Характеристика штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории СНГ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, Саркисова, Нана Валиевна

• Саркисова, Нана Валиевна
• 2005

Оглавление диссертации Саркисова, Нана Валиевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика биологических свойств сибиреязвенного микроба

1.2. Идентификация и внутривидовая дифференциация возбудителя сибирской язвы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов

2.2. Экспериментальные животные

2.3. Питательные среды и реактивы

2.4. Метод идентификации штаммов сибиреязвенного микроба по классической схеме

2.5. Определение спорообразования

2.6. Метод одновременного определения продукции капсулы, токсина и вирулентности in vitro

2.7. Метод определения гемолитической и протеолитической активности

2.8. Метод выявления измененных питательных потребностей В. anthracis

2.9. Плазмидный скрининг

2.10. Метод экстракции ДНК сибиреязвенного микроба

2.11. Метод полимеразной цепной реакции

2.12. Метод определения генотипа штамма по VNTR-принадлежности (локус vrrA)

2.13. Методы статистической обработки

Глава 3. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА ПО ОСНОВНЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ СВОЙСТВАМ

3.1 Подбор рабочей коллекции штаммов, выделенных на территории СНГ

3.2. Характеристика штаммов по тестам классической схемы лабораторного анализа

3.3. Определение чувствительности штаммов сибиреязвенного микроба к антибиотикам

Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ТЕСТОВ

4.1. Выявление измененных питательных потребностей и определение гемолитической и протеолитической активности

4.2. Определение вирулентности in vivo и in vitro

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ

СВОЙСТВ ШТАММОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО

МИКРОБА

5.1. Плазмидный скрининг и определение плазмидных генов основных факторов патогенности

5.2. Генетическая вариабельность анализируемых штаммов по хромосомному локусу vrrA

Глава 6. ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ

СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

6.1 . Анализ связи некоторых свойств штаммов и их генотипа по локусу vrrA

6.2. Разработка схемы исследования культур сибиреязвенного микроба и компьютерной базы данных для штаммов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории СНГ»

Актуальность проблемы. Сибиреязвенный микроб является возбудителем острой зооантропонозной инфекции, эпидемические и эпизоотические проявления которой имеют большую социальную и экономическую значимость. Современный мировой уровень заболеваемости людей составляет десятки тысяч случаев в год. Сибирская язва продолжает представлять собой серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран, включая Россию (Cherkasskiy B.L., 1998).

Интерес к этой инфекции и ее возбудителю не ослабевает на протяжении более чем столетия, им посвящена обширная литература, пополнившаяся недавно монографиями отечественных авторов (Маринин JI. И. с соавт.,

1999; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999; Бакулов И.А. с соавт., 2000, Черкасский Б.Л., 2002).

Сибиреязвенный микроб относится к числу наиболее вероятных и опасных средств биологического оружия. Его высокая патогенность обусловлена способностью образовывать экзотоксины и капсулу, а устойчивость к дезинфицирующим агентам и возможность длительного сохранения во внешней среде обеспечивается специфическими свойствами спор. Возможность использования спор Bacillus anthracis в качестве орудия биологического терроризма наглядно продемонстрировали события в США в 2001 г., заставившие существенно пересмотреть подходы к организации всей системы противоэпидемического обеспечения населения, а также к профилактике, лечению и лабораторной диагностике сибирской язвы.

Принятая у нас в стране и рекомендуемая ВОЗ "классическая" схема исследования материала на наличие возбудителя сибирской язвы и его идентификации основаны на тестах (чувствительность к бактериофагам, чувствительность к пенициллину в тесте "жемчужного ожерелья", капсулообразование, гемолиз на агаре с дефибринированной кровью барана, подвижность, тест на щелочную фосфатазу), которые дифференцируют типичные штаммы возбудителя сибирской язвы от близкородственных бацилл Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis, составляющих вместе с ним таксономическую группу Bacillus cereus. Однако иногда выделяют штаммы B.anthracis, которые по одному или нескольким из перечисленных тестов отличаются от типичных описаний свойств этого микроорганизма и являются «камнем преткновения» в идентификации. При этом определение фенотипических и генотипических различий между штаммами не нашло должного отражения в принятой в нашей стране схеме исследования на наличие возбудителя сибирской язвы. Внутривидовое типирование ограничивается разделением на три категории по степени патогенности, принадлежность к которым определяется дозой спор, вызывающей гибель кроликов при заражении.

До последнего времени В. anthracis считался одним из наиболее генетически мономорфных микробных видов (Harrel L. et al., 1995; Roloff H. et al., 1995; Keim P. et al., 1997). Сейчас предложены молекулярные методы, основанные на анализе областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR-анализ) и позволяющие выявить геномное разнообразие внутри вида B.anthracis (Andersen G. et al., 1996; Jackson P. et al., 1997; Keim P. et al., 1999; 2000). Эти методы позволили выявить более сотни отличающихся генотипов среди штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных в разных странах мира, а также обнаружить их приуроченность к определенным географическим регионам. Систематическое генотипирование изолятов из стран СНГ и России до сих пор не проводилось, отсутствуют данные о распространенности и циркуляции штаммов с генотипами, свойственными этим обширным территориям.

Одним из целого ряда неотложных вопросов, возникших в ситуации реального террористического акта в США в 2001 г., оказался вопрос об определении происхождения штамма - "убийцы". Несмотря на то, что для его типирования были использованы наиболее современные, имеющие высокую разрешающую способность молекулярные методы, включая метод многолокусного анализа регионов с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) и даже определение генетической последовательности всего генома в сравнении с известными данными, до настоящего времени не получено однозначного ответа на этот вопрос (Read Т. et al., 2002).

В связи с этим, в последнее время приобретают особую значимость исследования, связанные с возможностью получения информации о фенотипических и генотипических свойствах конкретных штаммов возбудителя, позволяющих отличить их от множества других, проследить за их распространением и циркуляцией.

Таким образом, существует ряд тесно связанных вопросов в области классификации, идентификации и эпидемиологического мониторинга возбудителя сибирской язвы, разрешение которых представляется вполне актуальным.

Цель исследования. Целью работы является получение на основе традиционных и дополнительными методов исследования характеристики штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных в некоторых регионах территории СНГ, анализ полученных данных и оценка возможности их использования в идентификации, внутривидовом типировании и эпидемиологическом мониторинге В. anthracis.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи исследования:

Подобрать рабочую коллекцию штаммов, выделенных на территории СНГ, для последующего изучения;

Определить основные фенотипические свойства штаммов возбудителя сибирской язвы;

Охарактеризовать штаммы по дополнительным фенотипическим признакам (токсинообразование и вирулентность in vitro, гемолитическая и протеолитическая активности в отношении ряда субстратов, питательные потребности);

Определить плазмидный состав изолятов и наличие плазмидных генов;

Оценить степень генетической вариабельности анализируемых штаммов микроба по хромосомному локусу vrrA;

Проанализировать связь определенных генотипов и фенотипов с географическим происхождением, источником и временем выделения штаммов;

Оценить информативность и значимость тестов лабораторного анализа для идентификации и внутривидового типирования;

Разработать обобщенную схему исследования культур В. anthracis, включающую, помимо идентификации, основанной на «классических» тестах, внутривидовое типирование ускоренным методом, а также с использованием дополнительных фенотипических и генотипических тестов;

Разработать форму представления результатов фенотипических и генотипических тестов из обобщенной схемы исследования культур В. anthracis в компьютерной базе данных по свойствам штаммов сибиреязвенного микроба, а также создать такую базу для изученных штаммов.

Научная новизна

Впервые получена комплексная фенотипическая и генотипическая характеристика штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории стран СНГ, оценена вариабельность ряда фенотипических признаков и соответствующих им генотипов, в том числе имеющих отношение к патогенности. Впервые определен диапазон генетической изменчивости этих штаммов по одному хромосомному локусу, проанализирована связь идентифицированных генотипов с географическим происхождением, источником и временем выделения. Впервые установлена корреляция генотипов штаммов по локусу vrrA с определенными географическими регионами и предположено существование «эндемичных» для них штаммов. Впервые дана оценка информативности и значимости тестов лабораторного анализа для идентификации и внутривидового типирования, предложена обобщенная схема исследования культур сибиреязвенного микроба, в которую введены ускоренный метод анализа и дополнительные тесты для внутривидого типирования. На основании фенотипического и генотипического анализа выделено 16 внутривидовых типов возбудителя сибирской язвы. Впервые разработана форма представления результатов фенотипических и генотипических тестов в компьютерной базе данных, позволяющей сравнивать свойства штаммов и дополнять ее новыми параметрами.

