Молекулярно-биологический анализ функциональной асимметрии пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях стресса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Сорокин, Максим Игоревич

• Сорокин, Максим Игоревич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Сорокин, Максим Игоревич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Характеристика дрожжей как модельного объекта эукариотической клетки

2. Дифференцировка дрожжей как следствие асимметрии деления

3. Асимметричность деления дрожжей БассИаготусея сегечгзгае

4. Асимметричное наследование макромолекулярных комплексов клетками & сегеушае

5. Различие длин фаз клеточного цикла материнской и дочерней

клетки »У. сегег'шае

6. Различие профилей экспрессии материнской и дочерней

клетки & сегеушае

7. Типы спаривания дрожжей и НО-эндонуклеаза

8. Механизм формирования асимметрии между

материнской и дочерней клеткой дрожжей

9. Асимметричное деление и репликативная продолжительность жизни

10. Наследование белковых агрегатов клетками дрожжей Я. сегеугзше

11. Репликативная продолжительность жизни дрожжей Басскаготусез сеге\1в1ае

12. Методы определения репликативной продолжительности жизни дрожжей

13. Генетика репликативного старения дрожжей

14. Влияние АФК и митохондрий на репликативную продолжительность жизни дрожжей

15. Асимметричное наследование митохондрий клетками се/-еушяс?

16. Влияние вакуолярного рН на функцию митохондрий и репликативную продолжительность жизни дрожжей

17. Изменения в клетках дрожжей, происходящие на ранних этапах репликатвного старения

18. Дифференцировка дрожжей в составе микроколонии

19. Дифференцировка дрожжей в стационарной фазе роста

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Объект исследования и методы культивирования

2. Амплификация дрожжевых генов при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3. Горизонтальный гель-электрофорез ДНК

4. Выделение суммарной ДНК из дрожжей сегеушае

5. Выделение плазмидной ДНК из Е.соИ методом щелочного лизиса

6. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции

7. Выделение ДНК из агарозного геля

8. Реакция лигирования

9. Приготовление электрокомпетентных клеток Е.соИ и электропорация

10. Трансформация дрожжей

11. Получение мутантных линий дрожжей

12. Получение линии клеток, в которых ген 1Л1АЗ находится под контролем НО промотора

13. Измерение устойчивости клеток сегеушае К6001 к стрессу, вызванному низким рН, в зависимости от репликативного возраста

14. Измерение устойчивости клеток & сегеу/^/ае к стрессу в зависимости

от репликативного возраста

15. Измерение доли клеток, образовавших споры на бедной среде, в зависимости от репликативного возраста

16. Измерение доли клеток, образовавших псевдогифу в ответ на бутанол, в зависимости от репликативного возраста

17. Прочие микроскопические методы

18. Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Возрастное распределение культуры клеток дрожжей

2. Устойчивость клеток дрожжей к стрессу в зависимости от репликативного возраста

3. Зависимость стрессоустойчивости клеток дрожжей от размера

4. Стресс-специфический характер зависимости устойчивости клеток дрожжей в зависимости от репликативного возраста

5. Активация транскрипционных факторов ответа на стресс в зависимости от репликативного возраста

6. Характеристика ранневозрастных изменений клеточных органелл

& сегемгзгае

7. Поиск генов, связанных с ранним снижением стрессоустойчивости клеток дрожжей

8. Способность к дифференцировке клеток дрожжей в зависимости от репликативного возраста

9. Получение и описание штамма, в котором оротидин 5'-фосфат декарбоксилаза находится под контролем НО промотора

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ДСН — додецилсульфат натрия

дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфаты

МЭ - меркаптоэтанол

ПИ - пропидий йодид

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЭГ — полиэтиленгликоль

РПЖ - репликативная продолжительность жизни

ТАЭ - трис-ацетатный буфер с добавлением ЭДТА

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

экрДНК — экстрахромосомальные кольцевые рибосомальные ДНК

5-FOA — 5-фтор оротовая кислота

BCECF - 2',7'-бис-(2-карбоксиэтил)-5-(и-6)-карбоксифлуоресцеин CW — калькофлуор белый

DIC — дифференциальный интерференционный контраст Е. coli — Escherichia coli

FITC-ConA - конконавалин А, конъюгированный с флуоресцеин изотиоцианатом

GFP - зеленый флуоресцентный белок

LR-полимераза - полимераза высокой точности (Long Read)

mQ - деионизованная вода

PBS - фосфатно-солевой буфер

Pfu-полимераза - полимераза высокой точности (Pili)

PI - пропидий йодид

S. cerevisiae — Saccharomyces cerevisiae

TMR — тетраметилродамин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологический анализ функциональной асимметрии пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях стресса»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae, находясь в экспоненциальной фазе роста, размножаются почкованием, то есть делятся асимметрично. Исходную клетку принято называть материнской, а новообразованную — дочерней. Известно, что материнская клетка дрожжей способна дать ограниченное количество дочерних (Mortimer and Johnston, 1959). При этом с каждым последующим делением размер клетки увеличивается, а последние несколько клеточных циклов проходят значительно дольше предыдущих (Mortimer and Johnston, 1959). Этот феномен был назван репликативным старением дрожжей, а количество дочерних клеток, образованных материнской, ее репликативным возрастом. В последнее время опубликовано много работ, указывающих на сходство репликативного старения дрожжей и старения высших эукариот.

Примером является ограничение калорийности питания, увеличивающее как продолжительность жизни высших эукариот, так и репликативную продолжительность жизни (РПЖ) дрожжей. Другим примером является дрожжевой ген SIR2 — КАО+-зависимая деацетилаза гистонов, гомолог SIRT1 млекопитающих, который дозо-зависимо продлевает РПЖ дрожжей, а также оказывает влияние на старение высших эукариот (Kaeberlein et al., 2013). Поэтому репликативное старение дрожжей считается моделью для исследования старения высших организмов.

