Исследование процессов лазерной микропорации и доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Козлова Анастасия Дмитриевна

• Козлова Анастасия Дмитриевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Козлова Анастасия Дмитриевна

РЕФЕРАТ

SYNOPSIS

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВ, СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА НОГТЯ, ОНИХОМИКОЗ И МЕТОДЫ ЕГО ЛЕЧЕНИЯ

1.1.Особенности доставки лекарств

1.1.1. Пути доставки лекарств

1.1.2. Пассивные методы увеличения эффективности трансдермальной доставки лекарств

1.1.3. Активные методы увеличения эффективности трансдермальной доставки лекарств

1.2. Строение и свойства ногтя

1.2.1. Анатомия и физиология ногтя

1.2.2. Физические, химические и оптические свойства ногтевой пластины

1.3. Онихомикоз и методы его лечения

1.3.1. Онихомихоз и традиционные методы его лечения

1.3.2 Фотодинамическая терапия онихомикоза

1.3.3 Увеличение эффективности местной доставки лекарств для лечения онихомикоза

1.4. Выводы к главе

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ПРОИСХОДЯЩИХ ПРИ ЛАЗЕРНОЙ ДОСТАВКЕ ФОТОДИНАМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПОД НОГТЕВУЮ ПЛАСТИНУ

2.1. Экспериментальное исследование и аналитическая модель лазерной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину

2.1.1. Экспериментальное исследование активной лазерной доставки водного раствора фотодинамического препарата (метиленовый синий) под ногтевую пластину излучением Er:YLF и InGaN лазеров

2.1.2. Аналитическая модель проникновения фотодинамического препарата

через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке

2.1.3 Экспериментальная оценка коэффициента проникновения фотодинамического препарата через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке

2.2 Исследование гидроакустических процессов при воздействии на водный раствор фотодинамического препарата (метиленовый синий) излучения Er:YLF лазера

2.3 Выводы по главе

ГЛАВА 3. ПАССИВНАЯ И АКТИВНАЯ ДОСТАВКА ЛЕКАРСТВ ИЗЛУЧЕНИЕМ ЛАЗЕРОВ ВИДИМОГО И ИК ДИАПАЗОНОВ

3.1. Пассивная доставка лекарств (метиленового синего) под ногтевую пластину

3.1.1 Оборудование и методы для исследования пассивной доставки водного и водно-спиртового раствора метиленового синего под ногтевую пластину

3.1.2 Результаты исследования влияния диаметра и плотности упаковки микропор в ногтевой пластине на порог и скорость пассивной доставки водного и спиртового раствора метиленового синего

3.2 Активная доставка фотодинамических препаратов излучением видимого и

ИК- диапазона

3.2.1 Микропорация ногтевой пластины и активная доставка лекарств лазерным излучением с длиной волны 1540 нм (Yb,Er:Glass лазера)

3.2.2 Микропорация ногтевой пластины и активная доставка лекарств лазерным излучением с длиной волны 2810 нм (Er:YLF лазера)

3.2.2.1 Микропорация ногтевой пластины лазерным излучением с длиной волны 2810 нм (Er:YLF лазера)

3.2.2.2 Активная доставка (ВБЬЛОВ) метиленового синего излучением Er:YLF лазера

3.2.2.3 Активная доставка (ВБЬЛОВ) метиленового синего (гель на основе агар-агара) излучением Er:YLF лазера

3.2.2.4 Активная доставка хлоринсодержащих препаратов излучением Er:YLF лазера

3.2.3 Микропорация ногтевой пластины и активная доставка лекарств лазерным излучением с длиной волны 450 нм (InGaN лазера)

3.2.3.1 Микропорация и активная доставка метиленового синего лазерным излучением с длиной волны 450 нм (InGaN лазера)

3.2.3.2 Активная доставка хлорин-содержащих препаратов лазерным излучением с длиной волны 450 нм

3.3. Сравнение эффективности абляции ногтевой пластины и активной доставки лазерным излучением с длиной волны 450 нм, 2810 нм или 1540 нм

3.4.Выводы по главе

ГЛАВА 4. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

4.1 Исследование влияния лазерного и фотодинамического воздействия и спектр

экстинкции метиленового синего

4.1.1 Влияние лазерного излучения с длиной волны 2810 нм на спектр экстинкции метиленового синего

4.1.2 Влияние фотодинамического воздействия на спектр экстинкции метиленового синего

