Изучение матриксов из полиэфира и белка, полученных методом электроспиннинга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Павлова Елизавета Робертовна

• Павлова Елизавета Робертовна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Павлова Елизавета Робертовна

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Метод электроспиннинга и области его применения

1.2 Электроспиннинг: теоретические основы

1.2.1 Деформация капли на срезе капилляра и инжекция струи

1.2.2 Траектория движения струи и возникновение изгибных деформаций

1.2.3 Осаждение волокон на коллектор

1.3 Форма и морфология волокон, полученных методом электроспиннинга

1.3.1 Образование разветвленных волокон

1.3.2 Образование волокон типа «бусины на ниточке»

1.3.3 Образование лент и морщинистых волокон

1.3.4 Образование пористых волокон

1.4 Электроспиннинг белков

1.5 Электроспиннинг белоксодержащих смесей на основе полилактида

1.5.1 Полилактид как основа смесевых матриксов

1.5.2 Смесевые белоксодержащие матриксы на основе полилактида

1.6 Совместимость полимеров и методы оценки совместимости

1.6.1 Термодинамическая совместимость полимеров

1.6.2 Методы оценки совместимости полимеров

1.6.3 Фазовое разделение компонент в волокнах, полученных электроспиннингом

1.7 Выводы

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Получение матриксов и волокон методом электроспиннинга

2.3 Получение поливных пленок

2.4 Построение трехкомпонентной фазовой диаграммы

2.5 Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

2.6 Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (ЭДС)

2.7 Флуоресцентная микроскопия волокон

2.8 Спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) отдельных волокон

2.9 Спектроскопия КР волокон и лент, визуализированных с помощью СЭМ

2.10 Кинетика высвобождения белка из матриксов в водную среду

2.11 Деградация матриксов ПЛА-БСА в водном растворе азида натрия

2.12 Денатурирующий электрофорез

2.13 Спектроскопия кругового дихроизма

2.14 Иммуноферментный анализ

2.15 Атомно-силовая микроскопия (АСМ) молекул БСА

2.16 Механические испытания

2.17 Рентгеноструктурный анализ

2.18 Определение контактного угла смачивания матриксов

2.19 Исследование роста фибробластов на матриксах ПЛА и ПЛА-БСА

2.20 Оценка антибактериальной активности лизоцима

2.20.1 Бактериальные штаммы и условия культивирования

2.20.2 Диско-диффузионный метод

2.20.3 Оценка диффузного просветления клеточных стенок и убыли оптической плотности суспензий бактерий

2.21 Статистическая обработка данных

Глава 3. Смесь ПЛА-БСА как модельная система - морфологические особенности

3.1 Морфология волокон из полилактида

3.2 Морфология волокон из БСА

3.3 Морфология смесевых волокон

3.4 Выводы

Глава 4. Распределение компонент в смесевых матриксах ПЛА-БСА

4.1 Флуоресцентная микроскопия и элементный анализ волокон ПЛА-БСА

4.2 Спектроскопия комбинационного рассеяния смесевых волокон ПЛА-БСА

4.3 Спектроскопия КР смесевых волокон, визуализированных с помощью СЭМ

4.4 Механические свойства смесевых матриксов

4.5 Выводы

Глава 5. Изучение белковой компоненты и ее влияния на свойства смесевых матриксов

5.1 Кинетика высвобождения белковой компоненты из матрикса

5.2 Деградация смесевых матриксов

5.3 Вторичная структура БСА, высвободившегося из смесевого матрикса

5.4 Антигенная структура БСА, высвободившегося из смесевого матрикса

5.5 Анализ формы молекул БСА методом атомно-силовой микроскопии

5.6 Рост фибробластов 3Т3 на смесевых матриксах

5.7 Выводы

Глава 6. Антибактериальные матриксы, сформированные электроспиннингом смеси ПЛА-лизоцим

6.1 Морфология матриксов ПЛА-лизоцим, полученных методом электроспиннинга

6.2 Элементный анализ смесевых волокон ПЛА-лизоцим

6.3 Кинетика высвобождения лизоцима из смесевого матрикса

6.4 Вторичная структура лизоцима, высвободившегося из матрикса

6.5 Антибактериальная активность лизоцима, высвободившегося из матрикса

6.6 Выводы

Заключение

Благодарности

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение матриксов из полиэфира и белка, полученных методом электроспиннинга»

Введение

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Функциональные полимерные материалы биомедицинского назначения находят широкое применение как в научных разработках, так и в повседневной жизни. В основе массово-используемых медицинских защитных масок и пластырей, а также активно исследуемых и разрабатываемых тканеинженерных конструкций, систем доставки и пролонгированного высвобождения терапевтических средств лежат, как правило, нетканые материалы из биосовместимых полимеров. Среди методов создания полимерных материалов биомедицинского назначения электроспиннинг выделяется своей простотой, гибкостью, масштабируемостью и способностью производить волокна микро- и наномасштаба. Волокнистая структура материалов, сформированных электроспиннингом, может имитировать естественный внеклеточный матрикс тканей, а также обеспечивать необходимую газо- и паропроницаемость и транспорт питательных веществ через поры материала, но при этом служить барьером для бактерий. С каждым годом количество научных статей по тематике электроспиннинга растет, а в мире уже существуют десятки компаний, которые предоставляют свои услуги по разработке материалов на основе электроспиннинга или предлагают готовые изделия, сформированные данным методом.

Электроспиннинг позволяет совмещать в одном материале полимеры, низкомолекулярные органические соединения, наноструктуры (например, наночастицы или нанотрубки), а также минералы. Стратегия совмещения биосовместимого и биодеградируемого полимера с биополимером или биологически активным веществом для получения новых функциональных свойств является одной из наиболее перспективных для биомедицины. В настоящей работе исследуются свойства матриксов, сформированных методом электроспиннинга из смеси полиэфира и белка. Электроспиннинг белков часто затруднен из-за реологических свойств белковых растворов. Поэтому в подобных системах полиэфир служит основой, обеспечивающей проведение электроспиннинга, механическую прочность и целостность конечного материала. Белок, в свою очередь, выступает функциональным элементом, улучшающим биосовместимость материала и выполняющим биологическую функцию, например, терапевтическую в случае белковых лекарственных средств или антител. Полимерная основа также может служить матрицей для инкапсуляции белков с их последующим пролонгированным высвобождением. Несмотря на большое количество работ по электроспиннингу смесей полимеров с белками, систематический подход к выбору условий,

компонент и анализу свойств матриксов отсутствует, а данные касательно функциональных свойств белков в матриксах приводят к противоречивым выводам. Поэтому изучение подобных систем необходимо для выявления общих закономерностей между составом и свойствами материала, их дальнейшей оптимизации и внедрения в медицинскую практику.

Цель и задачи

Цель настоящей работы - изучение физических и биологических свойств смесевых матриксов из полиэфира и белка, сформированных методом электроспиннинга. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение морфологических особенностей смесевых матриксов и их связи с распределением компонент в отдельных волокнах различной формы, а также с наличием фазового разделения в трехкомпонентной смеси «полимер-белок-растворитель».

2. Исследование кинетики высвобождения белковой компоненты, а также ее влияния на механические свойства, скорость деградации матрикса и рост фибробластов на матриксах.

3. Изучение структуры и активности высвободившегося из матрикса белка.

Научная новизна

Для полимер-белковых пар, как и для большинства полимерных систем, характерна термодинамическая несовместимость, которая приводит к фазовому разделению смеси. Фазовое разделение может существенно повлиять на конечные свойства полимерного изделия. Изучение совместимости компонент смеси для электроспиннинга игнорируется в большинстве статей. Редко уделяется внимание и исследованию фазового разделения в конечном продукте электроспиннинга - волокнистом матриксе и отдельных волокнах.

В данной работе был предложен подход к изучению свойств смесевых матриксов, учитывающий фазовое поведение смеси белка и полиэфира в общем растворителе. Впервые было изучено количественное соотношение компонент в единичных смесевых волокнах различной морфологии (в цилиндрических и плоских волокнах). Для этого была реализована технология получения спектров комбинационного рассеяния образцов волокон, предварительно визуализированных и картированных с помощью сканирующей электронной микроскопии.

В работе впервые проведены комплексные исследования вторичной, третичной структуры и активности белков в составе смесевого матрикса после воздействия растворителя и электростатического поля в процессе электроспиннинга, а также изучено влияние белковой компоненты на механические свойства и деградацию матриксов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая ценность данной работы состоит в определении и описании морфологических особенностей смесевых матриксов, а также однокомпонентных белковых и полиэфирных матриксов. Показана зависимость морфологии волокон от состава раствора. Белки из растворов в гексафторизопропаноле (ГФИП) преимущественно формируют ленты, в то время как полиэфиры - цилиндрические волокна. Смесевые матриксы содержат, как волокна, так и ленты. Общность данных результатов продемонстрирована на различных системах. Также было показано, что метод электроспиннинга позволяет совмещать обе компоненты в одном нановолокне вне зависимости от его морфологии даже из смеси с фазовым разделением. Эти результаты могут быть использованы для выбора новых систем полиэфир-белок для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Практическая значимость работы заключается в возможности использования разработанных антибактериальных смесевых матриксов на основе лизоцима в качестве раневых или ожоговых материалов. Было продемонстрировано, что лизоцим в составе матриксов не теряет своей активности по сравнению со свежерастворенным лизоцимом. Также был предложен метод быстрого получения выровненных матриксов из полилактида (ПЛА) путем растяжения в этаноле.

