Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Цыганкова, Елена Анатольевна

• Цыганкова, Елена Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Цыганкова, Елена Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Геном В.аШкгаЫя и современные методы его изучения.

1.1. Характеристика генома сибиреязвенного микроба.

1.2. Методы генетического типирования В. аШкгаЫя и молекулярное разнообразие штаммов.

1.3. Теоретические и практические аспекты генетического типирования возбудителя сибирской язвы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы.

2.1.2. Реактивы и питательные среды.

2.1.3. Лабораторное оборудование.

2.1.4. Программное обеспечение.

2.2. Методы.

2.2.1. Фенотипические свойства штаммов.

2.2.2. Приготовление проб ДНК.

2.2.3. Метод отбора колониально-морфологических вариантов штаммов

В. аЫкгаш.

2.2.4.Метод анализа нуклеотидной последовательности гена ПА.

2.2.5. Метод рестрикционного анализа.

2.2.6. Метод выявления областей генома с тандемными повторами.

2.2.7. Метод многолокусного анализа областей генома

2.2.8. Методы статистической обработки материала.

ГЛАВА 3. ОБНАРУЖЕНИЕ И АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА С ТАНДЕМНЫМИ И ЕДИНИЧНЫМИ НУКЛЕОТИДНЫМИ ПОВТОРАМИ.

3.1. Поиск областей с тандемными повторами в геноме В.аЫкгаш.

3.2 Идентификация и анализ новых УШИ-локусов в геноме В.апШгаЫБ.

3.3. Поиск и анализ областей генома В. агйЬгасгъ с единичными нуклеотидными повторами.

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИКАЦИОННО-РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА В. АШНЯАСШ.

4.1 Анализ т яШсо полиморфизма единичных нуклеотидных повторов в гене ПА сибиреязвеннного микроба.

4.2 Подбор эндонуклеаз с сайтами рестрикции в пределах гена ПА и условий ПЦР с праймерами к области этого гена сибиреязвенного микроба.

4.3 Оптимизация набора эндонуклеаз и условий рестрикции для РСЯ-ИТЕР-анализа гена ПА и анализ полученных результатов.

4.4. Распределение РСЯ-КБЬР- типов гена ПА по источнику выделения и географическим регионам.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА МЕТОДИЧЕСКОГО ПОДХОДА К ГЕНО

ТИПИРОВАНИЮ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА, ОСНОВАННОГО

НА СОЧЕТАННОМ ПРИМЕНЕНИИ MLVA, SNR, PCR-RFLP АНАЛИЗА ГЕНА ПА И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ МЕТОДОВ.

5.1. Генотипирование штаммов В. anthracis с использованием MLVA.

5.2. Использование MLVA в сочетании с PCR-RFLP-анализом гена ПА.

5.3. Использование SNR-локусов для выявления дополнительного генетического разнообразия.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба»

Актуальность проблемы

Сибирская язва в настоящее время продолжает оставаться проблемой для здравоохранения и ветеринарии. Даже в высокоразвитых странах имеют место разлитые эпизоотии этой инфекции. Примером может служить небывалая по масштабам эпизоотия сибирской язвы среди сельскохозяйственных и диких травоядных животных на сопредельных территориях США и Канады летом и осенью 2006 г. (Nishi J. S. et al., 2007). Вспышки заболеваемости людей, связаны с эпизоотиями и носят спорадический характер. Тем не менее, они всегда сопряжены с проведением большого объема диагностических, терапевтических, противоэпидемических, профилактических мероприятий. Запоздалая и ошибочная диагностика сибирской язвы у людей нередко влечет за собой неадекватную терапию, чреватую летальными исходами, особенно при осложненной кожной, кишечной и висцеральной формах заболевания.

Проблема сибирской язвы вряд ли будет окончательно решена в связи с существованием стационарно-неблагополучных пунктов, сопряженных с почвенными очагами инфекции, сохраняющимися неопределенно долго. Только на территории России таких пунктов зарегистрировано более 35 ООО (Черкасский Б.Д., 1969; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999; Черкасский Б.Д., 2003). Чрезвычайная устойчивость спор Bacillus anthracis, выживающих во внешней среде десятилетиями без утраты вирулентности, обеспечивает потенциал новых эпизоотий, возможность распространения возбудителя за пределы эпизоотического очага с инфицированными продуктами животноводства и заболевания людей. Возросшая в современных условиях мобильность населения и расширяющиеся торгово-экономические связи определяют повышенный риск завоза возбудителя из неблагополучных областей с импортируемыми продуктами.

В последние годы заявил о себе новый аспект проблемы - использование возбудителя сибирской язвы в качестве средства биологического терроризма (Черкасский Б.Л., 2004; Frischknecht F. et al., 2003). Вдыхание спор сибиреязвенного микроба в таких случаях, как и при военном применении, ведет к развитию у жертв ингаляционной формы инфекции, отличающейся тяжелым течением и частыми летальными исходами.

Весьма важным вопросом, который в числе прочих необходимо решать всякий раз при возникновении вспышек сибирской язвы, как природного характера, так и вызванных преднамеренным использованием спор В. anthracis в качестве поражающего агента, является вопрос о происхождении и путях распространения возбудителя. Неоценимым для его практического решения становится подход, основанный на генетическом типировании возбудителя. В частности, при расследовании вспышки сибирской язвы вследствие террористического акта в США в 2001 г., были использованы разработанные там же методы многолокусного анализа областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA) (Keim P. et al., 2000) и секве-нирования гена протективного антигена (ПА) (Price L. et al., 1999; Hoffmaster A. et al., 2002). Эти методы позволили проследить связь случаев инфекции между собой и местом заражения, а также отличить культуры, не относящиеся к этой вспышке. Однако выявить генетическую вариабельность штаммов, выделенных в ходе одной вспышки, а также у вариантов одного и того же штамма дал возможность только полный сиквенс геномов (Read T. et al., 2002).

Применение ML VA в сочетании с филогенетическим анализом дало возможность обнаружить закономерное географическое распределение генотипов штаммов сибиреязвенного микроба и различия в степени генетического родства между ними (Еременко Е.И. с соавт., 2000; Keim P. et al., 2000; Fasanella A. et al., 2001; Le Flech P. et al., 2001; Wang B. et al., 2001, Maho A. et al., 2006). Необходимо отметить, что ML VA в оригинальном варианте и тем более секвенационное типирование требует дорогостоящего оборудования и реактивов, которыми в настоящее время в Российской Федерации располагает очень ограниченный круг ведущих научно-исследовательских учреждений. У нас в стране предложена более доступная модификация ML VA, с использованием которой оценена генетическая вариабельность штаммов B.anthracis, выделенных в СНГ (Еременко Е.И. с соавт., 2000, Цыганкова О.И. с соавт., 2003). Однако до настоящего времени не разработаны практически применимые методические подходы и методы, позволяющие исследовать как географические и филогенетические связи изолятов сибиреязвенного микроба, так и дифференцировать штаммы, выделенные в ходе отдельных вспышек сибирской язвы и внутри каждой из таких вспышек. Отсутствует? метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных \ фрагментов (PCR-RFLP-анализ) гена протективного антигена (ПА) сибире- ( язвенного микроба, который мог бы стать доступной альтернативой секвена-ционному типированию этого гена. Весьма информативным может быть i также анализ вариабельности единичных нуклеотидных повторов (SNR), ко- ^ торому посвящены лишь отдельные работы (van Belkum A. et al., 1998; Keim P. et al., 2004; Diamant E. et al., 2004; Read T. et al., 2002; Muscillo M. et al., ( 2005; Stratilo Ch. et al., 2006).

Таким образом, исследования, направленные на поиск практически приемлемого методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, представляются актуальными.

Цель исследования - разработка методического подхода к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанного на сочетании ML VA, SNR- и PCR- RFLP - анализа. Задачи исследования:

1. Провести поиск потенциально вариабельных тандемных и единичных нуклеотидных повторов в геноме B.anthracis. Сконструировать прай-меры к обнаруженным областям с тандемными и единичными нуклео-тидными повторами и оптимизировать параметры амплификации с ними в ПЦР для VNTR- и SNR-анализа.

2. Изучить вариабельность выявленных областей генома различных штаммов возбудителя сибирской язвы.

3. Подобрать эндонуклеазы, имеющие сайты узнавания и рестрикции в пределах гена протективного антигена сибиреязвенного микроба. Подобрать праймеры для амплификации областей гена протективного антигена и последующего рестрикционного анализа.

4. Разработать метод анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP- анализа) гена протективного антигена сибиреязвенного микроба.

5. Изучить вариабельность последовательностей гена ПА у штаммов сибиреязвенного микроба и морфологических колониальных вариантов их популяций разработанным методом.

6. Разработать методический подход к генотипированию B.anthracis, основанный на сочетанном применении MLVA, SNR- и PCR- RFLP- анализа гена ПА.

7. Оценить возможности применения использованных методов генетического типирования для эпидемиологического анализа штаммов возбудителя сибирской язвы разного географического происхождения, а также выделенных в ходе отдельных вспышек сибиреязвенной инфекции.

Научная новизна. Для генетического типирования сибиреязвенного микроба сконструированы оригинальные праймеры: PX3f/PX4r, 39VNTRchf/39VNTRchr и 196chr/196chf к вариабельным плазмидным и хромосомным областям генома; 16Achf/16Achr, polyAf/polyAr и PXf/PXr к SNR-областям генома; PA 953f/PA 953г и PA800f/PA800r к гену ПА.

