Конструирование фотоаффинных реагентов для использования комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот: Производные d(NTP), несущие перфторазидоарильные группы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Сафронов, Игорь Викторович

• Сафронов, Игорь Викторович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Сафронов, Игорь Викторович

Список сокращений

Введение 6

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. 8-49 Фотоаффинные реагенты для сайт-специфичной модификации комплексов матричнозависимого синтеза ПК.

1» 1, Основные нуклеотиды НК как фотоаффинные реагенты

1.1.1. Фотохимические свойства гетероциклов, нукяеозидов и нуклеотидов НК

1.1.2. Урацил, тамин и их производные

1.1.3. Цкгозин и его производные

1.1.4. Аденин и его производные

1.1.5. Фотоаффинная модификация белков производными гетероциклических оснований

1.2. 4-Тиоуридин и другие тионуклеозиды

1.2.1. Исследования фотохимических реакций тионуклеотвдов в растворах

1.2.2. Реакции тионуклеотидов в составе макромолекулярных комплексов

1.3. 5-Галоидпиримиднны

1.3.1. 5-Бромурацил (5-Вг-ига)

1.3.2. 5-Иодуридин (5-1-игф и 5-иодцитидин (5-1-Су<1)

1.3.3. Параметры, определяющие эффективность получения фотосшивок в составе белково-нуклеиновых комплексов с помощью галоид-пиримцдинов

1.4. Ароматические азиды

1.4.1. Общие фотохимические свойства ароматических азидов

1.4.2. Реакции ароматических азидов в составе макромолекулярных комплексов

1.4.3. Азидонуклеозиды

1.4.4. Ароматические азиды, присоединенные к основаниям НК через спейсеры

1.4.4.1. 4-Азвдобензоильная группа

1.4.4.2. 4-Азидофенацильная группа

1.4.4.3. 5-Азщо-2-нитро-бснзоильная группа

1.4.4.4. Перфторированныс арилазидные группы

1.4.4.5. Другие арилазидные группы

1.5. Фотоактивные группы - предшественники карбенов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование фотоаффинных реагентов для использования комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот: Производные d(NTP), несущие перфторазидоарильные группы»

Аффинные реагенты на основе Ат-Из активно используются для сайт-специфичной модификации комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот на протяжении последних 20 лет [1-5]. При облучении УФ и видимым светом с высоким квантовым выходом (ф — 0.1-1.0) происходит фото диссоциация (фотолиз) Аг-Ыз с образованием N2 и синг летного ароматического нитрена (Аг^Ы). Среди Аг-Ы3 перфорированные ароматические азиды (¥Аг-N3) наиболее перспективны для применения в фотоаффинных реагентах. Введение электроноакцепторных атомов фтора в о- и о'- положения к азидо группе резко увеличивает реакционную способность образующегося при фотолизе арилнитрена и предотвращает нежелательные внутримолекулярные перегруппировки [8-10]. Поэтому использование РАг-Ы3 позволяет точнее локализовать положение фотоаффнных реагентов в составе макромолекулярного комплекса к моменту облучения. Однако, низкая чувствительность к ближнему УФ свету широко используемых перфторированных 4-азидобензильных и 4-азидобензоильных групп (БАВг) не позволяет их применять для исследования биологических систем т у:уо и чувствительных к УФ свету иакромолекулярных комплексов т \ntro. Чтобы преодолеть это ограничение, необходимо повысить чувствительность ЕАг-Мз групп к ближнему УФ и, желательно, к видимому свету.

Замена РАВг групп на /гари-азидотетрафторбензилиденовые (РАВс!) являегся одним из способов резко увеличить чувствительность фотоаффинньгх реагентов к ближнему УФ свету без существенной потери реакционной способности. БАБс! группы успешно применены в составе олигонуклеопздных конъюгатов для фотоаффннного мечения белков, специфически узнающих НК [11] и сайт-специфичной фотомодификацни НК в комплементарных комплексах [12]. Кроме того, были сконструированы бинарголе системы олигонуклеотидных копью гагов. несущих остатки РАг-Ыз и сенсибилизатора. При сближении фотореагента и сенсибилизатора за счет комплементарных взаимодействий связанных с ними олигонуклеотидов на онДНК, формируется фотореакционноспособный центр, в котором может происходить поренос энергии с фотовозбужденного сенсибилизатора на РАг-М.( 1руппу. К настоящему времени описаны несколько бинарных систем для сенсибилизированной фотомодификацни онДНК |13-18]. Одна из таких бинарных систем, содержащая 4азидотетрафторбензилиденгидразтюкарбонилысую »руппу (Р'АВс1-НСЬ), была использована для фотоаффинной модификации регуляторных белков гена цитохрома Р-450 ВааНш те$а1епит []9|.

Для фото аффинной модификации комплексов матрично-зависимого синтеза НК широко применяются производные (d)NTP. Фрагменты (d)NTP могут быть использованы как в качестве аффинных групп, так и для введения соответствующих фотоактивных аналогов (d)NMP в НК ферментами in situ. Способ присоединения (d)NTP к фотоактивной группе может существенно влиять на субстратные свойства фогоаффинного реагента. В частности, способность включаться в качестве dTTP была обнаружена для экзо-К-[2-(4-азидотетрафторбензоиламино)-этил]-2'ч1СТР при использовании синтетических праймер-матричных систем и HTV1-RT [20]. Одной го причин этого явления могло быть вызванное введением заместителя в "^-положение смещение тдутомерного равновесия Cyd от енамино к кетимино форме. Последняя по своей электронной структуре напоминает Urd. Для проверки этого предположения в качестве аффинных остатков были выбраны производные 1N-(2-аминоэтил)-(^)СТР, находящиеся преимущественно в енамино форме, а также производные 4К-(4-ашгнооксибутилокси)-^)СТР и 4МЧ4-пщразидобут11лкарбамил)-^)СТР у которых таутомерное равновесие сдвинуто к кетимино форме [21]. В качестве аффинного остатка был выбран также у-амид А IT. Производные у-амндов A'IT используются РНК полимеразами в качестве инициирующих субстратов и, поэтому, наиболее удобны для исследования контактов компонентов транскрипционных комплексов с 5'-концевой трифосфатной группой синтезируемой РНК.

Цель данного исследования состояла в разработке реагентов для сш1т-специфичной фотомодификации комплексов матрично-зависимого синтеза НК на основе перфторированых лара-азидобензилиденовых групп и производных (d)NTP.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Синтезировать и охарактеризовать производные (d)NTP, несущие FABd, FABz и NABz 1руппы, а также фотосенсибилизатор - гидразон 9-aiпраценалъде1 ида.

2. Сравнить основные фотохишгческне свойства полученных производных (d)N'IT.

3. Оценить элонгирующие субстратные свойства фотоакгивных производных dC'IP при использовании ферментов матрично-зависимого синтеза ДНК.

4. Сравнить эффективность и селективность фотоаффинной модификации белков комплексов матр!гчно-зависимого синтеза НК при использовании FABd, FABz и NABz производных (d)CTP.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Сафронов, Игорь Викторович

ВЫВОДЫ

1. Впервые синтезировано и охарактеризовано 13 производных (d)CTP по экзо-И-положению и A TP по у-фосфату, несущих 4-азадотетрафтор-бензилиденаминоокси-, 4-23идотетрафторбегоилиденгидразинокарбонильные, 4-азидотетрафтобензоиламино- и 2-нитро-5-азидобензоиламино- группы.

2. Показано, что производные (d)CTP, несущие 4-азидотетрафторбензилиден-аминоокси- и 4-азидотетрафторбегоилиденгидразтшокарбонильные группы, более фотоактивны чем 4-азидотетрафтобензоиламино- производные при облучении УФ светом с X ~ 313 нм в 25 и 50 раз, а при облучении УФ светом с X ~ 365 нм в 4 и10 раз.

3. Показано, что введение фотореакционноспособных групп по экзоциклической аминогруппе (d)CTP не вызывает потери элонгирующих свойств в реакции матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот. Впервые показано, что направленная модификация экзоциклической аминогруппы dCTP, приводящая к сдвигу таутомерного равновесия от енамино к кетимино форме, позволяет получать аналоги, имитирующие dTTP.

4. Представленные данные о фотохимических и субстратных свойствах фотоактивных аналогов (d)CTP, а также результаты фотоаффиного мечения ряда ферментов репликации показал, что применение 4-азидотетрафтор-бешилцценовых групп перспективно для фотоаффинной модификации комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот при облучении ближним УФ светом.