Методология и методы исследования

Изучение морфологии и состава матриксов проводили методами электронной и оптической флуоресцентной микроскопии, энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Для определения степени кристалличности полимера и ориентации молекул в матриксах, деформированных на воздухе и в спирте, использовали метод рентгеновской дифракции в больших углах. Белковую компоненту исследовали методами УФ-спектрофотометрии, спектроскопии кругового дихроизма и комбинационного рассеяния, иммуноферментного анализа и атомно-силовой микроскопии высокого разрешения. Для оценки антибактериальной активности лизоцима использовались диско-диффузионный метод и спектрофотометрический метод оценки диффузного просветления бактериальных стенок Micrococcus lysodeikticus. Для обработки изображений использовалось программное обеспечение FIJI и плагины DiameterJ и OrientationJ. Обработка и статистический анализ данных был проведен с использованием программного обеспечения OriginPro и Microsoft Excel.

Положения, выносимые на защиту:

1. Электроспиннинг позволяет совмещать две термодинамически несовместимые компоненты в одном нановолокне вне зависимости от его морфологии (цилиндрическое или плоское волокно).

2. Добавка бычьего сывороточного альбумина (БСА) в состав матриксов сокращает время их деградации, снижает прочностные характеристики (предельное напряжение и удлинение при разрыве) и уменьшает жесткость матриксов по сравнению с однокомпонентными матриксами из полилактида.

3. Полимерная матрица обеспечивает пролонгированное высвобождение белка (на примере БСА и лизоцима) из смесевого матрикса в водную среду, причем вторичная структура белка восстанавливается после действия растворителя.

4. БСА, высвободившийся из смесевого матрикса, сохраняет около 70% своей антигенной структуры.

5. Смесевые матриксы из ПЛА и БСА обеспечивают более высокую скорость роста фибробластов мыши линии 3Т3 по сравнению с однокомпонентным матриксом из ПЛА, однако, в этом случае адгезия клеток на смесевые матриксы снижается.

6. Лизоцим в составе смесевых матриксов сохраняет свою антибактериальную активность.

Степень достоверности и апробация работы

Результаты диссертационной работы изложены в 10 работах, в том числе 5 статьях в рецензируемых журналах, индексируемых базами Web of Science и Scopus, 1 статье в журнале из списка ВАК и 4 тезисах конференций. Результаты исследований были представлены и обсуждены на следующих конференциях:

1. Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (2015, Пущино, Россия);

2. IV Международная научно-практическая конференция «Наноматериалы и живые системы» (2016, Москва, Россия);

3. Научная конференция молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА (2016, Москва, Россия);

4. 61th Annual Biophysical Society Meeting (2017, Новый Орлеан, США);

5. Открытый конкурс-конференция научно-исследовательских работ по химии элементоорганических соединений и полимеров (2018, Москва, Россия);

6. Научная конференция молодых ученых по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА (2019, Москва, Россия);

7. 23-я международная Пущинская школа-конференция молодых учёных "Биология - наука 21 века" (2019, Пущино, Россия);

8. The 44th FEBS congress (2019, Краков, Польша).

Личный вклад автора

Постановка целей и задач диссертации выполнена автором совместно с научным руководителем. Подготовка экспериментальных образцов, большая часть экспериментальной и аналитической работы проведена лично автором. Подготовка материалов к публикации осуществлялась автором совместно с научным руководителем и соавторами опубликованных работ по теме диссертации. Обобщение полученных результатов, формулировка выводов и положений, выносимых на защиту, сделаны лично автором. Личный вклад автора также отражен в опубликованных работах по теме диссертации.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, четырех глав, заключения, списка сокращений, библиографии, включающей 233 наименования, и приложения. Общий объем работы составляет 124 страницы с 15 таблицами и 51 рисунком. Приложения содержат 3 рисунка.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Метод электроспиннинга и области его применения

Электроспиннинг является современной технологией производства тонких полимерных волокон с диаметрами от нанометров до микрон [1]. Этот метод отличается удобством и простотой и позволяет формировать волокна как в лабораторных, так и в промышленных масштабах [2]. Принципиальная схема электроспиннинга изображена на рисунке 1 . Раствор или расплав полимера помещается в шприц или специальный резервуар и подается на срез капилляра (иглы), подключенного к источнику высокого напряжения. Капля полимера электризуется и деформируется в электрическом поле, что приводит к инжекции струи при достижении критического значения поля, необходимого для преодоления сил поверхностного натяжения и вязкоупругих сил, стабилизирующих каплю на срезе капилляра. По мере продвижения заряженной полимерной струи к противоэлектроду она уменьшается в диаметре и претерпевает изгибные деформации, изменяющие траекторию её движения. В процессе движения заряженной полимерной струи растворитель испаряется (или расплав остывает) и на коллектор осаждается твердое полимерное волокно. На морфологию волокна (пористость или гладкость), его диаметр, форму (цилиндрическое, плоское или более сложной формы), разветвленность или волнистость влияет множество параметров [3]:

> свойства полимерного раствора и растворителя: концентрация раствора, плотность, вязкость, проводимость, поверхностное натяжение, диэлектрическая проницаемость;

^ параметры электроспиннинга: разность потенциалов, расстояние между капилляром и противоэлектродом, объемный расход раствора, геометрия и форма электродов; ^ условия окружающей среды: влажность, температура и давление.

Рисунок 1. Схематическое изображение горизонтального электроспиннинга с проводящим коллектором и одним соплом для инжекции раствора полимера.

Множество тонких полимерных волокон, осажденных на коллектор в процессе электроспиннинга, формируют матрикс. За счет волокнистой структуры матриксы обладают высокой пористостью и большой площадью поверхности (большим соотношением площади поверхности к объему), что определило интерес к ним в области воздушной и жидкостной фильтрации [4-6]. В СССР большое распространение получили так называемые фильтры Петрянова (ФП), разработанные в НИФХИ имени Л. Я. Карпова сотрудниками И. В. Петряновым-Соколовым, Н. Д. Розенблюм и Н. А. Фуксом. Их использовали в армейских противогазах и средствах коллективной химической и бактериологической защиты, изначально они были сделаны из ацетилцеллюлозы, затем начали использовать более дешевую перхлорвиниловую смолу [7]. Помимо фильтров, большое распространение матриксы получили в качестве субстратов для культивирования клеток и основы для тканеинженерных конструкций, поскольку волокнистая структура материала, полученного электроспиннингом, может имитировать естественный внеклеточный матрикс тканей, а пористость обеспечивает транспорт питательных веществ, сигнальных молекул и продуктов метаболизма [8]. Ряд компаний по всему миру производят коммерчески доступные матриксы, полученные электроспиннингом, для культивирования клеток или готовые тканеинженерные конструкции. Например, компания «The Electrospinning Company» [9] из Великобритании предлагает услуги по проектированию, разработке и производству биоматериалов на основе электроспиннинга, а компания "Biostage" [10] из США разрабатывает импланты (cellspun implants) для пищевода, бронхов и трахей на основе клеток пациента и цилиндрического матрикса, полученного электроспиннингом. В регенеративной медицине матриксы, сформированные методом электроспиннинга, находят применение в первую очередь в качестве ожоговых и раневых покрытий [11,12]. Израильская компания «Nanomedic Technologies» [13] разработала коммерчески доступное, портативное устройство "Spincare", основанное на технологии электроспиннинга, для нанесения полимерного защитного слоя непосредственно на рану на коже пациента.

Метод электроспиннинга крайне гибок и позволяет совместить в одном матриксе несколько полимеров, низкомолекулярные терапевтические или антисептические агенты, наночастицы и нанотрубки различной природы, соли и другие неорганические соединения (например, глину) [14]. Поэтому электроспиннинг также находит применение для систем инкапсуляции и пролонгированного высвобождения лекарственных средств; для создания антибактериальных защитных материалов; для сорбции токсичных газов, красителей или масел; для детекции газов,

ионов тяжелых металлов и взрывчатых веществ; для каталитической деградации различных органических соединений [4,15].

1.2 Электроспиннинг: теоретические основы

Формирование волокна и волокнистого слоя (матрикса) методом электроспиннинга включает в себя следующие основные этапы:

^ деформация капли на срезе капилляра и инжекция струи;

> прямолинейный участок траектории струи;

^ начало изгибных деформаций с изменением траектории движения струи;

^ осаждение волокон на коллекторе.