Подобраны оптимальный набор эндонуклеаз и условия реакций рестрикции, проведения обычной и мультиплексной ПЦР для VNTR-, SNR- и PCR-RFLP-анализа. Впервые обнаружена генетическая вариабельность плаз-мидной VNTR-области РХЗ-4, ассоциированная с фенотипической вариабельностью штаммов, отличающихся по комплексу биохимических и патогенных свойств. Впервые обнаружена генетическая вариабельность хромосомного локуса 39VNTRch, расположенного в пределах гена, кодирующего синтез коллагенового адгезивного белка B.anthracis. Впервые разработан метод PCR-RFLP анализа гена ПА сибиреязвенного микроба. Впервые выявлена высокая вариабельность полиадениновых областей генома и PCR-RFLP типов гена ПА штаммов, выделенных в ходе одной вспышки сибирской язвы, а также вариантов штаммов, имеющих идентичный ML VA-генотип. Впервые идентифицировано шесть новых, а также пять известных, но не встречавшихся ранее ML VA-генотипов среди штаммов, выделенных на территории СНГ. Разработан методический подход к генетическому типированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в нашей модификации, позволяющий дифференцировать штаммы разного географического происхождения, а также группы изолятов и отдельные штаммы, выделенные во время вспышек сибиреязвенной инфекции.

Научно-практическая значимость. Разработанные методы генетического типирования используются в лаборатории сибирской язвы ФГУЗ СтавНИПЧИ для анализа музейных, вновь поступивших для идентификации и выделенных из исследуемого материала штаммов возбудителя сибирской язвы. Полученные в результате исследования новые генетические характеристики штаммов дополнили данные, имеющиеся в компьютерной базе данных «Штаммы Bacillus anthracis».

Материалы диссертационной работы вошли в следующие методические документы, утвержденные на учрежденческом уровне: «Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипических признаков (гемолитической, протеолитической, лецитиназной и пигментсинтезирующий активностей, способности штаммами/изолятами продуцировать капсулу и токсин in vitro) культур Bacillus anthracis», рекомендованные на заседании секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН академиком И.А. Бакуловым 28 мая 2004 г., протокол секции №2 и утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 9 от 21 октября 2004 г.]. «Молекулярное типирование штаммов сибиреязвенного микроба на основе вариабельности нуклеотидных последовательностей гена протективного антигена», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. «Методические рекомендации по межвидовой и внутривидовой дифференциации группы бацилл, включающих В. аМЬгаЫй», утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. «Методические рекомендации по филогенетическому анализу штаммов микроорганизмов» утвержденные директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.]. Учебно-методическое пособие «Теоретические основы и практические аспекты полимеразной цепной реакции», утверждено директором СтавНИПЧИ профессором Ефременко В.И. [протокол заседания Ученого совета № 5 от 27 мая 2005 г.].

Материалы диссертации вошли в заключительный отчет по НИР СтавНИПЧИ «Изучение фенотипической и генетической вариабельности штаммов сибиреязвенного микроба» № ГР 02.200.109091.

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний.

Положения, выносимые на защиту: 1. Локус с вариабельным числом тандемных повторов РХ 3-4 в межгенной области плазмиды рХ02 В. аМкгаЫБ имеет два аллельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков.

2. Анализ трех областей генома, содержащих единичные нуклеотидные повторы, позволяет выявить высокую степень индивидуальной генетической варибельности у штаммов В. аШкгаш.

3. РСК-И^ЬР-анализ гена ПА, основанный на амплификации двух фрагментов гена pag с последующей рестрикцией тремя эндонуклеазами, обнаруживает семь генотипов среди штаммов В. аМкгаш и их вариантов разного происхождения.

4. Методический подход к генотипированию штамов, основанный на со-четанном анализе маркеров МЬУА, РСЯ-КРЬР и 8М1 в нашей модификации дает возможность одновременно дискриминировать штаммы, происходящие из разных вспышек сибирской язвы, объединяя штаммы из одной вспышки, и различать штаммы, выделенные в течение отдельной вспышки.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ (Киров, 2003), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (г. Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), научно-практической конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине» (Ставрополь 2006), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». (Оболенск, 2006), научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 4 - в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации '

Работа изложена на 181 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 работу, из них 17 отечественных и 234 - зарубежных авторов. Материалы иллюстрированы 20 рисунками и 24 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Цыганкова, Елена Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. В результате поиска in silico в геноме B.anthracis выявлено по три потенциально вариабельных области с тандемными повторами и единичными повторами нуклеотидов. Сконструированные праймеры к этим областям и оптимизированные параметры амплификации в ПНР выявили разную степень их вариабельности.

2. Показано, что VNTR- локус РХ 3-4 имеет два отличающихся ал-лельных варианта, присущих штаммам сибиреязвенного микроба с разной фенотипической экспрессией комплекса ассоциированных с вирулентностью признаков. Локус VNTR 39, находящийся в области гена адгезивного колла-генового белка у одних штаммов и в области псевдогена или межгенной области у других штаммов бацилл группы Bacillus cereus, имеет не менее 4 аллелей. Вариабельность этого локуса может влиять на характер адгезии у разных штаммов.

3. Три локуса с единичными нуклеотидными повторами имеют высокую степень индивидуальной генетической вариабельности у штаммов B.anthracis. Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов практически одинаков, и составляет 0,864 для штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов. Величина Pic РХ F-R для штаммов из группы, сформированной по вспышкам, составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов - 0,7970. Индекс вариабельности Pic локуса 16А ch для штаммов по вспышкам близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,820.

4. Установлено, что эндонуклеазы Mfe I, PspE I, BstMC I имеют по одному сайту рестрикции в пределах последовательности гена ПА. Сконструированные праймеры к двум фрагментам гена ПА и оптимизированные параметры реакций рестрикции и амплификации для этих эндонуклеаз обеспечивают проведение генотипирования штаммов методом PCR-RFLP.

5. Разработанный метод PCR-RFLP-анализа гена протективного антигена позволяет обнаруживать не менее 7 PCR-RFLP типов гена ПА среди штаммов сибиреязвенного микроба. Метод отличается большей простотой и доступностью по сравнению с методом сравнительного определения полной нуклеотидной последовательности при аналогичной разрешающей способности.

6. С использованием метода РСК-ИГЬР показано, что чаще всего (49,5%) встречался 1 РСИ-КРЬР тип гена ПА, присущий как вирулентным изолятам разного географического происхождения, так и большинству вакцинных штаммов. Ко второму по частоте встречаемости 4 РСЯ-Ю^Р типу гена ПА, а также к редким типам 5 и 7 ПА принадлежали только штаммы, выделенные на Кавказе и в Закавказье. Наиболее вариабельными по РС11-ИРЬР типу гена ПА были штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерших от сибирской язвы людей. Морфологические колониальные варианты одного и того же штамма имели 2-3 разных РСЯ-Ю^Р типа гена ПА.

7. МЬУА 8-ми вариабельных локусов выявил среди изученных штаммов шесть новых полных генотипов и пять неполных МЬУА-генотипов В. агикгаЫБ, а также 5 известных, но ранее не встречавшихся среди изолятов с территории СНГ генотипов.

8. Разработанный методический подход к генетическому тпирова-нию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров МЬУА, РСК-ИРЬР и 8МЯ в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты из нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции. В предлагаемом методическом подходе к генотипирова-нию В.апЛгаЫз МЬУА-генотип в сочетанных схемах позволяет выявить принадлежность к определенному географическому региону и сопоставить полученные данные с мировой коллекцией В. апМгаш. Включение в схемы маркеров РСЛ-Ш^Р типа гена ПА и локуса 16А сЬ разделяет штаммы из одной вспышки, имеющие одинаковый МЬУА генотип, на групповые подтипы, а маркеров трех БЫК-локусов - на индивидуальные генотипы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возбудитель сибирской язвы, B.anthracis, на протяжении долгого времени является объектом пристального внимания ученых. Важность его изучения обусловлена способностью спор B.anthracis длительно сохраняться в почвенных очагах, периодически вызывая вспышки сибирской язвы, а так же высокой вирулентностью и возможностью использования этого микроба в качестве биологического оружия в военных и террористических целях. В связи с этим особую важность приобретает не только совершенствование методов и средств диагностики, профилактики и лечения, но и разработка точных и эффективных методов генетического типирования возбудителя для определения источника происхождения штаммов B.anthracis, вызвавших вспышку сибирской язвы или использованных при террористическом акте.

В настоящее время наиболее распространен метод молекулярного типирования штаммов B.anthracis, основанный на анализе нескольких хромосомных и плазмидных локусов с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR- локусов), называемый ML VA (Keim P. et al., 2000; Le Fleche P. et al., 2001). В качестве дополнительных генетических маркеров при определении степени генетического родства штаммов используют предложенное L. Price et al., (1999) определение генотипа гена ПА в соответствии с полиморфизмом единичных нуклеотидов. Несмотря на высокую разрешающую способность данных систем генотипирования, они не способны различать штаммы, произошедшие из одного источника и имеющие одинаковый ML VA- и ПА- генотипы. Кроме того, используемые методы требуют наличия дорогостоящего оборудования для автоматического сиквенса и фрагментного анализа. В связи с этим, целесообразным может быть дополнение существующих схем генетического анализа штаммов B.anthracis маркерами единичных нуклеотид-ных повторов (SNR), которые проявляют высокую степень генетического полиморфизма (Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., 2005, Muscillo М. et al., 2005, Stratilo Ch. et al., 2006), новыми VNTR-маркерами, а также замена определения SNP методом сиквенса на PCR-RFLP-анализ гена ПА. Решение этих задач позволило бы предложить приемлемый для нынешнего уровня оснащенности большинства лабораторий соответствующего профиля у нас в стране метод генетического типирования сибиреязвенного микроба.

