Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Кутукова, Екатерина Александровна

• Кутукова, Екатерина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кутукова, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Транспорт веществ через бактериальную мембрану.

1.1. Общая характеристика транспортных белков. Типы и классификация.

1.2. Белки множественной лекарственной устойчивости и их регуляция.

1.3. Транспортеры аминокислот у разных организмов.

1.3.1. Экспортеры аминокислот у Corynebacterium glutamicum.

1.3.2. Импортеры аминокислот у Corynebacterium glutamicum.

1.3.3. Экспортеры аминокислот у Escherichia coli.

1.3.4. Импортеры аминокислот у Escherichia coli.

1.3.5. Системы устойчивости к низким рН у E.coli.

2. Общие принципы регуляции генной экспрессии у прокариот. Глобальные и локальные регуляторы.

2.1. Глобальный регулятор Lrp.

2.1.1. Строение белка Lrp.

2.1.2. Регуляция экспрессии lrp.

2.1.3. Фенотип мутантов.

2.1.4. Сайты связывания Lrp. Влияние экзогенных аминокислот.

2.1.5. Гены, экспрессию которых регулирует Lrp.

2.1.6. Взаимодействие с другими факторами.

2.1.7. Семейство AsnC-Lrp.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение генов, кодирующих белки семейства RhtB у Escherichia coli»

Штаммы Escherichia coli широко используются для получения продуцентов различных биологически активных веществ, в частности, аминокислот. Аминокислоты применяют в различных отраслях, в основном в пищевой, кормовой и фармацевтической промышленности. Мировой объем продукции аминокислот составил в 1998 году 3 миллиарда долларов США, и эти показатели растут на 5-10% каждый год.

Для создания штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции требуется детальное знание метаболических путей и процессов регуляции, контролирующих клеточный метаболизм.

В последнее время появляется все больше данных о том, что немаловажную роль в увеличении эффективности продукции биологически активных веществ штаммами-продуцентами Е. coli играют белки, осуществляющие транспорт из клетки конечного продукта. У эффективных продуцентов концентрация целевого метаболита может достигать значительной величины, например, при ферментации треонина штаммом-продуцентом Е. coli концентрация последнего в культуральной жидкости составляет 100120 г/л. В этих условиях может происходить подавление активности ферментов и роста клетки продуктами собственного метаболизма. Поэтому для увеличения выхода продукта необходимо уменьшать его внутриклеточную концентрацию. Одним из способов такого уменьшения является активация экскреции метаболитов.

В процессе ферментации может изменяться множество параметров среды: доступность различных питательных веществ, концентрации кислорода и углекислого газа, рН и осмотический статус среды и т.д. В этих условиях активируются так называемые глобальные или мультигенные регуляторные системы. К ним относятся, в частности, системы, защищающие клетку от стрессов, в том числе, системы осмотического стресса, перехода в стационарную фазу роста, в состояние анаэробиоза и др. Поскольку для получения максимального выхода продукта необходимо культивировать штамм-продуцент в наиболее подходящих условиях, чрезвычайно интересным представляется изучение влияния глобальных регуляторов на различные компоненты ферментных и транспортных систем клетки.

Поиск и изучение генов, продукты которых ответственны за транспорт метаболитов из клетки, а также определение влияния на уровень их экспрессии различных глобальных регуляторных систем является важной задачей, которая имеет большое научное и практическое значение.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение генов Е. coli, кодирующих белки, входящие в состав семейства RhtB. Эти гены являются паралогами ранее описанного гена rhtB, продукт которого осуществляет экскрецию гомосерина и треонина из клеток Е. coli.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

- Изучить влияние сверхэкспрессии генов - паралогов rhtB на устойчивость клеток к аминокислотам и их аналогам.

- Изучить влияние сверхэкспрессии этих генов на накопление аминокислот штаммами Е. coli - продуцентами аминокислот.

Провести компьютерный поиск возможных сайтов связывания белков — регуляторов в регуляторных областях генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN.

Сконструировать вектор на основе малокопийной плазмиды pMW119 для исследования уровня экспрессии генов на основе определения активности Р-галактозидазы.

Определить индукцию экспрессии исследуемых генов аминокислотами.

Изучить влияние аллельного состояния генов, кодирующих белки регуляторы, на уровень экспрессии исследуемых генов.

Изучить влияние некоторых физиологических стрессов на уровень экспрессии исследуемых генов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе были исследованы гены, кодирующие белки - члены семейства RhtB: yfiK, yeaS, yggA и yahN. Впервые показано, что амплификация каждого из них повышает устойчивость клеток Е. coli к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и увеличивает продукцию ряда аминокислот модельными штаммами-продуцентами. При этом сверхэкспрессия гена yeaS приводит к значительному увеличению накопления в среде культивирования лейцина, и в меньшей степени - метионина и гистидина. Эти данные представляют практический интерес при получении промышленных штаммов-продуцентов аминокислот на основе Е. coli. В работе также исследовалась регуляция генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Установлено, что экспрессия гена yeaS индуцируется такими аминокислотами, как лейцин, а-аминобутират и, в меньшей степени, треонин, метионин, лизин, гистидин, аланин и гомосерин. Показано, что для осуществления этой индукции необходимо присутствие в клетке белка Lrp, который является репрессором yeaS.

Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN также регулируется белком Lrp. Кроме того, обнаружено, что уровень экспрессии гена yahN значительно падает при добавлении в среду лейцина, и это падение также зависит от присутствия в клетке белка Lrp.

Также показано, что продукт гена уеаТ, расположенного рядом с геном yeaS на хромосоме Е. coli и кодирующего LysR-подобный регулятор, не оказывает влияния на экспрессию гена yeaS.

