Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сычева, Елена Викторовна

• Сычева, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сычева, Елена Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. "Скрытый" метаболизм.

1.1.1. Примеры реакций "скрытого" метаболизма.

1.1.2. Синтез неканонических аминокислот в пути биосинтеза лейцина.

1.1.3. Механизм токсического действия норлейцина.

1.1.4. Получение аналогов белков, содержащих неканонические аминокислоты.

1.2. Пути метаболизма треонина в клетках Е. coli.

1.2.1. Биосинтетическая треониндезаминаза.

1.2.1. Аэробные пути деградации треонина.

1.2.2. Анаэробный путь деградации треонина.

1.2.3. Регуляция транскрипции tdcABCDEFG оперона.

1.2.4. ТРР-зависимый путь деградации треонина.

1.2.5. Метилцитратный цикл метаболизма пропионил-КоА.

1.3. Синтазы ацетогидроксикислот в синтезе разветвленных аминокислот у Е. coli.

1.3.1. Классификация синтаз ацетогидроксикислот и их метаболическая роль.

1.3.2. Изоферменты AHAS у Е. coli.

1.3.3. Субстратная специфичность и кинетические свойства AHAS.

1.3.4. Регуляция экспрессии AHAS.

1.3.4.1. Регуляция транскрипции ilvBN оперона.

1.3.4.2. Регуляция транскрипции ilvGMEDA оперона.

1.3.4.3. Регуляция транскрипции ilvIHоперона.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Среды, условия культивирования штаммов.

2.2. Трансформация, трансдукция бактерий, интеграция экспрессионных кассет.

2.3. Хромосомные модификации с использованием ARed-зависимой системы интеграции линейных фрагментов ДНК.

2.4. Бактериальные штаммы, использованные в данной работе.

2.5. Эксперименты с рекомбинантной ДНК.

2.6. Конструирование рекомбинантных плазмид.

2.7. Условия измерения методами ТСХ и ГЖХ.

2.8. Анализ деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3.

2.9. Получение Ь-13С-треонина.

2.10. Регистрация и обработка ЯМР-спектров.

2.11. Измерение энзиматических активностей.

2.11.1. Определение активности треониндезаминазы.

2.11.2. Определение активности ацетолактатсинтазы.

2.11.3. Определение активности изопропилмалатсинтазы.

2.12. Определение времени полужизни треониндезаминазы и AHAS.

2.13. Идентификация и анализ накопления норвалина и норлейцина.

2.14. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) аминокислот.

2.15. Анализ образования норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli.

2.16. Компьютерные программы, использованные в данной работе.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение аэробной деградации треонина в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии треониндезаминазы, устойчивой к ретроингибированию.

3.1.1. Конструирование модельного штамма ITP290-3.

3.1.2. Изучение конверсии треонина в изолейцин в модельном штамме 1ТР290-3 в условиях контролируемой экспрессии гена ilvAlleK.

3.1.3. Анализ продуктов деградации Ь-[и-14С]треонина в штамме ITP290-3.

3.1.4. Анализ продуктов деградации Ь-13С-треонина методом ЯМР-спектроскопии

3.2. Изучение ферментов пути аэробного метаболизма треонина в пропионат.

3.2.1. Влияние амплификации и инактивации генарохВ на синтез пропионата в штамме ITP290

3.2.2. Влияние инактивации гена асеЕ на синтез пропионата в штамме ITP290-3.

3.2.3. Изучение возможного метаболизма пропионил-КоА в метилцитратном цикле.

3.3. Модификация экспрессии AHAS - ключевых ферментов биосинтеза разветвленных аминокислот.

3.3.1. Клонирование генов AHAS II под контролем регуляторной области ilvBN оперона.

3.3.2. Клонирование генов валин-чувствительных AHAS I и AHAS III.

3.3.3. Клонирование генов AHAS I в составе оперона PmrA-Aatt-lhrA442B.

3.3.4. Клонирование генов AHAS из М. methylotrophus.

3.4. Изучение сверхсинтеза норвалина и норлейцина в пути биосинтеза лейцина у штамма

Е. coli, дефектного по AHAS.

3.4.1. Сверхсинтез норвалина и норлейцина штаммом B7AilvBNAilvGMAilvIH.

3.4.2. Подтверждение предполагаемого пути биосинтеза норвалина и норлейцина.96 3.4.3 Образование норвалина и норлейцина покоящимися клетками Е. coli с разным уровнем экспрессии генов биосинтеза лейцина.

