Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Рыбак, Константин Вячеславович

• Рыбак, Константин Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рыбак, Константин Вячеславович

I Введение.

II. Обзор литературы.

1. Транспортные белки. Общие положения.

2. Бактериальные экспортеры аминокислот.

2.1 Экспортеры обнаруженные у Coryncbacterium glutamicum.

2.1.1 Экспортер лизина и аргенина LysE.

2.1.2 Экспортер треонина и серина ThrE.

2.1.3 Экспортер разветвленных аминокислот BmEF.

2.2 Экспортеры обнаруженные у Escherihia coli.

2.2.1 Экспортеры гомосерина и треонина - RhtA и RhtB.

2.2.2 Экспортеры L-цистеина и О-ацетил-Ь-серина - YdeD и YßK.

2.2.3 Экспортер L-аргинина - YggA (ArgO).

3. Системы множественной лекарственной устойчивости (MDR).

3.1 Классификация MDR транспортеров.

3.1.1 MDR транспортеры ЛВС-типа.

3.1.2 Вторичные MDR транспортеры.

3.2 Регуляция работы систем MDR-транспорта.

3.3 Физиологическая роль MDR-транспортеров.

III. Материалы п методы.

IV. Результаты п обсуждении.

1. Компьютерный поиск гипотетических белков E.coli, способных транспортировать аминокислоты.

2. Клонирование исследуемых генов в составе мультикопийных плазмид.

3. Влияние гибридных плазмид иа устойчивость клеток Е.coli к различным ингибиторам клеточного роста.

4. Изучение эффекта амплификации исследуемых генов на скорость поглощения аминокислот.

5. Влияние амплификации изучаемых генов на продукцию штаммов E.coli

- продуцентов аминокислот.

6. Поиск сайтов связывания регуляторных белков перед исследуемыми генами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск новых генов Escherichia Coli, участвующих в экспорте аминокислот»

Бактериальная клетка - открытая система, которая непрерывно обменивается с окружающей средой веществом и энергией. Единство автономности и, вместе с этим, тесной связи с окружающей бактерию средой осуществляет биологическая мембрана. Важнейшей функцией любой клеточной мембраны является граничная, которая заключается в создании барьера с селективной проницаемостью, позволяющего как пропускать, так и удерживать необходимые для жизнедеятельности клетки вещества. Во многих случаях биологического транспорта основой переноса веществ является их диффузия по градиент>г концентрации через клеточную мембрану. Однако перенос ряда веществ, например заряженных или гидрофильных, в силу их физико-химических свойств затруднен. Кроме того, для определенных процессов необходимо накапливать вещества, осуществляя перенос против их перепада концентраций. Для этих целей микроорганизмы обладают большим числом специальных транспортных систем, состоящих из одного или нескольких пронизывающих мембрану (трансмембранных) белков.

Как известно, движение веществ через клеточную мембрану не является однонаправленным. В процессе жизнедеятельности бактерии не только поглощают из окружающей среды питательные вещества, но и освобождаются от токсичных продуктов собственного метаболизма, транспортируют сигнальные молекулы, кроме того, многие видел продуцируют антибиотики и экзоферменты. Отдельно стоит отметить важность систем мембранного транспорта для выживания микроорганизмов в неблагоприятных условиях.

Стоить заметить, что о транспортных системах осуществляющих поступление веществ внутрь бактериальной клетки накоплена довольно обширная информация. Определены участвующие в большинстве этих процессов белки, энергетика транспорта, предложены механизмы переноса и возможные схемы регуляции. Что касается транспорта наружу, то функционирование таких систем изучено в меньшей степени. Однако открытие феномена множественной лекарственной устойчивости у патогенных микроорганизмов и связанная с этой проблемой необходимость её решения активизировало изучение процессов переноса вещества из клетки наружу. Присутствие таких транспортных систем уже обнаружено у многих организмов и объём такого рода информации всё возрастает.

Наряду с чисто фундаментальными задачами, проблема транспорта веществ из клетки имеет важное значение и в прикладном аспекте. Создание эффективных продуцентов аминокислот - комплексная задача, требующая решения множества проблем, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести увеличение экспрессии биосинтетичеких генов, достаточный уровень предшественников требуемой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза и жизнедеятельности клеток и т.д. Одной из таких задач является эффективный транспорт синтезированной аминокислоты из бактериальной клетки. Выброс из клетки продукта может сдвинуть в нужном направлении равновесие в цепи необходимых биохимических реакций, решить проблему негативного контроля синтеза целевого продукта, который в большинстве случаев осуществляет аминокислота, не допустить накопления в клетке ее токсических количеств.

