. - FASEB J., 1991, v. 5, p. 2068-2077.

50. Liscovitch M., Cantley L.C. Lipid second messengers. - Cell, 1994, v. 77, p. 329-334.

51. Hannun Y.A., Loomis L.R., Merrill A.H., Bell R.M. Sphingosine inhibition of protein kinase C activity and of forbol dibutyrate binding in vitro and human platelets. - J. Biol. Chem., 1986, v. 261, p. 12604 - 12609.

52. Chatterjee S. Neutral sphingomyelinase action stimulates signal transduction of tumor necrosis factor-a in the synthesis of cholesterol esters in human fibroblasts. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 879-882.

53. Ballou L.R., Chao C.P., Holness M.A., Barker S.C., Raghow R. Interleukin-1-mediated PGE2 production and sphingomyelin metabolism. Evidence for the regulation of cyclooxygenase gene expression by sphingosine and ceramide. -J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 20044-20050.

54. Dobrowsky R.T., Weiner M.H., Castellino A.M., Chao M.V., Hannun Y.A. Activation of the sphingomyelin cycle through the low-affinity neurotrophin receptor. - Science, 1994, v. 265, p. 1596-1599.

55. Tepper C.G., Jayadev S., Liu B., Bielawska A., Wolf R.A., Yonehara S., Hannun Y.A., Seldin M.F. Role for ceramide as an endogenous mediator of

Fas-induced cytotoxicity. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, p. 84438447.

56. Kim M.-Y., Linardic C., Obeid L., Hannun Y.A. Identification of sphingomyelin turnover as an effector mechanism for the action of tumor necrosis factor-a and gamma-interferon. Specific role in cell differentiation. -J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 484-489.

57. Quintans J., Kilkus J., Mc Shan C.L., Gottschalk A.R., Dawson G. Ceramide mediates the apoptotic response of WEHI 231 cells to antiimmunoglobulin, corticosteroids and irradiation. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, v. 202, p. 710-714.

58. Niculescu F., Rus H., Shin S., Lang T., Shin M.L. Generation of diacylglicerol and ceramide during homologous complement activation. - J. Immun., 1993, v.150, p. 214-224.

59. Linardic C.M., Jayadev S., Hannun Y.A. Brefeldin A promotes hydrolysis of sphingomyelin. - J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 14909-14911.

60. Strum J.G., Small G.W., Pauig S.B., Daniel L.W. 1-b-D-arabinofuranosylcytosine stimulates ceramide and diglyceride formation in HL-60 cells. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 15493-15497.

61. Zhang J., Alter N., Reed J.C., Borner C., Obeid L.M., Hannun Y.A. Bcl-2 interrupts the ceramide-mediated pathway of cell death. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 5325-5328.

62. Haimovitz-Friedman A., Kan C.C., Ehleiter D., Persaud R., Mc Loughlin M., Fuks Z., Kolesnick R.N. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis. - J. Exp. Med., 1994, v. 180, p. 525535.

63. Chang Y., Abe A., Shayman J.A. Ceramide formation during heat shock: a potential mediator of aB-crystallin transcription. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, p. 12275-12279.

64. Jayadev S., Liu B., Bielawska A.E., Lee J.Y., Nazaire F., Pushkareva M.Y., Obeid L.M., Hannun Y.A. Role for ceramide in cell cycle arrest. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 2047-2052.

65. Liu B., Obeid L.M., Hannun Y.A. Sphingomyelinase in cell regulation. -Seminars in Cell and Developmental Biology, 1997, v. 8, p. 311-322.

66. Spence M.W., Wakkary J., Clarke J.T., Cook H.W. Localization of neutral magnesium-stimulated sphingomyelinase in plasma membrane of cultured neuroblastoma cells. - Biochim. Biophys. Acta, 1982, v. 719, p. 162-164.

67. Chatterjee S. Neutral sphingomyelinase. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 26, p. 2547.

68. Okazaki T., Bielawska A., Domae N., Bell R.M.. Hannun Y.A. Characteristic and partial purification of novel cytosolic magnesium-independent, neutral sphingomyelinase activated in the early signal transduction of la,25-

dihydroxyvitamin D3-induced HL-60 differentiation. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 4070-4077.

69. Spence M.W. Sphingomyelinases. - Adv. Lipid Res., 1993, v. 26, p. 3-23.

70. Dobrowsky R.T., Hannun Y.A. Ceramide stimulates a cytosolic protein phosphatase. - J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 5048-5051.