Нами при анализе in silico полной нуклеотидной последовательности генома пяти штаммов B.anthracis удалось выявить три перспективные области на хромосоме и плазмиде рХ02, вариабельные по количеству аденинсо-держащих нуклеотидов. Мы разработали праймеры, состав реакционной смеси и подобрали программу амплификации выбранных фрагментов генома B.anthracis. Было проанализировано три SNR-локуса в геноме В. anthracis: два из них - Poly А и РХ F-R находятся на плазмиде рХ02, а один -16А ch -на хромосоме. Каждый локус анализировался по двум выборкам штаммов (из отдельных вспышек и из разных географических регионов). При исследовании SNR локуса Poly А среди группы штаммов В. anthracis, подобранных по вспышкам (46 штаммов, имеющих плазмиду рХ02), было выявлено 11 аллелей. В выборке из 29 штаммов В. anthracis из разных географических регионов (у четырех штаммов отсутствовала плазмида рХ02) идентифицировано 10 аллелей. Среди первой группы штаммов размер Poly А локуса колеблется в интервале от 314 п.н. (13 А) до 327 п.н. (26 А), а среди штаммов из различных географических регионов диапазон был значительно шире - от 321 п.н. (20 А) до 342 п.н. (41 А). Следует так же отметить, что если для территории Северного Кавказа и Закавказья (Ставропольсккий край, Кабардино-Балкарская Республика, Карачаево-Черкесская Республика, Чечено-Ингушская АССР, Азербайджан, Грузия) характерны аллели величиной менее 330 п.н., то для Центральной России (Воронежская, Оренбургская, Самарская, Ульяновская, Калужская, Липецкая области) характерны фрагменты Poly А большей величины: от 331 до 342 п.н. Индекс вариабельности Pic для обеих групп штаммов В. anthracis практически одинаков, и составляет 0,864 для штаммов по вспышкам и 0,860 для штаммов из разных регионов.

Для вариабельного SNR-локуса РХ F-R обнаружено 11 аллелей при исследовании 46 штаммов, изолированных в ходе отдельных вспышек и шесть аллелей для выборки штаммов из различных географических регионов. Среди штаммов В. anthracis, принадлежащих к разным вспышкам инфекции, наиболее часто встречается аллель 252 п.н. Аллель 252 п.н. характерен для штаммов из двух вспышек - в Ставропольском крае в 2004 г. и в Карачаево-Черкесской Республике в 1992 г., этот же аллель имеет большая часть (кроме двух) штаммов В. anthracis из Малгобекского района Чечено-Ингушской АССР. Остальные аллели данного локуса встречаются значительно реже и не привязаны к конкретной вспышке, кроме аллеля 258 п.н., который обнаружен у всех, кроме одного штамма из двух последовательных вспышек в Терском районе Кабардино-Балкарской Республики (1998, 1999). Величина Pic РХ F-R для штаммов В. anthracis из группы, сформированной по вспышкам, составляет 0,7758, а для штаммов из разных регионов - 0,7970.

Недостаток двух вышеописанных SNR-локусов заключается в том, что они не могут быть использованы при изучении штаммов В. anthracis, лишенных плазмиды рХ02.

Полиадениновый SNR-локус 16А ch расположен на хромосоме В. anthracis и поэтому присутствует у всех изученных штаммов. Этот локус оказался наиболее вариабельным из трех выявленных и изученных нами: для выборки штаммов по вспышкам выявлено 28 аллелей, а среди штаммов из разных регионов - 10. Всего для полиморфного локуса 16А ch было выявлено 32 аллеля. Индекс вариабельности Pic для штаммов В. anthracis из отдельных вспышек близок к единице и составляет 0,984, а для штаммов из разных регионов - 0,820. Заслуживает внимания не только высокая разрешающая способность данного локуса, но и то, что штаммы из одной вспышки имеют близкую величину области 16А ch, и отличаются от штаммов из других вспышек сибиреязвенной инфекции.

Проведенный нами анализ показал, что из трех изученных локусов оптимальным для использования при генотипировании штаммов В. anthracis на первоначальном этапе является локус 16А ch. Так как данный локус расположен на хромосоме, то его можно определять у всех, в том числе и у моно- и бесплазмидных штаммов. Локус 16А ch не только обладает высокой дискриминирующей способностью, но и позволяет объединять штаммы из одной вспышки в группы с близкими величинами данного SNR локуса. Нами подобран такой состав реакционной смеси для локуса 16 А ch, при котором можно проводить амплификацию по той же программе, что и MLVA-локусы системы Р. Keim et al., (2000), для одновременное определение MLVA -генотипа и величины аллеля локуса 16А ch.

Ни для одного из изученных локусов не было выявлено закономерности распределения по годам или в зависимости от источника выделения.

Проведенный анализ показал, что единичные нуклеотидные повторы обладают высокой разрешающей способностью при их использовании для генетического анализа и типирования штаммов В. anthracis. Значительное разнообразие аллелей каждого локуса и их комбинации, уникальные практически для каждого штамма, при дополнении существующих схем MLVA -генотипирования характеристикой данного локуса, позволяют добиться большой точности в определении степени генетического родства изучаемых штаммов.

Кроме SNR, на плазмиде вирулентности рХ02 было обнаружен вариабельный тандемный повтор, который, как показали наши исследования, является своеобразным «маркером атипичности», так как аллель 248 п.н. обнаруживается у типичных по фенотипическим и биохимическим признакам штаммов В. anthracis, а аллель 256 п.н. - у штаммов, отличающихся по одному или нескольким признакам от типичных. Величина аллеля РХ 3-4 коррелирует с MLVA-генотипом изучаемых штаммов: все атипичные штаммы, имеющие генотип 13N, имеют РХ 3-4 аллель 256 п.н. Повтор РХ 3-4 имеет более сложную структуру, нежели большинство VNTR, и состоит из двух областей с повторами размером 8 п.н., разделенных областью размером 105 п.н., при этом один из аллелей, не обнаруженный среди исследованных нами штаммов, но встречающийся среди полных сиквенсов штаммов B.anthracis в GenBank, имел удвоение сегмента из 4 повторов и разделяющей области.

Еще один вариабельный тандемный повтор 39VNTR ch, размером 39 п.н., обнаружен нами на хромосоме В. anthracis. При исследовании 116 штаммов В. anthracis и 13 видов близкородственных сапрофитов рода Bacillus (В. thuringiensis и B.cereus) были выявлены четыре аллеля данного локу-са: 478, 439, 400 и 283 п.н. Выявленный тандемный повтор имеется у В. anthracis, В. thuringiensis и B.cereus. В результате анализа in silico нами выявлено, что у ряда штаммов вариабельная область с повтором 39 VNTR приходится на межгенное пространство, а у других - на расположенный на том же участке ген, кодирующий синтез адгезивного коллагенового белка. Количество повторов у В. anthracis варьирует от пяти до семи, наиболее распространенным является аллель 400 п.н., содержащий шесть повторов. Ранее описана генетическая вариабельность, связанная с VNTR, в области, кодирующий коллагеноподобный белок филаментов экзоспориума В. anthracis, который определен так же как иммунодоминантный (Steichen С., et al., 2003). Было показано, что длина филаментов прямо связана с количеством повторов (Sylvestre P., et al 2003) Возможно, и число тандемных повторов локуса 39 VNTR ch может оказывать влияние на адгезивные свойства штаммов, а так же на их иммуногенность.

Еще одной группой генетических маркеров, способных выявлять меж-штаммовые различия, являются SNP (Price L. et al., 1999; Read T. et al., 2002)/

При анализе in silico полной нуклеотидной последовательности гена протективного антигена 16 штаммов В. anthracis, опубликованных на сайте GeneBank, нами были выявлены шесть SNP в пределах гена pag, для каждого из которых были подобранны эндонуклеазы рестрикции. На основании SNP нами была разработана схема генотипирования штаммов В. anthracis по гену протективного антигена методом PCR-RFLP анализа. Для амплификации гена pag были разработаны три пары праймеров и подобран режим амплификации таким образом, чтобы амплификация всех трех фрагментов происходила при одном режиме амплификации. Было проведено генотипирование 138 штаммов В. anthracis по PCR-RFLP типу гена протективного антигена. В ходе работы из семи эндонуклеаз для генотипирования штаммов В. anthracis по гену протективного антигена было отобрано три: Mfe I, PspE I, BstMC I. Разные комбинации фрагментов, образующихся при действии этих эндонуклеаз на ампликоны pag 67-68 (Mfe I и PspE I) и РА 953 (BstMC I) позволяют выделить среди штаммов В. anthracis семь PCR-RFLP типов гена ПА.

Наиболее разнообразными по числу PCR-RFLP типов гена ПА являются штаммы, выделенные из почвы и из материала от больных и умерших от сибирской язвы людей. Редкие PCR-RFLP типы гена ПА- 5, 6 и 7 встречаются только в этих двух группах штаммов.

Наиболее многочисленными и разнообразными по источнику выделения являются штаммы, относящиеся к 1 PCR-RFLP типу гена ПА (49,5%), выделенные из почвы с места прирезки и скотомогильников, материала от больных людей и животных, проб воды, смывов и соскобов с различных поверхностей. Вторую по частоте встречаемости группу составляют штаммы, относящиеся к 4 PCR-RFLP типу гена ПА (25%), распространенному исключительно на территории Кавказа и Закавказья, как и редкие 5, 6 и 7 типы гена ПА (кроме штамма В. anthracis 539/59, имеющего 6 PCR-RFLP тип гена ПА и выделенного в Волгоградской области).

Для проверки предположения о высокой гетерогенности популяции штаммов по нуклеотидной последовательности гена pag, нами была проведена выборочная селекция колониально-морфологических вариантов трех штаммов В. anthracis. Селекция проводилась по признаку морфологии колоний. У вариантов штаммов 1020/11 (четыре варианта), 1021/23 (пять вариантов) и Sterne (три варианта), отобранных по морфологии колоний, было выявлено пять генотипов ПА. Все четыре выделенных варианта штамма 1020/11 имеют разные PCR-RFLP типы гена ПА, исходный штамм 1020/11 имеет 3 PCR-RFLP тип гена ПА, которого нет ни у одного из выделенных вариантов. У пяти вариантов штамма 1021/23 обнаружено 2 PCR-RFLP типа гена ПА - 1 и 2, исходный штамм имеет генотип 1 ПА , от которого 2 генотип отличается по сайту рестрикции Mfe I. Таким образом, можно сделать вывод, что популяции многих штаммов является гетерогенной по нуклеотидной последовательности гена ПА.