Практическая значимость работы

Разработанная обобщенная схема исследования культур В. anthracis и форма представления результатов фенотипических и генотипических тестов в компьютерной базе данных по штаммам сибиреязвенного микроба «Bacillus anthracis» могут быть предложены в качестве дополнения к действующим методическим указаниям «Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды». Компьютерная база данных и схема исследования культур внедрены в практику лаборатории сибирской язвы СтавНИПЧИ и могут быть использованы в учреждениях медицинского и ветеринарного профиля, занимающихся лабораторной диагностикой сибирской язвы.

Результаты исследований отражены в следующих методических документах, нашедших применение в научно-исследовательской работе и практическом здравоохранении:

1. Индикация возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды при помощи магноиммуносорбентов и полимеразной цепной реакции (Методические рекомендации). Утверждены Ученым советом СтавНИПЧИ 29 июня 2000 г., протокол заседания № 6.

2. «Методические рекомендации по экспресс-анализу атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы». Утверждены Ученым советом СтавНИПЧИ 26 декабря 2000 г., протокол заседания №11.

3. Методические рекомендации "Использование полимеразной цепной реакции для идентификации Bacillus anthracisУтверждены Ученым советом СтавНИПЧИ 31 мая 2001 г., протокол заседания № 5.

Положения, выносимые на защиту

1. Штаммы сибиреязвенного микроба, выделенные на территории России и некоторых стран СНГ имеют характерные для вида B.anthracis основные фенотипические свойства, отличаясь между собой в пределах внутривидовых вариантов морфологией колоний и характером роста на питательных средах. Существенные отличия касаются капсулообразования, вирулентности, лецитиназной активности и чаще всего встречаются среди штаммов, выделенных из почвы.

2. Вариабельность анализируемых изолятов по локусу vrrA определяется тремя VNTR-категориями. Неравномерность распределения разных VNTR-категорий по группам в зависимости от принадлежности к определенным географическим областям выделения штаммов может послужить основой для их эпидемиологической маркировки в целях мониторинга за распространением сибиреязвенной инфекции.

3. Использование дополнительных фенотипических характеристик в сочетании с генотипированием позволяет выделить внутри вида максимальное количество типов В.anthracis. Применение предлагаемой схемы исследования дает возможность проводить ускоренный и полный анализ, состоящий из идентификации и внутривидового типирования, в объеме, соответствующем уровню оснащения и квалификации лаборатории.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на юбилейной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998), на 3-ей международной конференции по сибирской язве (Plymouth, England, 1998), на 2-ой международной конференции по молекулярной биологии бацилл (Taos, New Mexico, USA, 1999), на 1-й Европейской конференции по опасным инфекциям (Winchester, England, 1999), на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), на международной научно-практической конференции «Современный эпидемический потенциал природных очагов чумы» (Казахстан, г. Талдыкорган, 2001), на 4-ой международной конференции по сибирской язве (Annapolis, USA, 2001) и юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы», посвященной 50 - летию СтавНИПЧИ.

Материалы диссертации являются результатом работы и вошли в заключительные отчёты по НИР СтавНИПЧИ «Изучение эпидемиологических, эпизоотологических и экологических особенностей сибирской язвы на Северном Кавказе» № ГР 01960001795 и НИР «Разработка новых диагностических тест-систем для выявления атипичных штаммов возбудителей особо опасных инфекций (чума, сибирская язва, бруцеллез, туляремия, холера), полученных в эксперименте и выделенных в природе», выполненной по Федеральной целевой программе «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера в 1999 - 2005 годах» по договорам № 321Д от 28.07.2000 г. и № 423Д от 03.07. 2001 г.

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции СтавНИПЧИ 04.11.2002 г.

Публикация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 16 работ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов. Список литературы включает 71 работу на русском и 148 - на иностранных языках. Материалы исследований иллюстрированы 8 рисунками и 12 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Саркисова, Нана Валиевна

Выводы:

1. Изученные штаммы сибиреязвенного микроба по своим основным фенотипическим характеристикам относятся к типичным представителям вида Bacillus anthracis, отличаясь между собой в пределах внутривидовых вариантов морфологией колоний и характером роста на питательных средах, за исключением бескапсульных, образующих капсулу на воздухе, и лецитиназоположительных изолятов.

2. Все исследованные штаммы имеют характерный для сибиреязвенного микроба спектр чувствительности к антибиотикам и не являются устойчивыми к используемым для экстренной профилактики и лечения сибирской язвы пенициллину, ампициллину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину и ципрофлоксацину.

3. Дополнительные фенотипические характеристики позволяют выявить среди штаммов лишенные способности лизировать отмытые эритроциты и деградировать гемоглобин и альбумин, с отличающимися питательными потребностями и не продуцирующие токсин in vitro. Использование дополнительных фенотипических характеристик обнаруживает большую, чем при исследовании только по основным тестам, степень фенотипической вариабельности, наиболее характерную для штаммов, выделенных из почвы.

4. Определение вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба методом in vitro, основанном на выявлении фенотипической экспрессии признаков капсуло- и токсинообразования, дает возможность подтвердить полученное в опытах in vivo на белых мышах разделение штаммов на вирулентные и авирулентные и различить внутри группы вирулентных высоко-, умеренно- и слабо- вирулентные штаммы без заражения кроликов.

5. Большинство изученных штаммов имеет обе плазмиды (pXOl и рХ02) с соответствующими генами капсуло - и токсинообразования, при этом один из штаммов образовывал капсулу на воздухе, а шесть не продуцировали токсин in vitro. Шесть бескапсульных штаммов не имеют плазмиды капсулоообразования рХ02, тогда как один штамм несет эту плазмиду без фенотипической экспрессии капсулообразования. Бесплазмидных, рХ02-моноплазмидных и несущих какие-либо иные, чем pXOl и рХ02, плазмиды, штаммов не обнаружено.

6. Генетическая вариабельность изученных штаммов по хромосомному локусу vrrA определяется наличием среди них относящихся к трем из пяти известных VNTR-категорий. Из числа изученных штаммов более половины (58,8%) относятся к категории VNTR4, что в целом соответствует распространенности этого генотипа в мире, 29,4% составляют категорию VNTR5, 11,8% относятся к VNTR3, и нет ни одного штамма, принадлежащего к категориям VNTR2 и VNTR,,, свойственным небольшому числу штаммов из Европы, Америки и Южной Африки.

7. Распределение штаммов разных генотипов по группам в зависимости от принадлежности к определенным географическим областям СНГ обнаруживает повсеместное распространение генотипа VNTR4, отсутствие генотипа VNTR5 в восточных регионах и наличие генотипа VNTR3 только в 3 из 16 регионов. Все штаммы, выделенные в 1979 и 1998 гг. во время нескольких одновременно происшедших вспышек сибирской язвы на сопредельных территориях, относятся к одному и тому же генотипу VNTR4.

8. В зависимости от степени и характера информативности, оцениваемых по числу выявляемых вариантов и однозначности результатов, все тесты схемы исследования сибиреязвенного микроба можно разделить на идентификационные, дифференциальные внутри вида и двоякого назначения. Обобщенная схема исследования культур B.anthracis, основанная на классических тестах с дополнением методом ускоренной идентификации и предлагаемыми фенотипическими и генотипическими тестами внутривидовой дифференциации позволяет надежно идентифицировать микроб и характеризовать штаммы сибиреязвенного микроба, выделяя среди них до 26 внутривидовых типов. В целях стандартизации лабораторных исследований для лабораторий двух разных уровней оснащения и специализации предлагается два набора тестов из числа вошедших в схему.

9. Разработанная форма представления результатов исследования штаммов сибиреязвенного микроба в виде компьютерной базы данных позволяет сравнивать характеристики известных и новых штаммов в целях эпидемиологического мониторинга и дает возможность модернизации за счет введения новых генотипических критериев для внутривидовой дифференциации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование, основной целью которого было получение всесторонней характеристики штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории СНГ, позволило решить ряд задач, что, помимо достижения этой цели, имело следствием разработку практического подхода к идентификации и внутривидовой дифференциации этого патогена (Саркисова Н.В., 2001). Это было важно как для непосредственной работы центра идентификации и музея культур В. anthracis, которые с 1981 г. функционируют в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте, так и для стандартизации подходов к изучению штаммов в целях получения в разных учреждениях сравнимых данных.

В ходе исследования были оценены информативность и значимость тестов идентификации и внутривидовой дифференциации.