Данная работа представляет собой поиск среди ¡^охарактеризованных генов Е.соИ тех, которые могут участвовать в экспорте аминокислот из бактериальной клетки, а также оценка их влияния на продуктивность некоторых штаммов Е.соИ - продуцентов различных аминокислот.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Рыбак, Константин Вячеславович

VI. выводы

1. На основании сравнительного анализа генома E.coli с геномами других организмов были отобраны 30 неохарактеризованных гипотетических генов, кодирующих белки гомологичные известными транспортерами. Анализ на возможную оперонную организацию показал, что 8 из них могут входить в гипотетические оиероны.

2. Исследовано влияние повышенной экспрессии отобранных генов на уровень устойчивости клеток E.coli к 50 соединениям различной химической природы. Установлено, что амплификация 14 исследуемых генов приводит к изменению устойчивости модельного штамма E.coli TGI к ряду аминокислот или их аналогов.

3. Изучено влияние амплификации 14 исследуемых генов на скорость поглощения 18 природных аминокислот клетками модельного штамма E.coli TGI. Обнаружено, что повышенная экспрессия 5 из них сказывается на скорости поглощения некоторых аминокислот клетками этого штамма.

4. Осуществлены ферментации штаммов-продуцентов 10 природных аминокислот при амплификации 14 исследуемых генов. Показано, что 9 генов изменяют уровень продукции аминокислот некоторыми штаммами.

5. Проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей перед исследуемыми генами (upstream-областей) на предмет обнаружения предполагаемых мест связывания как известных регуляториых белков E.coli, так и неизвестных регуляторов. Обнаружено, что в upstream-областях 16 изучаемых генов присутствуют иотенциатьные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli, а в регуляторной области двух генов - возможные места связывания неохарактеризованных на данный момент регуляториых белков.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Задачей данной работы являлось обнаружение среди ¡^охарактеризованных белков Е.соИ тех, которые могут транспортировать аминокислоты. Для этого на основании сравнительного анализа генома Е.соИ с геномами других микроорганизмов были отобраны открытые рамки считывания Е.соИ, кодирующие белки гомологичные известным транспортерам. Результаты такого подхода носят предсказательный характер и требуют экспериментальной проверки. Поэтому изучались три характеристики исследуемых генов, а точнее влияние их повышенной экспрессии па: а) устойчивость клеток Е.соИ к ингибирующим концентрациям веществ различной химической природы, б) скорость поглощения этой бактерией различных природных аминокислот и в) продуктивность некоторых штаммов Е.соИ - продуцентов аминокислот. Безусловно, амплификация случайного гена также может сказаться на одном из этих свойств, но одновременное изменение этих характеристик может являться серьёзным указанием на то, что изучаемый ген кодирует белок с транспортной функцией. В результате было установлено следующее.

Некоторые из отобранных генов могут входить в опероны. Поскольку подобная организация генов подразумевает общую для них функцию, то в таких случаях исследовали весь оиерон. В частности, для генов и у^аН продемонстрирована необходимость их совместной экспрессии для формирования наблюдаемых эффектов.

Повышенная экспрессия некоторых из отобранных генов оказалась токсична для Е.соИ: часть из них вовсе не удалось клонировать, а остальные образовывали сегрегационно нестабильные плазмиды. Смена в таких случаях мультикопийного вектора на малокопийный не изменила ситуацию.

Амплификация исследуемых генов по-разному сказывалась на устойчивости клеток Е.соИ к ингибирующим концентрациям различных химических веществ. Ряд генов увеличивал устойчивость или, наоборот, чувствительность модельного штамма к одному и даже к нескольким соединениям подчас различной химической природы. При этом амплификация некоторых из них приводила к увеличению чувствительности бактерий к одним веществам и одновременно повышала устойчивость к другим. Кроме того, было обнаружено, что повышенная экспрессия ряда генов не сказывается на устойчивости клеток Е.соИ ни к одному из использованных химических соединений.