При анализе локуса уггА 98 штаммов В. апОпгаыь нами было выяснено, что подавляющее большинство штаммов (78,6%) относятся к УЫТ!^ категории, которая наиболее часто встречается как на территории стран бывшего СССР, так и во всем мире. Географически УШТ^ категория распространена на всей территории Европейской части России: Дагестане, Республике Северной Осетии-Алании, Оренбургской, Ульяновской, Тамбовской, Липецкой, Самарской областях, Краснодарском крае, Башкирии а так же в Молдове, Грузии и Узбекистане. УШТ^ категорию имеют штаммы, выделенные в ходе вспышек в Ставропольском крае (2004 г.), Кабардино-Балкарской Республике (1994, 1998, 1999 гг.), Азербайджане (две вспышки в 1980 г.). Аллель 325 п.н. (УЫТК5 категория) выявлен у штаммов из Карачаево-Черкесской Республики (1992 г.) и Чечено-Ингушской АССР (1968 г) а так же у штаммов из Тульской, Калужской, Волгоградской и Курской областей.

Один штамм, выделенный от больного в Воронежской области, имел УМТЯз категорию. Редкая для СНГ УМТЯз категория в мировой коллекции является второй по частоте встречаемости после УШТ^. Нами был обнаружен один штамм с не встречавшейся у нас ранее УШИг категорией. Это штамм В. аШЬгаыь 217/1 из Каракалпакии (Узбекистан), выделенный от трупа человека.

По другим хромосомным локусам не было обнаружено значительного генетического разнообразия: локусы у/тС/, хггВ] и \ггВ2 у всех изученных штаммов имели одинаковые аллели 613, 229 и 162 п.н. соответственно, за исключением штамма В. ашЬгаыБ 217/1, имеющего аллель 538 п.н. локуса уггС]. Как уже отмечалось ранее (Еременко Е.И. и др., 2002; Цыганкова О.И. и др., 2003), именно значительно большее разнообразие аллелей плазмидных локусов рХ01аМ и рХ02м и их различные комбинации позволяют выделить множество генотипов у В. аЫЬгаыь. В данном исследовании нам удалось обнаружить по четыре аллеля локусов рХО\ааг и рХ02м. Их комбинации между собой, а так же с различными величинами 6 хромосомных локусов позволили нам описать шесть новых генотипов.

На основании анализа MLVA-генотипов штаммов В. anthracis из разных регионов России и стран СНГ можно сделать вывод, что наиболее типичной как для территории Северного Кавказа, так и для всей России и сопредельных стран (Молдовы, Грузии, Азербайджана, Узбекистана) является генетическая ветвь А, и в частности кластер АЗа (Keim Р. et al., 2000), к которому относится большинство изученных нами штаммов В. anthracis.

При сравнительном анализе дендрограмм, построенных на основе MLVA (8-ми локусный анализ Р. Keim et al., 2000 и вариабельных хромос-моных областей Ceb-Bams Р. Le Fleche et al., 2001), видно, что система гено-типирования более точно отражает реально существующие связи. Дендро-грамма, построенная на основании локусов Ceb-Bams имеет практически то же строение, что и дендрограмма, построенная с использованием данных MLVA-анализа по системе Keim Р. et al., однако, из-за отсутствия в системе Р. Le Fleche et al., плазмидных локусов, имеющих большую по сравнению с хромосомными степень вариабельности, она менее структурирована и не разделяет на отдельные подтипы штаммы из разных вспышек (Кабардино-Балкарская Республика, Азербайджан, Чечено-Ингушская АССР). Кроме того, одинаковое число тандемных повторов в каком-либо локусе Ceb-Bams (например, Ceb-Bams 5 или Ceb-Bams 53) может привести к искажению реально существующих связей между штаммами В. anthracis и неправильным выводам при эпидемиологическом расследовании. Генетическая стабильность хромосомных локусов в 8 MLVA системе в сочетании с высокой вариабельностью плазмидных локусов обеспечивают высокую дискриминирующую способность данной системы генотипирования. О большей разрешающей способности системы Р. Keim et al. свидетельствует и величина генетической дистанции 0,005 против 0,02 для локусов Ceb-Bams, т.е. в 4 раза.

Мы объединили данные по 8 локусам MLVA и 12 локусам Ceb-Bams. для того, чтобы проверить, насколько увеличится разрешающая способность филогенетического анализа при их совместном использовании. Дендрограм-ма, построенная с использованием обеих систем генотипирования, практически не отличается от дендрограммы, построенной с использованием данных только по 8 локусам MLVA. Единственным отличием является объединение неродственных штаммов В. anthracis 1255 и 492/497 на основании редкого аллеля 212 локуса Ceb-Bams 53. Однако следует отметить, что именно хромосомные локусы Ceb-Bams (Ceb-Bams 5) позволяют отделить штамм В. anthracis 462/471 из Нагорного Карабаха (Азербайджан) от штаммов из Джуль-финского района Азербайджана, имеющих такой же MLVA-генотип. Таким образом, можно сделать вывод о том, что MLVA система Р. Keim et al. эффективно разделяет штаммы в соответствии с мировой классификацией генотипов В. anthracis. В то же время, использование только этой MLVA-системы не всегда позволяет эффективно разделять штаммы, изолированные одновременно на близких территориях (Нагорных Карабах и Джульфинский район Азербайджана), что очень важно при расследовании случаев заболеваний сибирской язвы. На основании полученных данных мы считаем, что полиморфные хромосомные локусы Ceb-Bams Р. Le Fleche et al. следует использовать в дополнение к системе Р. Keim et al., (2000) при создании полного генетического паспорта штаммов, однако в качестве быстрого и надежного метода дискриминации штаммов они менее пригодны еще и из-за значительной трудоемкости и длительности данного метода генотипирования. Если система генотипирования Р. Keim et al., (2000) была успешно модифицирована Е.И. Еременко и др., (2001) для амплификации всего в 3 реакционных смесях при одном режиме амплификации, то большинство локусов Ceb-Bams ам-плифицируются в отдельных реакционных смесях по разным программам амплификации. Опробованные нами смеси для одновременного амплифици-рования нескольких локусов Ceb-Bams позволяют несколько упростить и ускорить генотипирование, однако большое количество локусов Ceb-Bams невозможность использования одной программы амплификации по-прежнему не позволяет использовать ее в качестве ускоренного метода генотипирова-ния.

Для выявления более тонких различий между штаммами В. anthracis, относящимися к одному MLVA генотипу целесообразно использовать маркеры PCR-RFLP- и SNR- анализов (Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. 2005; Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. 2006; Keim Р. et al., 2003; Muscillo М. et. al 2005). Информативность SNR характеристики заключается в способности выявлять различия у штаммов с идентичным MLVA генотипом. Анализ характеристик трех выявленных и изученных нами полиморфных SNR-локусов позволил выявить большее генетическое разнообразие В. anthracis. Дендрограмма, построенная на основании данных по 8 VNTR-локусам MLVA и 3 SNR-локусам показывает, что благодаря использованию SNR-локусов для генетического анализа внутри каждой вспышки удается выделить штаммы, различающиеся по величине SNR-локусов или их комбинациям.

Так, при использовании только MLVA схемы Р. Keim et al., (2000) штаммы В. anthracis из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и Джульфинского района Азербайджана невозможно отличить друг от друга, так как они имеют одинаковый 43 MLVA-генотип. При включении в схему генотипирования SNR- локусов становится возможным разделение штаммов В. anthracis с одинаковым MLVA -генотипом: ветвь, включающая штаммы из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и Джульфинского района Азербайждана делится на 2 группы: меньшую, куда входят штаммы из Баксанского района Кабардино-Балкарской Республики и примыкающие к ним из-за близких характеристик локусов РХ F-R и Poly А штаммы В. anthracis 505/628 и 473/634, и большую, включающую штаммы только из Джульфинского района Азербайджана.

Одновременное использование схемы генотипирования на основе MLVA, выделяющей более крупные генетические группы (генотипы) и высокополиморфных SNR-локусов, обладающих уникальными практически для каждого штамма характеристиками, позволяет более эффективно проводить генетический анализ штаммов В. anthracis и прослеживать их изменчивость в ходе вспышки сибирской язвы при действии различных условий (выделение из разных объектов, пассирование через организм больных людей и животных, выделение штаммов из объектов, подвергшихся дезинфекции).

При ускоренном генотипировании штаммов наиболее целесообразным, по нашему мнению, является использование MLVA-системы Р. Keim et al. (2000), определение типа гена ПА методом PCR-RFLP анализа и вариабельного хромосомного локуса 16А ch, который способен одновременно различать штаммы внутри вспышки и объединять штаммы из одной вспышки по близким значениям данного аллеля.

Для получения индивидуальной характеристики штаммов из одной вспышки следует использовать сочетание MLVA по Keim et al. (2000) с анализом трех SNR-локусов.

Таким образом, разработанный методический подход к генетическому тпированию сибиреязвенного микроба, основанный на сочетанном анализе маркеров MLVA, PCR-RFLP и SNR в нашей модификации, дает возможность сравнивать как штаммы, выделенные в разных географических регионах, так и дифференцировать изоляты из нескольких и даже одной вспышки сибиреязвенной инфекции

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Цыганкова, Елена Анатольевна, 2007 год

1. Методические рекомендации «Использование многолокусной полиме-разной цепной реакции для идентификации штаммов В. anthracis и оценки их генетического потенциала патогенности» Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Брюханов А.Ф. (Ставрополь, 2002).

2. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. -М.: Мир, 1984.- С. 480.

3. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР: МУ 3.5.5. 1034-01. - Москва: Минздрав России, 2001. - С. 8.

4. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - С. 448.

5. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф. и др. Генотипирова-ние штаммов сибиреязвенного микроба, изолированных на территории стран СНГ // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунол. 2003. - № 6. - Приложение. -С. 51-56.

6. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Разработка подхода к молекулярному типированию гена протективного антигена В. anthracis // Сборник научных трудов, посвященный 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ. Киров, 2003. - С. 128 - 130.

7. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. Обнаружение единичного нук-леотидного повтора на плазмиде вирулентности рХ02 Bacillus anthracis II Естествознание и гуманизм: Сборник научных работ. Томск, 2005. - Т.2, №1. -С. 15.

8. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И. Молекулярное типирование штаммов Bacillus anthracis и эпидемиологический анализ // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. Ставрополь 2006. - С. 186- 189.