1.6. Заключение

К настоящему времени определилось несколько областей в структурно-функциональных исследованиях комплексов матрично-зависимого синтеза ДНК и РНК, в которых находит применение метод фотоаффинной модификации. Наиболее общая -определение белков, контактирующих с НК в природных клеточных структурах. Для этой цеди проводится фотолиз целостных природных комплексов in vitro и in vivo жестким УФ слетом, в том числе с помощью лазеров. Кроме того, часть природных нуклеотидов НК заменяется фотоактивными аналогами с помощью собственной полимеразной активности in situ или при выращивании клеток на средах, содержащих эти аналоги. В этом случае обычно применяются фото активные производные нуклеозидов, имеющие минимальные стерические отклонения и малотоксичные для клеток - в4-(с1)иг<3, Вг-(1-) (с1)игд, 1-<б)СуА

Исследование снквенс-специфичных взаимодействий налагает ряд ограничений и требований к свойствам фотоактивируемых групп. Необходимо исключить фотоиндуцированные реакции белков и нуклеиновых кислот, которые могут проходить при наличии стэкинг взаимодействий нуклеиновых оснований с ароматическими АК даже при освещении УФ-светом сХ> 290 нм. Подход, основанный на использовании групп, фстеяшуюадихся при облучении коротковолновые УФ-свсгсж с зыссжкк квантовый шодок ограничен и малоперспекшвен. Более перспективно использование фотоактшных групп, которые можно селективно возбуждать ближним УФ и видимым светом. При исследовании комплексов матрично-зависимого синтеза НК определенные успехи бьиш достигнуты при использовании 84-Цг<1, азидонуклеотидов, Аг-Ыз, присоединенных к нуклеотидам через спенсеры и, в самое последнее время З-трифторметил-З-арилдиазиршюв.

Применение фотоаффинной модификации для исследования трехмерного строения активных центров и систем белково-нуклеиновых взаимодействий добавляет к выше перечисленным еще ряд более жестких, часто исключающих друг друга требований. Необходимо, чтобы эффективность пришивки была высокой и её устойчивости было достаточно для проведших последующего анализа. С этой точки зрения хорошо себя зарекомендовали арилазиды. Кроме того данные по исследованию мембранных систем позволяют предположить применимость для этой цели ароматических диазиринов.

Исходя из изложенных данных можно сделать некоторые выводы о возможности применения рассмотренных фото активных групп дм сайт-специфической фотоаффинной модификации. Из природных нуклеозидов только дам уридина и тимидина позволяют получать полезную информацию о устройстве нуклеотад-связывающих структур ферментов матрично-зависимого синтеза НК. Причем при использовании УФ света с \> 300 нм можно селективно выявлять плотные контакты нуклеиновых оснований с ароматическими аминокислотами.

Примерно такими же свойствами обладают галоид-пиримидины, но их можно возбуждать светом, где практически не поглощают белки и НК. Поэтому их можно использовать для сайт-специфической модификации и в составе НК.

Тио-нуклеотиды позволяют получать полезную информацию о структуре много-субъединичных белково-нуклеиновых комплексов, но для исследования структур активных

49 центров имеют ограниченную ценность, так как пока не удалось идентифицировать АК-остатки, по которым проходит пришивка.

Аг-Из позволяют получать полезную информацию как о субъединичном строении полимеразных комплексов, так и о строении каталитических активных центров и сайтов связывания нуклеотидов и НК. Однако при интерпретации полученных данных необходимо учитывать специфические фотохимические свойства конкретных Аг-Из.

Арилдиазирины по своим фотохимическим свойствам близки к Аг-Ы3 и, особенно, Прямое сравнение результатов по фотоаффижой модификации шюгосубъеданичного комплекса РНК полимеразы Ш (120) показало, что арилдиазирины не уступают, а в некоторых случаях, и превосходят возможности арилазндов по выявлению слабых белково-нуклеиновых контактов. Данных по идентификации АК или пептидов, участвующих в формировании активных центров обнаружить не удалось, однако достаточно высокий выход фотопришивки, и его чувствительность к присутствию прайм ер-матриц может служить предпосылкой получения полезных данных и в этой области исследований.

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 2.1 Синтез фотоактивных аналогов (d)NTP.

2.1.1. N-Экзо-замещенные фото активные производные (d)CTP.

Фотоактнвные N-экзо производные dCTP: экзо-М-[2-{4-азндо-2,3,5,6-тетрафторбензоиламино)-этил]- (1а), экзо-Ы-[2-(2-Ниггро-5-азчдо6ензоиламино)-зтил]- (2а), зкзо-Ы-[2-<4-Азидо-2,3,5,6-тетрафторбеюшшден-амштооксзиметилкарбами^ (За), экзо N-[4 -(4-азидо-2,3,5,6, -тетрафторбетидиден~ам№1(юкси)-бутлокси]- (11а), 3K30-N-[4-(4-A3H40-2,3,5,6,-теч>афторбетилвден-щцр^ (14а)

2'-дезокси1ретидин-5'-трифосфаты, соответствующие рибо-производные lb, 2b, 3b, lib, 14b и сенсибилизатор экзо-М-{ 1 -[(Антрщен-9-металенгидразгаю)-адига1Л-6]-амино}-2'-дезоксицищцин-5'-трифосфат (15) получали по двухстадийной схеме (рис. 19). Сначала экзоциклическую амино группу (d)CTP замещали на линкеры, содержащие свободные функциональные группы, по которым затем вводили фотореакционноспособные группы или сенсибилизатор.

На первой стадии экзоциклическую аминогруппу (d)CTP замещали на EDA, СЦ4-амино<жсибугал)шдроксиламин (9) и дигидразид адипиновой кислоты (13). На второй стадии ацилировали полученные на первой стадии жзо-Н<2-аминоэтил>2'-дезоксицитндин-5'-трифосфат (4а) и его рибо-аналог 4Ь по введенным алифатическим аминогруппам N-оксисукцинимидными эфирами 4-азидотетрафторбензойной (5), 5-азидо-2-нитро-бензойной (6) и 4-азидотетрафторбензилиденаминооксиуксусной (7) кислот. Для экзо-Н-(4-аминооксибутилокси)-2,-дезоксицитидин-5'-трифосфата (8а), экзо-Ы-(4-гидразндо-бутилкарбамил )-2'-дезокситдггидин- 5' -трифосфата (12а) и их рибо-аналоге в 8Ь и 12Ь проводили конденсацию с 4-азидотетрафторбензальдегидом (10). При получении сесибилизатора 15 проводили конденсацию гидразида 12а с 9-анграценальдегидом (16).

Вводимые на первой стадии линкеры различаются по своим конформационным и физико-химическим характеристикам. Первый - аминоэтильный линкер (производные 1а и 2а) имеет достаточную длину и гибкость, чтобы не блокировать Уотсон-Криковские комплементарные взаимодействия. Второй - 2-(аминооксиметилкарбо1 шл)аминоэтильный линкер (соединение За) существенно длиннее, но содержит жесткий плоский амидный фрагмент между двумя подвижными участками. Третий и четвертый линкеры (производные 11а и 14а) имеют достаточно дтинный и гибкий тетрамстиленовый фрагмент.

2а-74% 2Ь-7б%

Jij HU* J^J râb ^ ppp(tií¿ib ■NH I ppp(d)Rib

4â-78% 4fe-53%

JL ft Я ff ppp(d)Rib в о—p-o-p-o—P-o-¿' ó" ô"

HO OH (H)

M1H m

12а-40% Ufe-43% I ppp(d)Rib t h

14a-77% 14b-55% ppp{d)Rlb

IS hih 9

Ж.ца-70% oXJ lLb-70% ppp(d)Aib

15-54%

Рис. 19. Общая схема синтеза N-экзо- замещенных производных 2'-дезоксирибо и рибо СТР.

Кроме того, увеличение электроноакцепторных свойств экзоциклического заместителя Суй в ряду -№12 < -ЫН-А1к < -ЫН-ОА1к ~ -ЫН-МН-СО-АГк приводит к смещению таутомерното равновесия основания цитозина от енамино к кетимино форме [21]. Последняя напоминает структуру уридина, что теоретически позволяет образовывать комплементарные водородные связи с аденозином (рис. 20). Подобный эффект наблюдался для экзо-н-(0-метил1ндроксиламш1о)цитадина в составе днДНК [145] и, поэтому, можно ожидать увеличения характерных для (фТТР субстратных свойств при ферментативной матрично-зависимой элонгации трифос фатами 11 и 14.

Рис. 20. Образование комплементарных пар в составе днДНК Ы-экзо замещенными производными (1СТР в енамино и кетимино форме.