4.2 Исследование влияния лазерного и фотодинамического воздействия и спектр экстинкции хлорин-содержащих препаратов

4.2.1 Влияние лазерного излучения с длиной волны 2810 нм на спектр экстинкции геля «Кеу1хап»

4.2.2 Влияние лазерного излучения с длиной волны 450 нм на спектр экстинкции геля «СЫоёегт»

4.3. Выводы к главе

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И АПРОБАЦИЯ ЛАЗЕРНОЙ МИКРОПОРАЦИИ И ДОСТАВКИ ФОТОДИНАМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОНИХОМИКОЗА

5.1 Исследование антимикотической активности современных фотодинамических

препаратов до и после фотодинамического воздействия

5.2 Апробация микропорации и доставки хлоринсодержащего фотодинамического препарата излучением Er:YLF лазера для лечения онихомикоза

5.3. Выводы к главе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 АКТ О ВНЕДРЕНИИ

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ТЕКСТЫ ПУБЛИКАЦИЙ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование процессов лазерной микропорации и доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину»

РЕФЕРАТ 1. Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Лазеры широко применяются в современной физике, технике и медицине, в том числе в дерматологии для лечения грибковых заболеваний. Онихомикоз — распространенное в дерматологии заболевание ногтей, вызванное грибковой инфекцией [1,2]. Для лечения онихомикоза широко применяют пероральные противогрибковые препараты. Однако в этом случае терапия занимает длительное время и существует риск гепатотоксичности. Хирургические методы лечения онихомикоза весьма болезненны [3]. Также при лечении онихомикоза широко используются местные фармацевтические препараты. Эффективность такого лечения ограничена, так как ногтевая пластина препядствует доставке местных лекарственных средств к ногтевому ложу, пораженному грибком [4,5].

Механические, химические и физические методы могут быть использованы для повышения эффективности доставки местных препаратов через ногтевую пластину к ногтевому ложу [1]. Механические методы повышения эффективности доставки местных препаратов травматичны, заживление происходит долго, что причиняет массу неудобств пациентам. Также стоит отметить высокую вероятность повторного инфицирования пациента, а также возможное инфицирование медицинских работников и дополнительные расходы по обработке и утилизации биологически опасных отходов [2]. Для химического травления требуется значительное время, кроме того, неграмотное химическое воздействие приводит к обширным химическим ожогам и некрозу тканей [1-3]. Ионофорез, сонофорез, электропорация, ультразвуковая доставка лекарств имеют низкую эффективность и малую глубину доставки лекарств [4].

Проницаемость ногтевой пластины можно увеличить с помощью лазерной микропорации. При лазерном воздействии в результате преобразования поглощаемой лазерной энергии в тепло биоткань нагревается и аблируется образуя

микропоры (микроканалы), по которым возможна доставка лекарства [6]. Известно, что эффективная лазерная микропорация ногтя возможна с помощью излучения лазеров ИК-диапазона. Ег- и С02- лазеры явяляются наиболее перспективными лазерами ИК-диапазона для микропорирования биологической ткани, в том числе ногтевой пластины [5-6]. Излучение Ег-лазеров эффективно поглощается водой, содержащейся в ногтевой пластине и а-кератином, который является основным компонентом ногтя [7]. Вместе с тем излучение лазеров УФ- и видимого диапазона (400-450 нм) также может быть использовано для эффективной лазерной микропорации ногтя особенно пораженного онихомикозом так как их излучение эффективно поглощается кератином и меланином, вырабатывающимся меланоцитами ногтевой матрицы вследствие меланонихии (гиперпигментации ногтей) при онихомикозе, а также возбудителями онихомикоза, находящимися в ногтевой пластине.

Различают пассивную или активную доставку лекарств к ногтевому ложу через микропоры в ногтевой пластине, созданные лазерным излучением [8-12]. При пассивной доставке препараты на водной основе медленно проникают через микропорированную ногтевую пластину [12]. При активной доставке лазерно-индуцированные гидродинамические процессы могут увеличивать скорость проникновения лекарств в результате генерации волн давления [13-16].

В современной научной литературе отсутствует адекватное описание процессов, происходящих при доставке лекарств в ноготь, что стимулирует разработку новых аналитических моделей и экспериментальных методов, в том числе таких при которых лекарство помещается на поверхность ногтевой пластины до ее микропорации.