9. Черкасский, Б.Л. Критерии оценки эпизоотологической и эпидемиологической активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов // Журн. микробиол. 1969. - № 1. - С. 132-136.

10. Черкасский, Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «ИНТЕРСЭН», 2002. - 384 с.

11. Abravaya К., Carrino J. J., Muldoon S., Lee H.H. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR). // Nucleic Acids Res. -1995. -Vol. 23. № 4. - P. 675-682.

12. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A. et al. PlcR is pleotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis II Mol. Microbiol. 1999. -Vol. 32. - № 5. - P. 1043-1053.

13. Ahmadian A., Gharizadeh В., Gustafsson A.C. et al. Single-nucleotide polymorphism analysis by pyrosequencing // Anal. Biochem. -2000. Vol.280.-№1.-P. 103-110.

14. Arber W. Promotion and limitation of genetic exchange // Science.- 1979.-Vol. 205.-P. 361-365.

15. Alland D., Whittam T.S., Murray M.B. et al. Modeling bacterial evolution with comparative-genome-based marker systems: application to Mycobacterium tuberculosis evolution and pathogenesis // J. Bacteriol. Jun 2003. - Vol. 185. -№11. -P. 3392-3399.

16. Andersen G.L., Simchock J.M., Wilson K.H. Identification of a region of genetic variability among Bacillus anthracis strains and related species // J.Bacteriol.-1996.-Vol. 178. P. 377-384.

17. Arguello J.R., Little A.-M., Pay A.L. et al. Mutation detection and typing of polymorphic loci through double strand conformation analysis // Nat. Genet.-1998.-Vol. 18.-P. 192-194.

18. Bartkus J.M., Leppla S.H. Transcriptional regulation of the protective antigen gene of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - № 8. - P. 405408.

19. Botstein D., White R.L., Skolnik M., Davise R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms // Am. J. Hum. Genet. 1980. - Vol. 32. - №3. - P. 314-331.

20. Borgogne A., Drysdale M., Hilsenbeck S. et al. Global effects of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmids // Infection and Immunity. May 2003. - Vol. 71. - №5. - P. 2736-2743.

21. Candela T., Mock M., Fouet A. Cap E, a 47 amino acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poly glutamate capsule synthesis // J. Bacteriol. Nov. 2005. - Vol.187. - №22. - P. 7765-7772.

22. Candela T., Fouet A. Bacillus anthracis CapD belonging to the gamma-glutamyltranspeptidase family is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan //Mol. Microbiol. Aug. 2005. - Vol.57. - №3. - P. 717-726.

23. Caskey, C. T., Pizzuti A., Fu Y. et al. Triplet repeats mutations in human disease // Science. 1992. - Vol.256. - P. 784-789.

24. Cataldi A., Labruyere E., Mock M. Constructions and characterization of a protective antigen deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. -1990. -V. 4. - №7. - P. 1111-1117.

25. Chang H.W., Yang C.H., Chang P.L. et al. SNP-RFLP restriction enzyme mining for SNPs in genomes // BMC Genomics 2006; 7:30.

26. Charlton S., Moir A.J.G., Baillie L., Moir A. Characterisation of the exosporium of Bacillus cereus II J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol.87. - P. 241245.

27. Chen J., Hebert P.D. Directed termination PCR: a one-step approach to mutation detection //Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 1546-1547.

28. Chen Y., Succi J., Koehler T.M. Silent P-lactamase genes in Bacillus an-thracis II Abstract Book. 4t-h International Conference on Anthrax. Annapolis, USA, 10-13 June 2001.-P. 33.

29. Cifarelli, R. A., Gallitelli M., Cellini F. Random amplified hybridization microsatellites (RAHM): isolation of a new class of micro-satellite containing DNA clones // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol. 23. - P. 3802-3803.

30. Clements M.O., Moir A. Role of the gerl operon of Bacillus cereus 569 in the response of spores to germinates // J. Bacteriol. 1998. - Vol.180- P. 67296735.

31. Coggins, L. W., O'Prey M. DNA tertiary structures formed in vitro by misaligned hybridization of multiple tandem repeat sequences // Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 7417-7426.

32. Corfe B.M., Sammons R.L., Smith D.A., Mauel C. The gerB region of the Bacillus subtilis 168 chromosome encodes a homologue of the gerA spore germination operon // Microbiology. 1994. - Vol. 140- P. 471-478.

33. Cotton R.G. Mutation detection by chemical cleavage // Genet. Anal. -1999. Vol. 14. - № 5-6- P. 165-168.

34. Crow J.F. Spontaneous mutation of a risk factor // Exp. Clin. Immunoge-net.- 1995.-Vol. 12-P. 121-128.

35. Dai Z., Sirard J.-C., Mock M., Koehler T. M. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence // Mol. Microbiol.-1995.-Vol. 16.-P. 1171-1181.

36. Dai Z., Koechler T. Regulation of anthrax toxin activator gene (AtxA) expression in Bacillus anthracis: temperature, not C(V bicarbonate affects atx sythesis // Infection and Immunity. July 1997. - Vol. 65. - №7. - P. 2576-2582.

37. Diamant E., Palti Y., Gur-Arie R. et al. Phylogeny and strain typing of Escherichia coli, inferred from variation at mononucleotide repeat loci // Appl. Environ. Microbiol. Apr 2004. - Vol. 70. - №4. - P. 2464-2473.

38. Drysdale M., Bourgogne A., Hilsenbeck S.G., Koechler T.M. AtxA controls Bacillus anthracis capsule synthesis via acpA and a newly discovered regylator acpB I I J. of Bacteriology. Jan. 2004. - Vol.186. - №2. - P. 307-315.

39. Dwyer K.G., Lamonica J.M., Schumacher J.A. et al. Identification of Bacillus anthracis specific chromosomal sequences by suppressive subtractive hybridization // BMC Genomics. Feb. 2004. - Vol.12. - №5 (1):15.

40. Easterday W.R., Van Ert M.N., Simonson T.S., Wagner D.M. Use of the single nucleotide polymorphisms in the plsR gene for specific identification of Bacillus anthracis II J. of Clinical Microbiology. Apr. 2005. - Vol.43. - №4. - P. 1995-1997.

41. Edlund T., Siden I., Boman H.G. Evidence for two immune inhibitors from Bacillus thuringiensis interfering with the humoral defense system of saturniid pupae //Infeect. Immun. 1976. - Vol.14. - P. 934-941.

42. Ellenbrok H., Nattermann H., Ozel M. et al. Rapid and sensitive identification of pathogenetic and apathogenetic Bacillus anthracis by real-time PCR // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol.214. - P. 51-59.

43. Etienne-Toumelin J., Serard J.C. et al. Characterization of the Bacillus anthracis S-layer: cloning and sequencing of the structural gene // J. Bacteriol. -1995. - Vol. 177. - №3. - P. 614-620.

44. Ewing B., Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities // Genome Res. 1998. - Vol. 8. - P. 186.

45. Ezzell J.W., Abshire T., Ibrahim S. et al. Identification of Bacillus anthracis: an overview // Abstract Book. 3rd International Conference on Anthrax. -Plymouth, England., September 7-10, 1998. P.47.

46. Fasanella A., Smith K.L., Keys C. et al. Molecular Epidemiology of Bacillus anthracis in Italy // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax. -St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, June 10-13,2001. P. 14.

47. Farchaus J.W., Ribot W.J., Ezzel J.W. Purification and characterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-1 //J. Bacterid. 1995. - Vol. 177. - P. 614-620.

48. Foster, P. L., Trimarchi J. M. Adaptive reversion of a frame shift mutation in Escherichia coli by simple base deletions in homopolymeric runs //Science. -1994.-Vol. 265.-P. 407-409.

49. Fouet A., Namy O., Lambert G. Characterization of the operon encoding the alternative oB factor from Bacillus anthracis and its role in virulence // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - №18. - P. 5036-5045.

50. Fouet A., Smith K., Keys C. et al. Diversity among French Bacillus anthracis isolates // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P. 4732-4734.

51. Frischknecht F. The history of biological warfare. Human experimentation, modern nightmares and lone madmen in the twentieth century // EMBO reports. 2003. - Vol. 4. - Special issue. - P. 47-52.

52. Gaylord P., Heeger A.J., Bazan G.C. DNA hybridization detection with water-soluble conjugated polymers and chromophore-labeled single-stranded DNA // J. Am. Chem. Soc. Jan. 2003. - Vol. 125. - №4. - P. 896-900.

53. Gierczynski R., Kaluzewsky S., Rakin A. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern Poland the molecular echoes of the past outbreaks // FEMS Microbiology Letters. - 2004. - Vol. 239. - P. 235-240.

54. Gohar, M., 0kstad O. A., Gilois N. et al. Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome of Bacillus cereus reveals the importance of the PlcR regulon // Proteomics. 2002. - Vol. 2. - P. 784-791.

55. Gominet, M., Slamti L., Gilois N. et al. Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis PlcR regulon and for virulence // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 40. - P. 963-975.

56. Gottesman S., Neidhardt G. Gene Function in Procariotes // Eds. J. Beckwithet al. Cold Spring Harb. - 1983. - P. 163-183.

57. Green B.D., Battisti B.L., Koehler T.M. et al. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1985. - Vol.49. - P. 291-297.

58. Green B.D., Battisti B. L., Thorne C.B. Involvement of Tn4430 in transfer of Bacillus anthracis plasmids mediated by Bacillus thuringiensis plasmid pX012 //¿Bacterid. 1989. -Vol. 171.-P. 104-113.

59. Griffin T.J., Hall J.G., Prudent J.R., Smith L.M. Direct genetic analysis by matrix assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol.96. - P. 6301-6306.

60. Guidi-Rontani C., Pereira Y., Ruffle S. et al. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1999. - Vol.33. - P. 407- 414.

61. Guidi-Rontani C., Weber-Levy M., Labruyere E., Mock M. Germination of Bacillus anthracis spores within alveolar macrophages // Mol. Microbiol. -1999.-Vol.31.-P. 9-17.