Ввести заместитель по экзо-Ы-положенюо Cyd в одну-две стадии можно нуклеофильным замещением экзоциклической аминогруппы на аминопронзводные. Эта реакция протекает в слабокислой среде при действии сильных нуклеофильных групп, таких как алкилгидразины [21], гидразиды карбоновых кислот [146-149] и О-замещенные гидроксиламины [21, 150-153]. При этом проходят параллельные реакции присоединения по С5=С6 связи и ряд неизученных процессов. Для замещения экзо-Ы-аминогруппы на алкиламино или ариламино необходимо предварительно увеличить электрофильность С4-атома Cyd. Это можно сделать двумя способами. Введение по экзоциклической аминогруппе электроноакцепторных арил- или алкилсульфонильных групп действием соответствующих сульфохлоридов, позволяет резко увеличить электрофильность С4-атома и получить более хорошую уходящую группу [154, 155]. Этот метод применяется при получении защищенных аналогов мононуклеотидов дня олигонуклеотидного синтеза. H G I 1

2.1.2. Переаминирование (d)CTP этилендиамином, 0-(4-аминооксибутл)-гидроксиламином и дигидразидом адипиновой кислоты.

Насыщение связи С5=С6 позволяет более мягко поднять электрофильность атома С4 цитозина. Для этой цели лучше всего подходит бисульфит-анион, который обратимо присоединяется по связи С 5=С6 пиримидинов в слабокислых рН

Бисульфитный аддукт (d)CTP не устойчив. Поэтому замещение аминогруппы различными аминами проводят у получаемого in situ 6-сульфо-5,6-дигидрогфоизводного (d)CTP (рис. 21). Механизм этой реакции хорошо изучен [156-160].

МН ЛpppdRib нр Hso3

-HSC>3

NHj ЛpppdRib "^fc u I so3" pppdRib и

HS03- ^ 1 oX) HS03I pppdRib

Рис. 21. Бисульфит-катализируемое нуклеофильное замещение экзоциклической аминогруппы dCTP.

Переаминирование гидразидами карбоновых кислот и О-алкилщдроксиламинами в присутствии бисульфита проходит в более мягких условиях, быстрее и с большим выходом, по сравнению с прямыми методами [161-163]. Однако образующиеся бисульфнтные аддукты продуктов переаминирования (d)Cyd стабильны. Бисульфнтные аддукты гидразидов 12 удается разрушить только длительным выдерживанием при рН - 10-11, не выделяя из реакционной смеси или с помощью специфической фосфат-катализируемой реакции после предварительного отделения от избытка бисулы[итта как это описано для соответствующего производного семикарбазида [163]. Бисульфтные аддукты продуктов переаминирования Суё и СМР О-алкилщдроксиламинами описаны как стабильные до рН 13 [161, 162].

Бисульфит-катализируемое переаминирование можно проводить в водных растворах. При этом ж требуется защищать другие функциональные группы нуклетидов и реакцию можно проводить в составе однонитчатой НК и ^)СТР. Прямое и бисульфит-катализируемое переаминирование было использовано для введения бнотиновых, флуоресцентных и гашенных меток в производные (d)CTP, а также в одно- и двух-нитчатые ДНК [164-171].

Экзоциклическую аминогруппу у получаемого in situ 6-сульфо-5,6-дигидрог фоизводного (d)CTP замещали на 2-аминоэтиламино группу действием EDA при рН 6.2. Как было отмечено в работах [158, 159], критическим фактором для успешного проведения этой реакции является качество используемого бисульфша. При использовании нами препаратов Na2S205 квалификации "чда" из разных партий, состав реакционной смеси через 24 часа сильно отличался. В лучшем случае она содержала 90% 4, 8% СТР и 2% CDP, в худшем 6-7 продуктов с близким соотношением. Наименьший выход побочных продуктов и высокая воспроизводимость результатов получались только при использовании растворов Na^SOj, оттитрованных 1 M раствором НС1 до требуемой рН сразу перед реакцией. Оптимальные концетрации компонентов реакционной смеси: 2. 5-3.0 M EDA и 0.4-0.5 M бисульфита Na при рН 5.5-6.2. В этих условиях реакция протекает на 90% за сутки при деградации трифосфатного остатка нуклеотида на 2-3 %. Для увеличения степени превращения (d)CTP до 95% необходимо добавлять дополнительно свежую порцию раствора бисульфита через 12-15 часов.

Замещение экзоциклической аминогруппы 6-сульфо-5,6-дигадро-00СТР реагентами 13 и 9 проходило почти количественно за 1-2 часа, т. е. ~ в 10 раз быстрее, чем при использовании EDA. Вероятнее всего это объясняется тем, что в условиях, оптимальных для бисульфит-катализируемого переаминировання этнлендиашшом (рН 6.0-6.2), менее 10 % молекул EDA (рК, ~ 7.5) находятся в реакционноспособной монопротонированной форме, в то время как соединения 13 (рК, ~ 3.2) и 8 (рК, ~ 4.5) почти целиком находятся в основной форме (оптимальная рН в обоих случаях 5.0-5.5).

Как и ожидалось, большая разница наблюдалась в устойчивости полученных переаминированных бнсульфитных аддуктов. Устойчивость экзо-Ы-аминоэтил-6-сульфо-5,6-дищцро-(й)СТР существенно выше, чем 6-сульфо- 5,6-дигидро-^ )СТР. Дм количественного отщепления бисульфита с образованием производного 4а необходимо выдерживать реакционную смесь при рН 8-9 в течение 1 ч при 18-20 °С. При проведении препаративного синтеза, реакционная смесь наносилась на колонку Sephadex G-10 и бисульфит отщеплялся в процессе хроматографии. Для разрушения примерно 60% бисульфитногс адцукта производного 12 требуется уже многочасовая обработка при рН 10-11. Повышение рН до 12-13 не желательно, так как сопровождается значительным разрушением трифосфатной группы и частичным гидролизом свободной гцдразвдной группы до кар<5оксильной.

Бисульфитный аддукт производного 8 нам удалось разрушить только после отделения от избытка бисульфита и последующего выдерживания при рН > 13 и 50 °С в течении 3 часов.

Таким образом бисулъфит-катализируемое переаминирование является удобным способом получения замещенных по экзоциклнческой аминогруппе производных (ё)СТР. Перед проведением реакции необходимо проверять качество препарата Иаг^Оз проводя синтез в аналитическом масштабе. По нашим данным, лучше всего использовать свежеприготовленный раствор Ыа^О^ оттитрованный до требуемого рН перед реакцией. Стабильные бисульфитные аддукты производных 8 и 12 желательно предварительно очистить от избытка бисульфита. Условия разрушения этих аддуктов достаточно жесткие (рН -13, 50 °С) и сопровождаются значительным гидролизом трнфосфатного остатка. Однако быстро получить целевой продукт переаминирования (Й)СТР в две стадии можно только этим методом.

2.1.3. Прямое переаминирование (с!)СТР 0-(4-аминооксибутил)-гидроксиламином.

Экзо-К-алкилокеи производаые СМР были получены прямым переаминированием О-метилгидроксиламином с выходом 46 % и дигидроксиламином 9 с выходом 22 % [151, 153]. Параллельно с прямым переаминированием проходит образование 4-О-со-аминооксибутил-оксим-6чо-аминооксибу1и;юкснам1шо-5,6-дагидро-((1)1лгр (рис. 22). Механизм и кинетика реакций О-метилщцроксиламина с цитозиновым ядром были исследованы в работе [152].

ИНз £ pppdRib рррс!№Ь

НаН-ОЯ = —(СНгЬ-ОЯНа

NN3 N

Н^-СЖ м-ок pppdRib

I и' pppdR¡b

Рис.22. Прямое переаминирование <1СТР дигидроксиламином 9.

Увеличить содержание гидроксиламина 8 с 58 до 72 % в реакционной смеси нам удалось применяя цредварительный нагрев растворов (<1)СТР н 9 до 50°С перед смешиванием. Это позволило поднять конечный выход с 43 до 55 %. Конечные выходы целевого трифосфата 8 при прямом переаминировании существенно выше чем в бисульфит-катализируемом варианте 40 %, данные не представлены).

2.1.4. Введение аминоэтиламцдной группы в у-фосфат АТР.

Основными областями применения замещенных по у-фосфату (d)NTP являются исследование нуклеотид-связывающих и инициирующих сайтов ферментов, а также белков, взаимодейсгвуюшрик с 5'-коыцевым трифосфатом синтезируемой цепи РНК.