В итоге удалось отобрать 14 генов, изменяющих устойчивость бактерий к аминокислотам или их аналогам, что могло свидетельствовать об участии кодируемых ими белков в транспорте аминокислот. Именно эти гены изучались в дальнейших экспериментах. Гибридными плазмидами трансформировали клетки некоторых штаммов продуцентов аминокислот и следили за изменением уровня накопления продуцируемой аминокислоты. В результате было обнаружено, что амплификация 9 из 14 исследуемых генов изменяет продуктивность некоторых штаммов: одни геиы увеличивали или уменьшали накопление продуцируемой аминокислоты лишь определенными штаммами, не изменяя продукцию всех остальных продуцентов. Другие влияли на продуктивность сразу нескольких штаммов. Причем амплификация некоторых из них приводила к увеличению накопления аминокислоты в одних продуцентах, и к уменьшению в других. Сравнение полученных данных с таблицей устойчивостей показало, что лишь для трех генов (ybiF, Ь2372 и оперона ygaZlI) существует некоторая корреляция. При этом было замечены некоторые особенности: необходимость определённого генетического «background» для проявления эффекта при амплификации оперона ygaZ-ygall и возможно неоптимальный уровень экспрессии тепа ybiF.

Прямые измерения влияния повышенной экспрессии отобранных генов на скорость поглощения аминокислот клетками E.coli показали, что 5 из исследованных 14 генов влияют на характер поглощения некоторых аминокислот. Причем три гена (yfbS, Ь2372 и Ы645) изменяли пулы какой-либо одной из тестируемых аминокислот, а при амплификации генов ybiF и yhgN наблюдалось изменение скорости поглощения сразу нескольких аминокислот. Совпадение полученных данных с таблицей устойчивостей имела место только для гена ybiF. Действительно, нлазмида pYBIF не только заметно меняла скорость поглощения нескольких аминокислот, но и обеспечивала множественную устойчивость клеток штамма TG1 к ингибиторам роста. Изменения в пулах аминокислот, вызванные остальными плазмидами не коррелировали с тем эффектом, который они оказывали на спектр устойчивости клеток E.coli. Интересно, что амплификация оперона ygaZH, оказавшая плейотропный эффект на устойчивость бактерий, не изменяла скорость поглощения какой-либо аминокислоты. Возможно, одной амплификации генов недостаточно: для проявления эффекта необходимы определенные условия, а возможно и специфический генотип, что отмечалось в опытах с продуцентами.

Таким образом, корреляция между всеми тремя подходами в изучении отобранных генов имела место только для гена ybiF. Поскольку имеются данные литературы о том, что он кодирует транспортер аминокислот [Livshits V., Zakataeva N. et. al., 2003], это говорит о том, что с помощью выбранного метода исследования можно выявлять и охарактеризовать неизвестные белки-переносчики E.coli. К сожалению, полученные данные не позволяют сделать однозначного вывода о том, что остальные исследуемые гены также кодируют аминокислотные транспортеры. Можно только предполагать, что некоторые из них могут транспортировать их в определенных условиях.

Ещё одним подходом в установлении функции гена является изучение его регуляции. Наличие одинаковых регуляторных сайтов перед генами позволяет судить об их участии в одном метаболическом процессе. Поэтому был проведен анализ upstream-областей исследуемых геиов на предмет выявления как сайтов связывания известных регуляторных белков E.coli (из базы данных DPInteract), так и поиск предполагаемых мест связывания неизвестных регуляторов. В результате проведенной работы перед 16 изучаемыми генами были обнаружены возможные сайты связывания 10 различных регуляторов E.coli. В основном это регуляторные белки стрессовых условий, но присутствуют также регуляторы аэробного/анаэробного развития и некоторые глобальные регуляторы E.coli. Заметим, что отобранные гены кодируют белки, гомологичные транспортерам систем множественной лекарственной устойчивости, которые необходимы для защиты клеток в неблагоприятных условиях. Поэтому насыщение upstream-областей изучаемых генов возможными сайтами для стрессовых регуляторов представляется вполне обоснованными. Более того, это служит ещё одним подтверждением предположения о том, что для функционирования исследуемых генов необходимы определенные условия, например, состояние стресса.

Стоит отметить, что в регуляториой области двух исследуемых генов были обнаружены возможные места связывания неохарактризованных на данный момент регуляторных белков. В одном случае (гипотетический оперон Ы642-Ы643-Ы644), исходя из данных литературы и того факта, что похожий сайт был обнаружен перед геном критического гемолизина, мы предположили, что белки, кодируемые этим оиероном, могут принимать участие в секреции гемолизина.