1.2.1 Деформация капли на срезе капилляра и инжекция струи

В 1964 году Д. И. Тейлор описал форму деформируемой в электростатическом поле капли жидкости, не содержащей полимера [16]. Небольшой объем жидкости, имеющий изначально форму сфероида, за счет высокого приложенного напряжения электризовался, и электрические силы начинали действовать против поверхностного натяжения, в результате чего капля приобретала коническую форму с выпуклыми сторонами. При достижении критического значения напряженности электрического поля из конца конуса с углом 98,6° инжектировалась тонкая струя [16]. Однако, описание, которое предложил Тейлор, имело математическую особенность (сингулярность) в вершине конуса, где начинается струя. Позже А. Л. Ярин совместно с коллегами [17] предположил, что критическая (перед инжекцией струи) форма капли, является не конусом, а гиперболоидом, что позволило избежать сингулярности (рис. 2). Расчеты показали, что гиперболоид, асимптотически приближающийся к конусу, имеет значение угла меньшее, чем рассчитал Тейлор: 67о вместо 98,6о. Эксперименты, как утверждают авторы, показали результаты измерения угла, близкие к рассчитанному, причем критический угол для ньютоновких жидкостей не зависит от свойств этих жидкостей, поскольку увеличение поверхностного натяжения всегда сопровождается увеличением критического электрического поля [17]. При этом форма конуса может не сохраняться на протяжении всего процесса электроспиннинга, она может меняться в зависимости от гидростатического давления жидкости (скорости подачи раствора) и приложенного напряжения.

Значение напряженности электрического поля, при котором происходит инжекция струи из острия конуса Тейлора деформированной капли жидкости, зависит от параметров жидкости, капилляра, подающего каплю, и геометрии электростатического поля. Тейлор в своей работе

[16] предложил выражение для критического значения напряжения и, приложенного к капле на конце капилляра радиусом R и длиной L:

и2 = 4(0, 1 1 7тгИст) ( 1,5 ),

где Н — расстояние между электродами, а — коэффициент поверхностного натяжения.

Это уравнение предполагает, что жидкости с большим коэффициентом поверхностного натяжения требуют высоких электрических полей для образования конуса Тейлора и инициирования струи. На практике оба эти параметра сильно влияют на формирование конуса Тейлора и могут быть легко изменены с помощью добавок (например, поверхностно-активных веществ или солей) к раствору для электроспиннинга [18]. Помимо Тейлора ряд авторов в своих работах приводит полуэмпирические уравнения для критического напряжения (таблица 1).

Рисунок 2. Эволюция формы капли раствора полиэтиленоксида в электрическом поле [17]. За нулевой момент времени был принят кадр с инжекцией струи. Длина горизонтального края каждого изображения - 1 мм.

Антонио Сенадор совместно с коллегами в работе 2001 года [19] обобщил известные выражения для критического значения напряжения (из таблицы №1), применив анализ размерностей, и предложил общую взаимосвязь между критическим напряжением и другими переменными в безразмерной форме:

где сте - проводимость, п - вязкость, Ее - диэлектрическая п р о н и ц а е м о сть.

Первый член в F эквивалентен числу Онезорге (отношению вязкостных сил к

силам поверхностного натяжения), в то время как второй член (— представляет собой

безразмерную электропроводность.

Таблица 1. Известные уравнения для критического значения напряжения. Н - расстояние между электродами, R - радиус капилляра, о - коэффициент поверхностного натяжения, г0 -электрическая постоянная.

Уравнение Ссылка

и = 3 0 (Ы 2 ОтгЯа [20]

(оН и = 0,863 1— л! £° [21]

¡4(7 и = н |— ^ £ о [22]

Часто в процессе электроспиннинга вместо формирования одной струи реализуется мультиструйное течение за счет увеличения приложенного напряжения. Обычно в этом случае одна из струй становится стабильной, в то время как другие исчезают, не влияя на общий ток в системе [18]. На рисунке 3 показано увеличение количества сформировавшихся на срезе капилляра струй при увеличении приложенного к капилляру напряжения [23].

' 1 1 4 б А,,

в Л г 1

Рисунок 3. Образование струй из водного раствора поливинилового спирта при различных приложенных напряжениях: а) 4,8 кВ; б) 5,62 кВ; в) 6,75 кВ; г) 7,13 кВ [23].

1.2.2 Траектория движения струи и возникновение изгибных деформаций

После инжекции заряженная полимерная струя сначала проходит прямой участок, на котором диаметр струи монотонно уменьшается с удалением от капилляра за счет вытягивания под действием электростатических сил и испарения растворителя. Скорость типичного сегмента струи жидкости на прямом участке параллельна оси струи, однако могут присутствовать также небольшие боковые возмущения скорости. Помимо движения заряженной струи жидкости вдоль оси «капилляр - противоэлектрод» в электростатическом поле, избыточные ионы под действием радиальных компонент кулоновских сил перемещаются к поверхности (в равновесное состояние) [17]. Длина линейной траектории струи определяется параметрами электроспиннинга — в основном скоростью подачи раствора и напряженностью электрического поля [18]. После прямого сегмента струя меняет свою траекторию и разворачивается перпендикулярно направлению «капилляр — противоэлектрод» вследствие изгибной неустойчивости (bending instability). Изгибная неустойчивость возникает из-за небольших возмущений прямого сегмента траектории струи. Эти возмущения в свою очередь создают силу FR, перпендикулярную главной оси «капилляр — противоэлектрод» из-за отталкивания одноименно заряженных участков струи, как изображено на рисунке 4. На начальных этапах вязкоупругие силы препятствуют изменению траектории движения струи, однако экспоненциальный рост силы FR преодолевает силы сопротивления, давая начало изгибным деформациям, которые меняют траекторию движения струи с прямой на спиральную и дополнительно растягивают струю [17].

Рисунок 4. Участок струи с возмущенным сегментом (пунктир), который начинает расти в ответ на отталкивающие силы ^г>о и Fuo) между заряженными участками струи. Результирующая этих сил направлена перпендикулярно основной оси прямого сегмента струи [17].

Струя, закрученная в спираль с увеличивающимся диаметром витка (рис. 5) после возникновения первой изгибной деформации продолжает дрейфовать в сторону противоэлектрода и значительно удлиняется в небольшой области пространства (в ~ 10000 раз). В некоторых случаях первоначальное «скручивание в спираль» исчезает и повторяется несколько раз до установления устойчивой спиральной траектории. По мере уменьшения диаметра струи траектория снова становится нестабильной, и развивается новая изгибная неустойчивость меньшего диаметра (рис. 5а). Ситуация с возникновением новых изгибных деформаций струи может повторяться несколько раз до осаждения волокон на коллектор или до полного испарения растворителя или затвердевания. Часто можно наблюдать последовательность трех и более изгибных деформаций, которые придают струе фрактальную конфигурацию [17]. При инжекции сразу нескольких стабильных струй из капилляра, можно одновременно наблюдать спиральные траектории каждой из струй, как показано на рисунке 5б.

Рисунок 5. Траектория движения струи в процессе электроспиннинга. а) Схематическое изображение траектории заряженной струи: прямолинейный участок и изгибные деформации. б) Образование четырех струй на срезе капилляра с формированием спиральных траекторий вследствие изгибных деформаций [17].

Следует отметить, что в процессе электроспиннинга могут возникать другие виды неустойчивостей, которые существенно влияют на морфологию конечных волокон (разветвленные волокна, волокна типа «бусины на ниточке», раздел 1.3), а также на стабильность процесса формирования струи. Одна из наиболее частых неустойчивостей — капиллярная. Она может привести к полному распаду струи на множество капелек (распад

Рэлея, переход в режим электроспрея), если поверхностное натяжение жидкости будет превалировать над вязкоупругими и электрическими силами, стабилизирующими струю.

1.2.3 Осаждение волокон на коллектор

Последняя стадия процесса электроспиннинга, которая включает в себя затвердевание и осаждение волокон на коллектор, определяет молекулярную структуру волокна (ориентацию полимерных цепей, кристалличность полимера) и свойства всего волокнистого слоя (расположение и укладку волокон, остаточный заряд волокнистого матрикса, деформацию волокон при осаждении).