71. Dobrowsky R.T., Kamibayashi C., Mumby M.C., Hannun Y.A. Ceramide activates heterotrimeric protein phosphatase 2A. - J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p.15523-15530.

72. Fishbein J.D., Dobrowsky R.T., Bielawska A., Garrett S., and Hannun Y.A. Ceramide-mediated growth inhibition and CAPP are conserved in Saccaromyces cerevicae. - J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 9255 - 9261.

73. Wolff R.A., Dobrowsky R.T., Bielawska A., Obeid L.M., and Hannun Y.A. Role of ceramide-activated protein phosphatase in ceramide-mediated signal transduction. - J. Biol.Chem., 1994, v. 269, p. 19605 - 19609.

74. Goldcorn T., Dressier K.A., Muindi J., Radin N.S., Mendelsohn J., Menaldino D., Liotta D., Kolesnick R.N. Ceramide stimulates epidermal growth factor receptor phosphorylation in A431 human epidermoid carcinoma cells. Evidence that ceramide may mediate sphingosine action. - J. Biol. Chem., 1991, v. 266, p. 16092-16097.

75. Mathias S., Dressier K.A., Kolesnick R.N. Characterization of a ceramide-activated protein kinase: stimulation by tumor necrosis factor alpha. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v. 88, p. 10009-10013.

76. Joseph C.K., Byun H.S., Bittman R., Kolesnick R.N. Substrate recognition by ceramide-activated protein kinase. Evidence that kinase activity is prolin-directed. - J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 20002-20006.

77. Liu J., Mathias S., Yang Z., Kolesnick R.N. Renaturation and tumor necrosis factor a stimulation of a 97 kDa ceramide-activated protein kinase. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 3047-3052.

78. Lozano J., Berra B., Municio M.M., Diaz-Meco M.T., Dominguez I., Sanz L., Moscat J. Protein kinase C q isoform is critical for kB-dependent promoter activation by sphingomyelinase. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 1920019202.

79. Muller G., Ayoub M., Stozz P., Rennecke J., Fabbro D., Ptizenmaier K. PKC q is a molecular switch in signal transduction of TNF-a, bifunctionally regulated by ceramide and arachidonic acid. - EMBO J., 1995, v. 4, p. 19611969.

80. Okazaki T., Bielawska A., Bell R.M., Hannun Y.A. Role of ceramide as a lipid mediator of la, 25 - dihydroxyvitamin D3 - induced HL-60 cell differentiation. - J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 15823 - 15831.

81. Dressier K.A., Mathias S., Kolesnick R.N. Tumor necrosis factor-a activates the sphingomyelin signal transduction pathway in a cell-free system. - Science, 1992, v. 255, p. 1715-1718.

82. Wakita H., Tokura Y., Nishimzura K., Furukawa F., Takigawa M. Keratinocyte differentiation is induced by cell-permeant ceramide and its proliferation is promoted by sphingosine. - Arch. Dermatol. Res., 1994, v. 286, p. 350-354.

83. Riboni L., Prinetti A., Bassi R., Caminiti A., Tettamanti G. A Mediator role of ceramide in the regulation of neuroblastoma Neuro 2a cell differentiation. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 26868 - 26875.

84. Tettamanti G., Prinetti A., Bassi R., Viani P., Giussani P., Riboni L. Sphingoid bioregulators in the differentiation of cell of neural origin. - J. Lipid Mediators Cell Signal, 1996, v. 14, p. 263-275.

85. Prinetti A., Bassi R., Riboni L., Tettamanti G. Involvement of a ceramide activated protein phosphatase in the differentiation of neuroblastoma Neuro 2a cells. - FEBS Lett., 1997, v. 414, p. 475-479.

86. Low B., Rossie S. The dimeric and catalytic subunit forms of protein phosphatase 2a from rat brain are stimulated by C2-ceramide. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 12808-12813.

87. Dbaibo G., Obeid L.M., Hannun Y.A. TNF-a signal transduction through ceramide: dissociation of growth inhibitory effect TNF-a from activation of NF-kB. - J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 17762-17766.

88. Dbaibo G.S., Pushkareva V.I., Jayadev S., Schwarz J.K., Horowitz J.M., Obeid L.M., and Hannun Y.A. Rb as a downstream target for ceramide -dependent pathway of growth arrest. - Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, p. 1347 - 1351.