Для синтеза у-(2-аминоэтил)амида АТР (20) был выбран карбодиимидшж метод, включающий промежуточное образование реакционноспособного триметафосфата АТР [172, 173]. Был опробован водный варианты проведения этой реакции (рис. 23).

Рис. 23. Схема синтеза фотоактииных производных АТР, замещенных по у-фосфатной группе.

Содержание целевого амида 20 в реакционной смеси оказалась достаточно высоким (72%) при использовании 1-(3-ДИметиламинопропил)-3-этижарбод|ошида при рН 6.5.

Учитывая простоту при подготовке реакции и выделении полученного производного из реакционной смеси, был сделан выбор в пользу использования этого метода.

Время удерживания трифосфата 20 на МКХ, как и ожидалось, уменьшилось в соответствии с изменением суммарного заряда на +2 (см. табл. 2). Наличие первичной алифатической аминогруппы выявляли по реакции с нингодрином на пластинках ТСХ.

2.1.5. Введение фотоактивных групп и сенсибилизатора в полученные производные (d)NTP.

Ацилирование аминов 4 М-оксисуетщнимидньши эфирами кислот 5, 6 и 7 проводили двумя способами. Первый включал проведение этой реакции в 10-50 % водном растворе DMF или DMSO при рН 7-8, второй - ацилирование ТЕА-солей 4 в сухом DMSO. Мы остановили свой выбор на втором варианте, так как расход N-оксисукцинимидных эфиров

5 и 6 оказался в 1.5 раза, а 7 в 2 раза ниже, при этом деградация трифосфатного остатка составила только 2-3 % (в водном растворе 5-10 %). Кроме того реакцию можно проводить при более низких концентрациях реагентов чем в воде, так как конкурирующего гидролиза N-оксисукцинимидных эфиров кислот не происходило. у-[2-(4-Азидо-2,3,5,6-тетрафтор-бензоил)-аминозтил]-амцд A TP (17), у-[2-(5-азвдо-2-нтробензоил>аминоэтил]-амид АТР

18) и у-[2-{4-Азидо-2,3,5,6-тетрафторбетш1Щ1енамнн«жси АТР

19) получали ацилированием амина 20 N-оксисукцинимидными эфирами 5, 6 и 7 в сухом DMSO. При ацилировании 20 использовали 1.2 х избыток N-оксисукцинимидных эфиров 5,

6 и 7 и добавляли два эквивалетгга TEA.

Образование оксимов и гидразонов конденсацией О-замещенных гидроксиламинов и гидразидов карболовых кислот с альдегидами используется как удобный способ введения функциональных групп в биополимеры. Мы использовали эту реакцию также для направленного изменения спектральных свойств фотореакционнослособной перфторарилазидной группы. Замена в альдегиде 10 формильной группы на О-алкил-оксимную и щдразоновую приводит к батохромному смещению максимума поглощения от 251 нм к 287 нм и 306 нм, соответственно [174J. Сильное изменение поглощения в районе 260-350 нм позволяло следить за накоплением продукта конденсации по изменению спектра поглощения реакционной смеси. При использованных концентрациях трифосфатов 8, 12 и альдегида 10 ~ 2-3 мМ равновесие устанавливалось за ~ 30-60 мин при 16-18 °С.

Мы предполагали, что антрацен и его 9-производные могут быть синглет-синглетными сенсибилизаторами фотоднссоцнацни 4-аэ«дотстрафторбетилцденовых групп при освещении видимым светом в диапазоне 400-450 нм. Выбор в пользу использования производного 12а в качестве аффинной группы был сделан на основании субстратных свойств аналога 14а, который элонгируется как в качестве dCTP, так и в качестве dTTP (см. ниже). Это свойство может существенно повысить вероятность адсорбции аналога в dNTP-связывающем сайте и включения в растущую цепь в процессе репликации.

Образование производного 15 при конденсации нуклеотида 12а с альдегидом 16 сопровождалось существенными изменениями спектра поглощения в УФ и видимой областях. Образование гидразона 15 приводит к гипсохромному смещению максимумов поглощения от характерных для 9-антраценя льдегида на 263 нм и 407 нм к характерным для гидразона 15 на 255 нм и 388 нм и резким снижением интенсивности поглощения в районе 234 нм. Выделение продукта 15 хромато графическими методами осложнено низкой растворимостью (~ 1 мМ) в водных растворах при концентрации солей > 0.05 M В то же время, это свойство облегчало последующую очистку целевого трифосфата. При упаривании на ротационном испарителе соединение 15 выпадало в осадок, что позволяло избавлятся от основной часта солей декантацией. Затем целевой нуклеотид отделяли от 9-антраценальдегида экстрагируя водой.

Строение всех синтезированных фотоактивных производных (d)NTP подтверждено 1Н-ЯМР спектрами и, выборочно, 3IP- UC- и 19Р-ЯМР спектрами. Сигнала от -О-СН^-СО-группы в соединениях За, 3b, lia, 11b и 19 не удалось зафиксировать в D20 даже в условиях подавления воды. Этот сигнал присутствует как синглет на 5.11 и 5.09 м.д. в спектрах О-(карбоксиметил) -4-азидотетрафторбензальдоксима и соответствующего N-оксисукцин-имидного эфира 2 [174]. Последнее соединение использовалось при синтезе перечисленных производных (d)NTP. Данный сигнал, по-видимому, совпадает с сигналом Н20. Для всех фото активных производных (d)CTP определены спектральные и хроматографические (МКХ, ТСХ, табл. 1) характеристики.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Сафронов, Игорь Викторович, 1999 год

1. Sytvers L. А. & Wower J., Nucleic acid-incorporated azidonucleotides: probes for studying the interaction of RNA or DNA with proteins and other nucleic acids // Bioconj. Chem., 1993, V. 4, №6, P. 411-418.

2. Meisenheimer К. M. & Koch Т. H., Photocross-linkmg of nucleic acids to associated proteins // Critical Rev. Biochem. Mol. Biol., 1997, V. 32, №2, P. 101-140.

3. Кнорре Д. Г. у КудряшоваН. В., Лаврик О. И., Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: общие вопросы и исследование транскрипции // Успехи химии, 1997, Т. 66, N° 4, С. 401-413.

4. Кнорре Д. Г., Кудрямова Н. В., Л окрик О. И., Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: Исследование репликации и обратной транскрипции // Успехи химии, 1998, Т. 67, №> 5, С. 486-502.

5. Shuster G. B. & Platz M. S., Photochemistry of phenyl azide // Adv. Photochem., 1992, V. 17, P. 69-142.

6. Грицан H. П. и Притчина E. А, Механизм фотолиза ароматических азидов // Успехи химии, 1992, Т. 61, вып. 5, С. 910-939.

7. Brunner J., New Photolabelling and Photocrosslinking Methods // Ann. Rev. Biochem., 1993, V. 62, P. 483-514.

8. Власов В. В., Нечаева М. В, Байбородин С. И., Шестола б. Е., Сафронов И. В, Кошкин А. А., Якубо* Л. АПоглощенные клеткой охнгонуклеотады быстро накапливаются в ядре //Докл. РАН, 1995, Т. 345, № 1, С. 123-126.

9. Добриков М. И., Гайдамаков С. А., Кошкин А. А., Лукьянчук Н. П., Шишкин Г.

10. В., Власов В. ВНаправленная химическая модификация ДНК -фрагментов олигон}тслеотидкым производным перфторарилазида в присутствии олигокухлготидов, несущих фотосексибишшфукяцие пнреновые группы//Докл. РАН, 1995, Т. 344, Xs 1, С. 122125.

11. Добриков М. И., Гайдамаков С. А., Кошкин А. А., Шишкин Г. ВВласов В. В., Фотомодификация ДНК каталитической двухкомпонентной системой олигонуклеотидов, несущих остатки бензантрацена и перфторарилазида // Докл. РАН, 1996, Т. 351, № 4, С. 547550.

12. Dobrikov М. /., GmdamakovS. A., GainuttRnov Т. /., Koshkirt A. A., Vlassov V. К, Sensitized photomodificalion of singlet-stranded DNA by a binaiy system of oligonucleotide conjugates i I Antisense & Nucl. Acid Drug Develop., 1997, V. 7, P. 309-317.

13. Гайдамакова Е. К., Активация гена цитохрома Р450вм-3 (СУРJ02) фенобарбиталом: выявление потенциальных регуляторных элементов // Автореферат диссертации.

14. Dobrikov M.l.y Doromn S. V., Safronov /. V., Shishkin G. V., Lavrik O.I., Affinity modification of M13 DNA by a photoreactive analog of dNTP promoted by HIV-l reverse transcriptase // Chem. Sustainable Dev., 1994, V. 2-3, P. 529-534.