Процесс отверждения заряженной струи в волокно в результате быстрого испарения растворителя влияет на организацию молекул: их ориентацию и кристаллизацию [24]. Значительные осевые деформации, которым подвержена полимерная струя в процессе электроспиннинга до полного затвердевания, часто приводят к ориентации полимерных цепей. Например, авторы работы [25] с помощью поляризационной инфракрасной (ИК) Фурье спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) доказывают высокую степень ориентации молекул вдоль оси волокон аморфного поликарбоната. Ряд авторов показали, что степень ориентации молекул существенно зависит от диаметра волокна, и в одном матриксе (из-за большой гетерогенности по диаметру волокон) могут присутствовать волокна с ориентированными и неориентированными полимерными цепями [24]. Тайё Йошиока совместно с коллегами [26] провел анализ ориентации молекул в полиэтиленовых волокнах методом дифракции электронов с выбранной области (selected area electron diffraction, SAED) на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ). Цилиндрические волокна одного образца были разделены на три категории по степени ориентации в них молекул: 1) волокна диаметром более 1 мкм оказались изотропными, 2) волокна диаметром от 400 нм до 1 мкм показали промежуточный уровень ориентации молекул, 3) самые тонкие волокна (150 нм - 400 нм) состояли из сильно ориентированных цепей полиэтилена вдоль оси волокна. Другая группа авторов подтвердила вывод об увеличении степени молекулярной ориентации с уменьшением диаметра волокна на примере волокон из поли(Ь-лактида) и поликапролактона методами электронной дифракции и широкоугловой дифракции рентгеновских лучей [27]. Принято считать, что в отличие от ориентации молекул, степень кристалличности полимера понижается в процессе электроспиннинга за счет быстрого испарения растворителя и быстрого затвердевания волокон, в результате которого полимер не успевает закристаллизоваться [28]. Однако существуют противоречивые результаты, которые требуют более тщательного и

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Павлова Елизавета Робертовна, 2021 год

Список литературы

1. Li D., Xia Y. Electrospinning of nanofibers: reinventing the wheel? // Adv. Mater. 2004. Vol. 16, № 14. P. 1151-1170.

2. Persano L. et al. Industrial upscaling of electrospinning and applications of polymer nanofibers: a review // Macromol. Mater. Eng. 2013. Vol. 298, № 5. P. 504-520.

3. Haider A., Haider S., Kang I.-K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology // Arab. J. Chem. 2018. Vol. 11, № 8. P. 1165-1188.

4. Mirjalili M., Zohoori S. Review for application of electrospinning and electrospun nanofibers technology in textile industry // J. Nanostructure Chem. 2016. Vol. 6, № 3. P. 207-213.

5. Dotti F. et al. Electrospun porous mats for high efficiency filtration // Journal of Industrial Textiles. 2007. Vol. 37, № 2. P. 151-162.

6. Zhu M. et al. Electrospun nanofibers membranes for effective air filtration // Macromol. Mater. Eng. 2017. Vol. 302, № 1. P. 1600353.

7. Филатов Ю.Н. Электроформование волокнистых материалов (ЭФВ-процесс). 2001.

8. Sell S. et al. Extracellular matrix regenerated: tissue engineering via electrospun biomimetic nanofibers // Polym. Int. 2007. Vol. 56, № 11. P. 1349-1360.

9. The Electrospinning Company — official website. URL: https://www.electrospinning.co.uk/ [Electronic resource].

10. Biostage — official website. URL: http://www.biostage.com/ [Electronic resource].

11. Chen S. et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing // Nanomedicine. 2017. Vol. 12, № 11. P. 1335-1352.

12. Janmohammadi M., Nourbakhsh M.S., Bonakdar S. Electrospun skin tissue engineering scaffolds based on polycaprolactone/hyaluronic acid/l-ascorbic acid // Fibers Polym. 2021. Vol. 22, № 1. P. 19-29.

13. Nanomedic Technologies — official website. URL: https://nanomedic.com/ [Electronic resource].

14. Xue J. et al. Electrospinning and electrospun nanofibers: methods, materials, and applications // Chem. Rev. 2019. Vol. 119, № 8. P. 5298-5415.

15. Wang S.-X. et al. Electrospinning: a facile technique for fabricating functional nanofibers for environmental applications // Nanotechnol. Rev. 2016. Vol. 5, № 1.

16. Taylor G.I. Disintegration of water drops in an electric field // Proc. R. Soc. London. Ser. A. Math. Phys. Sci. 1964. Vol. 280, № 1382. P. 383-397.

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

Reneker D.H., Yarin A.L. Electrospinning jets and polymer nanofibers // Polymer (Guildf). 2008. Vol. 49, № 10. P. 2387-2425.

Yousefzadeh M. Modeling and simulation of the electrospinning process // Electrospun Nanofibers. Elsevier, 2017. P. 277-301.

Senador A.E., Shaw M.T., Mather P.T. Electrospinning of polymeric nanofibers: analysis of jet formation // MRS Proc. 2000. Vol. 661.

Baumgarten P.K. Electrostatic spinning of acrylic microfibers // J. Colloid Interface Sci. 1971. Vol. 36, № 1. P. 71-79.

Wilm M.S., Mann M. Electrospray and Taylor-Cone theory, Dole's beam of macromolecules at last? // Int. J. Mass Spectrom. Ion Process. 1994. Vol. 136, № 2-3. P. 167-180. Doshi J., Reneker D.H. Electrospinning process and applications of electrospun fibers // J. Electrostat. 1995. Vol. 35, № 2-3. P. 151-160.

Wu Y.-K. et al. Multi-jet electrospinning with auxiliary electrode: the influence of solution properties // Polymers (Basel). 2018. Vol. 10, № 6. P. 572.

Richard-Lacroix M., Pellerin C. Molecular orientation in electrospun fibers: from mats to single fibers // Macromolecules. 2013. Vol. 46, № 24. P. 9473-9493.

Xu Y. et al. Internal structure of amorphous electrospun nanofiber: oriented molecular chains // Macromol. Mater. Eng. 2017. Vol. 302, № 7. P. 1700054.

Yoshioka T. et al. Orientation analysis of individual electrospun PE nanofibers by transmission electron microscopy // Polymer (Guildf). 2010. Vol. 51, № 11. P. 2383-2389. Liu J. et al. Single electrospun PLLA and PCL polymer nanofibers: increased molecular orientation with decreased fiber diameter // Polymer (Guildf). 2017. Vol. 118. P. 143-149. Dhanalakshmi M., Jog J.P. Preparation and characterization of electrospun fibers of nylon 11 // Express Polym. Lett. 2008. Vol. 2, № 8. P. 540-545.

Collins G. et al. Charge generation, charge transport, and residual charge in the electrospinning of polymers: a review of issues and complications // J. Appl. Phys. 2012. Vol. 111, № 4. P. 044701.

Catalani L.H., Collins G., Jaffe M. Evidence for molecular orientation and residual charge in the electrospinning of poly(butylene terephthalate) nanofibers // Macromolecules. 2007. Vol. 40, № 5. P. 1693-1697.

Zander N. Hierarchically structured electrospun fibers // Polymers (Basel). 2013. Vol. 5, № 1. P. 19-44.

Mahjour S.B. et al. Improved cell infiltration of electrospun nanofiber mats for layered tissue

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

constructs // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2016. Vol. 104, № 6. P. 1479-1488.

Liu P. et al. New surgical meshes with patterned nanofiber mats // RSC Adv. 2019. Vol. 9, №

31. P. 17679-17690.

Li H. et al. Electrospun membranes: control of the structure and structure related applications in tissue regeneration and drug delivery // J. Mater. Chem. B. 2014. Vol. 2, № 34. P. 5492-5510. Batnyam O., Suye S., Fujita S. Direct cryopreservation of adherent cells on an elastic nanofiber sheet featuring a low glass-transition temperature // RSC Adv. 2017. Vol. 7, № 81. P. 5126451271.

Zhang D., Chang J. Patterning of electrospun fibers using electroconductive templates // Adv. Mater. 2007. Vol. 19, № 21. P. 3664-3667.

Koombhongse S., Liu W., Reneker D.H. Flat polymer ribbons and other shapes by electrospinning // J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 2001. Vol. 39, № 21. P. 2598-2606. Reneker D.H., Yarin A.L. Electrospinning jets and polymer nanofibers // Polymer (Guildf).

2008. Vol. 49, № 10. P. 2387-2425.

Zaarour B. et al. Branched nanofibers with tiny diameters for air filtration via one-step electrospinning // J. Ind. Text. 2020.

Rezaei B. et al. Multifactorial modeling and optimization of solution and electrospinning parameters to generate superfine polystyrene nanofibers // Adv. Polym. Technol. 2018. Vol. 37, № 8. P. 2743-2755.

Fong H., Chun I., Reneker D. Beaded nanofibers formed during electrospinning // Polymer (Guildf). 1999. Vol. 40, № 16. P. 4585-4592.

Choi J.S. et al. Effect of organosoluble salts on the nanofibrous structure of electrospun poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) // Int. J. Biol. Macromol. 2004. Vol. 34, № 4. P. 249256.

Abutaleb A. et al. Effects of surfactants on the morphology and properties of electrospun polyetherimide fibers // Fibers. 2017. Vol. 5, № 3. P. 33.

Li L. et al. Hierarchically structured PMMA fibers fabricated by electrospinning // RSC Adv. 2014. Vol. 4, № 95. P. 52973-52985.

Wang L. et al. Wrinkled surface topographies of electrospun polymer fibers // Appl. Phys. Lett.

2009. Vol. 151916. P. 1-4.

Herrmann G., Forrestal M.J. Buckling of a long cylindrical shell containing an elastic core // AIAA J. 1965. Vol. 3, № 9. P. 1710-1715.

Huang C., Thomas N.L. Fabrication of porous fibers via electrospinning: strategies and

applications // Polym. Rev. 2020. Vol. 60, № 4. P. 595-647.

48. Huang C., Thomas N.L. Fabricating porous poly(lactic acid) fibres via electrospinning // Eur. Polym. J. 2018. Vol. 99. P. 464-476.