Кроме того, изучено влияние некоторых физиологических стрессов па уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN. Показано, что в случае ряда стрессов уровень экспрессии всех четырех генов увеличивается в несколько раз.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Кутукова, Екатерина Александровна

V. ВЫВОДЫ

1. Амплификация каждого из генов Е. coli, кодирующих белки семейства RhtB, сообщает клеткам Е. coli устойчивость к нескольким аминокислотам и/или их аналогам и повышает продукцию аминокислот соответствующими модельными штаммами-продуцентами. Сверхэкспрессия гена yeaS приводит к увеличению накопления клетками штаммов-продуцентов лейцина, метионина и гистидина.

2. Экспрессия гена yeaS индуцируется добавлением в среду лейцина, а-аминобутирата и, в несколько меньшей степени, - треонина, метионина, лизина, гистидина, аланина и гомосерина. Вместе с данными о влиянии сверхэкспрессии этого гена на устойчивость бактерий Е. coli и В. subtilis к аминокислотам и их аналогам, а также на продукцию аминокислот, этот результат свидетельствует том, что белок YeaS участвует в выбросе из клетки ряда аминокислот, в основном — лейцина и его аналогов.

3. Индукция гена yeaS аминокислотами зависит от белка Lrp, который подавляет экспрессию этого гена. Продукт гена уеаТ, кодирующего LysR-подобный регулятор, не влияет на экспрессию гена yeaS.

4. Экспрессия генов rhtB, rhtC и yahN активируется белком Lrp.

5. Уровень экспрессии генов rhtB, rhtC, yeaS и yahN возрастает при осмотическом стрессе, при добавлении в среду 4% этанола, при снижении рН среды и в анаэробных условиях.

Автор благодарит Закатаеву Наталью Павловну за огромную помощь и поддержку, которую она всегда оказывала при выполнении данной работы.

Автор также благодарит Дмитрия Родионова и Константина Рыбака за неоценимую помощь в освоении компьютерных программ.

122

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа посвящена исследованию генов Е. coli, кодирующих белки семейства RhtB.

Было показано, что сверхэкспрессия генов yfiK, yeaS, yahN и yggA приводит повышению устойчивости к аминокислотам, причем сверхэкспрессия каждого из этих генов сообщает клеткам устойчивость сразу к нескольким аминокислотам и/или их аналогам. Кроме того, при сверхэкспрессии этих генов наблюдается увеличение накопления штаммами-продуцентами тех аминокислот, к которым возникает устойчивость.

Сверхэкспрессия гена yfiK сообщает клеткам устойчивость к пролину, гистидину, глутамату, гомосерину, дегидропролину, треонину и цистеину, а также увеличивает накопление треонина, пролина, глутамата и гистидина соответствующими штаммами-продуцентами.

При сверхэкспрессии гена yggA максимальный уровень устойчивости возникает к аминоэтилцистеину (аналогу лизина), а также к аргинину и лизину. Сверхэкспрессия гена yggA, кроме того, приводит к увеличению накопления аргинина и лизина соответствующими штаммами-продуцентами.

При сверхэкспрессии гена yahN возникает устойчивость клеток Е. coli к глутамату, гомосерину и пролину. Кроме того, сверхэкспрессия этого гена приводит к увеличению продукции пролина и глутамата.

При сверхэкспрессии гена yeaS максимальный уровень устойчивости наблюдался к глицил-лейцину и а-аминобутирату. Кроме того, амплификация гена yeaS приводит к возникновению устойчивости и к другим аналогам лейцина, к гистидину и его аналогу, гистидингидраксамату, и аналогу метионина - метионинсульфону. Инактивация гена yeaS значительно снижает устойчивость клеток к глицил-лейцину.

При помощи компьютерного анализа было показано, что ген yeaS кодирует белок, состоящий из 212 аминокислот и имеющий расчетную молекулярную массу 28,3 kDa. В его составе было показано наличие шести трансмембранных сегментов, и установлена его внутриклеточная локализация во внутренней мембране.

Сверхэкспрессия гена yeaS при помощи интеграции в хромосому Е. coli под конститутивным промотором Р„ipD приводит к увеличению накопления лейцина, метионина, и гистидина модельными штаммами-продуцентами. Инактивация гена yeaS снижает накопление лейцина, а добавление в среду разобщителя СССР практически останавливает выброс лейцина.

Полученные данные позволили предположить, что ген yeaS кодирует трансмембранный белок, участвующий в выбросе из клетки ряда аминокислот, преимущественно лейцина и а-аминобутирата, используя для этого процесса энергию протонного электрохимического потенциала. Мы предлагаем переименовать ген yeaS в leuE (leucine export).

Изучение регуляции экспрессии генов, кодирующих белки семейства RhtB, показало, что гены rhtB, rhtC, yeaS и yahN регулируются глобальным регулятором Lrp, причем экспрессия гена yeaS подавляется этим белком, а экспрессия остальных генов — активируется.

Кроме того, было показано, что уровень экспрессии гена yeaS индуцируется при добавлении в среду ряда аминокислот. Максимальный эффект наблюдался при добавлении лейцина и а-аминобутирата, кроме того, экспрессию гена yeaS индуцируют такие аминокислоты, как треонин, метионин, лизин, гистидин, аланин и гомосерин. Было показано, что индукция аминокислотами экспрессии гена yeaS нуждается в присутствии в клетке белка Lrp.

Для гена yahN также был показан эффект добавления лейцина в среду культивирования, но в этом случае добавление лейцина значительно уменьшало уровень экспрессии гена yahN. Этот эффект также обусловливался присутствием в клетке гена lrp.