89. Geilen C.C., Wieder T., Orfanos C.S. Ceramide signalling: regulatory role in cell proliferation, differentiation and apoptosis in human epidermis. - Arch. Dermatol. Res., 1997, v. 289, p. 559-566.

90. Geilen C.C., Bectas M., Wieder T., Orfanos C.E. The vitamin D3 analogue, calcipotriol, induces sphingomyelin hydrolysis in human keratinocytes. -FEB S Lett., 1996, v. 378, p. 88-92.

91. Jung E.M., Griner R.D., Mannblakeney R., Bollag W.P. A potential role for ceramide in the regulation of mouse epidermal keratinocyte proliferation and differentiation. - J. Invest. Dermatol., 1998, v. 110, p. 318-323.

92. Borchardt R.A., Lee W.T., Kalen A., Buckley R.H., Peters C., Schiff S., Bell R.N. Growth-dependent regulation of cellular ceramides in human T-cells. -Biochim. Biophys. Acta, 1994, v. 1212, p. 327 - 336.

93. Awad A.B., Vonholtz R.L., Cone J.P., Fink C.S., Chen Y.C. Beta-sitosterol inhibits the growth of HT-29 human colon cancer cells by activating the sphingomyelin cycle. - Anticancer Res., 1998, v. 18, p. 471-473.

94. Dechaves E.I., P., Bussiere M., Vance D.E., Campenot R.B. Elevation of ceramide within distal neurites inhibits neurite growth in cultured rat sympathetic neurons. - J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 3028-3035.

95. Xie H.Q., Johnson G.V.W. Ceramide selectively decreases tau levels in differentiated PC 12 cells through modulation of calpain 1. - J. Neurochemistry, 1997, v. 69, p. 1020-1030.

96. Gomez-Munoz A., Martin A., O'Brien L., Brindley D.N. Cell-permeable ceramides inhibits the stimulation of DNA synthesis and phospholipase D activity by phosphatidate and lysophosphatidate in rat fibroblasts. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 8937-8943.

97. Gomez-Munoz A., Waggoner D.W., O'Brien L., Brindley D.N., Interaction of ceramides, sphingosine and sphingosine-1-phosphate in regulation DNA synthesis and phospholipase D activity. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 26318-26325.

98. Olivera A., Buckley N.E., Spiegel S. Sphingomyelinase and cell-permeable ceramide analogs stimulate cellular proliferation in quiscent Swiss 3T3 fibroblasts. - J. Biol. Chem., 1992, v. 267, p. 26122 - 26127.

99. Olivera A., Romanowski A., Rani C.S.S., Spiegel S. Differential effects of sphingomyelinase and cell-permeable ceramide analogs on proliferation of Swiss 3T3 fibroblasts. - Biochim. Biophys. Acta, 1997, v. 1348, p. 311-323.

100. Kuroki J., Hirokawa M., Kitabayashi A., Lee M., Horiuchi T., Kawabata Y., Miura A.B. Cell-permeable ceramide inhibits the growth of B lymphoma Raji cells lacking TNF-alpha- receptor by inducing Go /Gi arrest and apoptosis. - Leukemia, 1996, v. 10, p. 1950-1958.

101. De Caprio J.A., Furukawa Y., Ajchenbaum F., Griffin J.D., Livingston D.M. The retinoblastoma-susceptibility gene product becomes phosphorylated in multiple stages during cell cycle entry and progression. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, p. 1795 - 1798.

102. Nevins J.R. E2F: a link between the Rb tumor suppressor protein and viral oncoprotein. - Science, 1992, v. 258, p. 424 - 429.

103. Goodrich D.W., Wang N.P., Qian Y.-W., Lee E.Y., Lee W. The retinoblastoma gene product regulates progression through the Gi phase of the cell cycle. - Cell, 1991, v. 67, p. 293-302.

104. Ludlow J.W. Interaction between SV-40 large tumor antigene and the growth suppressor proteins pRb and p53. - FASEB J., 1993, v. 7, p. 866-871.

105. Moran E. Interaction of adenoviral proteins with pRb and p53. - FASEB J., 1993, v. 7, p. 880-885.

106. Rani C.S., Abe A., Chang Y., Rosenzweig N., Saltiel A.R., Radin N.S., Shayman J.A. Cell cycle arrest induced by an inhibitor of glucosylceramide synthase. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 2859-2867.

107. Mc Cachren S.S., Salehi Z., Weinberg J.B., Niedel J.E. Transcription interruption may be a common mechanism of c-myc regulation during HL-60 differentiation. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, v. 151, p. 574 -58228.