При последовательной микропорации ногтевой пластины и лазерной доставке важно избежать трансформацию лекарства под действием лазерного излучения. В этой связи для доставки водных растворов лекарств следует использовать лазерное излучение, эффективно поглощающееся водой и не поглощающееся лекарством, то есть осуществлять нерезонансное воздействие за

пределами пика полосы поглощения лекарства. Вместе с тем в научной литературе информация по данному вопросу крайне малочислена, что делает его рассмотрение весьма актуальным.

Перспективным методом лечения онихомикоза является фотодинамическая терпия, в ходе которой фотосенсибилизирующий (фотодинамический) препарат проникает в ноготь с последующим облучением светом с длиной волны, поглощаемой фотосенсибилизирующим препаратом. Сочетание лазерной микропорации ногтевой пластины, активной лазерной доставки хлоринсодержащих фотосенсибилизирующих препаратов и фотодинамического воздействия на длинах волн, попадающих в полосы поглощения хлорина е6, может существенно увеличить эффективность и качество лечения грибковых заболеваний.

Таким образом, уточнение механизмов активной лазерной доставки и параметров лазеров, в том числе видимого и ИК-диапазонов длин волн для эффективных микропорации ногтя, активной лазерной доставки лекарств и фотодинамической терапии позволит усовершенствовать процесс лечения онихомикоза и будет весьма полезным при создании новой лазерной техники для дерматологии.

Целью данной работы является исследование процессов лазерной микропорации и доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину для повышения эффективности фотодинамического лечения онихомикоза. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- обзор литературы по теме исследования и выбор лазерного источника;

- теоретическое моделирование лазерной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину;

- разработка и создание экспериментального стенда для изучения микропорации ногтевой пластины и доставки фотодинамических препаратов излучением лазеров видимого и ИК-диапазонов;

- оценка эффективности и скорости микропорации ногтевой пластины излучением лазеров видимого и ИК-диапазонов;

- оценка эффективности и скорости доставки фотодинамических препаратов излучением лазеров видимого и ИК-диапазонов под ногтевую пластину;

- выбор лазерного источника для наиболее эффективной микропорации и доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину;

- выбор агрегатного состояния фотодинамического препарата и оптимальных для доставки лекарств под ногтевую пластину последовательности нанесения препарата на ногтевую пластину и лазерного воздействия, а также параметров лазерного источника для наиболее эффективной микропорации и доставки фотодинамических препаратов;

- исследование влияния параметров лазерного излучения на спектр экстинкции современных фотодинамических препаратов (фенотиазины, хлорины);

- исследование антимикотической активности лекарственных средств после их активной лазерной доставки под ногтевую пластину излучением лазерного источника для наиболее эффективной микропорации и доставки фотодинамических препаратов;

- апробация оптимального режима лазерной микропорации и доставки современных фотодинамических препаратов под ногтевую пластину излучением лазерного источника для наиболее эффективной микропорации и доставки фотодинамических препаратов.

Научная новизна работы заключается в том, что в ней впервые: 1. Обнаружено, что при пассивной доставке водно-спиртовой раствор

(Смассовая(А1с/н20)~50%) метиленового синего (Смассовая(мс/(А1с/н20)~0.25%) проникает под микропорированную лазерным излучением ногтевую пластину, при этом наибольшая средняя скорость проникновения такого водно-спиртового раствора под ногтевую пластину достигает 6.3±0.3 мкм/с, и наблюдается для массива микропор с диаметром микропоры 350±10 мкм и плотностью упаковки микропор 950 шт./см2, в то время как вода и водный раствор метиленового синего

(Cмассовая(мc/н20)~0.25 %) не проникают под ногтевую пластину с созданными лазерным излучением микропорами диаметром менее или равным 350±10 мкм вплоть до полного испарения воды.

2. Установлено, что минимальное количество субмиллисекундных импульсов Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм, необходимое для последовательной микропорации ногтевой пластины и активной доставки водного раствора метиленового синего под ногтевую пластину толщиной 350±20 мкм, при энергии лазерного импульса ~4 мДж, массовой концентрации метиленового синего в воде 0.001 %, толщине слоя препарата нанесенного на поверхность ногтевой пластины 100±10 мкм равно 14±1 импульсам, из которых 10±1 импульсов необходимы для микропорации ногтевой пластины, а 4±1 импульса - для активной лазерной доставки препарата под ногтевую пластину.