Уровень экспрессии гена rhtB не зависел от добавления лейцина, а-аминобутирата и субстратов, в транспорте которых участвует белок RhtB - гомосерина и треонина.

Уровень экспрессии гена rhtC увеличивался при добавлении лейцина в минимальную среду культивирования.

В работе было показано, что уровень экспрессии всех четырех изученных генов, кодирующих белки семейства RhtB, увеличивается во время таких физиологических стрессов, как осмотический стресс, при добавлении в среду 4% этанола, при низких значениях рН, а также в анаэробных условиях

Уровень экспрессии всех четырех проверенных генов не зависел от аллельного состояния генов ompR, crp, fis, marR, acrR, relA и spoT, а также от аллельного состояния гена rpoS. Инактивация гена rpoS оказывала незначительное действие лишь на уровень экспрессии теш yahN- он понижался вдвое.

В работе также было показано, что продукт гена уеаТ не является LysR-подобным регулятором экспрессии гена yeaS.

Полученные данные имеют важное практическое значение. Так, при введении гена yeaS, клонированного под конститутивным промотором, в штаммы, продуцирующие лейцин, метионин и гистидин, продукция названных аминокислот значительно возрастает.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кутукова, Екатерина Александровна, 2005 год

1. Авторское свидетельство СССР №1354458. Штамм бактерий Escherichia coli -продуцент лизина.

2. Аствацатурянц Г.В., Лисепков А.Ф., Смирнов Ю.В., Шакулов Р.С. 1988. Получение мутантов с нарушенным ретроингибированием биосинтеза гистидина. -Генетика 24:1928-1934.

3. Закатаева Н.П. 1997. Исследование плейотропной мутации устойчивости к гомосерину и треонину у Escherichia coli К-12. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, ГНИИГенетики и селекции промышленных микроорганизмов.

4. Зиятдинов М.М., Ворошилова Э.В., Гусятинер М.М. 2001. L-метионин продуцирующие бактерии рода Escherichia и метод продукции L-метионина. — ЗАО АГРИ, Патент РФ № 2209248.

5. Клячко Е.В., Зиброва М.Г., Шакулов Р.С., Дебабов В.Г., Козлов Ю.И. 1998. Штамм of Escherichia coli — продуцент гистидина. ГНИИГенетика. Патент РФ № 2119536.

6. Рыбак КВ. 2005. Поиск новых генов Escherichia coli, участвующих в экспорте аминокислот. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва. ЗАО «АГРИ». На правах рукописи.

7. Рыбак КВ., Сливииская Е.А., Хургес Е.М. 2004. Поиск новых генов Е. coli, ответственных за транспорт аминокислот. — Биотехнология 2:31-47.

8. Патент №2212447 по заявке № 2000110350, от 26.04.2000.

9. Тараканов Б.В., Яковлева А.А., Николичева Т.А., Комкова Н.М., Манухина А.К, Алешин В.В. 2004. Экспрессионный вектор pLF22 для молочнокислых бактерий. -Микробиология 73:211-217.

10. Харитонов А.А., Тарасов А.П. 1986. Клонирование и экспрессия генов Corynebacterium Jlavum АТСС 14067, комплементирующих мутации ArgA и ArgE в клетках Escherichia coli. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология 9:29-33.

11. Alekshun M.N., Levy S.B. 1997. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: the mar regulon. Minireview. Ant. Agents Chemoth. 41:2067-2075.

12. Aleshin V.V., Zakataeva N.P., Livshits V.A. 1999. A new family of amino-acid-efflux proteins. — Trends Biochem. Sci. 24:133-135.

13. Ambartsoumian G., D'Ari R., Lin R.T., Newman E.B. 1994. Altered amino acid metabolism in lrp mutants of Escherichia coli K12 and their derivatives. Microbiol. 140:17371744.

14. Anderson J.J., Oxender D.L. 1977. Escherichia coli transport mutants lacking binding protein and other components of the branched-chain amino acid transport systems. J. Bacteriol. 130:384-92.

15. Antonucci Т.К., Oxender D.L. 1986. The molecular biology of amino-acid transport in bacteria. Adv. Microbiol. Phys. 28:145-180.

16. Bachmann B.J. 1983. Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 7. Microbiol. Rev. 47:180-230.

17. Barbosa T.M., Levy S.B. 2000. Differential expression of ever 60 chromosomal genes in Escherichia coli by constitutive expression of MarA. J. Bacteriol. 182:3467-3474.

18. Belitski B.R., Gustafson M.C., Sonenshein A.L., von Wachenfeld C. 1997. An Lrp-like gene of Bacillus subtilis involved in branched-chain amino acid transport. J. Bacteriol. 179:5548-5557.

19. Bellmann A., Vrljic M, Patek M., Sahm H., Kramer R„ Eggeling L. 2001. Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. -Microbiol. 147:1765-1774.

20. Bern R. 1985. Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. Crit. Rev. Biochem. 19:145-190.

21. Blatther F.R., Plunkett G., Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M, et.al. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277:1453-1474.

22. Blomfield I.C., Calie P.J., Eberhardt K.J., McClain M.S., Eisenstein B.I. 1993. Lrp stimulates phase variation of Type 1 fimbriation in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 175:2736.

23. Borst D. W., Blumenthal R.M., Matthews R.G. 1996. Use of an in vivo titration method to study a global regulator: effect of varying Lrp levels on expression of gltBDF in Escherichia coli.- J. Bacteriol. 178:6904-6912.