Степень разработанности темы. Асимметричное деление приводит к тому, что дочерняя клетка сильно отличается от материнской. Примерами таких отличий является разница в профиле экспрессии некоторых генов между материнской и дочерней клетками (Cosma et al., 2004), а также то, что клеточная стенка дочерней клетки синтезируется de novo (Mortimer and Johnston, 1959). Существует также ряд потенциально токсичных факторов, которые наследуются преимущественно материнскими клетками: карбонилированные белки (Aguilaniu et al., 2003) и экстрахромосомальные

рибосомальные кольцевые ДНК (Sinclair et al., 1997). Более того, ранее было показано, что такая асимметрия формируется в результате работы специальной системы, одним из компонентов которой является комплекс белков, называемых полярисомой (Liu et al., 2010).

Асимметричное распределение ряда факторов между материнской и дочерней клешами, по-видимому, приводит к тому, что такие факторы накапливаются в материнских клетках с каждым последующим делением, как это было показано для экр-ДНК (Sinclair et al., 1997) и карбонилированных белков (Aguilaniu et al., 2003). Считается, что именно эти факторы приводят к тому, что репликативная продолжительность жизни дрожжей ограничена (Nystrom, 2014). Интересно, что отсутствие асимметрии деления по этим факторам приводит к снижению репликативной продолжительности жизни до 10-15 делений (Kaeberlein et al., 1999). Однако в экспоненциальной фазе роста культура клеток дрожжей будет более чем на 95% представлена клетками в возрасте от 1 (дочерних клеток) до 5 (материнских клеток, давших 4 дочерних). Отсюда возникает вопрос: какова функция асимметрии деления, если ее отсутствие не сказывается на выживаемости подавляющей фракции клеток дрожжей, находящихся в экспоненциальной фазе роста? В данной работе мы показали, что эффект отсутствия асимметрии деления проявляется в стрессовых условиях.

С другой стороны, асимметрия деления приводит не только к тому, что дочерние клетки дрожжей сильно отличаются от материнских, но и материнские клетки разного репликативного возраста серьезно отличаются друг от друга по ряду параметров. Как оказалось, культура клеток дрожжей дифференцирована по своей устойчивости к тепловому шоку, что связано с концентрацией белка Tsllp, ответственного за биосинтез трегалозы (Levy et al., 2012). Более того, эти исследователи обнаружили накопление клетками дрожжей Tsllp уже после первых делений, и это накопление приводило к снижению скорости роста (Levy et al., 2012). Получается, что культура клеток дрожжей дифференцирована с целью разделетая рисков (от англ. «bet

hedging»): часть клеток делятся быстро, а часть в ущерб скорости удвоения накапливают Tsllp, на случай резкого повышения температуры. Другие исследователи, используя данные Леви и соавторов (2012) подтвердили преимущества такой стратегии с помощью математического моделирования (Hartwell et al., 2014).

Действительно, стратегия разделения рисков — явление встречающееся и среди бактерий (Rainey et al., 2011), и среди растений (Childs DZ et al, 2010). Поэтому изучение этой стратегии с использованием такого детально изученного объекта как пекарские дрожжи, может представлять широкий научный интерес. Более того, разделение рисков у дрожжей в форме возраст-зависимой дифференцировки, тесно связано с репликативным старением, которое, в свою очередь, является экспериментальной моделью старения высших эукариот.

Цели и задачи. Целью настоящей работы было усовершенствование дрожжевой модели старения эукариотической клетки. Для достижения дели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер зависимости устойчивости к различным типам стресса от репликативного возраста дрожжей S. cerevisiae.

2. Найти факторы, которые влияют на характер зависимости стрессоустойчивости от репликативного возраста.

3. Изучить изменения, которые происходят в клетках дрожжей S. cerevisiae на ранних этапах репликативного старения.

Научная новизна. Впервые было показано, что отсутствие асимметрии деления дрожжей сказывается на выживаемости клеток в стрессовых условиях. В данной работе также было показано, что снижение выживаемости с увеличением репликативного возраста клеток дрожжей, находящихся в стрессовых условиях, начинается уже после 4-го деления. Данные представленной работы позволяют предположить, что такое снижение стрессоустойчивости связано с митохондриальной дисфункцией. В ходе данного исследования был получен штамм дрожжей, в котором ген оротидин

фосфат декарбоксилазы находится под контролем НО промотора, и с помощью этого штамма было показано, что в старых клетках дрожжей снижена вероятность экспрессии НО, что свидетельствует в пользу того, что в старых клетках дрожжей с меньшей вероятностью происходит спонтанная смена типа спаривания.

Теоретическая н практическая значимость работы. Учитывая то, что репликативное старение дрожжей считается моделью старения высших организмов, молено предположить, что данные полученные в ходе представленного исследования могут быть использованы в исследовании процессов старения млекопитающих. Наши данные также свидетельствуют в пользу того, что культура клеток дрожжей, даже находясь в экспоненциальной фазе роста, дифференцирована в следствие асимметричного деления. Это, в свою очередь, может быть полезно многим исследователям, использующим пекарские дрожжи как модельный объект.

Методология н методы исследования. В качестве объекта исследования использовали пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм W303. Дрожжи растили на богатой среде содержащей 2% глюкозы, 2% пептона и 1 % дрожжевого экстракта. Для получения мутантных штаммов использовали синтетические селективные среды, либо богатую среду с добавлением антибиотика (генетицин 250 мкг/мл). Получение мутантных штаммов дрожжей проводили по стандартному протоколу с использованием полиэтиленгликоля и литий-ацетатпого буфера. Генетические конструкции были получены стандартными молекулярно-биологическими методами (ПЦР, рестрикция, лигирование). Клетки Е. coli трансформировали электропорацией. Для получения микрофотографий клеток дрожжей использовали флуоресцентный микроскоп Olympus ВХ51.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки S. cerevisiae в культуре, находящейся в экспоненциальной фазе роста, дифференцированы по своей стрессоустойчивости в зависимости от репликативного возраста.