Характеристика роста в питательных средах является первой и необходимой в ходе исследования, типичные штаммы формируют весьма характерные колонии на плотных питательных средах и дают адгезивный рост в жидких средах. С другой стороны, некоторые штаммы В. anthracis представлены колониями со сглаженными краями, грубыми «локонами», а в жидких питательных средах образуют пристеночное кольцо и легкие хлопья. В проведенных экспериментах колонии даже одного и того же штамма отличались морфологией и размерами и до 16% штаммов имели культуральные признаки, не вполне соответствующие «классическому» варианту. Описания вариантов морфологии колоний встречаются во многих работах, однако они часто имеют достаточно субъективный характер. Так, например, Н. Chu (1952) характеризует колониальные варианты В. anthtracis как R-шероховатые, прозрачные, в виде "головы медузы", S-мутные колонии с более гладким краем, SM - гладкие, слизистые, а также формы, промежуточные между этими тремя. Сходные 7 типов колоний, из которых основными являются R, RS и S, а остальные считаются переходными между ними, приводит W.J.Nungester (1927). В методических указаниях "Лабораторная диагностика сибирской язвы." (Москва, 1989 г) описаны также колонии в RO-форме. Н. Г. Ипатенко и А. Д. Мелехов сообщали о карликовых (G) колониях культур, выделенных от свиней.

Классическая" схема идентификации В. anthracis, которая в своей основе оставлена без изменений, поскольку она хорошо зарекомендовала себя на протяжении всей истории лабораторной диагностики сибирской язвы, предполагает три опорных теста - капсулообразование, пробу с бактериофагом и тест "жемчужного ожерелья". Тест "жемчужного ожерелья" всегда был положительным, так как среди изученных не удалось обнаружить природных штаммов, устойчивых к пенициллину, описанных в литературе (Turnbull P. et al., 1992, 1998; Bradaric N. et Punda-Polic V., 1992; Doganay M., Aydin N., 1991; Lightfoot N. F. et al., 1991), которые могли бы давать негативный результат этого теста, хотя сейчас в литературе все чаще встречаются описания устойчивых к пенициллину штаммов, выделенных в разных странах, которые могут давать отрицательный результат в этом тесте (Turnbull P. et al., 1992, 1998; Bradaric N. et Punda-Polic V., 1992; Doganay M., Aydin N., 1991; Lightfoot N.F. et al., 1991). Частота их распространенности оценивается в 3-11% (Patra G. et al., 1998; Cavallo J.-D. et al., 2002), в связи с чем некоторые авторы полагают, что тест на чувствительность к пенициллину утрачивает свое значение как одного из опорных в идентификации B.anthracis (Helgason Е., 2000). Это обстоятельство рекомендуют учитывать также при выборе препаратов для экстренной профилактики антибиотиками во время вспышек сибирской язвы.

Бескапсульные штаммы встречаются достаточно часто, поэтому отрицательные результаты тестов на капсулообразование in vivo и in vitro не всегда означают, что исследуемая культура не относится к В. anthracis. Среди изученных было шесть бескапсульных природных штаммов, которые по всем остальным признакам отнесены к сибиреязвенному микробу. Источниками выделения этих штаммов были труп серой полевки (штамм 300/31), почва скотомогильников (137-1, 644/268, 880/372 и 940/16) и смыв с двери утилизационной фабрики (1177). Среди изученных был один почвенный штамм (140П), способный образовывать капсулу на воздухе.

В работе P. Fellows (1996), изучившей 31 штамм сибиреязвенного микроба из Америки, Европы, Азии и Африки, было обнаружено 8 бескапсульных штаммов, из которых четыре было выделено от животных, два -от человека и три были неизвестного происхождения.

Среди изученных также не обнаружено устойчивых к бактериофагу "Гамма А26" штаммов, хотя их описание встречается в литературе (Цыганкова О. И. с соавт, 1995; Redmond С. et al., 1996). В частности, в работе С. Redmond et al. более 3% испытанных культур В. anthracis были устойчивы ко всем использованным бактериофагам, включая диагностический фаг "Гамма".

Так же абсолютно однотипными выглядели результаты тестирования штаммов на гемолиз на агаре с дефибиринированной кровью барана - все штаммы не вызывали гемолиза. Следует отметить, что именно этот тест является первоочередным при исследовании культур в схемах идентификации В. anthracis, принятых в США, Великобритании и рекомендуемой ВОЗ.

Тест на щелочную фосфатазу, проводимый в описанной модификации, также для всех штаммов был отрицательным. Этот тест оказался удобным для идентификации штаммов и широко используется в дифференциально-диагностической селективной среде, позволяющей уже на первом этапе лабораторного исследования на сибирскую язву отобрать фосфатазонегативные колонии. Условием четкого проведения теста было добавление в среду 0,45 г/л ортофосфата калия, независимо от используемой питательной основы (Еременко Е. И. с соавт, 1984). Ранее показано (Lantos J. et Ivanovics G., 1965), что синтез щелочной фосфатазы у сибиреязвенного микроба носит индуцибельный характер и репрессируется при наличии в среде определенныхколичеств неорганического фосфата, тогда как у близкородственных бацилл фосфатаза продуцируется конститутивно, независимо от содержания фосфатов.

Недавно установлено, что у сибиреязвенного микроба имеются все те же гены, отвечающие за синтез гемолизинов, щелочной фосфатазы, пенициллиназы и ряда других ферментов, что и у В. cereus и В. thuringiensis. Многие из них координировано регулируются плейотропным регулятором plcR., который у В. anthracis имеет мутацию, приводящую к отсутствию экспрессии этих генов (Mignot Т. et al., 2001). Отбор этой мутации, приводящей к инактивации целого регулона, носит эволюционно закрепленный характер, поэтому вероятность встретить штамм сибиреязвенного микроба, дающий положительные результаты этих тестов, очевидно, невелика. Следует, однако, учитывать то обстоятельство, что и среди изолятов В. cereus и В. thuringiensis могут встречаться негемолитические и фосфатазонегативные. Это же соображение относится и к подвижности, которой не было выявлено ни у одного из штаммов сибиреязвенного микроба. Таким образом, перечисленные признаки — отсутствие подвижности, фосфатазной, гемолитической и пенициллиназной активности можно отнести к преимущественно идентификационным, так как штаммов сибиреязвенного микроба, дающих положительные результаты в этих тестах, мы не обнаружили, и различать культуры по ним не представлялось возможным.

Тест на лецитиназу также был отрицательным у большинства культур, однако 5 штаммов были активными, что позволяло отличить их от всех других.

Среди изученных 5 бескапсульных штаммов не вызывало гибели белых мышей при заражении взвесью суточной вегетативной культуры, что вполне соответствовало представлению о необходимости капсулообразования в реализации патогенности для этих животных.

Таким образом, исследование штаммов по классической схеме в совокупности позволяло идентифицировать их как относящиеся к В. anthracis, даже если 1 или 2 признака оказывались не характерными, однако именно эти признаки (капсулообразование и связанная с ним патогенность для белых мышей, а также лецитиназная активность) позволяли дифференцировать штаммы. Из 76 штаммов отличия имели 12 (7 бескапсульных, 4 лецитиназапозитивных и 1 образующий капсулу на воздухе). При этом дискриминирующие возможности этих тестов были разными, так как тест на капсулобразование выявлял три варианта штаммов, а тест на лецитиназу и патогенность для белых мышей — по два, что в совокупности позволяло разделить все штаммы на 5 типов.

Определение устойчивости к антибиотикам у исследуемых штаммов обнаружило характерный для этого вида профиль - все штаммы были чувствительны к антибиотикам пенициллинового, тетрациклинового ряда, аминогликозидам, рифампицину, обнаружить какие-либо различия по этому признаку не удалось. Аналогичным образом, все штаммы были умеренно устойчивы к некоторым цефалоспоринам (цефотаксим и цефтазидим). Перечисленные особенности могут быть дополнительным идентификационным признаком, отличающим сибиреязвенный микроб от близкородственных бацилл, однако он мало что дает для внутривидовой дифференциации. Среди штаммов не было чувствительных к макролидам (эритромицин, олеандомицин). Все штаммы соответственно определенным конкретным значениям МПК разных антибиотиков по отношению к ним можно было разделить на 12 групп, при этом подавляющие рост концентрации антибиотиков не выходили за пределы диапазонов, соответствующих чувствительности или устойчивости.