15. Кочетков H. К., Будовский Э. И., Свердлов E. Д., Симукова Н. А., Турчинский М. Ф., Шибаев В. Н., Органическая химия нуклеиновых кислот, М., "Химия", 1970.

16. Kovalsky О. I. & Budowsky Е. /., Laser (two-quantum) photolysis of polynucleotides and micleoproteins: quantitative processing of results I I Photochem. PhotobioL, 1990, V. 51, № 6, P.1. U^"-» V/ «.<• •

17. Gorner H., Transients of uracil and thymine derivatives and the quantum yields of electron ejection and intersystem crossing upon 20 ns photolysis at 248 nm // Photochem. Photobiol., 1990, V. 52, № 5, P. 935-948.

18. Shaw A. A., FatickA. M., Shedar M. D., Photoreactions of thymine and thymidine with N-acetyltyrosine // Biochemistry, 1992, V. 31, № 45, P. 10976-10983.

19. Lemaire D. G. E. & Ruzsicska B. P., Quantum yields and secondary photoreactions of die photoproducts of dTpdT, dTpdC and dTpdU, Photochem. Photobiol. // 1993, V. 57, № 5, P. 755-769.

20. Smith К. C, Photochemical addition of amino acids to 14C-uracil // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, V. 34, № 3, P. 354-357.

21. Williams K. R. & Königsberg W. H., J99J, Identification of amino acid residues at interfase of protein-nucleic acid complexes by photochemical cross-linking // Meth. Enzymol., 1991, V. 208, P. 516-539.

22. Smith К. C, A mixed photoproduct of thymine and cysteine: 5-S-cysteine, 6-hydrothymine// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, V. 39, № 6, P. 1011-1016.

23. Shaw A. A. & Shedar M. D., The photochemistry of 2-aIkoxycytosines in phosphate buffer and its link to cytosine photochemistry in alcoholic solution // Photochem. Photobiol., 1989, V. 49, № 3, P. 273-277

24. Arce R, Martinez L., Damdsen E., The photochemistry of adenosin: intermediates contributing to its photodegradation mechanism in aqueous solution at 298 K and characterization of major product//Photochem. Photobiol., 1993, V. 58, № 3, P. 318-328.

25. Arce R< Rodriguez G., Singmaster K., Intermediates in the room temperature flash photolysis of adenin and some of its derivatives // Photochem. Photobiol., 1983, V. 38, № 6, P. 631637.

26. Havron A. & Sperling JSpecificity of photocross-linking in protein-nucleic acid complexes: identification of the interacting residues in Rnase-pyrimidine nucleotide complex // Biochemistry, 1977, V. 16, №25, P.5631-5635.

27. Cheng N., Painter G. R, Furman P. A., Crosslinking of substrates occurs exclusively to the P66 subunit of heterodimetric HIV-1 reverse transcriptase // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, V. 174, № 2, P. 785-789.

28. Cheng /V., Merrill B. M., Painter G. A, Frick L. W.f Furman P. A., Identification of the nucleotide binding site of HIV-1 reverse transcriptase using dTTP as a photoaffinity label // Biochemistry, 1993, V. 32, № 30, P. 7630-7634.

29. Шефлян Г. Я., Кубарев Е. А., Громова Е. С., Методы ковалентного присоединения нуклеиновых кислот и их производных к белкам // Успехи химии, 1996, Т. 65, № 8, С. 765-781.

30. Favre А., 4-Thiouridin as an intrinsic photoaffinity probe of nucleic acid structure and interactions I I Bioorganic Photochemistry: Photochemistry and Nucleic Acids, 1990, V. 1, P. 379425.

31. Favre A., Stdntome C., Fourrey J.-L.y Ото P., Laugaa P., Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure 2nd nucleic acid-protein interactions /7 J. Photochem. Photobiol В: Biology; 1998, V. 42, P. 109-124.

32. HdhoffK., Redmond R W., Bralavsky S. E., Rougee V/., Salet C, Favre A, Bensasson EL V., Quantum yield of triplet and CbC'Ag) formation of 4-thiouridin in water and acetonitrile //Photochem. Photobiol., 1990, V. 51, № 6, P. 635-641.

33. Pfeiss M. G., Ochicd. H., Ceruid P. APhotochemicaBy induced transition of 4-thiouridine to uridine or uridine and cytidine in E. coli transfer ribonucleic acid // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1969, V. 34, № 1, P. 70-76.

34. Pleiss M. G. & CeruM P. APhototransformation of 4-thiouridine in Escherichia coli valine transfer ribonucleic acid to uridine, cytidine, and K'-methylcytidine // Biochemistry, 1971, V. 10, № 16, P. 3093-3099.

35. Fourrey J. L., Jouin P., Moron J., Thiocarbonyl photochemistry. П. The reaction of 4-thiouracil derivatives with unsaturated nitriles // Tetrahedron Lett., 1973, № 34, P. 3229-3232.

36. Fourrey J. L. & Jouin P., Thiocarbonyl photochemistry. I. Hydroxyalkylation of 1,3-dimethyl 4-thiouracil // Tetrahedron Lett., 1973, № 34, P. 3225-3228.

37. Fourrey J. Z., Thiocarbonyl photochemistry. VI. Light induced addition of a primary amine to 4-thiouracil derivatives 11 Tetrahedron Lett., 1976, № 4, P. 297-300.

38. Fourrey J. L. & Moron Thiocarbonyl photochemistry. VII. Photochemistry of 1,3-dimethyl 4-thiouracil in presence of triethylamine // Tetrahedron Lett., 1976, № 4, P. 301-304.

39. Peak M. J., Midden W. R., Babasick D. M., Haugen D. A., Photochemistry 4-thiouridine and thymine // Photochem. Photobiol., 1988, V. 48, Ks 2, P. 229-232.

40. NUdforov T T. & Connolly B. A., Oligodeoxynucleotides containing 4-tuiothymidine and 6-thiodeoxyguanosine as affinity labels for Eco RV restriction endonuclease and modification methylase // Nucleic Acids Res., 1992, V. 20, № 6, P. 1209-1214.

41. Mishima Y. & Staiz J. A., Site-specific crosslinking of 4-thiouridine-modified human tRNA3Lys to reversw transcriptase from human immunodeficiency virus type I // EMBO J., 1995, V. 14, № 11, P. 2679-2687.

42. Sheng N. & Dennis D., Active site labeling of HTV-1 reverse transcriptase // Biochemistry, 1993, V. 32, № 18, P. 4938-4942.

43. Лаврик О. И., Захаренко A. JI., Прасад P., Власов R А., Богаче« R С., Фабр A, dNTP, ко валентно присоединенные к ДНК-полнмеразам через основание, активны в режциях 1-:укяеот;1дид1,1юго переноса // Молекуляр. биология. 1998, Т. 32, № 4, С. 1-8.

44. Markovtsov V., Mustaev A., Galgfarb A., Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex // Proc. Natl. Acad. Sei., 1996, V. 93, P. 3221-3226.

45. Bartholomew В., Dahmus M. E., Meares C. F., RNA contacts subunits По and lie in HeLa RNA polymerase П transcription complexes // J. Biol. Chem., 1986, V. 261, № 30, P. 1422614231.

46. Pawel W., Bartholomew В., Reines D., Elongation factor SD contacts the З'-end of RNA in the RNA polymerase П elongation complex // J. Biol. Chem., V. 271, № 37, P. 22301-22304.

47. Roberge M., Dahmus M.E., Bradbury E. M, Chromosomal loop/nuclear matrix organization of transcriptionally active and inactive RNA polymerases in HeLa nuclei // J. Mol. Biol., 1988, V. 201, P. 545-555.

48. Roberge M. & Bradbury E. M., RNA contacts the two large polymerase subunits and a 52-kDa polypeptide in nucleolar RNA polymerase I transcribing complexes // J. Biol. Chem., 1988, V. 263, № 34, P. 18553-18557.

49. Bartholomew В., Braun В. R, Kassavetis G. A., Geiduschek E. P., Probing close DNA contacts of RNA polymerase П transcription complexes with the photoactive nucleoside 4-thiodeoxythymidine // J. Biol. Chem., 1994, V. 269, № 27, P. 18090-18095.

50. Röhn R. O. & Sellin H. G., Hoechst 33258 photosensitization of 5-iododeoxyuridine-substituted DNA to 365 um light: dependance of dehalogenation on the dye-to-nucleotide ratio // Photochem. Photobiol., 1992, V. 55, № 2, P.309-312.