108. Flamigni F., Faenza I., Marmiroli S., Stanic I., Giaccari A., Muscari C., Stefanelli C., Rossoni I. Inhibition of the expression of ornithine decarboxylase and c-myc by cell-permeant ceramide in difluoromethylomithine-resistant leukemia cells. - Biochem. J., 1997, v. 324, p. 783-789.

109. Riabowol K., Schiff J., Gilman M.Z. Transcription factor AP-1 activity is required for initiation of DNA synthesis and is lost during cellular aging. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, v. 89, p. 157-161

110. Stein G.H., Beeson M., Gordon L. Failure to phosphorylate the retinoblastoma gene product in senescent human fibroblasts. - Science, 1990, v. 249, p. 666-669.

111. Goldstein S. Replicative senescence: The human fibroblast comes of age. - Science, 1990, v. 249, p. 1129 - 1133.

112. Venable M.E., Lee, J. Y., Smyth, M.J., Bielawska, A., Obeid, L.M. Role of ceramide in cellular senescence. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 30701 -30709.

113. Venable, M.E., Blob G.C., Obeid L.M. Identification of a defect in the phospholipase D / diacylglycerol pathway in cellular senescence. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 26040 - 26044.

114. Bielawska A., Cran H.M., Liotta D., Obeid L., Hannun Y.A. Selectivity of ceramide-mediated biology. - J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 26226 - 26232.

115. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. - Br. J. Cancer, 1972, v. 26, p. 239-257.

116. Wyllie A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R. Cell death: the significance of apoptosis. - Int. Rev. Cytol., 1992, v. 68, p. 251-263.

117. Obeid L.M., Linardic C.M., Karolak L.A., Hannun Y.A. Programmed cell death induced by ceramide. - Science, 1993, v. 259, p. 1769 - 1771.

118. Jarvis W.D., Kolesnick R.N., Fornari F.A., Traylor R.S., Gevirtz D.A., Grant, S. Induction of apoptotic DNA damage and cell death by activation of the sphingomyelin pathway. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1994, v. 91, p. 73 -77.

119. Kaipia A., Chun S-E., Eisenhauer K., Hsuen J.W.A. Tumor necrosis factor a and its second messenger, ceramide, stimulate apoptosis in cultured ovarian follicules. - Endocrinology, 1996, v. 137, p. 4864 - 4869.

120. Larocca J.N., Farooq M., Norton W.T. Induction of oligodendrocyte apoptosis by C2-ceramide. - Neurochem. Res., 1997, v. 22, p. 529-534.

121. Hartfield P.J., Mayne G.C., Murray A.W. Ceramide induces apoptosis in PC 12 cells. - FEBS Lett., 1997, v. 401, p. 148-152.

122. Brugg B., Michel P.P., Agid Y., Ruberg M. Ceramide induces apoptosis in cultured mesencephalic neurons. - J. Neurochem., 1996, v. 66, p. 733-739.

123. Yoshimura S., Sakai H., Ohguchi K., Nakashima S., Banno Y., Nishimura Y., Sakai N., Nozava Y. Changes in the activity and mRNA levels of phospholipase D during ceramide-induced apoptosis in rat C6 glial cells. - J. Neurochem., 1997, v. 69, p. 713-720.

124. Iwasakibessho Y., Banno Y., Yoshimura S., Ito Y., Kitajima Y., Nozawa Y. Decreased phospholipase D (PLD) activity in ceramide-induced apoptosis of human keratinocyte cell line HaCat. - J Investigate. Dermatol., 1998, v. 110, p. 376-382.

125. Chmura S.J., Nodzenski E., Beckett M.A., Kufe D.W., Quintans J., Weichselbaum R.R. Loss of ceramide production confers resistance to radiation-induced apoptosis. - Cancer Res., 1997, v. 57, p. 1270-1275.

126. Michael J.M., Lavin M.F., Waiters D.J. Resistance to radiation-induced apoptosis in Burkitt's lymphoma cells is associated with defective ceramide signalling. - Cancer Res., 1997, v. 57, p. 3600-3605.

127. Bruno A.P., Laurent G., Averbeck D., Demur C., Bonnet J., Bettaieb A., Levade T., Jaffrezou J.P. Lack of ceramide generation in TF-1 human myeloid leukemic cells resistant to ionizing radiation. - Cell Death Differentiation, 1998, v. 5, p. 172-182.