49. Casper C.L. et al. Controlling surface morphology of electrospun polystyrene fibers : effect of humidity and molecular weight in the electrospinning process // Macromolecules. 2004. Vol. 37, № 2. P. 573-578.

50. Conoscenti G., Carrubba V. La, Brucato V. A versatile technique to produce porous polymeric scaffolds: the thermally induced phase separation (TIPS) method // Arch. Chem. Res. 2017. Vol. 1, № 2.

51. Nayani K. et al. Electrospinning combined with nonsolvent-induced phase separation to fabricate highly porous and hollow submicrometer polymer fibers // Ind. Eng. Chem. Res. 2012. Vol. 51, № 4. P. 1761-1766.

52. Venault A. et al. A review on polymeric membranes and hydrogels prepared by vapor-induced phase separation process // Polym. Rev. 2013. Vol. 53, № 4. P. 568-626.

53. Katsogiannis K.A.G., Vladisavljevic G.T., Georgiadou S. Porous electrospun polycaprolactone (PCL) fibres by phase separation // Eur. Polym. J. 2015. Vol. 69. P. 284-295.

54. Zaarour B. et al. Controlling the secondary surface morphology of electrospun PVDF nanofibers by regulating the solvent and relative humidity // Nanoscale Res. Lett. 2018. Vol. 13, № 1. P. 285.

55. Khadka D.B., Haynie D.T. Protein- and peptide-based electrospun nanofibers in medical biomaterials // Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. Elsevier Inc., 2012. Vol. 8, № 8. P. 1242-1262.

56. Ding J. et al. Electrospun polymer biomaterials // Prog. Polym. Sci. 2019. Vol. 90. P. 1-34.

57. Rho K.S. et al. Electrospinning of collagen nanofibers: effects on the behavior of normal human keratinocytes and early-stage wound healing // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 8. P. 1452-1461.

58. Powell H., Supp D., Boyce S. Influence of electrospun collagen on wound contraction of engineered skin substitutes // Biomaterials. 2008. Vol. 29, № 7. P. 834-843.

59. Kitsara M. et al. Fabrication of cardiac patch by using electrospun collagen fibers // Microelectron. Eng. 2015. Vol. 144. P. 46-50.

60. Aras O., Kazanci M. Production of collagen micro- and nanofibers for potential drug-carrier systems // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2015. Vol. 30, № 6. P. 1013-1016.

61. Willard J.J. et al. Plant-derived human collagen scaffolds for skin tissue engineering // Tissue Eng. Part A. 2013. Vol. 19, № 13-14. P. 1507-1518.

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

Dias J.R. et al. In situ crosslinked electrospun gelatin nanofibers for skin regeneration // Eur. Polym. J. 2017. Vol. 95. P. 161-173.

Elsayed Y. et al. Fabrication and characterisation of biomimetic, electrospun gelatin fibre scaffolds for tunica media-equivalent, tissue engineered vascular grafts // Mater. Sci. Eng. C. 2016. Vol. 61. P. 473-483.

Zhang S. et al. Gelatin nanofibrous membrane fabricated by electrospinning of aqueous gelatin solution for guided tissue regeneration // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2009. Vol. 90A, № 3. P. 671-679.

Vardiani M. et al. Three-dimensional electrospun gelatin scaffold coseeded with embryonic stem cells and sertoli cells: a promising substrate for in vitro coculture system // J. Cell. Biochem. 2019. Vol. 120, № 8. P. 12508-12518.

Boland E.D. Electrospinning collagen and elastin: preliminary vascular tissue engineering // Front. Biosci. 2004. Vol. 9, № 1-3. P. 1422.

Nivison-Smith L., Weiss A.S. Alignment of human vascular smooth muscle cells on parallel electrospun synthetic elastin fibers // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2012. Vol. 100A, № 1. P. 155-161.

Rnjak J. et al. Primary human dermal fibroblast interactions with open weave three-dimensional scaffolds prepared from synthetic human elastin // Biomaterials. 2009. Vol. 30, № 32. P. 64696477.

McKenna K.A. et al. Mechanical property characterization of electrospun recombinant human tropoelastin for vascular graft biomaterials // Acta Biomater. 2012. Vol. 8, № 1. P. 225-233. Qian C. et al. Vascularized silk electrospun fiber for promoting oral mucosa regeneration // NPG Asia Mater. 2020. Vol. 12, № 1. P. 39.

Cattaneo I. et al. In vivo regeneration of elastic lamina on fibroin biodegradable vascular scaffold // Int. J. Artif. Organs. 2013. Vol. 36, № 3. P. 166-174.

Min B.-M. et al. Electrospinning of silk fibroin nanofibers and its effect on the adhesion and spreading of normal human keratinocytes and fibroblasts in vitro // Biomaterials. 2004. Vol. 25, № 7-8. P. 1289-1297.

Meechaisue C. et al. Preparation of electrospun silk fibroin fiber mats as bone scaffolds: a preliminary study // Biomed. Mater. 2007. Vol. 2, № 3. P. 181-188.

Teplenin A. et al. Functional analysis of the engineered cardiac tissue grown on recombinant spidroin fiber meshes // PLoS One / ed. Pesce M. 2015. Vol. 10, № 3.

Ansari A.Q. et al. Electrospun zein nanofibers as drug carriers for controlled delivery of

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

levodopa in Parkinson syndrome // Mater. Res. Express. 2019. Vol. 6, № 7. P. 075405. Aytac Z. et al. Antioxidant electrospun zein nanofibrous web encapsulating quercetin/cyclodextrin inclusion complex // J. Mater. Sci. 2018. Vol. 53, № 2. P. 1527-1539. Karthikeyan K. et al. Fabrication of electrospun zein nanofibers for the sustained delivery of siRNA // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2015. Vol. 26, № 2. P. 101.

Xu H. et al. Water-stable three-dimensional ultrafine fibrous scaffolds from keratin for cartilage tissue engineering // Langmuir. 2014. Vol. 30, № 28. P. 8461-8470.

Raic A. et al. Potential of electrospun cationic BSA fibers to guide osteogenic MSC differentiation via surface charge and fibrous topography // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 20003.

Nseir N. et al. Biodegradable scaffold fabricated of electrospun albumin fibers: mechanical and biological characterization // Tissue Eng. Part C Methods. 2013. Vol. 19, № 4. P. 257-264. Law J.X. et al. Electrospun collagen nanofibers and their applications in skin tissue engineering // Tissue Eng. Regen. Med. 2017. Vol. 14, № 6. P. 699-718.

Exposito J.-Y. et al. The fibrillar collagen family // Int. J. Mol. Sci. 2010. Vol. 11, № 2. P. 407426.

Zeugolis D.I. et al. Electro-spinning of pure collagen nano-fibres - just an expensive way to make gelatin? // Biomaterials. 2008. Vol. 29, № 15. P. 2293-2305.

Yang L. et al. Mechanical properties of single electrospun collagen type I fibers // Biomaterials. 2008. Vol. 29, № 8. P. 955-962.

Liu T. et al. Photochemical crosslinked electrospun collagen nanofibers: synthesis, characterization and neural stem cell interactions // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2010. Vol. 95A, № 1. P. 276-282.

Campiglio C.E. et al. Cross-linking strategies for electrospun gelatin scaffolds // Materials (Basel). 2019. Vol. 12, № 15. P. 2476.

Gomes S.R. et al. In vitro evaluation of crosslinked electrospun fish gelatin scaffolds // Mater. Sci. Eng. C. 2013. Vol. 33, № 3. P. 1219-1227.

Ghassemi Z., Slaughter G. Cross-linked electrospun gelatin nanofibers for cell-based assays // 2018 40th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society (EMBC). 2018. P. 6088-6091.

DeFrates K. et al. Protein-based fiber materials in medicine: a review // Nanomaterials. 2018. Vol. 8, № 7. P. 457.

Wang R. et al. Elastin in vascular grafts // Tissue-engineered vascular grafts. Springer

International Publishing, 2019. P. 1-32.

91. Araujo J. et al. Processing and characterization of a-elastin electrospun membranes // Appl. Phys. A. 2014. Vol. 115, № 4. P. 1291-1298.

92. Nivison-Smith L., Rnjak J., Weiss A.S. Synthetic human elastin microfibers: stable cross-linked tropoelastin and cell interactive constructs for tissue engineering applications // Acta Biomater. 2010. Vol. 6, № 2. P. 354-359.

93. Yeo G.C. et al. Fabricated elastin // Adv. Healthc. Mater. 2015. Vol. 4, № 16. P. 2530-2556.

94. Zhang X., Reagan M.R., Kaplan D.L. Electrospun silk biomaterial scaffolds for regenerative medicine // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. Vol. 61, № 12. P. 988-1006.

95. Mejia Suaza M.L., Moncada M.E., Ossa-Orozco C.P. Characterization of electrospun silk fibroin scaffolds for bone tissue engineering: a review // TecnoLogicas. 2020. Vol. 23, № 49. P. 33-51.

96. Jeong L., Lee K.Y., Park W.H. Effect of solvent on the characteristics of electrospun regenerated silk fibroin nanofibers // Key Engineering Materials. 2007. P. 813-816.