51. Dich T. M. & Koch T. ff., Photochemical coupling of 5-bromouracil to tryptophan, tyrosine and histidine, peptide-like derivatives in aqueous fluid solution // Photochem. Photobiol., 1987, V. 46, № 6, P. 971-978.

52. Dietz T. M. & Koch T. //. Photochemical reduction of 5-bromouracil by cysteine derivatives and coupling of 5~bromouracil to cystine derivatives U Photochem. Photobiol., 1989, V. 49, № 2, P. 121-129.

53. Norris C. L.y Meisenheimer P: L., Koch T. H., Mechanistic studies of the 5-iodouracil chromophore relevant to its use in nucleoprotein photo-cross-linking// J. Am. Chem. Soc., 1996, V. 118, № 24, P. 5796-5803.

54. Willis M. C, Hicke R /., Vhlenbeck O. G, Cech T. Ä, Koch T. H., Photocrosslinking of 5-iodouracil-substituted RNA and DNA to Proteins // Science, V. 262, P. 1255-1257.

55. Meisenheimer K. M., Meisenheimer P. L, Willis M. C, Koch T. H., High yield photocrosslinking of a 5-iodocytidine (IC) substituted RNA to its associated protein // Nucleic Acids Res., 1996, V. 24, № 5, P. 981-982.

56. Wolfes H., Fliess A., Winkler F., PingoudA., Cross-linking of bromouridine-substituted oligonucleotides to EcoRI and EcoRV restriction endonucleases // Eur. J. Biochem., 1986, V. 159, P. 267-273.

57. Hicke B. Willis M. C, Koch T. H., Cech T. R1, Telomeric protein-DNA point contacts identified by photo-cross-linking using 5-bromodeoxyuridine // Biochemistry, 1994, V. 33, № 11, P. 3364-3373.

58. Malkov V. A. & Camerim-Otero R. D., Photocross-links between single-stranded DNA and Escherichia coli recA protein map to loop LI (amino acid residues 157-164) and L2 (amino acid residues 195-209) // J. Biol. Chem., V. 270, № 50, P. 30230-30233.

59. InsdorfN. F. & Bogenhagett D. F., DNA polymerase y from Xenopus laevis. I. The identification of a high molecular weight catalytic subunit by a novel DNA polymerase photlabeling procedure // J. Biol. Chem., 1989, V. 264, № 36, P. 21491-21497.

60. VtdegardK., Murray J. В., Stockley P. G., Stonehouse N. J., LiljasL, Ciystal structure of an RNA bacteriophage coat protein-operator complex // Nature, 1994, V. 371, P. 623626.

61. Сгиба H. П., Ефимов В.Л., Липкин В. М., Чахмахчева О. Г., Овчинников Ю. А.,

62. Локализация мест связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. coli с фоточувствительными аналогами матрицы //Биоорган, химия, 1986, Т. 12, № 8, С. 10231029.

63. Починок А. В., Починок В. ЯАврамекко Л. Ф., Кондратенко П. .4. , Скопенхо В. Ж, Нагорный В. И., Чибисова Н. П., Исследование светочувствительности некоторых ароматических и гетероциклических азидов // Укр. хим. ж., 1979, Т. 45, № 12, С. 1204-1211.

64. Рое R, Schnapp К., Young М. J. Т., Grayzar J., Platz М. S., Chemistry and kinetics of singlet (Pentafluorophenyl)nitrene // J. Am. Chem. Soc., 1992, V. 114, № 13, P. 5054-5067.

65. Schnapp К. A. & Platz M. S., Laser flash photolysis study of di-, tri- and tetrafluorinated phenylnitrenes; implication for photoaffinity labeling // Bioconj. Chem., 1993, V. 4, № 2, P. 178183.

66. Zh(d H. B. & Platz M. S., Exploratory photochemistry of polyfluorinated 2-naphtyl azide // J. Phys. Chem., 1996, V. 100, № 22, P. 9568-9572.

67. Gritsan N. P., Yuzawa Т., Platz M. S., Direct observation of singlet phenylnitrsne and measurement of its rate of rearrangement // J. Am. Chem. Soc., 1997, V. 119, № 21, P. 5059-5060.

68. Gritsan N. P., ZhmH. Ä, Yuzawa Т., Kanveik D., Brooke J., Platz M. S., Spectroscopy and kinetics of singlet perfluoro-4-biphenylnitrene and singlet perfluorophenylnitrene // J. Phys. Chem. A, 1997, V. 101, № 15, P. 2833-2840.

69. Bayley H. & Knonies J. Ä, Photoaffinity labeDing // Meth. Enzymol., 1977, V. 46, P.69.114.

70. Bayley H., Photogenerated Reagent in Biochemistry and Molecular Biology // Amsterdam-NY-Oxford, Elsevier, 1983.

71. Shuster D. /., Probst W. C., Ehrlich G. K., Singh G. Photoaffinity labeling /' Photochem. Photobiol., 1989, V. 49, № 6, P. 785-804.

72. Soundararqjan N. & Platz M. S., Descriptive photochemistry of polyfluorinai ed azide derivatives of methyl benzoate // J. Org. Chem., 1990, V. 55, № 7, P. 2034-2044.

73. Schnapp К. А., Рое R, Leyva E., Soundararajan N., Platz M. S., Exploratoiy photochemistry of fluorinated aiyl azides. Implications for design of photoaflmity labeling reagents I I Bioconj. Chem., 1993, V. 4, № 2, P. 172-177.

74. SchrockA. K. & Schuster G. В., Photochemistry of phenyl azide: chemical properties of the transient intermediates 11 J. Am. Chem. Soc., 1984, V. 106, №> 18, P. 5228-5234.

75. Leyva E., Platz M. S., Persy G., Wirz J~, Photochemistry of phenyl azide: the role of singlet and triplet phenylnitrene as transient intermediates // J. Am. Chem. Soc., 1986, V. 108, № 13, P. 3783-3790.

76. Gritzan N. P., Zhu Z, Haded С. M., Platz M. S., Laser flash photolysis and computational study of singlet phenylnitrene // J. Am. Chem. Soc., 1999, V. 121, № 6, P. 12021207.

77. Soundararajan N. & Piatz M. S., Descriptive photochemistry of polyfluorinated azide derivatives of methyl benzoate I I J. Org. Chem., 1990, V. 55, № 7, P. 2034-2044.

78. Liang T.-Y. & Schuster G. fit, Photochemistry of 3- and 4-N-Nitrophenyl azides: detection and characterization of reactive intermediates // J. Am. Chem. Soc., 1987, V. 109, № 25, P. 7803-7810.

79. Галлъ Т. С., Грицан Н. П., Мызина С. Д., НемцеваЕ. А, л-Хинонодиимин -реакционноспособный промежуточный продукт фотолиза п-азидоанилина в водных растворах//Докл. АН СССР, 1983, т. 273, № 4, С. 883-887.

80. Badashkeyeva A. G., GaU Т. S., Efimova Е. V., Knorre D. G., Lebedev А. V., Mysina S. D., Reactive derivative of adenosine-5'-triphosphate formed by irradiation of ATP y-p-azidoamlid, FEBS Lett. //1983, V. 155, № 2, P. 263-266.

81. Бадаишеева А. Г., Гать E. С., Кнорре Д. Г., Лебедев А. В., Ефимова Е. В., Мызина С. Д., Изучение продукттов фотопревращения У"""азидоанилидов нуклеозид-5э-трифосфатов в водных растворах // Биоорган, химия, Т. 10,. № 5, С. 696-701.

82. MejfetR, Rathgeber G., Schafer H.-J., Dose K., UV-induced cross-linking of Tet repressor to DNA containing tet operator sequences and 8-azidoadenines I I Nucleic Acids Res., 1990, V. 18, №22, P. 6633-6636. J

83. Evans K. E., Johnson J. D., Haley B. E., 5-Azido-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate: a photoaffinity-labeling reagent and tool for the enzymatic synthesis of photoactive DNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1986, V. 83, P. 5382-5386.

84. Evans K. E. & Haley B. E., Synthesis and biological properties of 5-azido-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate, a photoactive nucleotide suitable for making light-sensitive DNA // Biochemistry, 1987, V. 26, № 1, P. 269-276.

85. Cartnrightl. L. & Hutchinson D. W., Azidopolynucleo ti des as photoaffinity reagents I I Nucleic Acids Res., 1980, V. 8, № 7, P. 1675-1691.