24. BouvierJ., Gordia S., Kampmann G., Lange R., Hangge-Aronis R., Gutierrez C. 1998. Interplay between global regulators of Escherichia coli: effect of RpoS, Lrp and H-NS on transcription of the gene osmC. Mol. Microbiol. 28:971-980.

25. Brinkman A.B., Etterma T.J.G., de Vos W.M., van der Oost J. 2003. The Lrp family of transcriptional regulators. Mol. Microbiol. 48:287-294.

26. Broer S., Kramer R. 1990. Lysine uptake and exchange in Corynebacterium glutamicum. J. Bacterid. 172:7241-7248.

27. Burkovski A., Krdmer R. 2002. Bacterial amino acid transport proteins: occurrence, functions, and significance for biotechnological applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:265-274.

28. Burkovski A., Weil В., Kramer R. 1996. Characterization of a secondary uptake system for L-glutamate in Corynebacterium glutamicum. FEMS Microbiol. Lett. 136:169-173.

29. Calvo J.M., Mathhews R.G. 1994. The leucine-responsive regulatory protein, a global regulator of metabolism in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 58:466-490.

30. Campbell A. 1961. Sensitive mutants of bacteriophage lambda. Virology 14:22-32.

31. Campbell J.D., Biggin P.C., Baaden M., Sansom M.S. 2003ю Extending the structure of an ABC transporter to atomic resolution: modeling and simulation studies of MsbA. -Biochemistry, 42:3666-73.

32. Carole S., PichoffS., Bouche J.-P. 1999. Escherichia coli gene ydeA encodes a major facilitator pump which exports L-arabinose and isopropyl-P-D-thiogalactopyranoside. J. Bacteriol. 181:5123-5125.

33. Celis R.T. 1984. Phosphorylation in vivo and in vitro of the arginine-ornithine periplasmic transport protein of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 145:403-11.

34. Celis T.F., Rosenfeld H.J., Maas W.K. 1973. Mutant of Escherichia coli K-12 defective in the transport of basic amino acids. J. Bacteriol. 116:619-26.

35. Chen C.F., Lan J., Korovine M., Shao Z.Q., Tao L., Zhang J., Newman E.B. 1997. Metabolic regulation of lrp gene expression in Escherichia coli K-12. Microbiol. 143:20792084.

36. Chen C., Newman E.B. 1998. Comparison of the sensitivities of two Escherichia coli genes to in vivo variation of Lrp concentration. J. Bacteriol. 180:655-659.

37. Chollet R., Chevalier J., Bryskier A., Pages J.M. 2004. The AcrAB-TolC pump is involved in macrolide resistance but not in telithromycin efflux in Enterobacter aerogenes and Escherichia coli. Antimicrob. Ag. Chemother. 48:3621-4.

38. Chopra I., Roberts M. 2001. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Rev. 65:232-260.

39. Cohen S.P., Hachler H., Levy S.B. 1993. Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance {mar) locus in Escherichia coli. J. Bacterid. 175:1484-1492.

40. Cohen S.P., Yan W„ Levy S.B. 1993. A multidrug resistance regulatory chromosomal locus is widespread among enteric bacteria. J. Infect. Dis. 168:484-488.

41. Cole S.T., Brosh R., Parkhill J., Gamier Т., Churcher C.M., Harris D., et al. 1998. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. — Nature, 393:537-544.

42. Crost C., Garrivier A., Harel J., Matin C. 2003. Leucine-responsive regulatory protein-mediated repression of clp (encoding CS31A) expression by L-leucine and L-alanine in Escherichia coli. J. Bacterid. 185:1886-1894.

43. Cui Y., Wang Q„ Stormo G.D., Calvo J.M. 1995. A consensus sequence for binding of Lrp to DNA. J. Bacterid. 177:4872-4880.

44. Cundliffe E. 1989. How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu. Rev. Microbiol. 43:207-233.

45. Dabler Т., Maier Т., Winterhalter С., Bock F. 2000. Identification of a major facilitator protein from Escherichia coli involved in efflux of metabolites of the cystein pathway. Mol. Microbiol. 36:1101-1112.

46. D'Ari R., Lin R.T., Newman E.B. 1993. The leucine-responsive regulatory protein: more then a regulator? Trends Biochem. Sci. 18:260-263.

47. Datsenko K., Barry A., Wanner L. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products PNAS 97:6640-6645.

48. Eggeling L., Sahm H. 2003. New ubiquitous translocators: amino acid export by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. Arch. Microbiol. 180:155-160.

49. Ernsting B.R., Atkinson M.R., Ninfa A. J., Matthews R.G. 1992 Characterization of the regulon controlled by the leucine-responsive regulatory protein in Escherichia coli J. Bacteriol. 174:1109-1118.

50. Ernsting B.R., Deninger J. W, Blumenthal R.M., Matthews R.G. 1993. Regulation of the gltBDF operon of Escherichia coli: how is a leucine-insensitive operon regulated by the leucine-responsive regulatory protein? J. Bacteriol. 175:7160-7169.

51. Fath M.J., Kolter R. 1993. ABC-transporter: the bacterial exporters. Microbiol. Rev. 57:995-1017.

52. Franke I, Resch A., Dabler Т., Maier Т., Bock A. 2003. YfiK from Escherichia coli promotes export of O-acetylserine and Cysteine. J. Bacterid. 185:1161-1166.

53. Friedberg D., Midkiff M., Calvo J.M. 2001. Global versus local regulatory roles for Lrp-related proteins: Haemophilus influenzae as a case study. J. Bacteriol. 183:4004-4011.

54. Gazeau M., Delort F., Dessen P., Blanquet S., Plateau P. 1992. Escherichia coli leucine-responsive regulatory protein Lrp controls lysyl-tRNA synthetase expression. FEBS Lett. 300:254-258.