3.4.4. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IPMS.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение элементов "скрытого" метаболизма 2-кетобутирата у Escherichia coli на примере штаммов-продуцентов аминокислот»

актуальность проблемы

Всем ферментам в той или иной степени присуще наличие альтернативных субстратов. Именно это свойство определяет гибкость метаболических путей и обеспечивает замечательную приспособляемость микроорганизмов к изменяющимся условиям роста. Зачастую в новых условиях могут возникать целые альтернативные метаболические пути, так называемые пути "скрытого" метаболизма, которые обусловливают способность клеток к утилизации новых источников питания или к катаболизму токсичных агентов экзогенного или эндогенного происхождения [1]. Изучение таких путей становится особенно актуальным при создании на основе микроорганизмов штаммов-продуцентов различных метаболитов, в частности, аминокислот. Стандартным подходом в такой работе является усиление метаболических потоков, приводящих к синтезу целевого продукта, и блокирование "ненужных" путей. Это достигается путем увеличения или уменьшения экспрессии соответствующих генов, что может приводить к внутриклеточному накоплению интермедиатов биосинтеза. В результате чего могут включаться "скрытые" метаболические пути, катаболизирующие эти интермедиаты, причем соответствующие метаболические потоки могут быть весьма значительными, что может отрицательно сказаться на выходе целевого продукта и приводить к накоплению примесей.

Мы столкнулись с явлением "скрытого" метаболизма при конструировании на основе Escherichia coli штамма-продуцента изолейцина. Известно, что изолейцин образуется из треонина (Рис. 1.1), поэтому при создании штамма-продуцента изолейцина необходимо в первую очередь усилить биосинтез треонина и блокировать его деградацию. Кроме того, для эффективной конверсии треонина в изолейцин очень важно подобрать оптимальный уровень экспрессии ключевых ферментов биосинтеза изолейцина -биосинтетической треониндезаминазы (IlvA), осуществляющей превращение треонина в 2-кетобутират, и синтаз ацетогидроксикислот (AH AS), которые катализируют конденсацию 2-кетобутирата с пируватом с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата -предшественника изолейцина.

При создании штамма-продуцента изолейцина мы обнаружили, что усиление синтеза треонина в ряде случаев приводило к резкому снижению уровня синтеза изолейцина и накоплению в среде значительного количества пропионата. Мы предположили, что это явление связано главным образом с деградацией треонина, поэтому основной задачей работы стало изучение ранее неизвестных путей аэробной деградации треонина. транспорт из клетки включение в белки

2-амино- Tdh

3-кетобутират f КоА НАДН НАД+ Ч

TdcB

КЫ

IlvA ацетил-КоА

L-глицин у—L-треонин —^ -ч^ f NH3 рпв

Ч NH3 TdcE 9

AHAS Г КоА С02

1*4 со,

2-кетобутират ч

КоА

2-кетобутират пируват

НСООН пропионил-КоА Рн ч анаэробные условия

Pta

2-ацето-2-гидрокси-бутират

I I I

L-изолейцин

КоА пропионилфосфат АДФ АТФ пропионат

АскА TdcD

Рис. 1.1. Метаболизм L-треонина в Е. coli

Tdh - треониндегидрогеназа, КЫ - 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза, IlvA треониндезаминаза (биосинтетическая), AHAS - сингазы ацетогидроксикислот; TdcB -треониндезаминаза (катаболитная), PflB - пируватформиатлиаза, TdcE - 2-кетобутират-формиатлиаза, Pta - фосфотрансацетилаза, AckA, TdcD - пропионаткиназы

К настоящему времени в клетках Е. coli охарактеризованы два пути катаболизма треонина - превращение треонина в глицин, в котором участвуют треониндегидрогеназа (Tdh) и 2-амино-З-кетобутират-КоА-лигаза (КЫ) [2], и анаэробная деградация до пропионата [3] (Рис. 1.1). Показано, что на первом этапе анаэробного пути деградации треонин превращается в 2-кетобутират под действием биодеградативной треониндезаминазы (TdcB). Затем 2-кетобутират неокислительно декарбоксилируется с образованием пропионил-КоА фомиатлиазами кетокислот PflB и TdcE, которые чувствительны к кислороду и не активны в аэробных условиях. В дальнейшем превращении пропионил-КоА в пропионат через пропионилфосфат принимают участие фосфотрансацетилаза (Pta) и пропионаткиназы - TdcD и АскА. Другие пути деградации треонина в клетках Е. coli к настоящему времени не охарактеризованы. цели и задачи работы

Данная работа является продолжением исследований, проводимых в ЗАО "АГРИ" и направленных на конструирование высокоэффективных штаммов-продуцентов треонина и изолейцина. Основной целью настоящей работы являлось изучение путей аэробного метаболизма треонина в клетках Е. coli, связанных с образованием 2-кетобутирата.

В процессе работы решались следующие задачи:

- изучение путей аэробной деградации треонина в клетках Е. coli\ идентификация ферментов, участвующих в аэробной деградации треонина в клетках Е. coli\ создание коллекции генетических конструкций, несущих гены, кодирующие изоферменты синтаз ацетогидроксикислот (AHAS) из Е. coli и Methylophilis methylotrophus для дальнейшего применения при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот; исследование роли ферментов биосинтеза лейцина в образовании неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из 2-кетобутирата;

- изучение возможности сверхсинтеза норвалина и норлейцина в Е. coli. научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе изучена аэробная деградация L-треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в модельном штамме Е. coli ITP290-3. Этот штамм накапливает треонин в отсутствие экспрессии гена ilvAIleR, кодирующего биосинтетическую треониндезаминазу, устойчивую к ретроингибированию, и изолейцин в условиях экспрессии гена ilvAIleR. Показано, что в клетках Е. coli в аэробных условиях происходит деградация треонина в пропионат и 2-аминобутират в случае, когда треонин эффективно дезаминируется треониндезаминазой, устойчивой к ретроингибированию, с образованием 2-кетобутирата. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата является незначительным.