128. Bose R., Verheij M., Haimovitz-Friedman A., Scotto K., Fuks Z., Kolesnick R. Ceramide synthase mediates daunorubicin-induced apoptosis: an alternative mechanism for generating death signals. - Cell, 1995, v. 82, p. 405 -414.

129. Mansat V., Bettaieb A., Levade T., Laurent G., Jaffrezou J.P. Serine protease inhibitors block neutral sphingomyelinase activation, ceramide generation and apoptosis triggered by daunorubicin. - FASEB J., 1997, v. 11, p. 695-702.

130. Allouche M., Bettaieb A., Vindis C., Rousse A., Grindon C., Laurent G. Influence of bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells. - Oncogene, 1997, v. 14, p. 1837-1845.

131. Cifone M.G., De Maria R., Roncaioli P., Rippo M.R., Azuma M., Lanier K.K., Santoni A., Testi R. Apoptotic signalling through CD95 (Fas / Apo-1)

activates an acidic sphingomyelinase. - J. Exp. Med., 1994, v. 180, p. 1547 -1552.

132. Foghi A., Ravandi A., Teerds K.J., Vanderdonk H., Kuksis A., Dorrington J. Fas-induced apoptosis in rat thecal/intestial cells signal through sphingomyelin-ceramide pathway. - Endocrinology, 1998, v. 139, p. 20412047.

133. Tepper A.D., Boesendecock J.G.R., Devries E., Borst J., Vanblitterswijk W.J. CD 95/Fas-induced ceramide formation proceeds with slow kinetics and is not blocked by caspase-3/CPP 32 inhibition. - J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 24308-24312.

134. Watts J.D., Gu M., Polverino A.J., Patterson S.D., Acbersold R. Fas-induced apoptosis of T cells occurs independently of ceramide generation. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 7292-7296.

135. Brenner B., Ferlinz K., Grassme H., Weller M., Koppenhoeter U., Dichgans J., Sandhoff K., Lang F. Fas/CD 95/Apo-l activates the acidic sphingomyelinase via caspases. - Cell Death Differentiation, 1998, v. 5, p. 2937.

136. Demaria R., Rippo M.R., Schuchman E.H., Testi R. Acidic sphingomyelinase (ASM) is necessary for Fas-induced GD3 ganglioside accumulation and efficient apoptosis of lymphoid cells. - J. Exp. Med., 1998, v. 187, p. 897-902.

137. Boesendecock J.G.R., Tepper A.D., Devries E., Vanblitterswijk W.J., Borst J. CD 95 (Fas/Apo-1) induces ceramide formation and apoptosis in the absence of a functional acid sphingomyelinase. - J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 7560-7565.

138. Weiss E., Vonreyher U., Kittstein W., Moller P., Krammer P.H., Marks F., Gschwendt M. Suppression of apoptosis in COLO 205 cells by the phorbol ester TPA may be mediated by the PKC isoenzyme alpha. - International J. Oncology, 1997, v. 10, p. 1119-1123.

139. Wyllie A.H. Apoptosis and carcinogenesis. - Eur. J. Cell Biol., 1997, v. 73, p. 189-197.

140. Smith C.A., Farrah T., Goodwin R.G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins. Activations, costimulation and death. - Cell, 1994, v. 76, p. 959-962.

141. Herrmann J.L., Menter D.G., Beham A., Voneschenbach A., Mcdonell T.J. Regulation of lipid signalling pathway for cell survival and apoptosis by bcl-2 in prostate carcinoma cells. - Exp. Cell Res., 1997, v. 234, p. 442-451.

142. Kojima H., Datta R. Involvement of a Crm-insensitive ICE/Ced-3-like protease in ceramide-induced apoptosis. - Oncology Res., 1996, v. 8, p. 497501.

143. Dbaibo G.S., Perry D.K., Gamard C.J., Piatt R., Poirier G.G., Obeid L.M., Hannun Y.A. Cytokine response modifier A (crm A) inhibits ceramide

formation in response to tumor necrosis factor (TNF)-a: crm and bcl-2 target distinct component in the apoptosis pathway. - J. Exp. Med., 1997, v. 185, p. 481-490.

144. Monney L., Olivier R., Otter I., Jansen B., Poirier G.G., Borner C. Role of an acidic compartment in tumor necrosis factor-alpha-induced production of ceramide, activation caspase-3 and apoptosis. - Eur. J. Biochem., 1998, v. 251, p. 1-2.