55. Gentry D.R., Hernandes V.J., Nguyen L.H., Jensen D.B., Cashel M. 1993. Synthesis of the stationary phase sigma factor cts is positively regulated by ppGpp. J. Bacteriol. 175:79827989.

56. Gibson T.J. 1984. Ph. D. Thesis. Cambridge University. Cambridge. London,

57. Gong S., Richard H„ Foster J.W. 2003. YudE (AdiC) is the Arginine:Agmatine antiporter essential for Arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 185:4402-4409.

58. Griffith J.K., Baker M.E., Rouch D.A., Page M.G., Skurray R.A., Paulsen I.T., Chater K.F., Baldwin S.A., Henderson P.J. 1992. Membrane transport proteins: implications of sequence comparisons. Curr. Opin. Cell Biol. 4:684-95.

59. Grkovic S., Brown M.H., Skurray R.A. 2002. Regulation of bacterial drug export systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66:671-701.

60. Gusyatiner, M.M., hunts, M.G., Ivanovskaya, L.V., Rostova, Y.G., Bachina, T.A., Khurges, E.M., Livshits, V.A., Kozlov, Y.I., and Debabov, KG. 2000. Method for producing L-leucine. Ajinomoto. United States Patent No. 6124121.

61. Haney S.A., Platko J.V., Oxender D.L., Calvo J.M: 1992. Lrp, a leucine-responsive protein, regulates branched-chain amino acid transport genes in Escherichia coli. — J. Bacteriol. 174:108-115.

62. Heatwole V.M., Somerville R.L. 1991. Cloning, nucleotide sequence, and characterization of mtr, the structural gene for a tryptophan-specific permease of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 173:108-115.

63. Hecht K., Tjhang S., Klopotowski Т., Ferro-Luzzi Ames G. 1996. D-histidine utilization in Salmonella typhimurium is controlled by the leucine-responsive regulatory protein (Lrp). J. Bacteriol. 178:327-331.

64. Hung S„ Baldi P., Hatfield G. W. 2002. Global gene expression profiling in Escherichia coli K-12: the effects of leucine-responsive regulatory protein. J. Biol. Chem. 277:4030940323.

65. Jack R. W., TaggJ.R., Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59:171-200.

66. Jafri S., Evoy S., Cho K., Crayghead H.G., Winans S.C. 1999. An Lrp-type transcriptional regulator from Agrobacterium tumefaciens candenses more than 100 nucleotides of DNA into globular nucleoprotein complexes. J. Mol. Biol. 288:811-824.

67. Kawamura-Sato K., Shibayama K., Horii Т., linuna Y., Arakmva Y., Otha M. 1999. Role of multiple efflux pumps in Escherichia coli in indole explusion. FEMS Microbiol. Lett. 179:345-352.

68. Kennerknecht N. Sahm H., Yen M.-R., PatekM., Saier M.H., Eggeling J.M., EgglingL. 2002. Export of L-isoleucine from Corynebacterium glutamicum: a two-gene-encoded member of a new translocator family. J. Bacteriol. 184:3947-3956.

69. Keuntje В., Masepohl В., Klipp W. 1995. Expression of the putA gene encoding proline dehydrogenase from Rhodobacter capsulatus is independent of NtrC regulation but requires an Lrp-like activator protein. J. Bacteriol. 177:6432-6439.

70. Kinoshita S., Udaka S., Shimono M. 1957. Amino acid fermentation. I. Production of L-glutamic acid by various microorganisms. J. Gen. Appl. Microbiol. 3:193-205.

71. Kolling R., Lother H. 1985. AsnC: an autogenously regulated activator of asparagine synthetase A transcription in Escherichia coli. J. Bacteriol. 164:310-315.

72. Koning W.N., Poolman В., Driessen A.J.M. 1989. Bioenergetics and solute transport in Lactococci- Crit. Rev. Microbiol. 16:419-476.

73. Koyanagi Т., Katayama T.M., Suzuki H., Kumagai H. 2004. Identification of the LIV-I/LS system as the third phenylalanine transporter in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 186:343-350.

74. Kruse D., Kramer R., Eggeling L., Rieping M., Pfefferle IV., Tchieu J.H., Chung Y.J., Saier M.H., Burkovski A. 2002. Influence of threonine exporters on threonine production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59:205-210.

75. Kyte J., Doolittle R.F. 1982. A simple method for displaying the hydrophatic character of a protein. J. Mol. Biol. 157:105-132.

76. Landgraf J.R., Boxer J.A., Calvo J.M. 1999. Escherichia coli Lrp (leucine-responsive regulatory protein) does not directly regulate expression of the leu operon promoter. J. Bacteriol. 181:6547-6551.

77. Landgraf J.R., Wu J., Calvo J.M. 1996. Effects of nutrition and growth rate on Lrp levels in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:6930-6936.

78. LandickR., Oxender D.L. 1985. The complete nucleotide sequences of Escherichia coli LIV-BP and LS-DP genes. J. Biol. Chem. 260:8257-8261.

79. Landini P., Hajec LI., Nguyen L.H., Burgess R.R., Volkert M.R. 1996. The leucine-responsive regulatory protein (Lrp) acts as a specific repressor for as-dependent transcription of the Escherichia coli aidB gene. Mol. Microbiol. 20:947-955.

80. Levinthal M„ Lejeune P., Danchin A. 1994. The H-NS protein modulates the activation of the ilvIH operon of Escherichia coli K-12 by Lrp, the leucine regulatory protein. — Mol. Gen. Genet. 242:736-743.