62. Gur-Arie R., Cohen C.J., Eitan Y. et al. Simple sequence repeats in Escherichia coli: abundance, distribution, composition, and polymorphism // Genome Res. Jan. 2000. - Vol. 10. - № 1. - P. 62-71.

63. Guttmann D.M., Ellar D.J. Phenotypic and genotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for a selection of known and putative B. thuringiensis virulence factors // FEMS Microbiology Letters. 2000. - Vol. 188. -P. 7-13.

64. Hacia J.G., Collins F.S. Mutation analysis using oligonucleotide microar-rays // J. Med. Genet. 1999. - Vol. 36. - P. 730-736.

65. Harrell L.J., Andersen G.L., Wilson K.H. Genetic variability of B. anthracis and related species // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. - №.7. - P. 18471850.

66. Hauge, X. Y., Litt M. A study of the origin of "shadow bands" seen when typing dinucleotide repeat polymorphisms by the PCR // Nucleic Acids Res. -1993.-Vol.2.-P. 411-4 15.

67. Healey B.G., Matson R.S., Walt D.R. Fiberoptic DNA sensor array capable of detecting point mutations // Anal. Biochem. 1997. - Vol.251. - P. 270-279.

68. Heath, D.D., Iwama G. K., Devlin R. H. PCR primed with VNTR core sequences yields species specific patterns and hypervariable probes // Nucleic Acids Res. 1993. Vol.21. - P. 5782-5785.

69. Hecker M., Schumann W., Volker U. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis II Mol. Microbiol. 1996. - - Vol.19. - P. 417-428.

70. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - Vol. 6. - №.9. - P. 86-94.

71. Henderson I. Fingerprinting Bacillus anthracis strains // Abstract Book. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England, September 19-21, 1995. - P. 55-59.

72. Hill K.K., Ticknor L.O., Okinaka R.T. et al. Fluorescent amplified fragment length polymorphism analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolates // Appl. Environ. Microbiology 2004. Vol.70. - P. 1068-1080.

73. Hoffmaster A.R., Koehler T.M. Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - №.15. - P.4485-4492.

74. Hoffmaster A.R., Fitzgerald C.C., Ribot E. et al. Molecular subtyping of Bacillus anthracis and the 2001 Bioterrorism-Associated Anyhrax Outbreak, United States // Emerging Infection Diseases. Oct. 2002. - Vol. 8. - № 10. - P. 1111-1116.

75. Hogar M., 0kstad O.A., Fedhila S. et al. PlcR and virulence factors in Batlicillus cereus II Abstract Book. 5 International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 58.

76. Howard J.T., Ward J., Watson J.N., Roux K.H. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease // Biotechniques. 1999. - Vol. 27. - № 1. - P. 9-18.

77. Huber C.G., Oefner P.J., Preuss E., Bonn G.K. High-resolution liquid chromatography of DNA fragments on non-porous poly-(styrene-divinylbenzene) particles //Nucleic Acids Res. 1993. - Vol. 21. - P. 1061-1066.

78. Hugh-Jones M., Jackson P.J., Keim P. Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1999. - Vol.181. - № 8. - P. 2358-2362.

79. Hurtle W., Bode E., Kulesh D., Kaplan R. Detection of Bacillus anthracis gyrA gene by using a minor groove binder probe // J. of Clin. Microbiol. Jan. 2004.-Vol. 42.-№1.-P. 179-185.

80. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis II Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. -№.2. - P.537-542.

81. Jackson P.J., Walthers E.A., Kalif A.S. et al. Characterization of the Variable-Number Tandem Repeats in vrrA from different Bacillus anthracis isolates // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - №4. - P.1400-1405.

82. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. Hypervariable "minisatellite" regions in human DNA // Nature. 1985. - Vol. 314. - P. 67-73.

83. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. Individual specific finger-prints of human DNA // Nature. 1985. - Vol. 316. - P. 76-79.

84. Jeffreys, A. J., Wilson V., Thein S. L. et al. DNA fingerprints and segregation analysis of multiple markers in human pedigrees // Am. J. Hum. Genet. 1986. -Vol. 39.-P. 11-24.

85. Jeffreys, A. J., MacLeod A., Tamaki K. et al. Minisatellite repeats coding as a digital approach to DNA typing // Nature . -1991. Vol. 354. - P. 204-209.

86. Irie R., Fujita Y., Kobayashi M. Nucleotide sequence and gene organization of the gerK spore germination locus of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 42. - P. 41-53.

87. Kaspar R.R., Robertson D.R. Purification and physical analysis of Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02 // Bioch. Res. Comm. 1987. - Vol. 149. - № 2.-P. 362-368.

88. Keim P., Kalif A., Schupp J. et al. Molecular Evolution and Diversity in Bacillus anthracis as Detected by Amplified Fragment Length Polimorphism Markers // J. Bacteriol. 1997. - Vol.179. - №3 - P.818-821.

89. Keim P., Klevytska A., Price L.B. et al. Molecular diversity in Bacillus anthracis // J.App.Microbiol. 1999. - Vol. 87. - P.215-217.

90. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. et al. Multiple-locus VNTR analysis (MLVA) reveals genetic relationships within Bacillus anthracis II J.Bact. 2000. -Vol. 182. - P.2928-2936.

91. Keim P., Zinser G., Solomon D. et al. Dissection of Bacillus anthracis into distinct types using VLVA // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax June 10 - 13, 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, P. 16.

92. Keim P., Van Ert M., Read T. et al. The evolution of B. anthracis subtypes from a B. cereus ancestor: VNTR and SNP for evolutionary analysis // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. P. 24.

93. Keim P., Solomon D., Huynh L. et al. Single nucleotide repeats (SNRs)thin the B. anthacis genome are highly mutable // Abstract Book. 5 International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 65.

94. Keim P., Van Ert M., Pearson T. et al. Anthax molecular epidemiology and forensis: using and appropriate marker for different evolutionary scales // Infect. Genet. Evol. 2004. - Vol. 4. - P.205-213.

95. Kilger C., Paabo S. Direct DNA sequence determination from total genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P.2032-2034.

96. Kim H.S., Sherman D., Johnson F., Aronson A. Characterization of a maior Bacillus anthracis spore coat protein and its role in spore inactivation // J. Bacterid. Apr 2004. - Vol. 186. - №8. - P.2413-2417.

97. Klichko, V. I., Miller J., Wu A. et al. Anaerobic induction of Bacillus anthracis hemolytic activity //Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 303. -P.855-862.

98. Koehler T., Ruhfel R.E., Green B.D., Therne B.C. // American Society for Microbiology: Annual Meeting. 86th: Abstract. Washington. - 1986 - P. 157.

99. Koehler T.M., Pasha R., Williams R.P. //General Meetingof Amer. Soc. Microbiol. Wachington. - 1992. - P. 46.

100. Koehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen: C02 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters // J. Bacteriol. 1994. - Vol.176. - P.586-595.

101. Koehler T.M. Bacillus anthracis genetics and virulence gene regulation // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - Vol.271. - P. 143-164.

102. Kristensen T., Nedelcheva-Kristensen V., Borresen-Dale A.-L. High throughput screening for known mutations by automated analysis of single sequencing reactions (SSR) // Bio Techniques. 1998. - Vol. 24. - P.832-835.

103. Kumar S., Tamura K., Nei M. Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment //Briefings in bioinformatics. -2004.-Vol. 5.-P. 150-163.

104. Kwok S., Kellogg D.E., McKinney N. et al. Effect of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies //Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - №4. - P.999-1005.

105. Lai E-M., Phadle N.D., Kachman T. et al. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis II J. Bacteriol. Feb. 2003. - Vol. 185.-№4. -P. 1443-1454.

106. Le Flèche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersinia pestis and Bacillus anthracis II BMC Microbiology. 2001., 1:2.

107. Leach, F. S., Nicolaides N. C., Papadopoulos N. et al. Mutations of a MutS homolog in hereditary non-polyposis colorectal cancer // Cell. 1993. - Vol. 75.-P. 1215-1225.

108. Leendertz F.H., Yumlu S., Pauli G. et al. A new Bacillus anthracis found in wild chimpanzees and a gorilla from West and Central Africa // PLoS Pathog. -2006.-Vol. 2.-Issue l:e8.

109. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenilate cyclate that increases cyclic AMP concentrations in eucaryotic cells // Proc. Acad. Sei. Us. -1982. Vol. 79. - P.3162-3166.

110. Leppla S.H. Anthrax toxins //In: Bacterial toxins and virulence factors in disease. Ed. Moss J., Iglevski B„ Vaughan M., Tu A.T. N.Y. 1995. - P. 543-572.

111. Levinson, G., Gutman G. A. Slipped-strand mispairing: mecha-nism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. - Vol. 4. - P.203-221.

112. Levinson, G., and Gutman G. A. High frequency of short frameshifts in poly-CA/GT tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12 //Nucleic Acids Res. 1987. - Vol. 15. - P.5323-5338.

113. Levy H., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. Identification of strain specific markers in Bacillus anthracis by random amplification of polymorphic DNA // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. -P. 64.

114. Lewis, R. J., Brannigan J. A., Offen W. A. et al. An evolutionary link between sporulation and prophage induction in the structure of a repressor: anti-repressor complex // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 283. - P.907-912.

115. Li W.H., Ellsworth D.L., Krushkal J. et al. Rates of nucleotide substitution in primates and rodents and the generation-time effect hypothesis // Mol. Phy-logenet. Evol. 1996. Vol. 5. - P. 182-187.

116. Lista F., Faggioni G., Valjevac S. et al. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci Multi Locus Variable-Number Tandem Repeats Analysis // BMC Microbiology. 2006. - Vol. 6. - P.33.

117. Little S.F., Novak J.M., Leppla S.H. et al. Characterization of lethal factor binding domains of protective antigen of Bacillus anthracis using monoclonal antibodies // Microbiology. 1995. - Vol. 142. - P.707-715.

118. Livak K.J. Allelic discrimination using fluorogenic probes and the 5' nuclease assay // Genet. Anal. 1999. - Vol. 14. - №5-6. - P. 143-149.