Отсутствие среди исследованных изолятов устойчивых к наиболее распространенным средствам терапии сибирской язвы — пенициллину, тетрациклину, доксициклину, рифампицину, ципрофлоксацину, как и отсутствие сообщений о выделении штаммов с трансмиссибельными плазмидами антибиотикорезистентности, отражает ту особенность сибирской язвы, что ее возбудитель не передается от человека к человеку, долгое время пребывает во внешней среде и значительно реже подвергается воздействию антибиотиков, чем возбудители антропонозных инфекций. В этом может заключаться отличие сибиреязвенной инфекции от многих других, вызываемых полирезистентными штаммами возбудителей, приобретающими устойчивость под селективным прессом антибиотикотерапии, передающимися внутри человеческого сообщества и становящимися все большей проблемой. Отмеченные за рубежом случаи выделения устойчивых к пенициллину штаммов В. anthracis, вероятно, связаны с большей распространенностью там лечения больных сибирской язвой сельскохозяйственных животных. Существуют также данные о том, что устойчивость к макролидам у сибиреязвенного микроба опосредуется генетическим элементом ermJ, кодирующим метилтрансферазу и делающим микроб нечувствительным к макролидам, линкозамид и стрептограмину В (MLS-устойчивость). Этот элемент сходен с ermK Bacillus licheniformis, что дает основания предполагать распространение егтК- подобных генов среди бацилл посредством транспозиции (Kim H.S. et al., 1993).

Использование в исследовании дополнительных тестов расширило возможности дифференцирования штаммов. Определение гемолитической и протеолитической активности подтвердило их взаимосвязь, что могло быть объяснено решающим вкладом протеолиза в феномен лизирования отмытых эритроцитов барана (Цыганкова О. И., 1993). В основном типичные вирулентные штаммы лизировали отмытые эритроциты барана, что находит подтверждение в работе Perry J. М. et al. (1983), а также деградировали все белковые субстраты. Сочетанное отсутствие гемолиза, протеолиза альбумина и гемолобина отмечено у 14 штаммов из 15 нелизирующих отмытые эритроциты барана, штамм 377/3 также не вызывал гемолиза, но деградировал все белковые субстраты. У 7 штаммов, включая вакцинный штамм СТИ-1, отсутствие гемолитической и протеолитической активностей коррелировало также с неспособностью продуцировать капсулу, а у 5 - с отсутствием токсинообразования in vitro.

Тест на гемолиз мог дифференцировать штаммы сибиреязвенного микроба или служить надежным идентификационным признаком, отличая штаммы В. anthracis от близкородственных бацилл, в зависимости от того, каким образом этот тест проводился - в среде с дефибринированной кровью или с отмытыми эритроцитами барана.

Возбудитель сибирской язвы имеет сложные и не вполне определенные потребности в факторах роста, являясь природным ауксотрофом по ряду аминокислот и тиамину (Найманов П. И. с соавт., 1984; Еременко Е. И., 1986; Микшис Н. И., 1996; Gladstone J. Р., 1939; Brewer С. R. et al, 1946; Thorne С. В., 1993). При этом, в отличие, например, от чумного микроба, не было обнаружено какой-либо взаимосвязи с географическим происхождением. Для удобства в практической работе ранее была сконструирована синтетическая минимальная среда 9АТ, состоящая из девяти аминокислот, тиамина, глюкозы и минеральных солей. Как было установлено, большинство типичных штаммов было способно в течение 24 ч формировать на ней колонии; некоторые атипичные штаммы не могли расти на ней и дополнительно требовали наличия в среде аминокислот ароматической группы; эти же аминокислоты стимулировали рост бескапсульных штаммов, которые в их отсутствие росли медленнее и менее эффективно прорастали. Такое разделение упрощало исследование и позволяло отнести штаммы к одной из трех групп - 1- растущие на этой среде и формирующие колонии через 24 ч; 2-растущие с задержкой через 48 ч и формирующие меньшее число колоний, чем на полноценной среде; 3 - не растущие на среде, не способные через 48 ч формировать колонии и требующие дополнительных или иных факторов роста. Из числа изученных в этой работе 18 штаммов не росло на этой среде и еще пять росло с задержкой через 48 ч, остальные формировали колонии через 24 ч.

Было установлено, что чаще всего не росли на этой среде и имели дополнительные потребности в аминокислотах ароматической группы штаммы с комплексом атипичных признаков: атоксигенные, не продуцирующие гемолизинов и протеаз (Еременко Е. И., 1997). Среди изученных в данной работе было выявлено 6 таких штаммов, остальные же отличались от большинства только неспособностью расти на среде 9АТ.

Традиционный метод определения вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба требует заражения лабораторных животных. Существуют разночтения в критериях и градациях степени этого показателя. Пороговой для отличия вирулентных штаммов от авирулентных при определении LD50 для белых мышей или DCL для морских свинок и кроликов служит величина 10000 спор («Инструкция и методические указания., Москва 1980; «Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней», том 1, Саратов, 1998 г). Методические указания «Лабораторная диагностика сибирской язвы.» (Москва, 1989), предписывают определять степень вирулентности на кроликах, при этом выделяются высоковирулентные штаммы, при заражении которыми кролики гибнут от дозы 10000 спор, умеренно вирулентные (100000 и 1 млн спор), слабовирулентные и авирулентные в этих дозах не вызывают гибели.

Способ определения вирулентности in vitro основан на оценке капсулообразования и токсинообразования при культивировании на среде для сочетанного определения продукции этих двух факторов в обогащенной СОг атмосфере и капсулообразования на агаре Хоттингера в воздушной атмосфере (Еременко Е. И., 1997). При этом выделяются высоковирулентные, умеренно вирулентные, слабовирулентные, авирулентные и апатогенные штаммы. Сравнение вирулентности изученных штаммов методами in vivo на белых беспородных мышах и in vitro на среде СОПЭК дало следующие результаты. Все штаммы, за исключением бескапсульных, оцененные по методу in vivo, имели LD50 до 500 спор и отнесены к вирулентным, бескапсульные штаммы с LD50 выше 10000 спор были авирулентными. Методом in vitro капсуло-токсинообразующие штаммы были отнесены к высоковирулентным, 5 атоксигенных штаммов - к умеренно вирулентным, 1 атоксигенный, образующий капсулу на воздухе - к слабовирулентным и 7 токсигенных бескапсульных штаммов - к авирулентным. Этот метод давал возможность более тонкой, чем при определении in vivo на белых мышах, дифференциации штаммов по важному признаку - вирулентности, не прибегая к заражению кроликов.

Генетическая характеристика штаммов была проведена с использованием методов плазмидного скрининга и ПЦР с праймерами к специфическим плазмидным генам, а также к хромосомному локусу с вариабельным числом тандемных повторов. Наличие плазмид и генов, отвечающих за синтез компонентов токсинов и капсулы, обычно локализующихся на плазмидах, должно коррелировать, однако, по данным P. Fellows (1996), один из штаммов в исследованной ею коллекции не имел плазмид, но в ПЦР выявлялись гены капсуло- и токсинообразования. Этот феномен мог объясняться интеграцией плазмидных генов в хромосому, так как молекулярная основа для такого рода событий в виде наличия IS-элементов, фланкирующих некоторые плазмидные регионы и располагающихся на хромосоме, существует (Okinaka R. et al., 1998, 1999). В представляемой работе все без исключения штаммы имели плазмиду pXOl и гены pag, pag A, lef и суа , кодирующие синтез компонентов токсина, хотя шесть штаммов не продуцировали токсин in vitro. Подобные штаммы описаны (Еременко Е. И., 1997; Fellows Р., 1996), наблюдающееся у них нарушение синтеза токсина может быть обусловлено мутациями в структурных или регуляторных генах.

Плазмида рХ02 и гены сарВ и сарС имелись у всех штаммов, за исключением 7 бескапсульных штаммов. Бескапсульный штамм 940/16 также имел плазмиду рХ02 и ген сарВ и сарС, но не образовывал капсулу in vivo и in vitro. Это также можно было объяснить мутациями в структурных и регуляторных генах капсулы. Следует заметить, что по определению вирулентности in vivo и in vitro этот штамм отнесен к авирулентным, хотя при заражении белых мышей суточной вегетативной культурой в дозе приблизительно 2-5 xlO6 КОЕ одна мышь из четырех пала на третьи сутки и от нее была выделена культура, также не образующая капсулу.