81. LiX.Z., Nikaido H. 2004. Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs. 64:159204.

82. Lin R, D'Ari R., Newman E.B. 1990. The leucine regulon of Escherichia coli: a mutation in rblA altered expression of L-leucine-dependent metabolic operons. J. Bacteriol. 172:4529-4535.

83. Lin R, D'Ari R., Newman E.B. 1992. X placMu insertions in genes of the leucine regulon: extension of the regulon to genes not regulated by leucine. J. Bacteriol. 174:19481955.

84. Lin R., Ernsting В., Hirshfield I.N., Matthews R.G., Neidhardt F.C., Clark R.L., Newman E.B. 1992. The lrp gene product regulates expression of lysll in Escherichia coli K-12. -J. Bacteriol. 174:2779-2784.

85. Lin S., Riggs A.D. 1975. The general affinity of Lac repressor for E. coli DNA: implications for gene regulation in prokaryotes and eucaryotes. Cell 4:107-111.

86. Liu J. Y., Miller P.F., Gosink M., Olson E.R. 1999. The identification of a new family of sugar efflux pumps in Escherichia coli. -Mol. Microbiol. 31:1845-1851.

87. Liu J.Y., Miller P.F., Willard J., Olson E.R. 1999. Functional and biochemical characterization of Escherichia coli sugar efflux transporters. J. Biol. Chem. 274:22977-22984.

88. Livshits, V.A., Doroshenko, V.G., Mashko, S.V., Akhverdyan, A.Z., and Kozlov, Y.I. 2001. Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing amino acid. Ajinomoto. European patent no.1149911.

89. Livshits V.A., Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Vitushkina M.V. 2003. Identification and characterization of the new rhtA gene involved in threonine and homoserine efflux in Escherichia coli. Res. In Microbiol. 154:123-135.

90. Lomovskaya 0., Kawai F., Matin A. 1996. Differential regulation of the mcb and emr operons of Escherichia coli: role of mcb in multidrug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 40:1050-1052.

91. Lomovskaya O., Lewis K., Matin A. 1995. EmrR is a negative regulator of the Escherichia coli multidrug resistance pump EmrAB. J. Bacteriol. 177:2328-2334.

92. Ma Д, Cook D.N., Alberti M„ Pon N.G., Nikaido Я, Hearst J.E. 1993. Molecular cloning and characterization of acrA and acrE genes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:6299-6313.

93. Ma D., Cook D.N., Alberti M., Pon N.G., Nikaido H., Hearst J.E. 1995. Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux system of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 16:45-55.

94. Madhusudhan K.T., Huang N. Sokatch J.R. 1995. Characterization of BkdR-DNA binding in the expression of the bkd operon of Pseudomonas putida. J. Bacteriol. 177:636-641.

95. Mathew E, Zhi J, Freundlich M. 1996. Lrp is a direct repressor of the dad operon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178:7234-40.

96. Merlin C., Gardiner G., Durand S„ Masters M. 2002. The Escherichia coli metD locus encodes an ABC transporter which includes Abe (MetN), YaeE (Metl), and YaeC (MetQ). J. Bacteriol. 184:5513-5517.

97. Miller J.H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

98. Miller P.F., Ganbino L.F., Sulavik M.C., Gracheck S.J. 1994. Genetic relationship between soxRS and mar loci in promoting multiple antibiotic resistance in Escherichia coli. -Ant. Agents Chemoth. 38:1773-1779.

99. Nandineni R„ Gowrishankar J. 2004. Evidence for an Arginine exporter encoded by yggA (argO) that is regulated by the LysR-Type transcriptional regulator ArgP in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186:3539-3546.

100. Newman E.B., D'Ari R., Lin R.T. 1992. The Ieucine-Lrp regulon in E. coli: a global response in search of a raison d'Etre. Cell 68:617-619.

101. Newman E.B., Lin R. 1995. Leucine-responsive regulatory protein: a global regulator of gene expression in E. coli. Annu. Rev. Microbiol. 49:747-775.

102. Newman E.B., Lin R.T., D'Ari R. 1996. The leucine/Lrp regulon. In Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology, pp. 1513-1525. Edited by F.C. Neidhardt,

103. Curtiss R. Ill, Ingraham J.L., Lin E.C.C., Low K.B., Magasanik В., Reznikoff W.S., Riley M. ASM Press, Washington, DC.

104. Neyfakh A.A. 2002. Mystery of multidrug transporters: the answer can be simple. Mol. Microbiol. 44:1123-1130.

105. Nies D.H. 1999. Microbial heavy-metal resistance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51:730-750.

106. Nikaido H. 1996. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 178:5853-5859.

107. Nikaido H., Zgurskaia HI. 2001. AcrAB and related multidrug efflux pumps of Escherichia coli. — J. Mol. Microbiol. Biotech. 3:215-218.

108. Nogueira Т., Springer M. 2000. Post-transcriptional control by global regulators of gene expression in bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 3:154-158.

109. Okusu H., Ma D., Nikaido H. 1996. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 18:306-308.

110. Ono E., Tsujimoto N., Izui H., Matsui K. 1997. Escherichia strain for fermentative production of L-glutamic acid. Patent FR2747689.

111. Paul L., Blumenthal R.M., Matthews R.G. 2001. Activation from a distance: roles of Lrp and integration host factor in transcriptional activation of gltBDF. J. Bacteriol. 183:39103918.

112. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. 1996. Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiol. Rev. 60:575-608.

113. Peekhaus N., Tolner В., Poolman В., Kramer R. 1995. The glutamate uptake regulator protein (Grp) of Zymomonas mobilis and its relation to the global regulator Lrp of Escherichia coli.-. Bacteriol. 177:5140-5147.