119. Lizardi P.M., Huang X., Zhu Z. et al. Mutation detection and single molecule counting using isothermal rolling circle amplification // Nat. Genet. -1998.-Vol. 19. №3. - P.225-32.

120. Luna V.A., King D.S., Peak K.K. et al. Bacillus anthracis virulent plas-mid pX02 genes found in large plasmids of two other Bacillus species // J. Clin Microbiol. 2006. - Vol. 44. - №7. - P.2367-2377.

121. Lyamichev V., Mast A.L., Hall J.G. et al. Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes // Nat. Biotechnol. 1999. - Vol. 17. - P.292-296.

122. Lysov I.U., Florent'ev V.L., Khorlin A. A. et al. Determination of the nucleotide sequence of DNA using hybridization with oligonucleotides // Dokl. Acad. NaukSSSR- 1988. Vol. 303. - №6.-P.1508-1511.

123. Maho A., Rossano A., Hachler A. et al. Antibiotic susceptibility and molecular diversity of Bacillus anthracis strains in Chad: detection of a new phyloge-netic subgroup // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - №9. P.3422-3425.

124. Makino S.J., Sasacawa C., Uchida I. Cloning and CO2 dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 1988. - Vol. 2. - №3. P.371-376.

125. Marras S.A., Kramer F.R., Tyagi S. Multiplex detection of single nucleotide variations using molecular beacons // Genet. Anal. Biomol. Eng. 1999. - Vol. 14. -P.151-156.

126. Mesnage S., Fouet A. Plasmid-encoded autolysinc in Bacillus anthracis: modular structure and catalytic properties // J. of Bacteriol. Jan 2002. - Vol. 184. -№l.-P.331-334.

127. Mignot, T., Mock M., Robichon D. et al. The incompatibility between the PlcR- and AtxA-controlled regulons may have selected a nonsense mutation in Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 42. - P. 1189-1198.

128. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1983. - Vol. 39. - P.371-376.

129. Mitas M. Trinucleotide repeats associated with human disease //Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P.2245-2253.

130. Nakamura, Y., Leppert M., O'Connell P. et al. Variable number of tandem repeat (VNTR) markers for human gene mapping // Science. 1987. - Vol. 235.-P. 1616-1622.

131. Nakamura, Y., Carlson M., Krapcho K. et al. New approach for isolation of VNTR markers // Am. J. Hum. Genet. -1988. Vol. 43. - P. 854-859.

132. Nishi J. S., Ellsworth T. R., Lee N. et al. An outbreak of anthrax (Bacillus anthracis) in free-roaming bison in the Northwest Territories, June-July 2006 // J. Can. Vet. 2007. - Vol. 48. - P. 37-38.

133. Nikiforov T.T., Rendle R.B., Goelet P. et al. Genetic bit analysis: a solid phase method for typing single nucleotide polymorphisms // Nucleic Acids Res. -1994.-Vol. 20.-P. 4167-4175.

134. Nurmi J., Ylikoski A., Soukka T. et al. A new label technology for the detection of specific polymerase chain reaction products in a closed tube // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - № 8. - P. 28.

135. Okamoto Y., Nagano H. Detection ofp53 gene mutations in its full trans-lational sequence by cleavase fragment length polymorphism analysis // Ann. Clin. Biochem. 1999. - Vol. 36. - P. 511-513.

136. Okamoto T., Suzuki T., Yamamoto N. Microarray fabrication with cova-lent attachment of DNA using bubble jet technology // Nat. Biotechnol. 2000. -Vol. 18.-P. 438-441.

137. Okinaka R., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence, assembly and analysis pXOl and pX02 // Abstract Book. 3 rd International Conference on Anthrax, University of Plymouth, 7-10th September 1998. P18.

138. Okinaka, R. T., Cloud K., Hampton O. et al. Sequence and organization of pXOl, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacterid. 1999. - Vol. 181. - P. 6509-6515.

139. Okstad, O. A., Gominet M., Purnelle B. et al. Sequence analysis of three Bacillus cereus loci carrying PlcR-regulated genes encoding degradative enzymes and enterotoxin // Microbiology. 1999. - Vol. 145. - P. 3129-3138.

140. Orti, G., Pearse D. E., Avise J. C. Phylogenetic assessment of length variation at a microsatellite locus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. -P. 10745-10749.

141. Pastinen T., Partanen J. Syvanen A.-C. Multiplex fluorescent solidphase minisequencing for efficient screening of DNA sequence variation // Clin. Chem. -1996.-Vol. 42.-P. 1391-1397.

142. Plaschke J., Voss H., Hahn M. et al. Doublex sequencing in molecular diagnosis of hereditary diseases // Bio Techniques. 1998. - Vol. 24. - P. 838-841.

143. Pomerantsev, A. P., Staritsin N. A., Mockov Y., Marinin L. I. Expression of cereolysine AB genes in Bacillus anthracis vaccine strain ensures protection against experimental hemolytic anthrax infection // Vaccine. 1997. - Vol. 15. -P.1846-1850.

144. Pomerantsev A.P., Kalnin K.V., Osorio M., Leppla S. H. Phosphatidyl-choline-specific phospholipase C and sphingomyelinase activities in bacteria of the Bacillus cereus group // Infect, and Immunity. Nov. 2003. - P.6591-6606

145. Preisz H. Zbl.Bakt., 1908 (1 Abt. Orig.)-47.-585.

146. Price L.B., Hugh-Jones M., Jackson P.J., Keim P. Genetic diversity in the protective antigen gene of Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. -№.8. - P.2358-2362.

147. Qi Y., Patra G., Liang X. et al. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis II Appl. and Envir. Microbiology. Aug. 2001. - Vol. 67. - №8. - P. 3720-3727.

148. Radnedge L., Argon P.G., Hill K.K. et al. Genome differences that distinguish Bacillus anthracis from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis II Appl. and Environ. Microbiology. May 2003. - Vol. 69. - №5. - P. 2755-2764.

149. Ramisse V., Patra G., Vaissaire J., Mock M. The Ba813 chromosomal DNA sequence effectively traces the whole Bacillus anthracis community // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 87. - P. 224-228.

150. Ravel J., Gajer P., Pop M. et al. Bacillus anthracis comparative genomics applied to SNP discovery // Abstract Book. 5th International Conference on Anthraxio Nice, France, 2003. - P. 50.

151. Read T.D, Salzberg S.L., Pop M. et al. Comparative genome sequencing for discoveiy of novel polymorphism in Bacillus anthracis II Science. 2002. -Vol. 296. - P.2029-2023.

152. Read T., Fräser C. Bacillus anthracis genomics // Abstract Book. 5th International Conference on Anthraxio Nice, France, 2003. - P. 20.

153. Read T.D., Peterson S.N., Tourasse N. et al. The genome sequence of Bacillus anthracis Ames and comparison to closely related bacteria // Nature. -May, 2003. Vol. 423(6935). - P. 81-86.

154. Richardson, T., Cato S., Ramser J. et al. Hybridization of microsatellites to RAPD: a new source of polymorphic markers // Nucleic Acids Res. 1995. -Vol. 23. - P. 3798-3799.

155. Roloff H., Glockner P., Mistele K., Bohn R. The taxonomic relationship between B.anthracis and the B.cereus group, investigated by DNA-DNA hybridization and DNA amplification fingerprinting (DAF) // Salisbury Medical Bulletin:

156. Proceedings of the International Workshop on Anthrax, Winchester, England, September 19-21,1995, Special Supplement. 1996. - №87. - P.38-40.

157. Rosche, W. A., Trinh T. Q., Sinden R. R. Differential DNA secondary-structure-mediated deletion mutation in the leading and lagging strands // J. Bacterid. 1995. - Vol. 177. - P. 4385-4391.

158. Rosche, W. A., Jaworski A., Kang S. et al. Single-stranded DNA-binding protein enhances the stability of CTG triplet repeats in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 5042-5044.

159. Ruano G., Kidd K.K. Coupled amplification and sequencing of genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. Vol. 88. - P. 2815-2819.

160. Ruhfel R.E., Robillard N.J, Therne C.B. Interspecies transduction of plasmids among Bacillus anthracis, B. cereus and B. thuringiensis II J. Bacteriol. -1984.-Vol. 157.-P. 2263-2266.

161. Sachadyn P., Stanislawska A., Kur J. One tube mutation detection using sensitive fluorescent dyeing of MutS protected DNA // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - №8 :E36.

162. Salamitou, S., Ramisse F., Brehelin M. et al. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects // Microbiology. 2000. - Vol. 146. - P. 2825-2832.

163. Sapolsky R.J., Hsie L., Berno A. et al. High throughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays // Genet. Anal. Biomol. Eng. 1999. - Vol. 14. - P. 187-192.

164. Schumm J.W., Knowlton R.G., Braman J.C. et al. Identification of more than 500 RELPs by screening random genomic clones // Am. J. Hum. Genet. -1988.-Vol. 42.-P. 143-159.

165. Shangkuan Y.H., Chang Y.H., Yang J.F. et al. Molecular characterization of Bacillus anthracis using multiplex PCR, ERIC-PCR and RAPD // Lett. Apll. Microbiol. 2001. - Vol. 32. - №3. - P. 139-145.

166. Shangkuan Y.H., Chang Y.H. Nucleotide sequence analysis of groEL of

167. Bacillus anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, and B. mycoides II Abstract Book, th

168. International Conference on Anthrax, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA, June 10 13, 2001. - P.20-B.12B.

169. Shannon J. G., Ross C. L., Koehler T. M., Rest R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71. - P. 3183-3189.

170. Shin H.J., Seong W.K., Chun J.H., Oh H.B. Characterization of genetic diversity within Korean Bacillus anthracis isolates using Multiple-Locus VNTR Analysis // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003.-P. 53.

171. Silman N., Bramhill E., Hudson M. et al. Development of diagnostic mi-croarrays for the detection and typing of Bacillus anthracis II Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France, 2003. - P. 52.

172. Singh Y., Klimpel K.R., Arora N. et al. The chymotrypsin sensitive site, FFD315, in anthrax toxin protective antigen is required for translocation of lethal factor // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - № 46. - P. 29039 -29046.