Во всех случаях наличие плазмид и генов капсуло- и токсинообразования у штаммов, выделенных на территории СНГ, совпадало, что давало возможность судить по наличию определяемых методом ПЦР генов (pag, pagAt, lef и суа, располагающихся на плазмиде pXOl и сарВ и сарС - на плазмиде рХ02) о плазмидном составе, не прибегая к технически более сложному методу плазмидного скрининга. При этом можно проводить ПЦР с одной парой праймеров для токсинного гена и одной - для капсульного, поскольку не было обнаружено штаммов, которые не имели бы какого-нибудь одного из генов токсинообразования. Практически удобным оказалось использовать пары праймеров для гена cap С и для гена суа, этот набор праймеров был высоко специфичным и хорошо работал в одной реакционной смеси для мультипраймерной ПЦР.

В последнем по времени издания пособии по лабораторной диагностике сибирской язвы (Саратов, 1998) методу ПЦР отводится роль только индикационного метода. В предлагаемой схеме, при постановке ПЦР из чистой культуры, которая может быть исследована по полной схеме развернутого исследования, ПЦР может играть роль весьма важного идентификационного метода, позволяющего также дифференцировать штаммы. На основании проведенных исследований можно заключить, что по результатам ПЦР с праймерами к генам капсуло- и токсинообразования, поставленной с материалом из колоний, уже через 24 ч можно было дать предварительный ответ о принадлежности исследуемой культуры к В. anthracis, который совпадал с результатами исследования по полной схеме.

Генотипирование штаммов, выделенных на территории СНГ, по признаку вариабельности локуса vrrA, выявило три из описанных пяти VNTR-категорий, составляющих более 83% штаммов из мировой коллекции, изученной P. Jackson et al.(1999). Среди изученных штаммов не было принадлежащих к категории VNTR2, которая охватывала штаммы из Европы, Америки и Южной Африки, а также к категории VNTR$, представленной почти исключительно штаммами из Южной Африки. Распределение штаммов по категориям несколько отличалось от описанного P. Jackson et al. Больше всего (более половины штаммов или 58,8%) относились к категории VNTR4, что почти совпадало с данными этих авторов (59,6%). 29,4% культур составляло категорию VNTR5, тогда как в сравниваемой работе таких штаммов было 5,6%, и 6 штаммов относились к VNTR3 (11,8 % против 17,7% в цитируемой работе.

Связь распределения штаммов по VNTR-категориям с географическим происхождением выразилась в том, что изоляты категории VNTR4 встречались повсеместно, штаммов VNTR5 не было среди выделенных на территории Узбекистана, Туркменистана, Татарстана и Дагестана, а штаммы категории VNTR3 были выделены в Дагестане, Татарстане, Калининской области. Интересно отметить, что в цитируемой работе американских исследователей штаммов VNTR5 не было среди выделенных на Ближнем Востоке (Пакистан, Ливан, Турция). Несомненно, продолжение таких исследований и расширение набора локусов для VNTR-анализа позволит получить более точно дискриминируемые и надежные маркеры для штаммов. Подтверждением возможности использования генотипирования по локусу vrrA в сочетании с филогенетическим анализом в целях эпидемиологического мониторинга послужил выявленный нами факт принадлежности выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы штаммов к одной и той же категории.

Выполненные исследования показали, что используемые тесты позволяют идентифицировать штаммы как сибиреязвенные даже в том случае, когда они имеют атипичные свойства. При этом разные тесты имеют разную значимость для идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов и в зависимости от количества проведенных тестов, внутри вида можно выделить от 5 до 16 типов, из которых 7 представлено уникальными штаммами. Очевидно также, что число типов может увеличиться при дополнении схемы новыми тестами, что делает целесообразным представление результатов исследования в виде предлагаемой формы базы данных.

В существующих до сих пор схемах лабораторного исследования основное внимание уделено идентификации культур, внутривидовое типирование либо не предусмотрено совсем, либо о нем упоминается вскользь. Разработанная схема изучения культур сибиреязвенного микроба может восполнить этот пробел и помочь стандартизации проводимых в разных лабораториях исследований по двум наборам тестов соответственно их оснащению и специализации.

Анализируя полученные результаты, можно сделать общее заключение о том, что большинство изученных штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории СНГ, по своим основным свойствам относится к типичным представителям вида Bacillus anthracis, но имеет ряд фенотипических и генотипических отличий, которые могут быть выявлены с использованием предлагаемых дополнительных методов исследования. Это расширяет возможности лабораторного исследования, позволяя выделять внутри вида несколько типов штаммов с подробной характеристикой каждого из них и применять эти данные для эпидемиологического мониторинга.

Список литературы диссертационного исследования Саркисова, Нана Валиевна, 2005 год

1. Азизбекян P.P., Белых Р.А. Нестабильность некоторых ауксотрофных маркеров Bacillus thuringiensis II Генетика.-1981.-Т.17.№11.-С.1936-1944.

2. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение // АН Армянской ССР, Ереван, 1973.-418 с.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Медиздат, Ленинград, 1962.-180 с.

4. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва (Антракс): новые страницы в изучении "старой" болезни.-Вольгинский, 2000, издательство "Посад", Владимир 2001 283 с.

5. Бугоркова Т. В., Шмеркевич Д.А., Наумшина М.С. Биохимия, патофизиология и микробиология особо опасных инфекций.-Саратов, 1983.-С.7-82.

6. Буравцева Н.П., Кулешова Л.И. Сравнительное изучение чувствительности Bacillus anthracis к различным антибиотикам // Антибиотики, 1972.-Вып. 11 .-С. 1019-1023.

7. Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы // Особо опасные инфекционные заболевания: Эпидмиология, экспресс-диагностика и профилактика: Докл.

8. Международного Симпозиума, Киров, 16-20 июня 1997 г.Киров, 1997.-С.73-81.

9. Ю.Буравцева Н.П. Специфическая и экстренная профилактика сибирской язвы // Дисс. док. мед. наук, Ставрополь, 1991.- 389с.

10. Буравцева Н.П. Роль пеницилиназы в механизме устойчивости сибиреязвенного микроба к бензилпеницилину // Антибиотики.-1971.-N2.-С.-168-173.

11. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция.-Москва, 1984, Медицина, 208 с.

12. Гребенкина М.В., Афанасьев Е.Н., Проскурина В.А., Ефременко В.И. Изучение терапевтической эффективности липосомальных форм антибиотиков при сибирской язве // Деп. В ВИНИТИ №2338 -В- 1997, 10.07.97.-9c.

13. Галсанова Г.Д., Цыдыпов В.Ц., Угрюмов Г.А., Филипов И.В., Будаев Ю.Ж., Содбоев Ц.Ц. Случай вспышки сибирской язвы в Бурятии // Ветеринария.-1995.-№9.-С.10-11.

14. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий,-Москва, "Наука", 1977.-С.216.

15. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. Москва,1985.-С.240.

16. Еременко Е.И. Потребности сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования // Дис. канд.мед.наук, Ставрополь, 1986.-С.181.

17. Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis. // Дисс. док. мед. наук, Ставрополь.- 1997.

18. Еремин С.А., Костюкова Т.А., Никифоров А.К. Изучение роли хромосомных генов в вирулентности B.anthracis // Матер.науч.-практ.конф., посвященной 100-летию образования противочумной службы России: Тез.докл., Саратов,16-18 сент., 1997.С.Д997.-Т.2.-С.45.

19. Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей.- Москва, 1980.

20. Инструкция по определению чувствительности возбудителей опасных инфекционных заболеваний к антибиотикам и химиопрепаратам.-Москва,1990.

21. Ипатенко Н.Г., Мелихов А.Д. Изучение измененных штаммов Bac.anthracis.- Ветеринария.-1986.- №7.- С.69-71.

22. Ипатенко Н.Г., Седов В.А., Зелепукин B.C., Гущин В.Н. Сибирская язва сельскохозяйственных животных.-Москва, Агропромиздат, 1987.-С.256.

23. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций : чумы, бруцеллеза и сибирской язвы // Автореф. дисс. док. мед. наук.-Саратов,1995.-С.38.

24. Коротич А.С., Погребняк Л.И. Сибирская язва.-Киев: Урожай, 1976.-С.160.

25. Лысогора Е.В., Биологические свойства штаммов Bacillus anthracis выделенных в очагах сибирской язвы Ставропольского края: Дисс.канд.мед.наук.-Ставрополь, 2001,- 237 с.

26. Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды (методические указания) // Москва ВО «Агропромиздат», 1989,-ЗОс.

27. Маничев А.А. Получение капсульной фракции возбудителя сибирской язвы //Ветеринария, 1978.-N5.-C.46-47.

28. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В., Старицин Н.А., Померанцев А.П., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. Микробиологическая диагностика сибирской язвы.-Москва.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.-224 с.