2. Асимметрия деления дрожжей необходима для повышения стрессоустойчивости дочерних клеток S. cerevisiae.

3. Старые клетки дрожжей хуже приспособлены к такой смене условий, как повышение температуры и недостаток питательных веществ.

4. Деления генов ретроградной сигнализации RTG1 и RTG3 приводит к снижению стрессоустойчивости репликативно старых клеток.

5. В репликативно старых клетках S. cerevisiae снижена экспрессия НО промотора, по сравнению с репликативно молодыми.

Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Биология - наука XXI века. 14 международная путинская школа-конференция, (2010); Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010»; Microbial stress from molecules to systems, (2012) Belgirate, Italy; 9th International Meeting on Yeast Apoptosis, Rome, Italy, (2012); 3-ий съезд микологов в России, (2012) Москва; Рецепторы и внутриклеточная сигнализация, (2013) Пущино.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Характеристика дрожжей как модельного объекта эукариотической

клетки

Пекарские дрожжи Засскаготусеь сегеу1$1ае являются удобным, хорошо изученным модельным объектом для исследования эукариотической клетки. Дрожжи обладают высокой скоростью роста: время удвоения в экспоненциальной фазе роста — около полутора часов, что значительно меньше времени удвоения клеток высших эукариот, поэтому пекарские дрожжи проще культивировать. & сегеушае также являются более удобным объектом для генетических манипуляций, чем высшие эукариоты. Для них быстрее и проще выполняются процессы получения штаммов с нокаутом определенного гена или набора генов, постановки гена под индуцибельный промотор, проведения генетических скринингов как с положительной, так и с отрицательной селекцией.

Однако при этом внутриклеточные молекулярные механизмы жизнедеятельности сегеушае схожи с соответствующими механизмами у высших эукариот. Таким образом, се/'еушае являются релевантной моделью для исследования эукариотической клетки.

Но при использовании & сеггугзгае в качестве модельного объекта, необходимо учитывать, что культура клеток дрожжей не является однородной: в зависимости от условий клетки в такой культуре могут значительно отличаться по ряду морфологических и биохимических признаков, т.е. можно говорить о своего рода дифференцировке клеток.

2. Дифферснцировка дрожжей как следствие асимметрии деления

Как известно, клетки пекарских дрожжей размножаются почкованием, то есть делятся асимметрично (НаИлуеП 1977). При этом одну из клеток в

литературе принято называть материнской, а новообразовавшуюся клетку -дочерней.

Известно, что при почковании клеточная стенка дочерней клетки синтезируется de novo (Mortimer et al. 1959). Одна материнская клетка может произвести несколько дочерних, и после каждого деления на материнской клетке будет оставаться зона округлой формы, обогащенная хитином по сравнению с остальной поверхностью клетки. В литературе эту зону обычно называют «почечным рубцом» (от англ. bud scar). Известно, что почечные рубцы можно визуализировать при помощи флуоресцентного красителя — калькофлуора белого, который связывается с хитином (Pringle 1991). Было показано, что почка на дрожжевой клетке не образуется в одном и том же месте дважды (Mortimer et al. 1959). Поэтому по количеству почечных рубцов можно определить количество дочерних клеток, которые дала материнская клетка. Эта характеристика дрожжевой клетки называется ее репликативным возрастом.

С увеличением репликативного возраста также несколько увеличивается размер клетки (Powel et al. 2003).

Таким образом, культура клеток S. cerevisiae, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, будет гетерогенна, т.к. будет состоять из клеток с разным репликативным возрастом.

3. Асимметричность деления дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Асимметричное деление S. cerevisiae приводит к тому, что образовавшиеся клетки существенно отличаются друг от друга по множеству параметров. Рядом авторов было показано, что поддержание асимметрии формируется уже при образовании почки на материнской клетке. Затем по мере роста клетки асимметрия поддерживается за счет специальных механизмов. Это приводит к тому, что в материнской и дочерней клетках различаются: (1) профили экспрессии некоторых генов, (2) длины некоторых фаз клеточного цикла, (3) концентрация окисленных (карбонилированных белков), (4)

концентрация экстрахромосомальных кольцевых рДНК. Также было показано: (5) асимметричное распределение органелл между материнской и дочерней клетками, в частности, митохондрии с функциональной аконитазой наследуются преимущественно дочерними клетками (6) дочерняя клетка наследует только полноценные ядерные поры (7) после удвоения полюс веретена деления остаётся в материнской клетке.

4. Асимметричное наследование макромолекулярных комплексов

клетками S. cerevisîae

В 2013 году Menendez-Benito et al. предложили систему для наблюдения за включением новых белков в различные компартменты клеток дрожжей в режиме реального времени (система RITE). Система состоит из индуцируемой (3-эстрадиолом Сге-рекомбиназы и кассеты, которая тэгирует интересующий ген. Схематически работа системы изображена на рисунке 1.

□ LoxP

22n3EEffiLoxP

6v orf s ЕЗЗШИШ

Рисунок 1. Работа системы RITE. Источник - Menendez-Benito et al.,2013.

Данная касета трансформируется в геном дрожжей. При этом дрожжи экспрессируют целевой ген, в виде гибридного белка с ОБР. Затем добавляется (3-эстрадиол, индуцируется Сге-рекомбиназа, происходит рекомбинация по ЬохР сайтам, имеющимся в кассете, и участок, кодирующий ОРР вьпцепляется,

а на его месте оказывается RFP, таким образом после добавления р-эстрадиола клетки экспрессируют целевой ген в виде гибрида белка уже с RFP, и становится возможным отличить новообразованные белки.