173. Singh Y., Chaudhary V.K., Leppla S.H. A deleted variant of Bacillus anthracis protective antigen is non-toxic and blocks anthrax toxin action in vivo // J. Biol. Chem. Nov, 1989. - Vol. 264. - № 32. - P. 19103-19107.

174. Skaar E.P., Gaspar A.H., Schneewind O. Bacillus anthracis IsdG, a heme-degrading monooxygenase // J. Bacteriol. Feb, 2006. - Vol. 188. - № 3. - P. 1071-1080.

175. Slamti, L., Lereclus D. A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group // EMBO J. 2002. -Vol. 21.-P. 4550-4559.

176. Slamti L., Perchat S., Gominet M. et al. Distinct mutations in PlcR explane whysome strains of the Bacillus cereus group are nonhemolytic //J. of Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - №11. - P. 3531-3538.

177. Smith J., Modrich P. Mutation detection with MutH, MutL and MutS mismatch repair proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - №9. -P. 4374-4379.

178. Smith K.L., De Vos V., Bryden H. et al. Bacillus anthracis diversity in KrugerNational Park// J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P.3780-37784.

179. Snyder M.P., Kimbrell D., Hunkapiller M. A transposable element that splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - Vol. 79. - №23. - P.7430-744.

180. Sokolov B.P. Primer extension technique for the detection of single nucleotides in genomic DNA // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P.3671.

181. Song J., Xie G., Myers G. et al. The LANL threat pathogens database: facilitating comparative genomics of Bacillus anthracis neighbors // Abstract Book. 5th International Conference on Anthrax. Nice, France. - 2003. - P. 51.

182. Steichen Ch., Kearney J., Tornbough C.L. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium // J. of Bacteriol. Mar. 2003. - Vol. 185. -№5. - P. 1903-1910.

183. Strand, S., Prolla T. A., Liskay R. M., Petes T. D. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair // Nature. 1993. - Vol. 365. - P. 274-276.

184. Sue D., Marston C.K., Hoffmaster A.R. et al. Genetic diversity in a Bacillus anthracis historical collection // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. -№6. -P, 1777-1782.

185. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium // Mol. Microbiol. Vol. 45.-P. 169-178.

186. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. Polymorphism in the collagenlike region of the Bacillus anthracis BclA protein leads to variation in exosporium filament length // J. of Bacteriol. Mar. 2003. - Vol. 185. - №5. - P. 1555-1563.

187. Sylvestre P., Couture-Tosi E., Mock M. Contribution of ExsFA and ExsFB proteins to the localization of BclA on the spore surface and to the stability of the Bacillus anthracis exosporium // J. of Bacteriol. Aug 2005. - P. 5122-5128.

188. Syvanen A.-C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms // Hum. Mutat.- 1999.-Vol. 13.-P. 1-10.

189. Tain G.Z., Hai R., Yu D.Z. et al. Use of variable-number tandem repeats to examine genetic diversity of Bacillus anthracis II Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. Aug. 2006. - Vol. 27. - №8. - P. 712-715.

190. Tanquay R. M. Transcriptional activation of heat-shok genes in eukaryo-tes // Biochem. Cell. Biol. 1988. - Vol. 66. - P. 584-593.

191. Teska J.D., Allan C.M., Redus S.L. et al. Identification of Bacillus anthracis using MIDI whole cell fatty acid analysis // Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax. June 10-13, 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA.-P. 15.

192. Tippets M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: calmodulin-dependent adenylate cyclase // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - №5. - P. 2263-2266.

193. Thibodeau S. N., Bren G., Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon // Science. 1993. - Vol. 260. - P. 816-819.

194. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis II Ann. N.Y. Acad. Sci. 1960. - Vol.88. - №6. - P. 1024-1033.

195. Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus and Bacillus anthracis II Bact. Rev. 1968. - Vol. 32. - P. 358-361.

196. Thorne C.B. Transducing bacteriophage for Bacillus cereus II J. Virol. -1968.-Vol. 2.-P. 657-662.

197. Thorne C.B., Holt S.C. Cold lability of Bacillus cereus bacteriophage CP-51 // J. Virol. 1974. - Vol. 14. - P. 1008-1012.

198. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis. In: Leive L., Bonventre P.F., Morello J.A. and Wu H.C. (ed.). Microbiology. - 1985, American Society for Microbiology, Washington D.C.

199. Thorne C.B. Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria // American Society for Microbiology. 1993. - P. 113-114.

200. Tippets T.M., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin dependent adenylate cyclase // J. Bacteriol. - 1988. - Vol. 170. - № 5. - P. 2263-2266.

201. Tito B.J., Poff. H.E., Novotny M.A. et al. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection // Clin. Chem. 1998. - Vol. 44. - P. 731-739.

202. Todd S.J., Moir A. J., Johnson M.J., Moir A. Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium //J. Bacteriol. Jun. 2003. - Vol. 185. - № 11. - P. 3373-3378.

203. Turnbull P.C.B., Hutson R.A., Ward M.J. et al. Bacillus anthracis but not always anthrax // J. Appl. Bact. 1992. - Vol. 72. - P. 21-28.

204. Uchida I., Sekizaki T., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. -1985. Vol. 131.-№2.-P. 363-367.

205. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 Mda and 60 Mda plasmids // J.Gen.Microbiol. 1986. - Vol.132. - P.557-559.

206. Uchida I., Hornung J.M., Thorne C.B. et al. Cloning and characterization of gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J. Bacteriol. 1993. - Vol.175. - № 17. - P.5329-5338.

207. Uchida I., Makino S., Terakado N. Cross-talk to the genes for Bacillus anthracis by atxA, gene encoding the trans-activator of anthrax toxin synthesis // Mol. Microbiol. -1997. Vol.23. - № 6. - P.1229-1240.

208. Van Belkum, A., Scherer S., Van Leeuwen W. et al. Variable number of tandem repeats in clinical strains of Haemophilus influenzae II Infect. Immun. -1997.-Vol. 65. P.5017-5027.

209. Van der Auwera G., Mohillon J. TnpXOl, a germination-associated class II transposon from Bacillus anthracis II Plasmid. May. 2005. - Vol. 53. - № 3. -P.251-257.

210. Van Ert M.N., Easterday W.R., Huynh L.Y. et al. Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis // PLoS ONE 2(5): e461. doi:10.1371/journal.pone.0000461

211. Van Ham, S. M., Van Alphen L., Mooi F. R., Van Putten J. P. M. Phase variation of H. influenzae fimbriae: transcriptional control of two divergent genes through a variable combined promoter region // Cell. 1993. - Vol. 73. - P.1187-1196.

212. Vetter S.M., Shlievert P.M. Glycerol monolayram inhibits virulence factor production in Bacillus anthracis //Antimicrobial agents and chemotherapy. -Apr. 2005. -Vol. 49. №4. - P. 1302-1305.

213. Vierti N. J., Marrero R., Hoover T. A., Welkos S. L. Identification and characterisation of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis II Gene. -1995. -Vol. 152. № 1. - P.l-9.

214. Vogler A. P., Purvis A. Comparative method and evolution // EXS. -2002. -Vol. 92. P.225-236.

215. Vos P., Hogers R., Bleeker M. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting // Nucleic Acids Res. 1995. -Vol. 23. - P.4407-4414.

216. Waldor, M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXphi are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. -Vol. 24. - P.917-926.

217. Wallace R.J. Digestion of rumen bacteria in vitro // Br. J. Nutr. Jan. 1983. -Vol. 49. -№ l.-P. 101-108.

218. Walt D.R. Bead based fiber optic arrays // Science. 2000. -Vol. 287. -P.451-452.

219. Wang B., Smith K.L., Keys C. et al. Molecular epidemiology of BacillusxLanthracis in China // Abstract Book. 4 International Conference on Anthrax, -June 10 -13, 2001. St. John's College, Annapolis, Maryland, USA. - P.M.

220. Welkos S.L. Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (pXOl") Bacillus anthracis II Microb. Pathog. 1991. -Vol. 10. - P.183-198.

221. Welkos S.L, Vietri N.J, Gibbs P.H. Non-toxigenic derivatives of the Ames strain of Bacillus anthracis are fully virulent for mice: role of plasmid pX02 and chromosome in strain-dependent virulence. // Microb. Pathog. 1993. Vol. 14. - P.381-388.

222. Welsh, J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P.7213-7218.

223. Williams J. K., Kubelik A. R., Livak K. J. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. -1990.-Vol. 18.-P.6531-6535.

224. Wood, H. E., Devine K. M., McConnell D. J. Characterization of a repressor gene (xre) and a temperature-sensitive allele from the Bacillus subtilis prophage, PBSX // Gene. 1990. - Vol. 96. - P.83-88.

225. Xu Y., Kool E.T. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA automation reaction // Nucleic Acids Res. 1999. - Vol. 27. - № 3. - P.875-881.

226. Yager T.D., Baron L., Batra R. et al. High performance DNA sequencing and the detection of mutations and polymorphisms on the Clipper sequencer // Electrophoresis. 1999. - Vol. 20. - P.1280-1300.

227. Yelton D.B., Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus by each of two bacteriopiohages // J. Bact. -1970. Vol. 102. - P. 573-579.

228. Zhu K.Y., Clark J.M. Addition of a competitive primer can dramatically improve the specificity of PCR amplification of specific alleles // Biotechniques. -1996. Vol. 21. - № 4. - P.586-590.

229. Zinser G., Schupp J.M., Keim P. Identification of novel VNTR loci in Bacillus anthracis II Abstract Book. 2nd International Workshop on the molecular biology of B.anthracis, B.cereus, B.thuringiensis, August 11-13, Taos, New Mexico, USA.- 1999. -P.61.

230. Zinser G., Solomon D.L., Miller S. et al. Mutation rate estimates for VNTR regions in Bacillus anthracis II Abstract Book. 4th International Conference on Anthrax, June 10-13 2001, St. John's College, Annapolis, Maryland, USA. -P.28-B.17A.