3. Установлено, что минимальное количество субмиллисекундных импульсов Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм, необходимое для последовательной микропорации ногтевой пластины и активной доставки хлоринсодержащего фотодинамического препарата «Revixan» (ООО«Ревиксан», Россия) под ногтевую пластину толщиной 320±20 мкм, при энергии лазерного импульса ~4 мДж, толщине слоя препарата нанесенного на поверхность ногтевой пластины 100±10 мкм равно 45±1 импульсам, из которых 22±1 импульса необходимы для микропорации ногтевой пластины, а 23±1 импульса - для активной лазерной доставки препарата под ногтевую пластину.

4. Показано, что воздействие субмиллисекундных импульсов излучения Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм и энергией импульса от 1 мДж до 4 мДж на хлоринсодержащие фотодинамические препараты приводит к увеличению коэффициента экстинкции препаратов в полосах поглощения с максимумами на длинах волн 664±5 нм и 710±3 нм, обусловленному ростом концентрации фотосенсибилизатора (хлорин e6) в препарате в результате испарения окружающего фотосенсибилизатор вещества и нагрева препарата под действием лазерного излучения.

5. Обнаружено, что воздействие субмиллисекундных импульсов излучения Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм и энергией импульса от 1 мДж до 4 мДж на фенотиазины (метиленовый синий) приводит к увеличению количества димеров по отношению к количеству мономеров, снижая фотодинамическую эффективность фенотиазинов, а воздействие на хлорины, наоборот, приводит к увеличению количества мономеров по отношению к количеству тетрамеров, увеличивая фотодинамическую эффективность хлоринов.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Эффект растекания препарата под ногтевой пластиной при лазерной доставке водного раствора метиленового синего приводит к увеличению скорости проникновения метиленового синего через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе под действием излучения субмиллисекундных импульсов Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм. Оценка коэффициента проникновения в этом случае достигает 5 10-5 см/с, что в 1.2-1.6 раза выше коэффициента проникновения без учета эффекта растекания.

2. Эффективность микропорации ногтевой пластины излучением субмиллисекундных импульсов Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм при одинаковой плотности энергии в 3-4 раза выше, чем эффективность микропорации непрерывным излучением InGaN лазера с длиной волны 450 нм и более чем на два порядка выше эффективности микропорации микросекундными импульсами YЪ,Er:Glass лазера с длиной волны 1540 нм.

3. Воздействие на каплю водного раствора метиленового синего (Смассовая(Н20)~0.25%), расположенную на поверхности ногтевой пластины над микропорой с диаметром 220±10 мкм, импульсами излучения Yb,Er:Glass лазера с длиной волны 1540 нм и длительностью импульса 4.5±0.5 мкс, которые распространяются по оптическому волокну, погруженному в объём капли данного раствора на 0.1±0.01 мм, приводит к доставке раствора под ногтевую пластину при энергии импульсов 35-55 мДж, и не приводит к доставке при энергии импульсов более 55 мДж.

4. Доставка водного раствора метиленового синего под ногтевую пластину при помощи излучения субмиллисекундных импульсов Er:YLF лазера с энергией 1-4 мДж, осуществляемая посредством лазерной микропорации ногтевой пластины и последующей активной лазерной доставки раствора (Смассовая(мс/Н20)~0.001%), нанесенного слоем толщиной 100±10 мкм, происходит с 1.2-2 раза большей скоростью в случае, когда микропорация осуществляется через предварительно нанесенный на поверхность ногтевой пластины слой раствора метиленового синего.

Практическая значимость:

1. Разработан экспериментальный стенд для изучения особенностей микропорации и доставки фотодинамических препаратов излучением ЕгУЬБ (2810 нм) лазера с диодной накачкой, который используется в учебном процессе Университета ИТМО при подготовке магистров по направлению 12.04.05 "Лазерная техника и лазерные технологии".

2. Определены оптимальные параметры излучения ЕгУЬБ (2810 нм) и 1пОаК (450 нм) лазеров для микропорации и доставки фотодинамических препаратов, которые учтены при разработке аппарата для лечения онихомикоза ногтя (акт внедрения ООО «Лазерный Центр» СПб).

3. Продемонстрировано, что фотодинамическое воздействие излучением с длиной волны 656±10 нм, плотностью мощности 180±10 Вт/см2 и длительностью 10 минут в комбинации с последовательной лазерной микропорацией ногтевой пластины и активной лазерной доставкой геля «Яеу1хап» (ООО«Ревиксан», Россия) излучением субмиллисекундных импульсов ЕгУЬБ (2810 нм) лазера приводит к существенному уменьшению площади пораженной онихомикозом области ногтя, а после 3-х сеансов фотодинамического воздействия наступает полное выздоровление.