114. Peter H., Burkovski A., Kramer R. 1998. Osmo-sensing by N- and C-terminal extension of the glycine betaine uptake system BetP of Corynebacterium glutamicum. J. Biol. Chem. 273:2567-257'4.

115. Pittard A.J., Wookey P.J. 1991. Cloning and sequencing of the pheP gene, which encodes the phenylalanine-specific transport system of Escherichia coli. J. Bacteriol. 173:3622-3629.

116. Pittman M.S., Corker H., Wu G., Binet M.B., Moir A.J.G., Poole R.K. 2002. Cystein is exported from the Escherichia coli cytoplasm by CydDC, an ATP-binding cassette-type transporter required for cytochrome assembly. J. Biol. Chem. 277:49841-49849.

117. Platko J. V., Calvo J.M. 1993 Mutations affecting the ability of Escherichia coli Lrp to bind DNA, activate transcription, or respond to leucine. J. Bacteriol. 175:1110-1117.

118. Platko J.V., Willins D.A., Calvo J.M. 1990. The ilvIH operon of Escherichia coli is positively regulated. J. Bacteriol. 172:4563-4570.

119. Plesiat P., Nikaido H. 1992. Outer membranes of Gram-negative bacteria are permeable to steroid probes. Mol. Microbiol. 11:755-769.

120. Poole RK, Hatch L, Cleeter MW, Gibson F, Cox GB, Wu G. 1993. Cytochrome bd biosynthesis in Escherichia coli: the sequences of the cydC and cydD genes suggest that they encode the components of an ABC membrane transporter. Mol. Microbiol. 10:421-30.

121. Poolman В., Molenaar D., Smid E.J., Ubbink Т., Abee Т., Renauld P.P., Konings W.N. 1991. Malolactic fermentation: electrogenis uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy. J. Bacteriol. 173:6030-6037.

122. Ptashne M., Gann A. 1997. Transcriptional activation by recruitment. Nature 389:569-577.

123. Rahmanian M., Claus D.R., Oxender D.L. 1973. Multiplicity of leucine transport systems in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 116:1258-66.

124. Rahmati S., Yahg S., Davidson A.L., Zechiedrich E.L. 2002. Control of the AcrAB multidrug efflux pump by quorum sensing regulator SdiA. Mol. Microbiol. 43:677-695.

125. Reiaer J., Reizer A., Saier M.H. 1992. A new subfamily of bacterial ABC-type transport systems catalyzing export of drugs and carbohydrates. Prot. Sci. 1:1326-1332.

126. Rhodius V.A., Busby S.J. W. 1998. Positive activation of gene expression. Curr. Opin. Microbiol. 1:152-159.

127. Rosen B.P. 1971. Basic amino acid transport in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 246:3653-62.

128. Rosenberg M.F., Callaghan R., Ford R.C., Higgins C.F. 1997. Structure of multidrug resistance P-glycoprotein to 2.5 nm resolution determined by electron microscopy and image analysis. J. Biol. Chem. 272:10685-10694.

129. Rosner J.L., Slonczewski F. 1994. Dual regulation of inaA by the multiple antibiotic resistance (mar) and superoxide stress response (SoxRS) systems of Escherichia coli. — J. Bacteriol. 176:6262-6269.

130. Russel M., Model P. 1988. Sequence of thioredoxin reductase from Escherichia coli. -J. Biol. Chem. 263:9015-9019.

131. Saier M.H. 1994. Computer-aided analyses of transport protein sequences: cleaning evidence concerning function, structure, biogenesis and evolution. Microbiol. Rev. 58:71-93.138. SU Patent №5175107.

132. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. -Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

133. Schell, M.A. 1993. Molecular biology of the LysR family of transcriptional regulators.- Ann. Rev. Microbiol. 45:597-626.

134. Schembri M.A., Kjaergaard K., Klemm P. 2003. Global gene expression in Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 48:253-267.

135. Schubert M.P. 1937. Reaction of semimercaptals with amino compounds. J. Biol. Chem., 121:539-548.

136. Schwan W.R., Wetzel K.J., Gomez T.S., Stiles M.A., Beitlich B.D., Grunwald S. 2004. Low-proline environments impair growth, proline transport and in vivo survival of Staphylococcus aureus strain-specificputP mutants. Microbiology 150:1055-1061.

137. Seoane A.S., Levy S.B. 1995. Characterization of MarR, the repressor of the multiple antibiotic resistance {mar) operon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:3414-3419.

138. Simic P., Sahm H., Eggeling L. 2001. L-threonine export: use of peptides to identify a new translocator from Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 183:5317-5324.

139. Soksawatmaekhin W., Kuraishi A., Sakata K., Kashiwagi K., Igarashi K. 2004. Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli.- Mol. Microbiol. 51:1401-1412.

140. Speer B.S., Shoemaker N.B., Salyers A.A. 1992. Bacterial resistance to tetracycline: mechanisms, transfer, and clinical significance. Clin. Microbiol. Rev. 5:387-399.

141. Squires C.H., DeFelice M., Devereux J, Calvo J.M. 1983. Molecular structure of ilvIH and its evolutionary relationship to ilvG in Escherichia coli K-12. Nucleic Acid Res. 11:52995313.

142. Stasinopoulos S.J., Farr A., Bechhofer D.H. 1998. Bacillus subtilis tetA(L) gene expression: evidence for regulation by translation reinitiation. Mol. Microbiol. 30:923-932.

143. Stauffer L.T., Stauffer G.V 1999. Role of the leucine-responsive regulatory protein (Lrp) as a structural protein in regulating the Escherichia coli gcvTHP operon Microbiol. 145:569-576.