86. Woody A-Y. M, Voder C R, Woody R W., Haley B. E., Photoaffinity labeling of DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli with 8-azidoadenosine 5'-triphosphate // Biochemistry, 1984, V. 23, № 13, P. 2843-2848.

87. Borukov S., Lee J., Goldfarb A., Mapping of contact for the RNA 3' terminus in largest subunit of RNA polymerase // J. Biol. Chem., 1991, V. 266, № 35, P. 23932-23935.

88. Bowser C. A. & Hanna M. M, Sigma subunit of Escherihia coli RNA polymerase loses contacts with the 3' end of the nascent RNA after synthesis of a tetranucleotide it J. Mol. Biol., V. 220, P. 227-239.

89. Meffert K & Dose A'., UV-induced cross-linking of proteins to plasmid pBR322 containing 8-azidoadenine 2-deoxyribonucleotides, FEBS Lett. // 1988, V. 239, № 2, P. 190-194.

90. Wower J., Aymie M., Hixson S. S., Zimmermann K A., Photochemical labeling of Bovin pancreatic Ribonuclease A with 8-azidoadenosine 3'-5'-bisphosphate I I Biochemistiy, 1989, V. 28, № 4, P. 1563-1567.

91. Woody A-Y. M , Evans R K., Wootfy R W., Characterization of a photoaffinity analog of UTP, 5-azido-UTP for analysis of the substrate binding site on E. coli RNA polymerase // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, V. 150, № 3, P. 917-924.

92. Lee D. K., Evans R K., Blanco J., Gottesfeld J., Johnson J. D.y Contacts betwenn 5S DNA and Xenopus TFÜIA identified using 5-azido-2'-deoxyuridine-substituted DNA // J. Biol. Chem., 1991, V. 266, № 25, P. 16478-16484.

93. Farrar Y. J., Evans R K., Beach C. M., Coleman M. S., Interaction of photoreactive DNAs with terminal deoxynucleotidyl trainsferase: identification of peptides in DNA binding domain //Biochemistiy, 1991, V. 30, № 12, P. 3075-3082.

94. Rush J. & Königsberg W. H., Photoaffinity labeling of the Klenow fragment with 8-azido-dATP//J. Biol. Chem., 1990, V. 265, № 9, P. 4821-4827.

95. Srivastava D. K., Evans R K., Kumar A., Beard W. A., Wilson S. H., dNTP binding site in rat DNA polymerase ß revealed by controlled proteolysis and azido photoprobe cross-linking // Biochemistry, 1996, V. 35, № 12 , P. 3728-3734.

96. Moore B. M., II, Li K., Doughty M. B., Deoxyadenosine-based DNA polymerase photoprobes: design, synthesis, and characterization as inhibitors of the Escherichia coli DNA polymerase I Klenov fragment 11 Biochemistiy, 1996, V. 35, № 36, P. 11634-11641.

97. Sverdlov E. D.,Tsarev S. A., Kuznetsova N. F., Derivatives of guanosine triphosphate-photoreactive substrates of Eschcrikia coli RNA» polymerase // FEBS I.etl., 1980, V, 112, № 2, P. 296-29S.

98. Grachev M. A. & Ztdchikov E. F., Photo-modification studies of the contacts of the 5'-terminus of growing RNA with the subunits RNA-polymerase // FEBS Lett., 1981, V. 130, № 1, P. 23-26.

99. BartholomewB., Kassaveäs G. A., Braun B. R., Geiduschekj E. P., The subunit structure of Saccharomyces cerevisiae transcription factor IIIC probed with a novel photocrosslinking reagent // EMBO J., 1990, V. 9, № 7, P. 2197-2205.

100. Braun R B., Bartholomew B., Kassaveäs G. A., Geiduschek E. P., Topography of transcription factor complexes on the Saccharomyces cerevisiae 5S RNA Gene // J. Mol. Biol., 1992, V. 228, P. 1063-1077.

101. Radebaugh C. A., Gong X., Bartholomew R., Paule M. R, Identification of previously unrecognized common elements in eulcaryotic promoters // J. Biol. Chem., 1997, V. 272, № 6, P. 3141-3144.

102. Persinger J. & Bartolomew B., Mapping the contacts of Yeast TFÜIB and RNA I>olymerase HI at various distances from the major groove of DNA by DNA pliotoaffinity labeling // i. Biol. Chem., 1996, V. 271, № 51, P. 33039-33046.

103. Tate J. J., Persinger J., Bartholomew B., Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of Yeast RNA polymerase in transcription complexes // Nucleic Acids Res., 1998, V. 26, № 6, P. 1421-1426.

104. Oelgeschlager Т., Chiang C.-M., Roeder R G., Topology and reorganization of a human TFIID-promoter complex // Nature, 1996, V. 382, № 22, P. 735-738.

105. Stackhouse Т. M. & Meares C. F., Photoaffinity labeling of Escherichia coli RNA polymerase/polyd(A-T). transcription complexes by nascent RNA // Biochemistry, 1988, V. 27, №1. D ЭПЧ«t»^ S, . »

106. Hanna M. M., Zhang K, ReuSlng J. C, Thomas M. J., Jou J., Synthesis and characterization of new photocrosslinking CTP analog and its use in photoaffinity labeling E. coli and T7 RNA polymerases // Nucleic Acids Res., 1993, V.21, № 9, p. 2073-2079.

107. Liu K. & Hann a M. M, NusA interferes with interactions between the nascent RNA and the C-terminal domain of the a subunit of RNA polymerase in Escherichia coli transcription complexes//Proc. Natl. Acad. ScL USA 1995, V. 92, P. 5012-5016.

108. Uu K.f Zhang ¥., Severinov K., Das A., Hanna M. A/., Role of Escherichia coli RNA polymerase alpha subunit in modulation of pausing, termination and anti-termination by transcription elongation factor NusA // EMBO J., 1996, V. 15, № 1, P. 150-161.

109. Кнорре Д. Г., Биченкова Е. В., Коваль Ä В., Алексеев П. В., Кнорре Ä Д., Нордхоф Э., Годовикта Т. С., Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами // Биоорган, химия, 1998, Т. 24, № 9, С. 663-669.

110. Cataiano С Е., AUen D. J., BenkovicS. У., Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts // Biochemistry, 1990, V 29, № 15, P. 3612-3621.

111. Capson T. L, BencovicS. J., Nossat N. G., Protein-DNA cross-linking demonstrates stepwise ATP-dependent assembly of T4 DNA polymerase and its accessory proteins on primer-template // CeD, 1991, V. 65, P. 249-258.

112. Reems J. A., WoodS., McHenry C. S., Escherichia coli DNA polymerase Ш holoenzfane subunits оц p, and у directly contact the primer-template // J. Biol. Chem., 1995, V. 270, №> 10, P. 5606-5613.

113. JLavrik O. L, Kolpashchikov D. M., Nasheuer if.-P., WeisshartK., Favre A., Alternative conformation of humas replication protein A are detected by crosslink with primers carrying a photoreaclivegroup at 3'-end // FEBS Lett., V. 441, № 2, P. 186-190.

114. Doronin S. К, Dobrikov М. /., Lavrik О. /., Photoaffinity labeling of DNA polymerase a DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog // FEBS Lett., 1992, V. 313, № 1, P.31-33.

115. Doronin S. V., Dobrikov M. /., Buckle M, Roux P., Вис H., Lavrik O. L, Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs // FEBS Lett, 1994, V. 354, P. 200-202.

116. WlassoffW. A., Kimura M., IsMhamaA., Fanctional organization of two large subunits of fission yeast Schizosaccharomyces pombe RNA polymerase П: location of the catalytic Sites // J. Bioi. Chem., 1999, V. 274, P. 5104-5113.

117. Свердлов E. Д., Царев С. А., Модянов H. Н., Липкин К М, Грачев М. И., Зайчиков Е. Ф, Плетнев А. Г., Фотоаффинная модификация РНК-полимеразы Е. coli в транскрипционном комплексе аналогами субстратов // Биоорган, химии, 1978, Т. 4, № 9, С. 1278-1280.

118. DeRiemerL. Н. & Meares С F, Synthesis of mono and dinucleotide photoaffinity probes of ribonucleic acid polymerase // Biochemistry, 1981, V. 20, № 6, P. 1606-1612.

119. DeRiemer L. H. & Meares С /1, Early steps in nascent ribonucleic acid across the surface of ribonucleic acid polymerase, deterroined by photoaffinity labeling // Biochemistry, 1981, V. 20, № 6, P. 1612-1617.