145. Genestier L., Prigent A.F., Paillot R., Quemeneuz L., Durand I., Banchereau J., Revillard J.P., Bonnetoylerard N. Caspase-dependent ceramide production in Fas- and HLA class 1-mediated peripheral T-cell apoptosis. - J. Biol. Chem., 1998, v. 173, p. 5060-5066.

146. Geley S., Hartmann B.L., Kofler R. Ceramide induces a form of apoptosis in human acute lymphoblastic leukemia cells that is inhibited by bcl-2, but not by crm A. - FEBS Lett., 1997, v. 400, p. 15-18.

147. Ballou L.R., Laulederkind S.J.F., Rosloniec E.F., Raghow R. Ceramide signalling and the immune response. - Biochim. Biophys. Acta, 1996, v. 1301, p. 273 - 287.

148. Mathias S., Yuones A., Kan C.-C., Orlow I., Joseph C., Kolesnick R.N. Activation of the sphingomyelyn signalling pathway in intact EL4 cells and in a cell-free system by IL-lß. - Science, 1993, v. 259, p. 519 - 522.

149. Machelon V., Nome F., Durandgasselin I., Emilie D. Tumor necrosis factor-

alpha induces interleukin-6 mRNA and protein in human granulosa luteinizing cells

via protein tyrosine kinase without involving ceramide. - Molec. Cell.

Endocrinology, 1997, v. 126, p. 173-184.

150. Kirtikawa K., Laulederkind S.J.F., Raghow R., Kanekura T., Ballou L.R. An accessory role for ceramide in interleukin 1-beta induced prostaglandin synthesis. - Molec. Cell. Biochem., 1998, v. 181, p. 41-48.

151. Weigman K., Schutze S., Machleidt T., Witte D., Kronke M. Functional dichotomy of neutral and acidic sphingomyelinases in tumor necrosis factor signalling. - Cell, 1994, v. 78, p. 1005 - 1015.

152. Gamard C.J., Dbaibo G.S., Liu B., Obeid L.M., Hannun Y.A. Selective involvement of ceramide in cytokine-induced apoptosis. - Ceramide inhibits phorbol ester activation of nuclear factor kappa B. - J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 16474-16481.

153. Sallusto F., Nicolo C., Demaria R., Corinti S., Testi R. Ceramide inhibits antigen uptake and presentation by dendritic cells. - J. Exp. Med., 1996, v. 184, p. 2411-2416.

154. Reunanen N., Westermarck J., Hakkinen L., Holmstrom T.H., Elo I., Eriksson J.E., Kahari V.M. Enhancement of fibroblast collagenase (matrix metalloproteinase) gene expression by ceramide is mediated by extracellular

signal-regulated and stress activated protein kinase pathway. - J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 5137-5145.

155. Nakabo Y., Pabst M.J. C2-ceramide and C6-ceramide inhibited priming for enhanced release of superoxide in monocytes, but had no effect on the killing of leukemic cells by monocytes. - Immunology, 1997, v. 90, p. 477-482.

156. Van Veldhoven P.P., Matthews T.J., Bolognesi D.P., Bell R.M. Changes in bioactive lipids, alkylacylglycerol and ceramide, occur in HIV-infected cells. - Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, v. 187, p. 209 - 216.

157. Karasawas N., Erukulla R.K., Bittman R., Loskshin R., and Zakeri Z. Stereospecific induction of apoptosis in U 937 cells by N-octanoyl-sphingosine stereoisomers and N-octyl-sphingosine. - Eur. J. Biochem., 1996, v. 236, p. 729-737.

158. Дятловицкая Э.В. Зависимость биоэффекторных свойств сфинголипидов от строения их гидрофобного фрагмента. - Биохимия, 1998, т. 63, с. 67-74.

159. Lee J.V., Hannun Y.A., Obeid L.M. Ceramide inactivates cellular protein kinase Cot. - J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 13169-13174.

160. Venable M.E., Bielawska A., Obeid L.M. Ceramide inhibits phospholipase D in a cell-free system. - J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 24800-24805.

161. Abe A., Wu D., Shayman J.A., Radin N.S. Metabolic effects of short-chain ceramide and glucosylceramide on sphingolipids and protein kinase C. -Eur. J. Biochem., 1992, v. 210, p. 765-773.

162. Olshefski R., Taylor B., Heitger A., Hasegava A., Ladisch S. Induction of programmed cell death and immunosuppression by exogenous sphingolipids are separate processes. - Eur. J. Biochem., 1996, v. 241, p. 47-55.