Авторы этой работы с использованием системы RITE исследовали распределение новосинтезированных белков во многих клеточных органеллах iS. cerevisiae, и получили, что в большинстве органелл новые и старые белки распределены равномерно. Однако были и исключения. Так, например, новосинтезированные белки, формирующие ядерную пору, не перемешивались с белками, синтезированными до добавления p-эстрадиола (рисунок 2). Интересно, что ново- и старосинтезированные ядерные поры наследовались между материнскими и дочерними клетками равномерно.

Nuclear Pore Complex (NPC) Nup57 Nup188

GFP (old)

RFP

(new)

GFP RFP Nuclei

DIC

Рисунок 2. Новосинтезированные белки формируют новые ядерные поры, не встраиваясь в старые. Белки Nup57 и Nupl88 тэгированны с помощью системы RITE. Источник -Menendez-Benito et al., 2013.

Были исключения и из равномерного наследования между материнской и дочерней клетками. Так, новосинтезированные белки полюса веретена деления практически не попадали в дочернюю клетку, а большая их часть во время деления попадала в материнскую (рисунок 3).

Рисунок 3. Схема наследования новосинтезированных белков полюса веретена деления дочерними клетками. Источник - Мепеп(1е2-Вепио й а1., 2013.

Авторы объясняют такое наследование белков полюса веретена деления тем, что новосинтезированных белков может быть недостаточно для последующих делений, поэтому дочерняя клетка и наследует большую часть уже имеющихся белков (МепепсЬг-Вепйо е1; а!., 2013).

5. Различие длин фаз клеточного цикла материнской и дочерней клетки

5. сетех1ъ1ае

Хорошо известно, что первый клеточный цикл дрожжевая клетка проходит всегда медленнее, чем последующие. Было показано, что активность

Асе2р приводит к удлинению времени прохождения G1 фазы клеточного цикла в дочерней клетке (Рисунок 4, Talia 2009). Этот эффект достигается из-за уменьшения уровня экспрессии циклина CLN3 (Laabs 2003, Talia 2009), активирующего дрожжевую циклин-зависимую киназу Cdc28p для перехода из G1 в S фазу клеточного цикла (Cross 1988). Талиа и коллеги также показали, что Асе2р, Ashlp и Swi5p напрямую регулируют экспрессию CLN3 (Talia 2009).

Рисунок 4. Специфичная для дочерних клеток задержка в 01 стадии клеточного цикла (ТаИа 2009, рисунок с изменениями).

Талиа и коллеги выдвигали гипотезу о том, что задержка в дочерних клеток необходима для того, чтобы клетка достигла определенного размера перед тем, как начать следующее деление. При этом они показали, что есть обратная корреляция между начальным размером дочерней клетки и временем задержки первого клеточного цикла в С1. Причем эта корреляция сохраняется в клетках с делетированным геном СЬШ, и это, видимо, говорит о том, что за контроль времени задержки отвечает не только С1пЗр (ТаНа 2009).

Появление почки

Материнская

t + 8 минут

Цнтокенез

Появление почки

6. Различие профилей экспрессии материнской и дочерней клетки

S. cerevisiae

Профили экспрессии некоторых генов в материнской и дочерней клетках дрожжей различаются из-за асимметричного распределения двух транскрипционных факторов: Асе2р и Ashlp. Эти факторы специфически локализуются в дочерней клетке.

Асимметричное распределение Асе2р обусловлено работой комплекса Mob2-Cbkl, который переносит Асе2р специфически в ядро дочерней клетки. Примером гена, экспрессия которого активируется Асе2р является CTS1, кодирующий фермент эндохитиназу, необходимый для отделения дочерней клетки от материнской (O'Conallain 1999).

В свою очередь, дочко-специфичная локализация Ashlp является следствием активного транспорта AST/7-мРНК сначала к месту формирования почки, а затем в ядро дочерней клетки (Cosma 2004). Ashlp репрессирует экспрессию ЯО-эндонуклеазы, которая отвечает за смену типа спаривания у дрожжей (Bobola 1996, Sil 1996). Таким образом, НО экспрессируется специфично в материнских клетках.

Фактор транскрипции Swi5p также способен связываться с НО-промотором, но при этом активировать транскрипцию. Swi5p распределяется равномерно между материнской и дочерней клетками, и обычно быстро деградирует в Gl стадии (Tebb 1993), а экспрессируется SWI5 в S, G2 и М стадиях клеточного цикла. Однако в том случае, если Swi5p не полностью деградирован, он может связываться с ЯО-промотором и активировать экспрессию ЯО-эндонуклеазы. В таком случае становится возможным смена типа спаривания дочерними клетками.

7. Типы спаривания дрожжей и НО-эндонуклеаза

Гаплоидные клетки дрожжей могут быть двух типов спаривания, эти типы принято называть a-тип и альфа-тип. Определяется тип спаривания тем, какой набор генов находится в так называемом МАТ локусе (от англ. "mating"). Если на достаточно близком расстоянии находятся клетки разных типов спаривания, то они могут слиться и образовать диплоидную клетку, которая имеет ряд преимуществ перед гаплоидными, например, повышенную стрессоустойчивость. Слияние обеспечивается специальной системой, которая приводится в действие феромонами: клетки одного топа спаривания выделяют феромон, на который реагируют клетки противоположного типа, и наоборот.

В S. cerevisiae есть специальная система, которая позволяет гаплоидным клеткам спонтанно менять тип спаривания. Она необходима для того, чтобы, в случае отсутствия клеток противоположного типа спаривания, в этой культуре могли появиться диплоидные клетки, имеющие массу преимуществ перед гаплоидными.