97. Corradini E. et al. Recent advances in food-packing, pharmaceutical and biomedical applications of zein and zein-based materials // Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, № 12. P. 2243822470.

98. Selling G.W. et al. Impact of solvent on electrospinning of zein and analysis of resulting fibers // Macromol. Chem. Phys. 2007. Vol. 208, № 9. P. 1002-1010.

99. Merlot A.M., Kalinowski D.S., Richardson D.R. Unraveling the mysteries of serum albumin-more than just a serum protein // Front. Physiol. 2014. Vol. 5.

100. Sundar S., Kundu J., Kundu S.C. Biopolymeric nanoparticles // Sci. Technol. Adv. Mater. 2010. Vol. 11, № 1. P. 014104.

101. Dror Y. et al. Nanofibers made of globular proteins // Biomacromolecules. 2008. Vol. 9, № 10. P. 2749-2754.

102. Xu X. et al. Preparation and properties of electrospun soy protein isolate/polyethylene oxide nanofiber membranes // ACS Appl. Mater. Interfaces. 2012. Vol. 4, № 8. P. 4331-4337.

103. Hanumantharao, Rao. Multi-functional electrospun nanofibers from polymer blends for scaffold tissue engineering // Fibers. 2019. Vol. 7, № 7. P. 66.

104. Nurul Fazita M.R. et al. Green composites made of bamboo fabric and poly (lactic) acid for packaging applications—a review // Materials (Basel). 2016. Vol. 9, № 6. P. 435.

105. Elsawy M.A. et al. Hydrolytic degradation of polylactic acid (PLA) and its composites // Renew. Sustain. Energy Rev. 2017. Vol. 79. P. 1346-1352.

106. Kaavessina M., Ali I., Al-Zahrani S.M. The influences of elastomer toward crystallization of poly(lactic acid) // Procedia Chem. 2012. Vol. 4. P. 164-171.

107. Van de Velde K., Kiekens P. Biopolymers: overview of several properties and consequences on their applications // Polym. Test. 2002. Vol. 21, № 4. P. 433-442.

108. Farah S., Anderson D., Langer R. Physical and mechanical properties of PLA, and their functions in widespread applications—a comprehensive review // Adv. Drug Deliv. Rev. 2016. Vol. 107. P. 367-392.

109. Murariu M., Dubois P. PLA composites: from production to properties // Adv. Drug Deliv. Rev. 2016. Vol. 107. P. 17-46.

110. Saini P., Arora M., Kumar M.N.V.R. Poly(lactic acid) blends in biomedical applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2016. Vol. 107. P. 47-59.

111. Kanmaz D. et al. Electrospun polylactic acid based nanofibers for biomedical applications // Mater. Sci. Res. India. 2018. Vol. 15, № 3. P. 224-240.

112. Auras R., Harte B., Selke S. An overview of polylactides as packaging materials // Macromolecular Bioscience. 2004. Vol. 4, № 9. P. 835-864.

113. Lim L.T., Auras R., Rubino M. Processing technologies for poly(lactic acid) // Prog. Polym. Sci. 2008. Vol. 33, № 8. P. 820-852.

114. Ljungberg N., Wesslen B. Preparation and properties of plasticized poly(lactic acid) films // Biomacromolecules. 2005. Vol. 6, № 3. P. 1789-1796.

115. Liu S. et al. Current applications of poly(lactic acid) composites in tissue engineering and drug delivery // Compos. Part B Eng. 2020. Vol. 199. P. 108238.

116. Yoon S.J. et al. Reduction of inflammatory reaction of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) using demineralized bone particles // Tissue Eng. Part A. 2008. Vol. 14, № 4. P. 539-547.

117. Singhvi M.S., Zinjarde S.S., Gokhale D.V. Polylactic acid: synthesis and biomedical applications // J. Appl. Microbiol. 2019. Vol. 127, № 6. P. 1612-1626.

118. Yan S. et al. Fabrication and properties of PLLA-gelatin nanofibers by electrospinning // J. Appl. Polym. Sci. 2010. Vol. 117. P. 542-547.

119. Kim H.-W., Yu H.-S., Lee H.-H. Nanofibrous matrices of poly(lactic acid) and gelatin polymeric blends for the improvement of cellular responses // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2008. Vol. 87A, № 1. P. 25-32.

120. Leyva-Verduzco A.A. et al. Electrospun tubes based on PLA, gelatin and genipin in different arrangements for blood vessel tissue engineering // Polym. Bull. 2020. Vol. 77, № 11. P. 59856003.

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

Gu S.-Y. et al. Electrospinning of gelatin and gelatin/poly(l-lactide) blend and its characteristics for wound dressing // Mater. Sci. Eng. C. 2009. Vol. 29, № 6. P. 1822-1828. Hall Barrientos I.J. et al. Electrospun collagen-based nanofibres: a sustainable material for improved antibiotic utilisation in tissue engineering applications // Int. J. Pharm. 2017. Vol. 531, № 1. P. 67-79.

Ospina-Orejarena A. et al. Grafting collagen on poly (lactic acid) by a simple route to produce electrospun scaffolds, and their cell adhesion evaluation // Tissue Eng. Regen. Med. 2016. Vol. 13, № 4. P. 375-387.

Torres-Giner S. et al. Controlled delivery of gentamicin antibiotic from bioactive electrospun polylactide-based ultrathin fibers // Adv. Eng. Mater. 2012. Vol. 14, № 4. P. B112-B122. Na Ayutthaya S.I., Woothikanokkhan J. Extraction of keratin from chicken feather and electrospinning of the keratin/PLA blends // Adv. Mater. Res. 2013. Vol. 747. P. 711-714. Kim B.-S. et al. Fabrication of nanofibrous scaffold using a PLA and hagfish thread keratin composite; its effect on cell adherence, growth, and osteoblast differentiation // Biomed. Mater. 2013. Vol. 8, № 4. P. 1-9.

Isarankura Na Ayutthaya S. et al. Effect of clay content on morphology and processability of electrospun keratin/poly(lactic acid) nanofiber // Int. J. Biol. Macromol. 2016. Vol. 85. P. 585595.

Shanmugam K., Sundaramoorthy S. Development and characterization of an electrospun mat from Eri silk fibroin and PLA blends for wound dressing application // RSC Adv. 2015. Vol. 5, № 40. P. 31352-31364.

Xiong X. et al. Fibrous scaffolds made by co-electrospinning soluble eggshell membrane protein with biodegradable synthetic polymers // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2012. Vol. 23, № 9. P. 1217-1230.

Gugutkov D. et al. Electrospun fibrinogen-PLA nanofibres for vascular tissue engineering // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2017. Vol. 11, № 10. P. 2774-2784.

Paul D.R., Bucknall C.B. Polymer blends: formulation and performance // John Wiley & Sons. 2000.

Кулезнев В.Н. Смеси и сплавы полимеров. 2013. 1-220 p.

Sperling L.H. Introduction to Physical Polymer Science. Wiley: New York, 2006.

Paul D R. Polymer blends. 1978. 1-454 p.

Тагер А.А. Физико-химия полимеров. 1978. 1-547 p.

Michels J.J. et al. Polymer blending and phase behavior in organic electronics: two case studies

// Solution-processable components for organic electronic devices. Wiley, 2019. P. 227-258.

137. Guo Q., Liu Z. Phase behavior of polymer blends // J. Therm. Anal. Calorim. 2000. Vol. 59. P. 101 -120.

138. Qiu Z., Ikehara T., Nishi T. Miscibility and crystallization in crystalline/crystalline blends of poly(butylene succinate)/poly(ethylene oxide) // Polymer (Guildf). 2003. Vol. 44, № 9. P. 27992806.

139. Chee K.K. Determination of polymer-polymer miscibility by viscometry // Eur. Polym. J. 1990. Vol. 26, № 4. P. 423-426.

140. Rogosic M., Mencer H.J. Prediction of copolymer miscibility by the viscometric method // Eur. Polym. J. 1997. Vol. 33, № 5. P. 621-630.

141. Bognitzki M. et al. Preparation of fibers with nanoscaled morphologies: electrospinning of polymer blends // Polym. Eng. Sci. 2001. Vol. 41, № 6. P. 982-989.

142. Aluigi A. et al. Electrospinning of immiscible systems: the wool keratin/polyamide-6 case study // Mater. Des. Elsevier, 2017. Vol. 127. P. 144-153.

143. Daelemans L. et al. Nanostructured hydrogels by blend electrospinning of polycaprolactone/gelatin nanofibers // Nanomaterials. 2018. Vol. 8, № 7. P. 551.

144. Nanjundaswamy G.S. et al. Examination of miscibility characteristics of the synthetic plastic-mimetic peptide with polyacrylamide: development of nonwoven mats by electrospinning // Polym. Technol. Mater. 2021. Vol. 60, № 4. P. 405-418.

145. Schindelin J. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 676-682.

146. Hotaling N. a. et al. DiameterJ: a validated open source nanofiber diameter measurement tool // Biomaterials. Elsevier Ltd, 2015. Vol. 61. P. 327-338.