120. Alassai M., 4'-(l-Azi-2,2,2-trifluroethyl)phenylalanine, aphotolabile carbene-generating analogue of phenylalanine // J. Am Chem. Soc., 1984, V. 106, № 24, P. 7540-7545.

121. Yamaguchi T. & Saneyochi M, A photolabile 2',3'-dideoxyuridilate analog bearing an ar>'i(irifluoromethy!)di2zirine moiety: photoaifîniîy labeling of HTV-1 reverse transcriptase U Nucleic Acids Res., 1996, V. 24, № 17, P. 3364-3369.

122. AnandN. N., Brown D. M., Salisbury S. A., The stability of oligodeoxyribonucleotide duplexes containing degenerate bases //Nucleic Acids. Res., 1987, V. 20, P. 8167-8176.

123. Hayatsu H., Takàshi K.-L & Ukiia T., The modification of nucleosides and nucleotides. HI. A selective modification of cytidine with semicarbazide // Biochim. Biophys. Acta, 1966, V. 123, P. 445-457.

124. Kikugawa K., Hayatsu H. & Ukita T., The Modification of Nucleosides and Nucleotides. V. A Selective Modification of Cytidylic Acid with Girarc-P Reagent // Biochim. Biophys. Acta, 1967, V. 134, P. 221-231.

125. Kikugawa K., Muto A., Hayatsu H., Miura K.-L & Ukiia T., The Modification of Nucleosides and Nucleotides. VI. The Reaction of Girard-P Reagent with Transfer RNA ¡1 Biochim. Biophys. Acta, 1967, V. 134, P. 232-242.

126. Gal-Or L., Me&emaJ. £., Moudrianakis E. N. & Beer M, Electron microscopic study of base sequence in nucleic acids. VII. Cytosine-specific addition of acyl hydrazides // Biochemistry, 1967, V. 6, № 7, P. 1909-1915.

127. Kochetkov N. A'., Budowsky E. /., Sverdlov E. D., Shil aeva R. P., Shibaev V. N. Monasûrskaya G. S., The Mechanism of the Reaction of Hydroxylamine and O-Methylhydroxylamine with Cytidine // Tetrahedron Lett., 1967, № 34, P. 3253-3257.

128. Будовский Э. И., Шибаева Р. П., Свердлов Е. Д. и Монастырская Г. С, Свойства продуктов реакции цитидиловой кислоты с гидроксиламином и О-метилгидроксиламином // Молекуляр. биолотя, 1968, Т. 2, Вып. 3, С. 321-328.

129. Будовский Э. И., Свердлов Е. Д., Шибаева Р. П., Монастырская Г. С. и Кочетков Н. К., Механизм и кинетика реакций гадроксиламина и О-метштшдроксиламина с цитозиновым ядром // Молекуляр. биология, 1968, Т. 2, Вып. 3, С. 329-338.

130. Петренко В. А. и Спирин Г. В., Продукты взаимодействия цитидиловой кислоты с0-5-ашшосксибушлгцароксиламинок //Молекуляр. биология, 1982, Т. 16, Вып. 3, С. 644-648.

131. Markievicz W. Т., Kierzek R, Hemes В., A new method of 4-N-alkyl substituted cytosine derivatives via 4-N-alkylsulfonyI or alkylsulfonyl intermediates // Nuclesides Nucleotides., 1987, V. 6, Jfe 1&2, P. 269-272.

132. Markievicz W. Т., Groger G., Rosch R, ZebrowskaA., Sdiger H, A new method of synthesis of fluorescently labelled oligonucleotides and their application in DNA sequencing /' Nuclesides Nucleotides., 1992, V. 11, № 10, P. 1703-1711.

133. Shapiro R & Weisgras J. M., Bisulfite-catalized transamination of cytosine and cytydine // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1970, V. 40, № 4, P. 839-843.

134. Draper D.E. & GoldL.} A method for linking fluorecent labels to polynucleotides: application to studies of ribosome-iibonucleic acid interactions // Biochemistry, 1980, V. 19, P. 17741781.

135. Draper D.E., Attachment of reporter groups to specific, selected cytidine residues in RNA using a bisulfite-catalized transamination reaction // Nucleic Acids Res., 1984, V. 12, 2, P. 989-1002.

136. Molander J., Hurskmnen P., Hovinen J., LahU M., Lonnberg H., Bisulfite ion-catalyzed transamination of cytosine residues with ct, co-alkanediamines: the effect of chain length on the reaction kinetics // Bioconj. Chem., 1993, V. 4, №> 5, P. 362-365.

137. Budowsky E. I, Sverdlov E. D. & Monastyrskaya G. S., New method of selective and rapid modification of the cytidine residues // FEBS Lett.,1972, V. 25, № 1, P. 201-204.

138. Sverdlov E. D., Monastyrskaya G. S., Gtiskova L. L, Leviian T. L., Shàchenko V. L & Budowsky E. /., Modification of cytidine residues with a bisulfite-O-methylhydroxylamine mixture //Biochim. Biophys. Acta, 1974, V. 340, P. 153-165.

139. Hayatsu H., Reaction of cytidine with semicarbazide in the presence of bisulfite. A rapid modification specific for single-stranded polynucleotide // Biochemistry, 1976, V. 15, № 12, P. 26772682.

140. Gebeyehu G., Roa P. K, SooChm P., Simms D. A. & Klevan L,, Novel biotinyfated nucleotide» analogs for labeling and colorimetric detection of DNA // Nucleic Acids Res., 1987. V. 15, № 11, P. 4513-4534.

141. ReisfeldA., Rotheitberg J. M, Bayer E. A., Wdchek M., Nonradioactive hybridization probes prepared by the reaction of biotin hydrazide with DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, V. 142, № 2, P. 519-526.

142. Турчинский М. Ф., Айбиндер Е. И., Свердлов Е. Д., Множественная гибридизация в анализе геномов. 1. Реакция диаминов и бисульфита с цитозином для введения в ДНК нерадиоактивных меток // Молекуляр. биология, 1988, Т. 22, вып. 6, С. 1545-1552.

143. Турчинский М. Ф., Айбиндер Е. И., Кнорре В. Д., Щербо С //., Модификация дишдразидом янтарной кислоты для получения шбридизационных зондов // Биоорган, химия, 1989, Т. 15, № 10, С. 1341-1344.

144. Добриков М. И., Сафронов И. R, Шишкин Г. В., Определение биотинилированных нуклеиновых кислот, иммобилизованных на нитроцеллюлозе // Изв. СО АН СССР, Сер. хим. наук, 1989, Вып. 4, С. 3-8.

145. Добриков И. И., Приходько Т. А., Сафронов И. В. И Шишкин Г.В., Введете биотиновых меток в одноцепочечную ДНК без разрыва межнуклеотидных связей // Биоорган, химия, 1994, Т. 20, Xs 5, С. 515-523.

146. Зарытое а В. Ф., Кнорре Д. Г., Курбатов В. А., Лебедев А. В., Самуков В. В., Шишкин Г. В., Синтез алкилирующих производных у-амидов аденозинтрифосфорной кислоты // Биоорган, химия, 1975, Т. 1, № 6, С. 793-799.

147. Бабкина Г. Т., Зарытова В Ф., Кнорре Д. Г., Получение у-амидов нуклеознд-5'-трифосфатов в водном растворе с помощью годорастворнмию ка-рбодш-шгд'дз // Биоорган. -химия, 1975, Т. I № 5, С. 611-615.

148. Беккер Г. О./ред., Введение в фотохимию органических соединений/пер. с нем., Л., "Химия", 1976, Р. 213-217.

149. Ricchetti М. & Вис НReverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence dependent // EMBO J., 1990, V. 9, № 5, P. 15831593.

150. Ш, Двбритв MM, Прмх&дько ТА., Сифрен&еМВ., Шмшт» Г,-В., Синтез и свойства светочувствительных капроновых мембран. Фотоиммобидазацш ДНК // Сибирский Химический Журнал, 1992, Вып. 2, С. 18-24.

151. Богачев ÄC, Исследование реакции трифторуксусного ангидрида с тамидин-5'-фосфатом // Биоорган. Химия, 1995, Т. 21, Ks 3, С. 212-217.

152. S Bauer S. & Suresh K.S., S-co-(aminooxy)alkyl.isothiuronium salts, od.co'-bis(aminooxy)alkanes and related compounds ft J. Org. Chem., 1963, V. 28, P. 1604-1607.

153. Конверт Дж., ПиттсДж., Фотохимия: Пер. с англ. М; Мир, 1968. С. 625-627 (Calvert J.G., Pitts J.N. Photochemistry. New York; London; Sydney: Wiley, 1962).