Однако смена типа спаривания возможна только в материнских клетках, и невозможна в дочерних. Это необходимо для того, чтобы 4 гаплоидных клетки (которые содержатся в споре, образованной диплоидной клеткой на бедной среде) не могли менять тип спаривания во время первого деления. Схематически жизненный цикл дрожжей изображен на рисунке 5 (Haber, 2012).

MATa MATa

Spore

germination

haptoids

Ascus

Nitrogen

starvation

©

Meiosis and Sporulation

Stationary phase 61 arrest

Polar

budding in diploids

AshlmRNA localization in bud

MATa

MATa

MATa/MATa

éf) diploids 4__/

Mitosis Cytokinesis

О

MATa

Ashl represses HO expression in daughter

HO-induced MAT switching in late G1 Mother and new daughter switch

MATa

MATa

О

Axial

budding in haploids

MATa

MATa

Mating Zygote formation

Рисунок 5. Жизненный цикл пекарских дрожжей S.cerevisiae. Источник - Haber, 2012.

Смена типа спаривания происходит по механизму генной конверсии. В геноме дрожжей помимо МАТ локуса имеются также два локуса HML и HMR, в которых содержатся гены соответствующего типа спаривания. Однако экспрессии генов в этих локусах не происходит из-за сайленсинга, а тип спаривания определяется исключительно тем, какой набор генов находится в МАТ локусе. Функция НО-эндонуклеазы заключается в создании разрывов ДНК в МАТ локусе, которые репарируются рекомбинацией с одним из локусов HML или HMR (Haber, 2012). Схематически этот процесс изображен на рисунке 6.

RE

HMLa

Ya

а2 a1t

lui

МЛ Га Ya

НО endonuclease

С

W X

•с

M А Та

«2 а1 Ya

Рисунок 6. Схема молекулярного механизма смены типа спаривания клетками дрожжей 5. cerevisiae. Источник - Haber, 2013.

Как уже говорилось выше, экспрессия НО эидоиуклеазы проходит только в материнских клетках, в силу асимметричного накопления дочерними клетками репрессора НО промотора Ash 1р.

8. Механизм формирования асимметрии между материнской и дочерней

клеткой дрожжей

Каков же механизм формирования асимметрии между материнской и дочерней клетками S. cerevisiae? Известно, что ключевую роль в формировании асимметрии играет белок Sir2p. Ген SIR2 консервативен: его гомологи встречаются у дрожжей, нематод, мух и рыб; SIR2 влияет на продолжительность жизни этих организмов (Guarente, 2000; Imai et al., 2000; Rogina and Helfand, 2004; Sinclair, 2002; Tissenbaum and Guarente, 2001). Sir2p обладает белок-деацетилирующей активностью, в частности, было показано, что Sir2p - ЫАО+-зависимая деацетилаза гистонов (Landry et al. 2000). Таким образом, Sir2p является регулятором транскрипции.

Лиу и коллеги реконструировали глобальную сеть генетических взаимодействий гена SJR2, и показали, что полярисома, формин Bnilp и моторный белок миозин Муо2р необходимы для осуществления транспорта поврежденных белков из дочерней клетки в материнскую во время цитокенеза (Liu et al. 2010).

Схематично механизм работы полярисомы изображен на рисунке 7 (Liu et al. 2010). Полярисомой авторы называют белковый комплекс, расположенный на «верхушке почки» (от англ. bud tip, Рисунок 7, Liu et al. 2010).

Транспорт белковых агрегатов является актин-зависимым. Sir2p влияет на этот процесс через шаперонин ССТ (Liu et al. 2010), который отвечает за фолдинг актина (Brackley and Grantham, 2009). По-видимому, Sir2p влияет на ССТ напрямую, т.к. в клетках мутантного штамма дрожжей sir2А уровень ацетилирования ССТ значительно выше, чем в клетках дикого типа, при этом разницы в концентрации ССТ обнаружено не было. Также было показано, что ацетилирование ССТ приводит к неправильному сворачиванию актина (Liu et al. 2010).

Рост цепи Полярисома

Агрегаты белков

Направление My о 2

Рисунок 7. Гипотетическая модель участия полярисомы в ретроградном транспорте и удерживании белковых агрегатов в материнской клетке (Liu et al, 2010, рисунок с изменениями)

Помимо транспорта белковых агрегатов из дочерней клетки в материнскую полярисома, возможно, участвует в формирован™ асимметрии по транскрипционному фактору Ashlp. Сначала ASH1-мРНК связывается с белками She2p и Loclp в ядре, т.е. формируется мРНП, и экспортируется в цитоплазму. Затем белок She3p связывается уже с мРНП и выступает в роли адаптера для присоединения к моторному белку миозину Муо4р. При помощи Муо4р уДОЯУ-мРНП транспортируется по актину в «верхушку почки» и удерживается там при помощи белков Bnilp или Bud6p (Irie et al. 2002, Beach et al. 2001), которые являются компонентами полярисомы (Liu et al. 2010).

9. Асимметричное деление и репликативная продолжительность жизнн

Какова функция поддержания асимметрии между материнской и дочерней клеткой? Известно, что материнская клетка может сделать ограниченное количество делений, которое называется репликативной продолжительностью жизни, после чего умирает (Mortimer et al. 1959). Это является следствием того, что с возрастом клетка накапливает факторы старения. К таким факторам у S. cerevisiae относятся, например, окисленные, в частности, карбонилированные белки. Известно, что карбонилирование белка часто приводит к потере функциональной активности, а при увеличении концентрации таких белков они могут образовывать агрегаты, которые токсичны для клетки (Bota et al. 2002). Aguilaniu et al. показали, что карбонилированные белки не наследуются дочерними клетками. Более того, асимметричное наследование этих факторов приводит к тому, что они накапливаются в клетках дрожжей с возрастом (Рисунок 8). Важно отметить, что отсутсвие асимметрии в штамме с делецией SIR2 приводило к тому, что карбонилированные белки распределялись равномерно между материнской и дочерней клетками.