Методология и методы исследования

В диссертации использованы классические методы оптики, лазерной физики, гидродинамики, биологии, медицины и современное измерительное оборудование.

Теоретическое исследование процессов лазерной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину проведено с помощью численно-аналитических методов моделирования. Для моделирования проникновения фотодинамических препаратов при лазерной доставке использована программа Маthcad 14.0 (PTC, Inc, Канада).

В экспериментах при получении и обработке биологического материала соблюдались требования ГОСТ Р 59787-2021. Для микропорации и активной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину использовались лазерные стенды включающие ErYLF-лазер (Я=2810 нм), Yb,Er:Glass лазер (Я=1540 нм) и InGaN лазер (Я=450 нм), а для фотодинамической терапии онихомикоза использовался светодиодный аппарат "LED Forester 660" («НЕЛА» Россия). Оптические изображения образцов биотканей и препаратов до и после лазерного возействия фиксировались с помощью микроскопа «Zeiss Axio Scope.A1» («Carl Zeiss», Германия) с камерой «Axiocam ERc 5s» («Carl Zeiss», Германия), микроскопа «МСП-1» (ЛОМО, Россия), цифрового USB-микроскопа "Prima Expert" (ОАО "ЛОМО", Россия) цифрового USB-микроскопа "DTX90" (Levenhuk, Inc., США), микроскопа МСП-1 (АО «ЛОМО», Россия) и высокоскоростной камеры "FASTCAM SA4 RV" (Photron, Япония). Обработка оптических изображений, выполнялась в программе «CorelDRAW Graphics Suite» («Corel», Канада). Для спектральных измерений использовался спектрометр SD2000 (Ocean Optics Inc., США). В качестве источника подсветки использовался волоконный осветитель "ОВС-1" (ООО «ЛОМО», Россия). Температура фотодинамических препаратов измерялась с помощью термопары «K-1» («REXANT», Россия). Для измерения параметров лазерного излучения использовалось современное оптометрическое оборудование, в том числе набор оптико-механических изделий производства фирмы Standa (Standa Ltd., Литва) и измеритель мощности-энергии лазерного излучения "Nova II" (Ophir Optronics Ltd., Израиль). Полученные данные записывались и анализировались с помощью программы Microsoft Excel («Microsoft Company», США). Статистическая

обработка данных проводилась в программном пакете «Statgraphics 5.0» (Statgraphics Technologies, Inc., США).

Достоверность полученных результатов

Достоверность результатов, полученных в диссертационной работе, обеспечивается использованием современного оборудования, общепринятых теоретических и экспериментальных физико-математических методов, методов подготовки биотканей, адекватностью и логичностью используемых теоретических моделей, воспроизводимостью полученных экспериментальных результатов, согласованностью полученных теоретических результатов с собственными экспериментальными данными и данными других авторов.

Внедрение результатов работы

Результаты исследований использованы при проведении работ по гранту РНФ по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» - «Исследование структурных изменений и антимикотической активности хлоринсодержащих фотосенсибилизирующих препаратов при их лазерной активной доставке и нерезонансном лазерном воздействии в дерматологии» в 2022-2024гг., НИР Университета ИТМО №620169 «Разработка методов и средств решения прикладных задач лазерной и волноводной фотоники, оптоэлектроники и современной оптики», №619297 «Разработка методов и средств решения прикладных задач фотоники», №617033 «Разработка методов и устройств оптической и квантовой информатики», №621317 «Фундаментальные и прикладные вопросы фотоники».

Получен Акт о внедрении от 17.08.2022 (ООО «УНП Лазерный Центр ИТМО» СПб).

Апробация результатов работы

Результаты диссертационного исследования были представлены и обсуждались на университетских, всероссийских и международных конференциях:

1. XLVI научная и учебно-методическая Конференция Университета ИТМО, 2017 г.

2. VI Всероссиский конгресс молодых ученых, 2017 г.

3. XXI International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics (Saratov Fall Meeting SFM'17-School, September 25 - 29), 2017 г.

4. XLVII научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО 2018 г.

5. VII Всероссиский конгресс молодых ученых, 2018 г.

6. XXIX Международная конференция "Лазеры в науке, технике, медицине" 2018 г.

7. VI Symposium on Optics & Biophotonics and XXII International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser physics & Biophotonics (Saratov Fall Meeting 2018), 2018 г.