147. Pick M., Lovell R., Windle A.H. X-ray measurement of chain orientation in non-crystalline polymers // Polym. (United Kingdom). 1980.

148. Thermo Scientific NanoDrop spectrophotometers — technical guide. URL: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/Thermo-Scientific-NanoDrop-Products-Protein-Technical-Guide-EN.pdf [Electronic resource].

149. SPM Image Magic software — official website. URL: https://spm-image-magic.software.informer.com/ [Electronic resource].

150. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances // Nat. Protoc. 2008. Vol. 3, № 2. P. 163-175.

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

Nash J.A. et al. The peptidoglycan-degrading property of lysozyme is not required for bactericidal activity in vivo // J. Immunol. 2006. Vol. 177, № 1. P. 519-526. DeStefano V., Khan S., Tabada A. Applications of PLA in modern medicine // Eng. Regen. 2020. Vol. 1. P. 76-87.

Zhu G. et al. Effect of experimental parameters on nanofiber diameter from electrospinning with

wire electrodes // IOP Conf. Ser. Mater. Sci. Eng. 2017. Vol. 230. P. 012043.

Kim S.C. et al. Nanofiber filter performance improvement: nanofiber layer uniformity and

branched nanofiber // Aerosol Air Qual. Res. 2020. Vol. 20, № 1. P. 80-88.

Chen M. et al. Role of fiber diameter in adhesion and proliferation of NIH 3T3 fibroblast on

electrospun polycaprolactone scaffolds. // Tissue Eng. 2007. Vol. 13, № 3. P. 579-587.

Celebioglu A., Uyar T. Electrospun porous cellulose acetate fibers from volatile solvent mixture

// Mater. Lett. 2011. Vol. 65, № 14. P. 2291-2294.

Topuz F., Uyar T. Electrospinning of gelatin with tunable fiber morphology from round to flat/ribbon // Mater. Sci. Eng. C. 2017. Vol. 80. P. 371-378.

Tao J., Shivkumar S. Molecular weight dependent structural regimes during the electrospinning of PVA // Mater. Lett. 2007. Vol. 61, № 11-12. P. 2325-2328.

Koski A., Yim K., Shivkumar S. Effect of molecular weight on fibrous PVA produced by electrospinning // Mater. Lett. 2004. Vol. 58, № 3-4. P. 493-497.

Tsou S.-Y., Lin H.-S., Wang C. Studies on the electrospun nylon 6 nanofibers from polyelectrolyte solutions: 1. Effects of solution concentration and temperature // Polymer (Guildf). 2011. Vol. 52, № 14. P. 3127-3136.

Wang H. et al. Electrospun ultra-fine silk fibroin fibers from aqueous solutions // J. Mater. Sci. 2005. Vol. 40, № 20. P. 5359-5363.

Moradkhannejhad L. et al. Electrospinning of zein/propolis nanofibers; antimicrobial properties and morphology investigation // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2018. Vol. 29, № 11. P. 165. Zhao Y.Y. et al. Study on correlation of morphology of electrospun products of polyacrylamide with ultrahigh molecular weight // J. Polym. Sci. Part B Polym. Phys. 2005. Vol. 43, № 16. P. 2190-2195.

Chuangchote S., Sagawa T., Yoshikawa S. Electrospinning of poly(vinyl pyrrolidone): effects of solvents on electrospinnability for the fabrication of poly(p-phenylene vinylene) and TiO2 nanofibers // J. Appl. Polym. Sci. 2009. Vol. 114, № 5. P. 2777-2791.

Fleischer S. et al. Albumin fiber scaffolds for engineering functional cardiac tissues // Biotechnol. Bioeng. 2014. Vol. 111, № 6. P. 1246-1257.

166

167

168

169

170

171

172

173

174

175

176

177

178

179

Nuansing W. et al. Electrospinning of peptide and protein fibres: approaching the molecular scale // Faraday Discuss. 2013. Vol. 166. P. 209.

Posharnowa N. et al. Polymer-polymer interaction parameters for homopolymers and copolymers from light scattering and phase separation experiments in a common solvent // J. Chem. Phys. 2001. Vol. 115, № 20. P. 9536-9546.

Gonzalez-Leon J.A., Mayes A.M. Phase behavior prediction of ternary polymer mixtures // Macromolecules. 2003. Vol. 36, № 7. P. 2508-2515.

Dai J. et al. Doxorubicin-loaded PLA/pearl electrospun nanofibrous scaffold for drug delivery and tumor cell treatment // Mater. Res. Express. 2017. Vol. 4, № 7.

Tang C. et al. Effect of pH on protein distribution in electrospun PVA/BSA composite nanofibers // Biomacromolecules. 2012. Vol. 13, № 5. P. 1269-1278.

Stanishevsky A. et al. Ribbon-like and spontaneously folded structures of tungsten oxide nanofibers fabricated via electrospinning // RSC Adv. 2015. Vol. 5, № 85. P. 69534-69542. Aluigi A. et al. Structure and properties of keratin/PEO blend nanofibres // Eur. Polym. J. 2008. Vol. 44, № 8. P. 2465-2475.

Liu S. et al. Fabrication, mechanical properties and failure mechanism of random and aligned nanofiber membrane with different parameters // Nanotechnol. Rev. 2019. Vol. 8, № 1. P. 218226.

Stachewicz U. et al. Size dependent mechanical properties of electrospun polymer fibers from a composite structure // Polymer (Guildf). 2012. Vol. 53, № 22. P. 5132-5137. Pon9ot M., Addiego F., Dahoun A. True intrinsic mechanical behaviour of semi-crystalline and amorphous polymers: influences of volume deformation and cavities shape // Int. J. Plast. 2013. Vol. 40. P. 126-139.

Gualandi C. et al. Ethanol disinfection affects physical properties and cell response of electrospun poly(l-lactic acid) scaffolds // Eur. Polym. J. 2012. Vol. 48, № 12. P. 2008-2018. Englund-Johansson U., Netanyah E., Johansson F. Tailor-made electrospun culture scaffolds control human neural progenitor cell behavior—studies on cellular migration and phenotypic differentiation // J. Biomater. Nanobiotechnol. 2017. Vol. 8, № 1. P. 1-21. Torres-Martinez E.J. et al. A summary of electrospun nanofibers as drug delivery system: drugs loaded and biopolymers used as matrices // Curr. Drug Deliv. 2018. Vol. 15, № 10. P. 13601374.

Sun Y. et al. Electrospun fibers and their application in drug controlled release, biological dressings, tissue repair, and enzyme immobilization // RSC Adv. 2019. Vol. 9, № 44. P. 25712-

25729.

180. Wen P. et al. Encapsulation of bioactive compound in electrospun fibers and its potential application // J. Agric. Food Chem. 2017. Vol. 65, № 42. P. 9161-9179.

181. Wang X. et al. Controlled release of protein from core-shell nanofibers prepared by emulsion electrospinning based on green chemical // J. Appl. Polym. Sci. 2015. Vol. 132, № 16.

182. Piccirillo G. et al. Controlled and tuneable drug release from electrospun fibers and a noninvasive approach for cytotoxicity testing // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 3446.

183. Costa P., Sousa Lobo J.M. Modeling and comparison of dissolution profiles // Eur. J. Pharm. Sci. 2001. Vol. 13, № 2. P. 123-133.

184. Jannesari M. et al. Composite poly(vinyl alcohol)/poly(vinyl acetate) electrospun nanofibrous mats as a novel wound dressing matrix for controlled release of drugs. // Int. J. Nanomedicine. 2011. Vol. 6. P. 993-1003.

185. Gorrasi G., Pantani R. Hydrolysis and biodegradation of poly(lactic acid) // Advances in Polymer Science. 2017. P. 119-151.

186. Dong Y. et al. Degradation behaviors of electrospun resorbable polyester nanofibers // Tissue Eng. Part B Rev. 2009. Vol. 15, № 3. P. 333-351.

187. Cui W. et al. Investigation of drug release and matrix degradation of electrospun poly(DL-lactide) fibers with paracetanol inoculation // Biomacromolecules. 2006. Vol. 7, № 5. P. 16231629.

188. Stephansen K. et al. Bioactive protein-based nanofibers interact with intestinal biological components resulting in transepithelial permeation of a therapeutic protein // Int. J. Pharm. Elsevier B.V., 2015. Vol. 495, № 1. P. 58-66.

189. Xia T. et al. The combination of db-cAMP and ChABC with poly(propylene carbonate) microfibers promote axonal regenerative sprouting and functional recovery after spinal cord hemisection injury // Biomed. Pharmacother. 2017. Vol. 86. P. 354-362.

190. Tiwari S.K., Venkatraman S. Electrospinning pure protein solutions in core-shell fibers // Polym. Int. 2012. Vol. 61, № 10. P. 1549-1555.

191. Kim T.G., Lee D.S., Park T.G. Controlled protein release from electrospun biodegradable fiber mesh composed of poly(epsilon-caprolactone) and poly(ethylene oxide). // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 338, № 1-2. P. 276-283.