(Л

■О

Е

гэ

с ф

СП <0

о> >

<

12 10 8 6 4 2

1

JL

со ф

э <0

100 |

'•О

SS а>

80 -

I 60 |

40 |

С

20 о

A Bright Field ImFI Carbonyls

r 'f *Y

Age

2 3 4 Fraction

Рисунок 8. Репликативно старые клетки дрожжей накапливают карбонилированные белки. Предварительно получены фракции клеток разных репликативных возрастов. Слева: пустые колонки - среднее количество почечных рубцов во фракции клеток, заштрихованные колонки - уровень карбонилирования белков. Справа: микрофотография клеток дрожжей, окрашенных флуоресцентным красителем, связывающимся с карбонилированными белками. Источник - Aguilaniu et al. 2003.

Также к факторам старения относятся экстрахромосомальные кольцевые рДНК (экрДНК). Они образуются вырезанием из локуса рДНК на хромосоме и реплицируются, т.к. содержат ARS (от англ. «Autonomous Replicative Sequence»). Показано, что экрДНК быстро копятся с увеличением возраста клетки и при этом являются токсичными, т.к. затрудняют репликацию и транскрипцию с геномной ДНК (Sinclair et al. 1997).

По-видимому, накопление экрДНК, карбонилированных и агрегированных белков и приводит к тому, что репликативная продолжительность жизни S. cerevisiae ограничена. Однако благодаря тому, что деление дрожжей асимметрично, т.е. дочерняя клетка не наследует факторы старения материнской клетки и рождается «обновленной», культура дрожжей клонально не вырождается (Erjavec et al. 2007). Клональным вырождением в научной литературе принято называть постепенную гибель всей клеточной

линии ^аглутБк! 2004). Интересно, что в случае отсутствия асимметрии в штамме 5¿г2А средняя репликативная продолжительность жизни снижена. Видимо, это объясняется тем, что при делении дочерние клетки получают от материнских факторы старения, т.е. рождаются не «обновленными».

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сорокин, Максим Игоревич, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Allen, С., Buttner, S., Aragon, A.D., Thomas, J.A., Meirelles, О., Jaetao, J.E., Benn, D., Ruby, S.W., Veenhuis, M., Madeo, F., Werner-Washburne, M. Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.//J Cell Biol. - 2006. - 174. - 89-100

2. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, Т. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis.//Science. - 2003. -299. - 1751-1753

3. Beach, D.L., Bloom, K. ASH1 mRNA localization in three acts.//Mol Biol Cell. -2001. - 12.-2567-2577

4. Bobola, N., Jansen, R.P., Shin, Т.Н., Nasmyth, K. Asymmetric accumulation of Ashlp in postanaphase nuclei depends on a myosin and restricts yeast mating-type switching to mother cells.//Cell. - 1996. - 84. - 699-709

5. Bota, D.A., Davies, K.J. Lon protease preferentially degrades oxidized mitochondrial aconitase by an ATP-stimulated mechanism.//Nat Cell Biol. - 2002. . 4. _ 674-680

6. Brackley, K.I., Grantham, J. Activities of the chaperonin containing TCP-1 (CCT): implications for cell cycle progression and cytoskeletal organisation.//Cell Stress Chaperones. - 2009. - 14. - 23-31

7. Burtner, C.R., Murakami, C.J., Kennedy, B.K., Kaeberlein, M. A molecular mechanism of chronological aging in yeast.//Cell Cycle. - 2009. - 8. - 1256-1270

8. Cardenas, M.E., Cutler, N.S., Lorenz, M.C., Di Como, Heitman, J. The TOR signaling cascade regulates gene expression in response to nutrients.//Genes Dev. - 1999. - 13. - 3271-3279

9. Childs, D.Z., Metcali; C.J., Rees, M. Evolutionary bet-hedging in the real world: empirical evidence and challenges revealed by plants.//Proc Biol Sei. - 2010. -277. - 3055-3064

10. Choder, M. A general topoisomerase I-dependent transcriptional repression in the stationary phase in yeast.//Genes Dev. - 1991. - 5. - 2315-2326

11. Cosma, M.P. Daughter-specific repression of Saccharoinyces cerevisiae HO: Ashl is the commander.//EMBO Rep. - 2004. - 5. - 953-957

12. Cross, F.R. DAF1, a mutant gene affecting size control, pheromone arrest, and cell cycle kinetics of Saccharomyces cerevisiae.//Mol Cell Biol. - 1988. - 8. -4675-4684

13. Davey, H.M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide.//Environ Microbiol. -2011.- 13.- 163-171

14. Davidson, J.F., Schiestl, R.H. Cytotoxic and genotoxic consequences of heat stress are dependent on the presence of oxygen in Saccharomyces cerevisiae.//J Bacteriol. - 2001. - 183. - 4580-4587

15. Di Talia, Wang, H„ Skotheim, J.M., Rosebrock, A.P., Futcher, B., Cross, F.R. Daughter-specific transcription factors regulate cell size control in budding yeast.//PLoS Biol. - 2009. - 7. - el000221

16. Dickinson, J.R. 'Fusel1 alcohols induce hyphal-like extensions and pseudohyphal formation in yeasts.//Microbiology. - 1996. - 142 . - 1391-1397

17. Erjavec, N., Nystrom, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae.//Proc Natl AcadSciU S A. -2007. - 104. - 10877-10881

18. Fuge, E.K., Braun, E.L., Werner-Washburne, M. Protein synthesis in long-term stationary-phase cultures of Saccharomyces cerevisiae.//J Bacteriol. - 1994. - 176. -5802-5813