8. VI Symposium on Optics & Biophotonics, 2018 г.

9. X Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики», 2018 г.

10. XLVIII научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2019 г.

11. VIII Всероссийский конгресс молодых ученых, 2019 г.

12. VII Symposium on Optics & Biophotonics (Saratov Fall Meeting 2019), 2019 г.

13. Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики», 2019 г.

14. The 2nd International School-Conference for Young Researchers «Smart Nanosystems for Life», 2019 г.

15. International symposium «Fundamentals of Laser Assisted Micro & Nanotechnologies» (FLAMN-19), 2019 г.

16. XLIX Научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2020 г.

17. VIII Symposium on Optics & Biophotonics (Saratov Fall Meeting 2020), 2020 г.

18. Thematic International Scientific Autumn School On Laser Micro- & Nanotechnologies: 2020 - Biomedical Technologies, 2020 г.

19. L научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2021 г.

20. X Всероссийский конгресс молодых ученых, 2021 г.

21. The 2-Nd Thematic International Scientific Autumn School On Laser Micro- & Nanotechnologies: 2021 - Biomedical Technologies, 2021 г.

22. IX Symposium on Optics & Biophotonics (Saratov Fall Meeting 2021), 2021 г.

23. LI научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2022 г.

24. XI Всероссийский конгресс молодых ученых, 2021 г.

25. International symposium «Fundamentals of Laser Assisted Micro & Nanotechnologies» (FLAMN-22), 2022 г.

26. 20th International Conference on Laser Optics ICLO, 2022 г.

Публикации

Результаты диссертационного исследования опубликованы в 13 печатных работах, в том числе 9 - в изданиях, которые включены в международные базы цитирования Web of Science и Scopus, и 1 - в изданиях, перечень которых утвержден ВАК.

Личный вклад автора

Постановка цели и задач диссертационной работы проведены совместно с научным руководителем. Все результаты, приведенные в диссертации, составляющие ее научную новизну и выносимые на защиту, получены лично автором. Статьи подготовлены автором совместно с научным руководителем и соавторами.

Автор выражает благодарность к.т.н. Смирнову С.Н. (Университет ИТМО), к.т.н. Федоровой Ю.В. (Университет ИТМО), к.т.н. Сергееву А.Н. (Университет ИТМО), к.ф-м.н. Гагарскому С.В. (Университет ИТМО) за постоянный интерес к работе, полезные обсуждения ее результатов и помощь в апробации.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, включающего 218 наименований. Работа изложена на 379 страницах, содержит 83 рисунка и 7 таблиц.

2. Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель и задачи, перечислены методы исследования, описаны научная новизна и практическая значимость работы, приведены основные научные положения, выносимые на защиту.

Первая глава посвящена обзору литературных источников по теме диссертации. Отмечено, что одной из распространенных проблем современной дерматологии является грибковая инфекция (онихомикоз). От онихомикоза страдают ~10-40 % населения.

Проницаемость ногтя для местных препаратов существенно ограничена, что снижает эффективность лечения. Для повышения эффективности доставки местных препаратов можно использовать механические, физические и химические методы. В отличие от других методов, лазерная доставка характеризуется безболезненностью, минимальной инвазивностью, высокой локальностью доставки и улучшенной фармакокинетикой препарата. В современной научной литературе вопросам лазерной доставки лекарств уделяется достаточно большое внимание. Исследуются пассивная и активная лазерные доставки. Однако вопрос активной лазерной доставки лекарств под ногтевую пластину, состоящей в последовательной микропорации пластины и активной доставки лекарства до сих пор, не исследовался. Эффективным методом лечения онихомикоза является фотодинамическая терапия, которая использует фотосенсибилизатор и источник света для образования активных форм кислорода, разрушающих грибок. Для лечения онихомикоза наиболее часто используют метиленовый синий и хлоринсодержащие фотодинамические препараты. К сожалению, фотодинамическая терапия онихомикоза в сочетании с микропорацией и активной лазерной доставкой ранее не изучалась. Это сочетание может существенно увеличить эффективность и качество лечения грибковых заболеваний в дерматологии.