29. Микшис Н.И. Разработка экспериментальных подходов к генетическому анализу хромосомы возбудителя сибирской язвы: Дисс.канд.мед.наук.-Саратов, 1996.-С.117.

30. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия (справочник) // Москва, 1982.- 495с.

31. Найманов П.И., Голубинский Е.П., Соркин Ю.И. О питательных потребностях штаммов B.anthracis и особенностях роста штамма СТИ-1 в условиях периодического культивирования на жидких синтетических средах//ЖМЭИ.- 1984.-№6.-С.55-59.

32. Найманов П.И., Родзиковский А.В., Соркин Ю.И. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций.-Волгоград.-1992.-С. 164-165.

33. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: Актуальные аспектымикробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики.- М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.- 448 с.

34. Пархоменко А.А., Степанов А.С. ЬСлональный анализ культур сибиреязвенного микроба на способность продукции экзопротеаз и гемолизинов // Метод.пособие по генетике возбудителя сибирской язвы.-Саратов,1991.-С.28-30.

35. Петрова Л.С., Ларина B.C. Ускоренный метод обнаружения и идентификации бацилл сибирской язвы в почве // Особо опасные и природно очаговые инфекции.-Москва.-1962.-С.245-249.

36. Петрова Ю.М., Лебединская И.С., Харикова А.А., Ксенофонтова B.C. О выделении редких сапрофитов, близких сибиреязвенному возбудителю // ЖМЭИ.-1981 .-N6.-C. 106-107.

37. Петрюк В.А. Совершенствование противоэпидемических и профилактических мероприятий при сибирской язве в Карачаево-Черкесской республике // Авт.дис.канд. мед.наук.-Саратов, 1999.-23с.

38. Проскурина В.А., Буравцева Н.П. Сравнительная оценка некоторых методов определения чувствительности сибиреязвенного микроба к антибиотикам.- Антибиотики и мед. биотех.-1985.-Т.ЗО, №11.-С.845-847.

39. Старицин Н.А., Степанов А.В. О молекулярноой природе токсина сибиреязвенного микроба // Молек. генет. микробиол. вирусология,-1996.-№1.-С.З-10.

40. Стейниер Р. Мир микробов : в 3 т / Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж.-Пер. с англ.- М.: Мир, 1979.- Т.З 486 с.

41. Степанов А.С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы // Дисс.док.мед.наук.-Саратов, 1992.-С.230.

42. Тимошин В.Б. Конструирование видоспецифического ДНК-зонда для индикации возбудителя сибирской язвы: Автореф.дис.кан.мед.наук.-Саратов, 1994.-22 с.

43. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Липнпцкий А.В. Конструирование рекомбинантного фага fZAT6- продуцента одноцепочечного ДНК-зонда идентификации штаммов Bacillus anthracis, несущих плазмиду pXOl. //Биотехнология.-1995, N5-6.-C.6-10.

44. Тучков И.В., Куличенко А.Н., Норкина О.В.// В кн.: Генетика, микробиология и совершенствование методов лаб.диагностики особо опасных инфекций.-Саратов.-1991 .-С.89-91.

45. Урусбамбетов З.Х., Буравцева Н.П., Вайсман И.В., Тлупов Р.А., Казаков A.M. Эпидемиология и эпизоотология сибирской язвы в Кабардино-Балкарской республике // Деп. В ВИНИТИ 19.07.00.-№ 201—В00.

46. Цыганкова О.И., Буравцева Н.П. Определение гемолитической активности у сибиреязвенного микроба: Методические рекомендации.-Москва, 1989.С.З-6.

47. Цыганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба//Дисс.кан.мед.наук, Ставрополь, 1993.-С.176.

48. Цыганкова О.И., Буравцева Н.П. Влияние компонентов питательной среды на протеолитическую активность сибиреязвенного микроба. // Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии: Тез.конф. Махачкала, 1992.-С.48-50.

49. Цыганкова О.И., Брюханов А.Ф., Еременко Е.И., Абгарян А.Г., Ефременко В.И., Рязанова А.Г., Платонов М.Е., Шишкова Н.А.,

50. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы.-М .:"ИНТРЕСЭН", 2002, с.384.

51. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson К.Н. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species //J.Bacteriol.-1996.-Vol.l78.-P.377-384.

52. Battisti L., Green B.D. and Thorne C.B. Mating system for transfer plasmids among B.anthracis, B.cereus and B.thuringiensis //J. Bacterid.-1985.-Vol.162.-N2.-P.275-293.

53. Workshop on the Molecular Biology of Bacillus cereus, B.anthracis and B.thuringiensis .-Taos, New Mexico, USA.-August 11-13Д999.-Р. 1.

54. Beall F.A., Taylor M.J., Thorne C.B. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionation of the toxin of Bacillus anthracis .-J. Bacterid.- 1962.-Vol.83.N.6.-P.1274-1280.

55. Bernhard K., Schrempf H., Goebel W. Bacteriocin and antibiotic resistance plasmids in Bacillus cereus and Bacillus subtilis // J. Bacteriol.-1978.-Vol. 169.-P.897-903.

56. Bohm R., Beyer W. PCR-Elisa for detection of B.anthracis in environmental samples // 3rd International Conference on Anthrax, 7- 10th September 1998. Plymouth, England.-1998.-P. 179-186.

57. Boshwitz H., Milner J., Keynan A. et al. Effect of inhibitors of trypsin-like proteolytic enzymes on Bacillus cereus T spore germination // J.Bacteriol.-1983.-Vol. 153.-N2.-P .700-708.

58. Bovernick M. The formation of extracellular D-glutamic acid polypeptide by Bacillus subtillis // J.Biol.Chem.-l942.-Vol. 145.-P.415-424.

59. Bowen J.E., Quinn C.P. The native virulence plasmids affect the segregational stability of a theta-replicating shuttle vector in Bacillus anthracis II 3rd International Conference on Anthrax, 7-10th September 1998. Plymouth, England.-1998.-P. 19.

60. Bradaric N., Punda-Polic V. Cutaneous anthrax due to penicillin-resistant Bacillus anthracis transmitted by insect bite // Lancet.-1992.- Vol. 342.-P.306-307.

61. Brewer C.R., McCullough, Mills R.C., Roessler W.G., Herbst E.J., Howe A.F. Studies on the Nutritional Requirements of Bacillus anthracis // Arch.Biochem.-1946.-Vol. 10.-№. 1 .-P.55-75.

62. Brown W.C., Vellom D., Ho I., Mitchell N., and McVay P. Interaction between a Bacillus cereus spore hexosaminidase and specific germinants // J.Bacteriol. -1982. -Vol.149.- N3.-P.969-976.

63. Charlton A., Moir A., Redmond C., Bailie L. Exosporium characterization // 3rd international Conference on Anthrax, 7-10th September 1998. Plymouth, England.-1998.-P. 13.

64. Chu H.P. Variation of Bacillus anthracis with special reference to the noncapsulated avirulent variant // J. Hyg., Camb.- 1952.- V.50.- P.433-443.

65. Coker P.R., Smith K.L., Hugh-Jones M.E. Antimicrobial Susceptibilities of Diverse Bacillus anthracis Isolates// Antimicrob. Agents Chemother.-2002 .-V.46.-№12.-P.3843-3845

66. Doganay M., Aydin N. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis//Scand. J. Infect.Dis.- 1991.- Vol. 23.- P. 333-335.

67. Eremenko E.I., Buravtseva N.P., Tsygankova O.I., Abgaryan A.G. Study of atypical strains of Bacillus anthracis II 3-rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September, 1998.-P.46.

68. Ezzell J.W., Abshire Т., Ibrahim S., Teska J., Coyne S., Knauert F., Allen C., Nash D. Identification of Bacillus Anthracis: an overview // 3rd International Conference on Anthrax, 7-10th September 1998. Plymouth, England.-1998.-P.47.

69. Fasanella A., Smith K.L., Keys C., Coker P., Keim P.,Hugh-Jones M. // 4th International Conference on Anthrax: Program and Abstracts Book June 10 -13,2001, St. John's College Annapolis, Maryland, USA- P.14.

70. Fellows P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis. II Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1995, Salisbury Medical Bulletin. P.C.B.Turnbull 1996 -N87.-Spec. Suppl.-P.33.

71. Felsenstein, J. 2002. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version З.баЗ. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle.

72. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through an acid dependent process // J.Biol.Chem.-1986.-Vol.261N.16.-P.7123-7126.