19. Fujii, M., Miki, K., Takayama, S., Ayusawa, D. Identification of genes that affect sensitivity to 5-bromodeoxyuridine in the yeast Saccharomyces cerevisiae.//Mol Genet Genomics. - 2010. - 283. - 461-468

20. Gasch, A.P., Spellman, P.T., Kao, C.M., Carmel-Harel, O., Eisen, M.B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.//Mol Biol Cell. - 2000. - 11. - 4241-4257

21. Granek, J. A., Magwene, P.M. Environmental and genetic determinants of colony morphology in yeast.//PLoS Genet. - 2010. - 6. - el000823

22. Guarente, L. Sir2 links chromatin silencing, metabolism, and aging.//Genes Dev. -2000. - 14. - 1021-1026

23. Haber, J. Mating-type genes and MAT switching in Saccharomyces cerevisiae.//Genetics. - 2012. - 191. - 33-64

24. Hartwell, L.H., Unger, M.W. Unequal division in Saccharomyces cerevisiae and its implications for the control of cell division.//J Cell Biol. - 1977. - 75. - 422-435

25. Hellweger, F.L., Fredrick, N.D., Berges, J.A. Age-correlated stress resistance improves fitness of yeast: support from agent-based simulations.//BMC Syst Biol. -2014.-8. - 18

26. Hughes, A.L., Gottschling, D.E. An early age increase in vacuolar pH limits mitochondrial function and lifespan in yeast.//Nature. - 2012. - 492. - 261-265

27. Imai, S., Armstrong, C.M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase.//Nature. - 2000. - 403. - 795-800

28. Irie, K., Tadauchi, T., Takizawa, P.A., Vale, R.D., Matsumoto, K., Herskowitz, I. The Khdl protein, which has three KH RNA-binding motifs, is required for proper localization of ASH1 mRNA in yeast.//EMBO J. - 2002. - 21. - 1158-1167

29. Jarolim, S., Millen, J., Heeren, G., Laun, P., Goldfarb, D.S., Breitenbach, M. A novel assay for replicative lifespan in Saccharomyces cerevisiae.//FEMS Yeast Res. - 2004. - 5. - 169-177

30. Jazwinski, S.M. Yeast replicative life span—the mitochondrial connection.//FEMS Yeast Res. - 2004. -5.- 119-125

31. Jiang, J.C., Jaruga, E., Repnevskaya, M.V., Jazwinski, S.M. An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.//FASEB J. - 2000. - 14. - 2135-2137

32. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.//Genes Dev. - 1999. - 13. - 2570-2580

33. Kaeberlein, M., Powers, R.W., Steffen, K.K., Westman, E.A., Hu, D., Dang, N.. Kerr, E.O., Kirkland, K.T., Fields, S., Kennedy, B.K. Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.//Science. - 2005. -310. - 1193-1196

34. Kennedy, B.K., Austriaco, N.R., Guarente, L. Daughter cells of Saccharomyces cerevisiae from old mothers display a reduced life span.//J Cell Biol. - 1994. - 127.

- 1985-1993

35. Kim, S., Benguria, A., Lai, C.Y., Jazwinski, S.M. Modulation of life-span by histone deacetylase genes in Saccharomyces cerevisiae.//Mol Biol Cell. - 1999. -10.-3125-3136

36. Kirchman, P.A., Botta, G. Copper supplementation increases yeast life span under conditions requiring respiratory metabolism.//Mech Ageing Dev. - 2007. -128. - 187-195

37. Klinger, H., Rinnerthaler, M., Lam, Y.T., Laun, P., Heeren, G., Klocker, A., Simon-Nobbe, B., Dickinson, J.R., Dawes, I.W., Breitenbach, M. Quantitation of (a)symmetric inheritance of functional and of oxidatively damaged mitochondrial aconitase in the cell division of old yeast mother cells.//Exp Gerontol. - 2010. - 45.

- 533-542

38. Laabs, T.L., Markwardt, D.D., Slattery, M.G., Newcomb, L.L., Stillman, D.J., Heideman, W. ACE2 is required for daughter cell-specific G1 delay in Saccharomyces cerevisiae.//Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - 100. - 1027510280

39. Lai, C.Y., Jaruga, E., Borghouts, C., Jazwinski, S.M. A mutation in the ATP2 gene abrogates the age asymmetry between mother and daughter cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.//Genetics. - 2002. - 162. - 73-87

40. Lam, Y.T., Aung-Htut, M.T., Lim, Y.L., Yang, H., Dawes, I.W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells.//Free Radic Biol Med. - 2011. - 50. - 963-970

41. Lam, Y.T., Stocker, R., Dawes, I.W. The lipophilic antioxidants alpha-tocopherol and coenzyme Q10 reduce the replicative lifespan of Saccharomyces cerevisiae.//Free Radic Biol Med. - 2010. - 49. - 237-44

42. Landry, J., Sutton, A., Tafrov, S.T., Heller, R.C., Stebbins, J., Pillus, L., Sternglanz, R. The silencing protein SIR2 and its homologs are NAD-dependent protein deacetylases.//Proc Natl Acad Sci USA.- 2000. - 97. - 5807-11

43. Lee, R.E., Brunette, S., Puente, L.G., Megeney, L.A.// Proc Natl Acad Sci U S A.-2010.- 107.-13348-53

44. Levy, F., Ziv, N., Siegal, M.L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.//Plos Biol 10. - 2012. - el001325. -

45. Liu, B., Larsson, L., Caballero, A., Hao, X., Oling, D., Grantham, J., Nystrom, T. The polarisome is required for segregation and retrograde transport of protein aggregates.//Cell. - 2010. - 140. - 257-67