Обращается внимание на то, что при микропорации ногтевой пластины и лазерной доставке важно избежать изменения строения и свойств лекарства под действием лазерного излучения. В этой связи для лазерной доставки водных растворов лекарств следует использовать излучение с длиной волны лежащей за пределами полосы поглощения лекарств, то есть осуществлять нерезонансное воздействие. При этом, для эффективной микропорации ногтевой пластины и

доставки водных растворов лекарств следует использовать излучение с длиной волны близкой к пикам поглощения ногтевой пластины и воды, то есть осуществлять резонансное воздействие. Излучение Er-лазеров эффективно поглощается водой, содержащейся в ногтевой пластине, и а-кератином, который является основным компонентом ногтя. Излучение лазеров УФ- и видимого диапазона (400-450 нм) также может быть использовано для эффективной лазерной микропорации ногтя, особенно пораженного онихомикозом, так как их излучение эффективно поглощается кератином и меланином, а также возбудителями онихомикоза, находящимися в ногтевой пластине. Поэтому следует провести исследование процессов при лазерной микропорации ногтевой пластины и доставке фотодинамических препаратов излучением лазеров видимого и ИК-диапазонов; выбрать оптимальный источник излучения, оптимальную последовательности и параметры лазерного воздействия для эффективной микропорации и доставки фотодинамических препаратов.

Отмечается актуальность исследования спектров экстинкции метиленового синего, «Revixan» (ООО «Ревиксан», Россия) и «Chloderm» (ИП «В.В.Ашмаров», Россия) в процессе лазерной доставки, а также то, что информация о спектре фотосенсибилизатора до и после лазерного воздействия, позволит сформулировать требования к оптимальным параметрам лазерного излучения.

Вторая глава содержит результаты экспериментального и теоретического исследования процессов происходящих при лазерной доставке фотодинамических препаратов под ногтевую пластину.

Впервые в эксперименте in vivo продемонстрирована возможность активной лазерной доставки водного раствора фотодинамического препарата (метиленовый синий (MC), массовая концентрация Смассовая(мС/н20)=0.001 %) под ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и InGaN лазера. В ногтевой пластине в результате in vivo воздействия на ноготь добровольца десятью субмиллисекундными импульсами Er:YLF лазера с энергией 4±0.1 мДж и частотой повторения импульсов 30 Гц через слой нанесенного на поверхность ногтя водного

раствора МС (Cмассовая(мc/н20)=0.001 %) толщиной h=100±10 мкм создавалось микроотверстие. Затем проводилась активная лазерная доставка МС в результате воздействия четырех импульсов Er:YLF лазера с теми же параметрами излучения, что и при микропорации и на тот же слой МС. Таким образом всего для микропорации и доставки использовалось 14 лазерных импульсов. Также в ногтевой пластине в результате in vivo воздействия на ноготь добровольца непрерывным излучением InGaN лазера с мощностью 1.90±0.05 Вт в течение 0.4 с создавалось микроотверстие. После на поверхность ногтя наносился слой водного раствора МС (Cмассовая(мc/н20)=0.001 %). толщиной ^=100±10 мкм. Затем осуществлялась активная лазерная доставка МС в результате воздействия на этот же слой МС излучением InGaN лазера с мощностью 1.90±0.05 Вт в течение 0.2 с.

В эксперименте было создано и проанализировано десять микроотверстий, находящихся друг от друга на расстоянии порядка 1 мм. В ходе исследования было установлено, что при активной лазерной доставке водного раствора MC излучением Er:YLF лазера или InGaN лазера происходит растекание препарата под поверхностью ногтя вдоль границы ногтевой пластины с ногтевым ложем (см. рисунок 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Козлова Анастасия Дмитриевна, 2022 год

к - —

р _ по _ кай

П

по паг!

кМВ _1 кМВ _2

^ Ddrug ^паг!—Ъе(Л J

(2)

где Вмв - коэффициент диффузии МС в слое воды толщиной 100 мкм, расположенном на поверхности ногтя [м2/с], Эпаи-Ьга - коэффициент диффузии препарата в ногтевом ложе [м/с], а К - коэффициент распределения, характеризующий изменение концентрации препарата на границе между ногтевым ложем и водой, Япопаи - диффузионное сопротивление проникновению препарата через ногтевое ложе [с/м], НМв_1 - толщина нанесенного лекарственного средства

(метиленового синего) в виде водного раствора над ногтевой пластиной [м], hмв_2 -глубина, на которую препарат проникает в ногтевое ложе [м].