73. Friedlander A.M. Clinical aspects, diagnosis, and treatment of anthrax. // 3rd International Conference on Anthrax, 7-10th September 1998. Plymouth, England.-1998.-P.31.

74. Gardner J.M.,and Troy F.A. Chemistry and biochemistry of the poly (D-glutamyl) capsule in Bacillus licheniformis. // J.Biol.Chem.-1979.-Vol.254.-P.4687-4690.

75. Gladstone J.P. Interrelationships between amino acids in the nutrition of Bacillus anthracis. //Br. J.Exp. Pathol.-1939.-Vol.20.-P.189-200.

76. Gluex-Holzer S., Tomsik J. The isolation and chemical nature of capsular and cell-wall haptens in Bacillus species // J. Gen. Microbiol.-1956.-Vol.14.-P. 14-25.

77. Gordon V.M., Leppla S.H. Proteolytic activation of bacterial toxins: role of bacterial and host cell proteases // Infect. Immun. -1994.-Vol.62,N2.-P.91-95)

78. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M., Thorne C.B., Ivins B.E. Demonstration of a Capsule Plasmid in Bacillus anthracis // Infect. Immun.-1985.-Vol.49.-P.291 -297.

79. Guaracao-Ayala A.I., and Thorne C.B. Transposon mutagenesis of Bacillus anthracis and related species // J. Clin. Microbiol.-1995.-Vol.33.-P. 1847-1850.

80. Hammond S.E., Hanna P.C. Lethal factor active-site mutations affect catalytic activity in vitro //Infect. Immun.-1998.-Vol.66, N5.-P.2374-2378.

81. Hanby W.E., Ryden H.N. The capsule substance of Bacillus anthracis H Biochem. J., 1946.-Vol.4.-P.297-309.

82. Hanna P.C. Lethal toxin activities and their consequences. // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P .22.

83. Hanna P.C.and John Ireland . The immediate-early stage of anthrax. // The 2nd International Workshop on the molecular biology of Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis, August 11-13, Taos, New Mexico, USA.-1999.P.25.

84. Harrell L.J., Andersen G.L., Wilson K.H. Genetic Variability of B.anthracis and Related Species // J. Clin. Microbiol.-1995.-Vol.-33.-No.7.-1847-1850.

85. Henderson I. Fingerprinting Bacillus anthracis strains // Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1995, Salisbury Medical Bulletin .-1990.-P.55-59.

86. Henderson I., Duggleby C.J., and Turnbull P.C.B., Differentiation of B. Anthracis from other B.cereus group bacteria with PCR // Int. J. Syst. Bacteriol.1994.-Vol.44.-P.99-105.

87. Hugh-Jones M. 1996 Global anthrax report // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P. 1.

88. Hutson R.A. and Duggleby C. DNA probes for anthrax detection. // Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21,1995, Salisbury Medical Bulletin.-1990.-P.27-29.

89. Ivanovics G. The isolation and study of auxotrophic mutatnts of Bacillus anthracis with respect to virulence of this pathogen// Ann. Microbiol., Enzimol.-1964.-Vol. 14, № 1/3.-P.59-68.

90. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis II Infect. Immun.-1986.-Vol.54.-No.2.-P.537-542.

91. Ivins B.E., Welkos S.L., Knudson G.B., Leblanc D.J. Transposon Tn-916 mutagenesis in B.anthracis II Infect. Immun.-1988.-Vol.56.-P.176-181.

92. Ivins B.E., Welkos S.L., Little S.F., Nelson G.O. Immunization against anthrax with Bacillus anthracis protective antigen combined with adjuvants // Infect. Immun.-1992.-Vol.60.-No.2.-P.662-668.

93. Jackson P.J., Hill K.K., Laker M.T., Ticknor L.O., Keim P. Genetic comparison B.anthracis and its close relatives using AFLP and PCR analysis. II 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P 20.

94. Kaneko Т., Mozaki R., Aizawa K. Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis, II Microbiol. Immunol.-1978.-Vol.-22.-P.639-641.

95. Kearney J.F., Shu F. Bacillus spore-specific antibodies \\3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998, England. -P 53.

96. Keim P., Hugh-Jones M., Klevytska A.M., Smith K.L., Okinaka R., Adair D.M., Jackson P. Molecular Diversity in B.anthracis // 3rd International Conference on Anthrax University of Plymouth 7-10th September 1998.-P 8.

97. Keim P., Klevytska A., Price L.B., Schupp J.M., Zinser G., Okinaka R., Hill K.K., Jackson P., Smith K.L., and Hugh-Jones M.E. Molecular diversity in Bacillus anthracis И J.App.Microbiol.-1999.-Vol.87.-P.215-217.

98. Kim H.S., Choi E.C. and Kim B.K. A macrolide-lincosamide-streptogramin В resistance determinant from Bacillus anthracis'. cloning and expression of ermJII J. Gen. Microbiol.-1993.-Vol.l39.-P.601-607.

99. Klimpel K.R., Arora N., Leppla S.H. Anthrax toxin lethal factor contains a zinc metalloprotease consensus sequence which is required for lethal toxin activity. // Mol. Microbiol. -1994.P. 1093-1100.

100. Klimpel K.R., Arora N., Leppla S.H. Anthrax toxin letal factor has homology to the thermolysin-like proteases and displays proteolytic activity // Abstr. 93rd Gen. Meet. Am. Soc. Microbiol.-1993.-B.-l 11.-P.45.

101. Lantos J., Ivanovics G. // Acta microbial. Acad. sci. hung.- 1965.-Vol.ll-P.351-355.

102. Lefebre C.M. and Antippa A.F. The kinetics of germination in Bacillus spores // J. Theor. Biol.-1982.-Vol.95-P.489-515.

103. Leppla S.H. // Advanc. Cycl. Nucl. Prot. Phosphoryl.-1984.Vol. 17.-P.189-198.

104. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenilate cyclate that increases cyclic AMP concentrations in eucaryotic cells // Proc. Acad. Sci. Us.-1982.-V01.79.-P.3162-3166.

105. Leppla S.H. The anthrax toxin complex // In Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Alouf J.E., Freer J., (eds.), Academic Press Limited, Newk, NY.-1991.-P.277-302.

106. Leppla S.H., Park S. Anthrax toxin lethal factor: High- level expression and structure-function analysis // Abstract Book 3rd International Conference on Anthrax University of Plymouth 7-10th September 1998.-P 47.

107. Liddington R., Pannifer A., Hanna P., Leppla S., Collier R.J. Crystallographic Studies of the Anthrax lethal toxin // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P.23.

108. Lightfoot N.F., Scott R.J.D., Turnbull P.C.B. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis // Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1995, Salisbury Medical Bulletin. Special Supplement No.68, 1990.- P.95-96.

109. Long G.W., and O'Brien T. Antibody based systems for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples // Abstract Book 3rd International Conference on Anthrax University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P 7.

110. Makino S-J., Iinuma-Okada Y., Maruyama Т., Ezaki Т., Sasakawa C., Yoshikawa M. Direct detection of Bacillus anthracis DNA in Animals by Polimerase Chain Reaction. // J. Clin. Microbiol.-1993.-Vol.3 l.No.3.-P.547-551.

111. Makino S-J., Sasakawa C., Uchida N., Terakado N., Yoshikawa M. Molecular characterization and protein analysis of cap region wich is essentialfor encapsulation in Bacillus anthracis. II J. Bacterid.-1989.-Vol. 171.-P.722-730.

112. McBride B. W. et al. // Vaccine .-1998.-Vol.l6.-P.810-817.

113. McCormick N.C. Kinetics of spore germination // J.Bacteriol.-1965.-V0I.8O-P. 1340-1348.

114. Meynell E., Meynell G.C. The role of serum and dioxide in capsule formation by Bacillus anthracis. II J. Gen. Microbiol.-1964.-Vol.34.N.l.-P. 153154.

115. Mignot Т., Fouet A., Robichon D., Landier A., Mock M. An

116. Evolutionarily Selected Nonsense Mutation in plcR Led to the Inactivation of ath

117. Complete Regulon in Bacillus anthracis II 4 International Conference on Anthrax.- Programm and Abstracts Book, June 10 13, 2001,St. John's College,Annapolis, Maryland, USA.-P.33

118. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for Plasmid- mediated Toxin Production in Bacillus anthracis // Infect. Immun.-1983.-Vol.39.-P.371-376.

119. Murell W.G. Spore formation and germination as a microbial reaction to the environment // Symp.Soc.Gen.Microbiol.-1961.-Vol.11.-P. 100-150.