192. Murase S.K. et al. Electrospun fibrous mats from a l-phenylalanine based poly(ester amide): drug delivery and accelerated degradation by loading enzymes // Polym. Degrad. Stab. 2015. Vol. 119. P. 275-287.

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

206

207

Díaz A. et al. New poly(ester urea) derived from l-leucine: electrospun scaffolds loaded with antibacterial drugs and enzymes // Mater. Sci. Eng. C. 2015. Vol. 46. P. 450-462. Sode K. et al. Effect of reparation of repeat sequences in the human a-synuclein on fibrillation ability // Int. J. Biol. Sci. 2007. Vol. 3, № 1. P. 1-7.

Hirota N., Goto Y., Mizuno K. Cooperative a-helix formation of ß-lactoglobulin and melittin induced by hexafluoroisopropanol // Protein Sci. 1997. Vol. 6, № 2. P. 416-421. Rygula A. et al. Raman spectroscopy of proteins: a review // J. Raman Spectrosc. 2013. Vol. 44, № 8. P. 1061-1076.

García-Rubio D.L. et al. Analysis of platelets in hypertensive and normotensive individuals using Raman and Fourier transform infrared-attenuated total reflectance spectroscopies // J. Raman Spectrosc. 2019. Vol. 50, № 4. P. 509-521.

Maiti N.C. et al. Raman spectroscopic characterization of secondary structure in natively unfolded proteins: a-synuclein // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126, № 8. P. 2399-2408. Zhu G. et al. Raman spectra of amino acids and their aqueous solutions // Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2011. Vol. 78, № 3. P. 1187-1195.

Kranz J. et al. Biophysics for therapeutic protein development // Biophysics for therapeutic protein development. Springer New York, 2013. 1-293 p.

Matei I. et al. Formation and stabilization of gold nanoparticles in bovine serum albumin solution // Molecules. 2019. Vol. 24, № 18. P. 3395.

Bian H.-D. et al. The spectroscopy study of the binding of an active ingredient of dioscorea species with bovine serum albumin with or without Co2+ or Zn2+ // Evidence-Based Complement. Altern. Med. 2014. Vol. 2014. P. 1-12.

Peters J. et al. Protein secondary structure determination using drop coat deposition confocal raman spectroscopy // Spectroscopy. 2016. Vol. 31, № 10. P. 31-39.

Peng X. et al. Study on the structural changes of bovine serum albumin with effects on polydatin binding by a multitechnique approach // Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 2011. Vol. 81, № 1. P. 209-214.

Signorelli S., Cannistraro S., Bizzarri A.R. Structural characterization of the intrinsically disordered protein p53 using raman spectroscopy // Appl. Spectrosc. 2017. Vol. 71, № 5. P. 823-832.

Susi H., Byler D.M. Fourier deconvolution of the amide I Raman band of proteins as related to conformation // Appl. Spectrosc. 1988. Vol. 42, № 5. P. 819-826.

Ye H. et al. Burn-related collagen conformational changes in ex vivo porcine skin using raman

spectroscopy // Sci. Rep. 2019. Vol. 9, № 1. P. 19138.

208. Zhao X. et al. Composition and stability of anthocyanins from purple solanum tuberosum and their protective influence on Cr(VI) targeted to bovine serum albumin // J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, № 14. P. 7902-7909.

209. Yu J. et al. Conductance changes in bovine serum albumin caused by drug-binding triggered structural transitions // Materials (Basel). 2019. Vol. 12, № 7. P. 1022.

210. Charbonneau D.M., Tajmir-Riahi H.-A. Study on the interaction of cationic lipids with bovine serum albumin // J. Phys. Chem. B. 2010. Vol. 114, № 2. P. 1148-1155.

211. Abrosimova K. V., Shulenina O. V., Paston S. V. FTIR study of secondary structure of bovine serum albumin and ovalbumin // Journal of Physics: Conference Series. 2016.

212. Magyari K. et al. Addressing the optimal silver content in bioactive glass systems in terms of BSA adsorption // J. Mater. Chem. B. 2014. Vol. 2, № 35. P. 5799-5808.

213. Stan M.S. et al. Dynamic analysis of the interactions between Si/SiO2 quantum dots and biomolecules for improving applications based on nano-bio interfaces // Sci. Rep. 2018. Vol. 8, № 1. P. 5289.

214. Wang X. et al. Probing adsorption behaviors of BSA onto chiral surfaces of nanoparticles // Small. 2018. Vol. 14, № 16. P. 1703982.

215. Morozova O. V et al. Protein nanoparticles with ligand-binding and enzymatic activities // Int. J. Nanomedicine. 2018. Vol. 13. P. 6637-6646.

216. Klinov D. V. et al. An improved substrate for superior imaging of individual biomacromolecules with atomic force microscopy // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2020. Vol. 196. P. 111321.

217. Pan Y. et al. Nanoscale characterization of interaction of APOBEC3G with RNA // Biochemistry. 2017. Vol. 56, № 10. P. 1473-1481.

218. Protopopova A.D. et al. Visualization of fibrinogen aC regions and their arrangement during fibrin network formation by high-resolution AFM // J. Thromb. Haemost. 2015. Vol. 13, № 4. P. 570-579.

219. Tian F. et al. Quantitative analysis of cell adhesion on aligned micro- and nanofibers // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2008. Vol. 84A, № 2. P. 291-299.

220. Noriega S.E. et al. Effect of fiber diameter on the spreading, proliferation and differentiation of chondrocytes on electrospun chitosan matrices // Cells Tissues Organs. 2012. Vol. 195, № 3. P. 207-221.

221. Sisson K. et al. Fiber diameters control osteoblastic cell migration and differentiation in

electrospun gelatin. // J. Biomed. Mater. Res. A. 2010. Vol. 94, № 4. P. 1312-1320.

222. Tuin S.A., Pourdeyhimi B., Loboa E.G. Creating tissues from textiles: scalable nonwoven manufacturing techniques for fabrication of tissue engineering scaffolds // Biomed. Mater. 2016. Vol. 11, № 1. P. 015017.

223. Badami A.S. et al. Effect of fiber diameter on spreading, proliferation, and differentiation of osteoblastic cells on electrospun poly(lactic acid) substrates // Biomaterials. 2006. Vol. 27, № 4. P. 596-606.

224. Hackett J. et al. Electrospun biocomposite polycaprolactone/collagen tubes as scaffolds for neural stem cell differentiation // Materials (Basel). 2010. Vol. 3, № 6. P. 3714-3728.

225. Liu W. et al. Poly(meta-phenylene isophthalamide) nanofibers: coating and post processing // J. Mater. Res. 2002. Vol. 17, № 12. P. 3206-3212.

226. Kachooei E. et al. Paclitaxel inhibited lysozyme fibrillation by increasing colloidal stability through formation of "off-pathway" oligomers // Int. J. Biol. Macromol. 2018. Vol. 111. P. 870879.

227. Russell B.A. et al. Lysozyme encapsulated gold nanoclusters: effects of cluster synthesis on natural protein characteristics // Phys. Chem. Chem. Phys. 2017. Vol. 19, № 10. P. 7228-7235.

228. Vasita R., Katti D.S. Structural and functional characterization of proteins adsorbed on hydrophilized polylactide-co-glycolide microfibers // Int. J. Nanomedicine. 2012. Vol. 7. P. 6171.

229. Sheng L. et al. The changes of secondary structures and properties of lysozyme along with the egg storage // Int. J. Biol. Macromol. 2016. Vol. 92. P. 600-606.

230. Masschalck B., Michiels C.W. Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetative bacteria // Crit. Rev. Microbiol. 2003. Vol. 29, № 3. P. 191-214.

231. Ragland S.A., Criss A.K. From bacterial killing to immune modulation: recent insights into the functions of lysozyme // PLOS Pathog. 2017. Vol. 13, № 9. P. e1006512.

232. Liu X. et al. Stability of lysozyme incorporated into electrospun fibrous mats for wound healing // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2019. Vol. 136. P. 240-249.

233. Yang Y. et al. Release pattern and structural integrity of lysozyme encapsulated in core-sheath structured poly(dl-lactide) ultrafine fibers prepared by emulsion electrospinning // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008. Vol. 69, № 1. P. 106-116.

Приложения

Приложение 1. СЭМ пленки, полученной поливом из 6% смеси ПОБВ-БСА (7:3) в ГФИП. В пленке наблюдается фазовое разделение: круглые фазы содержат азот, углерод и кислород, а «матрица» - только углерод и кислород, как показано на спектрах ЭДС.

500 1000 1500 2000

Волновое число, см-1

Приложение 2. Спектры КР отдельных волокон, полученных из 6% смеси ПЛА-желатин (1:1). Серым цветом выделены характеристические пики белка, а голубым - характеристические пики ПЛА. Каждый спектр соответствует отдельному волокну.

Приложение 3. СЭМ изображения смесевых волокон и лент ПЛА-фибриноген и карты элементов углерода (С), кислорода (0^) и азота полученных методом ЭДС.