Создана коллекция экспрессионных кассет, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперона ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией. Полученные конструкции в дальнейшем могут применяться при конструировании штаммов-продуцентов разветвленных аминокислот.

Получен штамм Е. coli с делениями всех генов, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы с выходом 8%. На примере данного штамма подтвержден предполагаемый механизм образования норвалина и норлейцина в клетках Е. coli из 2-кетобутирата или пирувата ферментами пути биосинтеза лейцина.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сычева, Елена Викторовна

выводы

1. Изучена аэробная деградация треонина, однородно меченного изотопами 14С и 13С, в штамме Е. coli ITP290-3 с контролируемой экспрессией устойчивой к ретроингибированию треониндезаминазы. Обнаружено, что при сверхэкспрессии данного фермента в аэробных условиях в клетках Е. coli происходит превращение 2-кетобутирата, образовавшегося из треонина, в пропионат и 2-аминобутират.

2. Установлено, что основную роль в деградации 2-кетобутирата в пропионат играет пируватдегидрогеназный комплекс. Показано, что пируватоксидаза в случае ее сверхэкспрессии также принимает участие в деградации 2-кетобутирата, в отсутствие сверхэкспрессии вклад пируватоксидазы в деградацию 2-кетобутирата не является значительным.

3. Создана коллекция генетических конструкций, кодирующих изоферменты синтаз ацетогидроксикислот Е. coli и М. methylotrophus. Получены варианты оперонов ilvG603M и ilvBN Е. coli с модифицированными регуляторными областями как с плазмидной, так и с хромосомной локализацией.

4. Показано, что в клетках Е. coli с блокированной функцией синтаз ацетогидроксикислот в условиях дерепрессии генов биосинтеза лейцина происходит утилизация 2-кетобутирата ферментами биосинтеза лейцина, что приводит к образованию' неканонических аминокислот норвалина и норлейцина.

5. Получен штамм Е. coli, для которого отработаны условия сверхсинтеза неканонических аминокислот норвалина и норлейцина из глюкозы. Данный штамм можно рассматривать как потенциальный продуцент норвалина и норлейцина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сычева, Елена Викторовна, 2008 год

1. D' Ari R., Casadeus J.: Underground metabolism. BioEssays, 1998, 20: 181-186.

2. Aronson B.D., Levinthal M., Sommerville R.L.: Activation of a cryptic pathway for threonine metabolism via specific IS3-mediated alteration of promoter structure in Escherichia coli. J. Bacterid., 1989,171: 5503-5511.

3. Hesslinger C., Fairhurst S.A., Sawers G.: Novel keto acid formate-lyase and propionate kinase enzymes are components of an anaerobic pathway in Escherichia coli that degrades L-threonine to propionate. Mol. Microbiol., 1998, 27: 477-492.

4. Murray M. L., Hartman P.E.: Overproduction of hisH and hisF gene products leads to inhibition of cell division in Salmonella. Can. J. Microbiol., 1972,18: 671-681.

5. Casadesus J., Roth J.R.: Absence of insertions among spontaneous mutants of Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet., 1989, 216: 210-216.

6. Berg C.M., Wang M.-D., Vartak N.B., et al.: Acquisition of new metabolic capabilities: multicopy suppression by cloned transaminase genes in Escherichia coli K-12. Gene, 1988,65: 195-202.

7. Itikawa H., Vogel H.J.: Enzymic basis for a genetic suppression: accumulation and deacylation of N-acetylglutamic gamma-semialdehyde in enterobacterial muants. Biochim. Biophys. Acta, 1968,159: 547-550.

8. Richaud C., Mengin-Lecreulx D., Pochet S., et al.: Directed evolution of biosynthetic pathways. Recruitment of cysteine thioethers for constructing the cell wall of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, 269: 26827-26835.

9. Brutlag D., Kornberg A.: Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. XXXIV. A proofreading function for the 3-5' exonuclease activity in deoxyribonucleic acid polymerases. J. Biol. Chem., 1972, 247: 221-248.

10. Ninio J.: Kinetic devices in protein synthesis, DNA replication, and mismatch repair. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1987, 52: 639-646.

11. Jakubowski H.,Goldman E.: Editing of errors in selection of amino acids for protein synthesis. Microbiol. Rev., 1992, 56: 412-429.

12. Hopfield J,J.: Kinetic proofreading: a new mechanism for reducing errors in biosynthetic processes requiring high specificity. ProcNatl Acad Sci USA, 1974, 71: 4135-4139.

13. Ninio J.: Kinetic amplification of enzyme discriminatioa Biochimie, 1975, 57: 587-595.

14. Bauerle R.H., Freundlich M., Stoermer C.F., et al.: Control of isoleucine, valine and leucine biosynthesis. II. Inhibition by valine of acetohydroxyacid synthase in Salmonella typhimurium Biochim. Biophys. Acta, 1964,92: 142-149.1516,17,18,19,20.