46. Lord, P.G., Wheals, A.E. Asymmetrical division of Saccharomyces cerevisiae.//J Bacteriol. - 1980. - 142. - 808-18

47. Martin, D.E., Hall, M.N. The expanding TOR signaling network.//Curr Opin Cell Biol. -2005. - 17. - 158-66

48. Masoro, E.J. Dietary restriction.//Exp Gerontol. - 1995. - 30. - 291-8

49. McFaline-Figueroa, J.R., Vevea, J., Swayne, T.C., Zhou, C., Liu, C., Leung, G., Boldogh, I.R., Pon, L.A. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.//Aging Cell. - 2011. - 10. - 885-95

50. Meeusen, S., McCaffery, J.M., Nunnari, J. Mitochondrial fusion intermediates revealed in vitro.//Science. - 2004. - 305. - 1747-52

51. Menendez-Benito, V., van Deventer, S.J., Jimenez-Garcia, V., Roy-Luzarraga, M., van Leeuwen, F., Neefjes, J. Spatiotemporal analysis of organelle and macromolecular complex inheritance./ZProc Natl Acad Sci USA.- 2013. - 110. -175-80

52. Mortimer, R.K., Johnston, J.R. Life span of individual yeast cells.//Nature. -1959. - 183. - 1751-2

53. Motizuki, M., Yokota, S., Tsurugi, K. Autophagic death after cell cycle arrest at the restrictive temperature in temperature-sensitive cell division cycle and secretory mutants of the yeast Saccharomyces cerevisiae.// Eur J Cell Biol. -

1995.-68-275-287.

54. Nasmyth, K., Seddon, A., Ammerer, G. Cell cycle regulation of SW15 is required for mother-cell-specific HO transcription in yeast.//Cell. - 1987. - 49. -549-558

55. O'Conallain, C., Doolin, M.T., Taggart, C., Thornton, F., Butler, G. Regulated nuclear localisation of the yeast transcription factor Ace2p controls expression of chitinase (CTS1) in Saccharomyces cerevisiae.//in Saccharomyces cerevisiae. (1999) Mol Gen Genet. - 1999. - 262. - 275-282

56. Parsell, D.A., Kowal, A.S., Singer, M.A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hspl04.//Nature. - 1994. - 372. - 475-478

57. Pereira, M.D., Eleutherio, E.C., Panek, A.D. Acquisition of tolerance against oxidative damage in Saccharomyces cerevisiae.//BMC Microbiol. - 2001. - 1. - 11

58. Powell, C.D., Quain, D.E., Smart, K.A. Chitin scar breaks in aged Saccharomyces cerevisiae.//Microbiology. - 2003. - 149. - 3129-3137

59. Pringle, J.R. Staining of bud scars and other cell wall chitin with calcofluor./ZMethods Enzymol. - 1991. - 194. - 732-735

60. Rainey, P.B., Beaumont, H.J., Ferguson, G.C., Gallie, J., Kost, C., Libby, E., Zhang, X.X. The evolutionary emergence of stochastic phenotype switching in bacteria.//Microb Cell Fact. - 2011. - 10 (Suppl 1). - 14

61. Rogina, B., Helfand, S.L. Sir2 mediates longevity in the fly through a pathway related to calorie restriction.//Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. - 101. - 1599816003

62. Sil, A., Herskowitz, I. Identification of asymmetrically localized determinant, Ashlp, required for lineage-specific transcription of the yeast HO gene.//Cell. -

1996.-84.-711-722

63. Sinclair, D.A., Guarente, L. Extrachromosomal rDNA circles—a cause of aging in yeast.//Cell. - 1997. - 91. - 1033-1042

64. Sinclair, D. A. Paradigms and pitfalls of yeast longevity research.//Mech Ageing Dev.-2002. - 123.-857-867

65. Spokoini, R., Moldavski, O., Nahmias, Y., England, J.L., Schuldiner, M., Kaganovich, D.//Cell Rep. - 2012. - 2. - 738-747

66. Starovoytova, A.N., Sorokin, M.I., Sokolov, S.S., Severin, F.F., Knorre, D.A.//FEMS Yeast Res. - 2013. - 13. - 367-374

67. Tebb, G., Moll, T., Dowzer, C., Nasmyth, K. SWI5 instability may be necessary but is not sufficient for asymmetric HO expression in yeast.//Genes Dev. - 1993. -7. - 517-528

68. Tissenbaum, H.A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans.//Nature. - 2001. - 410. - 227-230

69. Vachova, L., Palkova, Z. Physiological regulation of yeast cell death in multicellular colonies is triggered by ammonia.//J Cell Biol. - 2005. - 169. - 711717

70. Veatch, J.R., McMurray, M.A., Nelson, Z.W., Gottschling, D.E. Mitochondrial dysfunction leads to nuclear genome instability via an iron-sulfur cluster defect.//Cell. - 2009. - 137. - 1247-1258

71. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G.C., Singer, R.A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.//Microbiol Rev. - 1993. - 57. - 383401

72. Yang, J., Dungrawala, H., Hua, H., Manukyan, A., Abraham, L., Lane, W., Mead, H., Wright, J., Schneider, B.L. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.//Cell Cycle. - 2011. - 10. - 144-155

73. Zadrag-Tecza, R., Kwolek-Mirek, M., Bartosz, G., Bilinski, T. Cell volume as a . factor limiting the replicative lifespan of the yeast Saccharomyces

cerevisiae.//Biogerontology. -2009. - 10. -481-488

74. Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.//PloS One. - 2012. - 7. - e48275

75. Zhou, С., Slaughter, B.D., Unruh, J.R., Eldakak, A., Rubinstein, В., Li, R. Motility and segregation of Hspl04-associated protein aggregates in budding yeast.//Cell. - 2011. - 147. - 1186-1196

76. Бочарова, H.A. Исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах Saccharomyces cerevisiae: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04/ Бочарова Наталья Александровна - М., 2008. - 147 стр.