120. Nungester W.J. Dissociation of Bacillus anthracis // Proceeding of the Society for experimental biology and medicine.-1927.-V.24, №9.-P.959-962.

121. Pannifer A.D.B., Petosa C.P., Hammond S., Hanna P.C., Leppla S., Liddington R.C. Towards the crystal structure of lethal factor. // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P.65.

122. Park Y-M., Seong W-K., Oh H.-B. Monoclonal antibody against spore surface antigen of B.anthracis // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P.66.

123. Patra G., Sylvestre P., Rammise V., Therasse J., Guesdon J-L. Specific oligonucleotid primers for rapid identification of B.anthracis strains // Salisbury Medical Bulletin : Proceedings of the International Workshop on Anthrax,

124. Winchester, England, September 19-21, 1995, Special Supplement.-1996.-N87.-P.45-47

125. Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C., and Mock M. Molecular Characterization of Bacillus Strains Involved in Outbreaks of Anthrax in France in 1997 // J. Clin. Microbiol., 1998, Vol. 36.- No. 11.- P. 3412-3414.

126. Patra G., Vaissaire J., Mock M., Ramisse V. PCR based characterization of Bacillus anthracis as mean for ecological studies // 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P10.

127. Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet C., Mock M. Molecular Characterization of Bacillus Strains Involved in Outbreaks of Anthrax in France in 1997// J. Clin. Microbiol., 1998.- Vol. 36.- № 1 l.-p. 34123414.

128. Parry J.M., Turnbull P.C.B., Gibson J.R. In: Wolf Medical Publication Ltd, A Colour Atlas of Bacillus Species.-1983.-P.59-68.

129. Preisz H. Zbl.Bakt., 1908 (1 Abt. Orig.)-47.-585.

130. Price L.B., Hugh-Jones M., Jackson P.J., Keim P. Genetic diversity in the Protective Antigen gene of Bacillus anthracis // J. Bacterid., 1999 V0I.I8I.N0.8. P.2358-2362.

131. Quinn C.P., and Dancer B.N. Transformation of vegetative cells of Bacillus anthracis with plasmid DNA // J. Gen. Microbiol.-1990.-Vol. 136.-P.1211-1215.

132. Reddy A., Battisti L., Thorne C.B. Identification of self-transmissible plasmids in four Bacillus truringiensis subspecies // J. Bacterid.-1987.-Vol.l69.-P.5263-5270.

133. Robbillard N., Koehler T.M., Murray R., Thorne C.B. Effect of plasmid loss on the physiology of Bacillus anthracis // Abstr. 83rd Ann.Meet. Am.Soc.Microbiol.-1983.-abstr.H.-54.

134. Shin S., Kim Y.B., Hur G.H. Involvement of phospholipase A 2 activation in anthrax lethal toxin-induced cytotoxicity // Cell.Biol.Toxicol.-1999.-Vol. 15 .N. 1 .-P. 19-29.

135. Shulin D. A recommendation of the typing of Bacillus anthracis. // Book 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P 94-95.

136. Smith H., Keppier J. Observation on experimental anthrax: demonstration lethal factor produced in vivo by Bacillus anthracis // Nature .-1954.-Vol. 173 .-P.689-690.

137. Smith H., Stoner H.B. Anthrax toxin complex // Fed.Proc.-1967.-Vol.26.-P. 1554-1557.

138. Stanley J.L., Sargent K., Smith H. Purification of anthrax toxin factors I and II of the anthrax toxin produced in Vitro // J. Gen. Microbiol.-1960.-Vol.22.-P.206-218.

139. Sterne M. Variation in Bacillus anthracis II Onderstepoort J. Vet. Sci.-1937.- Animal Ind. 8.- P.271.

140. Tenover F.C. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases // Clinical Microbiology Reviews .-1988.-N9.-P.49-67.

141. Thorne C.B., Gomez C.G., Housewright R.D. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis II.The effect of carbon dioxide on peptide production in solid media // J. Bacterid.- 1952.-Vol.63.-P.363-368.

142. Thorne C.B. Capsule formation and glutamyl polypeptide synthesis by Bacillus anthracis and Bacillus subtilis // Bacterial Anatomy Symp. Soc. Gen. Microbiol.-1956.-Vol.6.P.68.

143. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis // Ann.N.Y.Acad.Sci.-1960.-Vol.88.-N6.-P.1024-1033.

144. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis. In: Leive L., Bonventre P.F., Morello J.A. and Wu H.C. (ed.).- Microbiology.-1985, American Society for Microbiology, Washington D.C.

145. Thorne C.B. Genetic and physiological studies of Bacillus anthracis related to development of an improved vaccine // Annu.Progr.Rep.Mass.-1989.-P.l-58.

146. Thorne C.B. 8. Bacillus anthracis. In: Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics/ Editors: Sonnenshein A.L., Hoch J.A., and Losick R.// ASM, Washington, D.C.- 1993.- P.l 13-124.

147. Torii M. Optical isomers of glutamic acid comprising bacterial glutamyl polypeptides // Med. J. Osaka Univ.-1956.-Vol.6.-P. 1043-1046.

148. Troy F.A. Chemistry and biosynthesis of the poly-D-glutamyl capsule in Bacillus licheniformis. // J. Biol. Chemist.-1973.-Vol.248.-P.316-324.

149. Turnbull P.C.B. Anthrax vaccine: past, present and future. // Vaccine.-1991.-Vol.9.-P.533-539.

150. Turnbull P.C.B., Hutson R.A., Mandy J. Ward, Jones M.N., Quinn C.P., Finnie N.J., Duggleby C.J., Kramer J.M., Melling J. Bacillus anthracis but not always anthrax // J. Appl. Bacteriol.-1992.-Vol.72.-P.21-28.

151. Turnbull P.C.B .Bacillus anthracis. //Biochemistry, Physiology, and Molecular Genestics.-1993.-P. 113-124.

152. Turnbull P.C.B. Definitive identification of Bacillus anthracis. I I 3rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998.-P.12.

153. Turner A.J., Galvin J.W., Miller G.T. and Rubira R.I. Anthrax explodes in an Australian summer // 3 rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September .-1998.-P.3

154. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 Mda and 60 Mda plasmids // J.Gen.Microbiol.-1986.-Vol.l32.-P.557-559.

155. Uchida I., Hornung J.M., Thorne C.B., Klimpel K.R., Leppla S.H. Cloning and characterization of gene whose product is a /raws-activator of anthrax toxin synthesis.// J. Bacteriol.-1993.-Vol.l75.No.l7.-P.5329-5338.

156. Uchida I., Makino S., Terakado N. Cross-talk to the genes for Bacillus anthracis by atxA, gene encoding the trans-activator of anthrax toxin synthesis. // Molec. Microbiol. 1997.-Vol.23 .-N0.6.-P. 1229-1240.

157. Uchida I., Sekizaki Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol.-1985.-Vol. 131.-P.363-367.

158. Uchida,I., Hornung,J.M., Thorne,C.B., Klimpel,K.R. and Leppla,S.H. Cloning and characterization of a gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis J. Bacterid.- 1993.- V. 175.- No.17- P.5329-5338.

159. Vary J.C., Halvorson H.O. Kinetics of germination of Bacillus spores // J. Bacterid.-1965.-Vol.80.-N.5.-P. 1340-1348.

160. Watson J., Manchee R. J. Spore coat proteins of Bacillus anthracis II Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, April 11-13, 1989. Salisbury Medical Bulletin.- 1990.-N68.-P. 102

161. Welkos S.L, Lowe J.R., Eden-McCutchan F., Vodkin M., Leppla S.H., Schmidt J.J. Sequence and analysis of the DNA encoding antigen of Bacillus anthracis 11 Gene.-1988.-Vol.69.-P.287-300.

162. Welkos S.L. Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (pXOl") Bacillus anthracis И Microbiol.Pathogenesis.-1991.-Vol. 10.-P. 183-198.

163. Witzmann C., Bohm R. Specificity of monoclonal antibodies against vegetative cells of Bacillus anthracis // Proc.Inter.Workshop on anthrax. Winchester, England, April 11-19, 1989.-1992- Spec.Suppl.-Vol.68.-P.25-27.

164. Yelton D.B. and Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus by each of two bacteriophages // J. Bacteriol.-1970.-Vol.l02.N.2.-P.573-579.

165. Zinser G., Schupp J.M. and Keim P. Identification of novel VNTR loci in Bacillus anthracis II The 2nd International Workshop on the molecular biology of B.anthracis, B.cereus, B.thuringiensis, August 11-13, Taos, New Mexico, USA.-1999.-P.61.