Таким образом, мы охарактеризовали группу генов E.coli и получили данные о физиологическом эффекте их амплификации на такие свойства E.coli как устойчивость к ингибирутощим концентрациям большого списка весьма разнообразных веществ, скорости поглощения некоторых аминокислот и способности штаммов продуцировать различные аминокислоты. Кроме того, с помощью специализированных компьютерных программ были проанализированы upstream-области этих генов на предмет выявления возможной регуляции. Полученные данные позволили выдвинуть ряд предположений о возможной функции исследованных геиов, а также выбрать некоторых из них как наиболее привлекательных кандидатов для дальнейших более целенаправленных исследований. Безусловно, эти результаты являются важным этапом в изучении этих ^охарактеризованных генов E.coli и могут помочь в дальнейших попытках функционально охарактеризовать эти гены.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рыбак, Константин Вячеславович, 2005 год

1. Домакова Е.В., Эррайс ЛЛ, и др. (1998) Роль дополнительных сайтов связывания CytR белка в регуляции экспрессии гена udp Escherihia coli. Генетика 34(8), 1063-72

2. Кихнер 10. (1981) Тонкослойная хроматография. Мир. Том 1, стр. 478-485i

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Молекулярное клонирование. Издательство "Мир"

4. Миллер Дж. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Издательство "Мир"

5. Миронов А.А., Винокурова II.П., Гельфанд М.С. (2000) Программное обеспечение анализа бактериальных геномов. Мол. Биология, 34(2), 253-262

6. Abramson J., Smirnova I., Kasho V., Verner G., Ivvata S., Kaback H. (2003). The lactose permease of Escherichia coli: overall structure, the sugar-binding site and the alternating access model for transport.: FEBS Lett 555(1): 96-101

7. Ahmed M., Lyass L., Markham P., Taylor S., Vazquez-Laslop N., Neyfakh A. (1995) Two highly similar multidrug transporters of Bacillus subtilis whose expression is differentially regulated. J.Bacter. 177:3904-3910

8. Aleshin V., Zakataeva N., Livshits V. (1999). A new family of amino-acid-efflux proteins. Trends Biochem Sci 24:133-135

9. Altschul S., Madden Т., Schaffer A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D. (1997) Gapped BLAST and PSI- BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25,3389-402

10. Ames G. (1986) Bacterial periplasmic transport system: structure, mechanism and evolution. Ann Rev Biochem 55: 397-425

11. Ankri S., I. Serebrijski O. Reyes, G. Leblon (1996). Mutations in the Corynebacterium glutamicum proline biosynthetic pathway: a natural bypass of the proA step. J. Bacteriol. 178:4412-4419

12. Belitsky В., Gustafsson M., Sonenshein A., von Wachenfeldt C. (1997). An Lrp-like gene of Bacillus subtilis involved in branched-chain amino acid transport. J. Bacteriol. 179:5548-5557

13. Bellmann A., Vrljie M., Patek M., Sahm H., Krämer R., Eggeling L. (2001). Expression control and specificity of the basic amino acid exporter LysE of Corynebacterium glutamicum. Microbiology 147:1765-1774

14. Bennik M., Pomposiello P., Thorne D., Demple B. (2000) Defining a rob regulon in Escherichia coli by using transposon mutagenesis. J. Bacteriol 182(13): 37943801

15. Bentley J., Hyatt L., Ainley K., Parish J., Herbert R., White G. (1993). Cloning and sequence analysis of an Escherichia coli gene conferring bicyclomycin resistance. Gene 127:117-120.

16. Bohn C., Bouloc P. (1998). The Escherichia coli cmlA gene encodes the multidrug efflux pump Cmr/MdfA and is responsible for isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside exclusion and spectinomycin sensitivity. J.Bacteriol. 190:6072-6075.

17. Brown M., Paulsen I., Skurray R. (1999). The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Mol. Microbiol. 31:394—395

18. Brown, M., Paulsen I., Skurray R. (1999). The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters. Mol. Microbiol. 31:394—395.

19. Chou J., Greenberg J., Demple B. (1993). Posttranscriptional repression of Escherichia coli OmpF protein in response to redox stress: positive control of the micF antisense RNA by the soxRS locus. J. Bacteriol. 175:1026-1031.

20. Cohen S., Hachler H., Levy S. (1993). Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:1484-1492

21. Cosloy S., Oishi M. (1973) The nature of transformation process in Escherichia coli K-12 Mol Gen Genet 124(1): 1-11

22. Datta P. (1967) Regulation of homoserine biosynthesis by L-cysteine, a terminal metabolite of a linked pathway. Prot Natl Acad Sei USA 58: 635-641.

23. Eguchi Y., Oshima T., Mori H., Aono R., Yamamoto K., Ishihama A., Utsumi R. (2003). Transcriptional regulation of drug efflux genes by EvgAS, a two-component system in Escherichia coli. Microbiology. 149(Pt 10): 2819-282627,28,29,30,31,32.