163. Ji L., Zhang G., Uematsu S., Akahori Y., Hirabajashi Y. Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death by natural ceramide. - FEBS Lett., 1995, v. 358, p. 211-214.

164. Hashizume T., Kageura T., Sato T. Different effects of cell-permeable ceramide analogs on platelet activation. - Biochem. Molec. Biol. International, 1998, v. 44, p. 489-496.

165. Westwick J.K., Bielawska A.E., Dbaibo G., Hannun Y.A., Brenner D.A. Ceramide activates the stress-activated protein kinases. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 22689-22692.

166. Testi R. Sphingomyelin breakdown and cell fate. - TIBS, 1996, v. 21, p. 468-471.

167. Jayadev S., Linardic C.M., Hannun Y.A. Identification of arachidonic acid as a mediator of sphingomyelin hydrolysis in response to tumor necrosis factor a. - J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 5757-5763.

168. Jayadev S., Hayfer H.L., Andrieu N., Gamard C.J., Liu B., Balu R., Hayakawa M., Ito F., Hannun Y.A. Phospholipase A2 is necessary for tumor necrosis factor-a-induced ceramide generation in L929 cells. - J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 17196-17203.

169. Kronke M., Schutze S., Wiegman K., Machleidt T. Sphingomyelinases and TNF-a-induced apoptosis. - Cell Physiol. Biochem., 1996, v. 6. P. 337344.

170. Zhang P., Liu B., Jenkins G.M., Hannun Y.A Obeid L.M. - Expression of neutral sphingomyelinase identities a distinct pool of sphingomyelin involved in apoptosis. - J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 9609-9612.

171. Liu P., Anderson R.G.W. Compartmentalized production of ceramide at the cell surface. - J. Biol. Chem., 1995, v. 270, p. 27179-27185.

172. Obeid L.M., Hannun Y.A. Ceramide: a stress signal and mediator of growth suppression and apoptosis. - J. Cell. Biochem., 1995, v. 58, p. 191198.

173. Perry D.K., Obeid L.M., Hannun Y.A. Ceramide and the regulation of apoptosis and the stress response. - Trends Cardiovasc. Med., 1996., v. 6, p. 158-162.

174. Hannun Y.A. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress. - Science, 1996, v. 274, p. 1855 - 1859.

175. Dbaibo G.S. Regulation of the stress response by ceramide. - Lipids as Regulators of Cell Function, 1997, v. 25, p. 557-561.

176. Yoshimura S., Banno Y., Nakashima S., Takenaka K., Sakai H., Shimizu S., Eguchi Y., Tsujimoto Y., Nozawa Y. Ceramide formation leads to caspases activation during hypoxic PC 12 cell death-inhibitory effects of bcl-2 on ceramide formation and caspase-3 activation. - J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 6921-6927.

177. Bialojan C., Takai A. Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatase. - Biochem. J., 1988, v. 256, p. 283-290.

178. Vousden K. Interaction of human papillomavirus transforming protein with the products of tumor suppressor genes. - FASEB J., 1993, v. 7, p. 872-879.

179. Metz R.J., Vellody K., Patel S., Bergstrom R., Meisinger J., Jackson J., Wright M.A., Young M.R.I. Vitamin D3 and ceramide reduce the invasion of tumor cells through extracellular matrix component by elevation protein phosphatase 2A. - Invasion Metastasis, 1996, v. 16, p. 280-290.

180. Meisinger J., Patel S., Vellody K., Bergstrom R., Benefield J., Lozano Y., Young M.R.I. Protein phosphatase-2A association with microtubuls and its role in restriction the invasiveness of human head and neck squamous cell carcinoma cells. - Cancer Lett., 1997, v. 111, p. 87-95.

181. Hannun Y. A. Apoptosis and the dillema of cancer chemotherapy. - Blood, 1997, v. 89, p. 1845-1853.

182. Дятловицкая Э.В. Ганглиозиды и антитела к ганглиозидам сыворотки крови. - Биохимия, 1992, т. 57, с. 1004-1010.

183. Portoukalian J., David М., Gain P., Richard M. Characterization of gangliosides from normal and osteoarthritis human articular cartilage. -Arthritic and Rheumatism, 1993, v. 36, p. 938-942.

184. Cotterchio M., Seyfried T.N. Serum gangliosides in mice with metastatic and non-metastatic brain tumors. - J. Lipid Res., 1994, v. 35, p. 10-14.