144. Summers A. 1992. Untwist and shout: a heavy metal-responsive transcriptional regulator. J. Bacteriol. 174:3097-3101.

145. Tani Т.Н., Khodursky A., Blumenthal R.M., Brown P.O., Matthews R.G. 2002. Adaptation to famine: a family of stationary-phase genes revealed by microarray analysis. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:13471-13476.

146. Tavori H., Kimmel Y, Barak Z. 1981. Toxicity of leucine-containing peptides in Escherichia coli caused by circumvention of leucine transport regulation. J. Bacteriol. 146:676683.

147. Tong S., Porco A., Isturiz Т., Conway T. 1996. Cloning and molecular genetic characterization of the Escherichia coli gntR, gntK, and gntU genes of GntI, the main system for gluconate metabolism. J. Bacteriol. 178:3260-3269.

148. Trotschel C., Deutenberg D„ Bathe В., Burkovski A., Kramer R. 2005. Characterization of methionine export in Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol., 187: 3786-3794.

149. TuanL.R., D'Ari R., Newman E.B. 1990. The leucine regulon of Escherichia coli K-12: a mutation in rblA alters expression of L-leucine-dependent metabolic operons. J. Bacteriol. 172:4529-4535.

150. Vierra J., Messing J. 1991. New pUC-derived cloning vectors with different selectable markers and DNA replication origins. Gene 100:189-194.

151. Vrljic M., Konemeyer W., Sahm W., Eggeling L. 1995. Disbalance of L-lysine efflux in Corynebacterium glutamicum and its use for the isolation of excretion defective mutants. J. Bacteriol. 177:4021-4027.

152. Vrljic M., Sahm H., Eggeling L. 1996. A new type of transporter with a new type of cellular function: L-lysine export from Corynebacterium glutamicum. Mol. Microbiol. 22:815826.

153. Wang Q., Calvo J.M. 1993. Lrp, a major regulatory protein in Escherichia coli, bends DNA and can organize the assembly of a higher-order nucleoprotein structure. J. EMBO 12:2495-2501.

154. Wang Q., Calvo J.M. 1993. Lrp, a global regulatory protein of Escherichia coli, binds cooperatively to multiple sites and activates transcription of ilvIH. J. Mol. Biol. 229:306-318.

155. Wang L„ Miller A., Rusch S.L., Kendall D.A. 2004. Demonstration of a specific Escherichia coli SecY-Signal peptide interaction. Biochemistry 43:13185-13192.

156. Wang Q., Wu J., Friedberg D„ Platko J., Calvo J. 1994. Regulation of the Escherichia coli lrp gene J. Bacteriol. 176:1831-1839.

157. Ward J.B., Zahler S.A. 1973. Regulation of leucine biosynthesis in Bacillus subtilis. — J. Bacteriol. 176:1831-1839.

158. Wheldrake J.F. 1967. Intracellular concentration of cystein in Escherichia coli and its relation to repression of the sulphate-activating enzymes. J. Biochem. 105:697-699.

159. White, B.A. 1993. PCR protocols. Current methods and applications., ed. Humana Press , Totowa, New Jersey.

160. White D.G., Goldman J.D., Demple B, Levy S.B. 1997. Role of the acrAB locus in organic solvent tolerance mediated by expression of mar A, soxS, or robA in Escherichia coli. — J. Bacteriol. 179:6122-6126.

161. Willins, D.A., Calvo J.M. 1992. In vitro transcription from the Escherichia coli ilvH promoter. J. Bacteriol. 174:7648-7655.

162. Willins D.A., Ryan C.W., Platko J.V., Calvo J.M. 1991. Characterization of Lrp, an Escherichia coli regulatory protein that mediates a global response to leucine. J. Biol. Chem. 266:10768-10774.

163. Wood J.M. 1975. Leucine transport in Escherichia coli. The resolution of multiple transport systems and their coupling to metabolic energy. J. Biol. Chem. 250:4477-4485.

164. Wood J.M., Zadworny D. 1979. Characterization of an inducible porter required for L-proline catabolism by Escherichia coli K12. Can. J. Biochem. 57:1191-1199.

165. Wood J.M., Zadworny D. 1980. Amplification of the put genes and identification of the put gene products in Escherichia coli K12. Can. J. Biochem. 58:787-796.

166. Yang J., Hwang J.S., Camakaris H, Irawaty W., IshihamaA., PittardJ. 2004. Mode of action of the TyrR protein: repression and activation of the tyrP promoter of Escherichia coli. -Mol. Microbiol. 52:243-256.

167. Yen M.-R., Tseng Y.-H., Simic P., Sahm H., Eggeling L., Saier M.H.J. 2002. The ubiquitous ThrE family of putative transmembrane amino acid efflux transporters. Res. Microbiol. 153:19-25.

168. Zakataeva N.P., Aleshin V.V., Tokmakova I.L., Troshin P.V., Livshits V.A. 1999. The novel transmembrane Escherichia coli proteins involved on the amino acid efflux. FEBS Lett. 452:228-232.

169. Zeppenfeld Т., Larisch C., Lengeler J. W., Jahreis K. 2000. Glucose transporter mutants of Escherichia coli K-12 with changes in substrate recognition of IICB(Glc) and induction behavior of the ptsG gene. J. Bacteriol. 182:4443-4452

170. Zhi J., Mathew E., Frudlich M. 1999. Lrp binds to two regions in the dadAX promoter region of Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32:29-40.

171. Zhou A., WozniakA., Meyer-Lipp K„ Nietschke M., Jung H., Fendler K. 2004. Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E. coli. J. Mol. Biol. 343:931-42.