185. Chang F.M., Li R.X., Ladisch S. Shedding of gangliosides by human medulloblastoma cells. - Exp. Cell Res., 1997, v. 234, p. 341-346.

186. Hertervig E., Nilsson A., Nyberg L., Duan R.D. Alkaline sphingomyelinase activity is decreased in human colorectal carcinoma. -Cancer, 1997, v. 79, p. 448-453.

187. Dudeja P.K., Dahiya R., Brasitus T.A. The role of sphingomyelin synthase and sphingomyelinase in 1,2-dimethylhydrasine-induced lipid alteration of rat colonic plasma membranes. - Biochim. Biophys. Acta., 1986, v. 863, p. 309312.

188. Dahiya R., Boyle В., Goldberg B.C., Yoon W.-H., Konety В., Chen K., Yen T.-S., Blumenfeld W., Narayan P. Metastasis-associated alterations in phospholipids and fatty acids of human prostatic adenocarcinoma cell lines. -Biochem. Cell Biol., 1992, v. 70, p. 548-554.

189. van't Hof W., Silvius J., Wieland F., van Meer G. Epithelial sphingolipid sorting allows for extensive variation of the fatty acyl chain and the sphingosine backbone. - Biochem. J., 1992, v. 283, p.913-917.

190. Heape A.M., Boiron F., Bessoule J.-J., Cassagne C. Peripheral nerve sphingomyelin and cerebroside are both formed via two metabolicaly and kineticaly distinct pathway in vivo. - Eur. J. Biochem., 1994, v. 226, p. 491504.

191. McKay C.P. Ceramidase and signal transduction. - Sphingolipid-mediated signal transduction. (Hannun Y.A., ed) 1997., R.G. Landes Company, pp. 173181.

192. Юрьев Ю.К. Практические работы по органической химии. М.: МГУ, 1957.

193. Вайсберг А., Проскауэр Э., Раддик Д., Тупс Э. Органические растворители. М.: ИЛ, 1958.

194. Кейтс С.Т. Техника липидологии. М.: Мир, 1975, с. 138-140.

195. Wagner, Н., Horhammer, L., Wolf, P., Dunnschicht. Chromatographie von phosphatiden und glycolipiden.- Biochem. Z., 1961, v. 334, p. 175-184.

196. Svennerholm, L. Sialic acids and derivatives: estimation by the ionexchange methods.- Methods in Enzymol., 1963, v. 6, p. 459-462.

197. Van Gent, C.H., Roseleur, O.J., Van der Bijl, P. Detection of cerebrosides on thin-layer chromatograms with an anthrone spray reagent. - J. Chromatog., 1973, v. 85, p. 174-176.

198. Kawounura, N., Taketoni, Т. A new procedure for the isolation of brain gangliosides and determination of their long-chain base compositions. - J. Biochem., 1977, v. 81, p. 1217-1225.

199. Дятловицкая Э.В., Андреасян Т.О., Малых Я.Н. Церамиды и ганглиозиды яичников человека при старении. - Биохимия, 1995, т. 6, №8, с. 1302-1306.

200. Вайнберг А .Я., Манухин Б.Н., Решетникова H.A., Чуприянова Н.Е., Самохвалов Г., И. О роли ганглиозидов в рецепции серотонина. -Вопр.мед. химии, 1972, т. 18, с. 477-482.

201. Dyatlovitskaya, E.V., Novikov, A.M., Gorkova, N.P., Bergelson, L.D. Gangliosides of hepatoma 27, normal and regenerating rate liver. - Eur. J. Biochem., 1976, v. 63, p. 357-364.

202. Suzuki, K.A. Simple and accurate micromethod for quantitative determination of ganglioside patterns. - Life Sei., 1964, v. 3, p. 1227-1231.

203. Loury, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. - J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p. 265-275.

204. Дятловицкая Э.В., Леменовская А.Ф., Грешных К.П., Ушаков А.Н., Бергельсон Л.Д. Липиды опухолей. Сфингомиелин опухолей и гомологичных нормальных тканей. - Биохимия, 1973, т. 38, с. 943-948.

205. Дятловицкая Э.В., Заблоцкая А.Е., Волгин Ю.В., Азизов Ю.М., Бергельсон Л.Д. Структура ганглиозидов лимфоцитов крови крупного рогатого скота в норме и при лимфолейкозе. - Биохимия, 1980, т. 45, с. 1041-1047.

206. Добрынин Я.В., Монатова Т.И., Мирзоян Е.Е. - Вопр. онкологии, 1974,20, №3, с. 44-52.