Согласно модели представленной в [182], разработанной для кожи, в предположении, что доставляемый препарат (в нашем случае, водный раствор МС) мгновенно проникает в микроотверстие и роговой слой кожи полностью непроницаем для местных препаратов (рис.2.4), при замене модели кожи на модель ногтя, получаем, что коэффициент проникновения препарата через микропорированный ноготь и ногтевое ложе может быть определен как:

k , =—1— = 4 n • r

Р _ no _ ^ P

if ли \ 1 1 V1

1 + —n

1 1

D_ K. • D_

, (3)

VV ЖГ J DMB Ks • Dnail—bed J где DMB - коэффициент диффузии МС в слое воды толщиной 100мкм расположенном на поверхности ногтя и микроотверстии первоначально заполненном водой [м2/с], Dmu-bed - коэффициент диффузии препарата в ногтевом ложе [м2/с], а Ks - коэффициент распределения характеризующий изменение концентрации препарата на границе между ногтевым ложем и водой в микроотверстии и, Rno_tr - диффузионное сопротивление проникновению препарата через микропорированный ноготь и ногтевое ложе в предположении, что водный раствор MB мгновенно проникает в микроотверстие и ноготь полностью непроницаем для местных препаратов [с/м], hn - толщина ногтевой пластины [м], r - радиус микропоры [м], np - плотность заполнения площади ногтя микроотверстиями [шт./м2].

Необходимо также учесть коэффициент проникновения препарата через ногтевую пластину kp_nail который зависит от молекулярной массы препарата MW следующим образом [192]:

Ь _ 1 Q (—3.11-1.75log( MW))

kp _ nail = 10 (4)

Для МС имеет MW=319 Да [42] (1Да - атомная единица массы, определяется как 1/12 массы свободного покоящегося атома углерода, находящегося в основном состоянии [193]) и, соответственно, kpnail = 3.224-10-8 см/с.

Кроме того, в [170] предполагается, что изначально микропоры заполнены водой, а не воздухом, как это обычно бывает после микропорации. Следовательно, не учитываются капиллярные эффекты, возникающие на границе твердой (ногтевая пластина), жидкой (вода) и газообразной (воздух в микропорах ногтевой пластины) фаз. В то же время движение жидкости в микроотверстиях малого радиуса зависит от силы поверхностного натяжения. Обладая высоким коэффициентом поверхностного натяжения, препараты на водной основе не проникают в микропоры из-за сопротивления, вызванного силой поверхностного натяжения Дpff, которую можно оценить по формуле [194]:

ДРа = £, (5)

а

где а - коэффициент поверхностного натяжения [Н/м], d=2r - диаметр микропоры [м].

С учетом уравнения (5) скорость установившегося течения жидкости 4а

У

рГ [195] и толщине ногтевой пластины кп сопротивление ЯСЕ,

Ду =

обусловленное только силой поверхностного натяжения, можно определить как

^=кп К=к• (6)

Поскольку исследуемый водный раствор МС имеет низкую концентрацию (0,001%), при расчетах можно принять, что поверхностное натяжение раствора МС на границе с воздухом в микроотверстиях равно поверхностному натяжению воды на границе с воздухом в микроотверстиях: а = 72,86 10-3 Н/м (при температуре Т = 20°С) [196], а плотность водного раствора МС принять равной плотности воды р=997 кг/м3.

Коэффициент проникновения препарата через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе с учетом ЯпоГ (3) и ЯСЕ (6) определяется как:

4-1

к

p _ with _ Cfi

Я

= 4npr ■

with СЯ

4h (1 + ^)

1

жг D,

1

1

MB

KS ' Dnail-bed ^

рг

где г - радиус микроотверстия [м], Rwith_CE - диффузионное сопротивление проникновению препарата через микропорированный ноготь и ногтевое ложе с учетом капиллярных эффектов [с/м].

Коэффициент проникновения препарата через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе с учетом капиллярных эффектов и коэффициента проницаемости ногтевой пластины определяется как:

(

кР =1 = 4прг ■

Y1

(i+4hn) ^+

жг D,

MB

KS Dnail-bed

V Рг

+ (l - np жг2 к

p _ nail'

(8)

Коэффициент 1—пряг2позволяет учитывать диффузию только через часть ногтевой пластины, не имеющую микропор. При отсутствии микропор (пр=0) этот коэффициент равен 1, а коэффициент проникновения kp = kpnail. С максимально возможной плотностью заполнения поверхности ногтевой пластины микропорами без перекрытия, пр = пр max = 1/(2r)2 kp достигает максимального значения.

Для преодоления сопротивления, вызванного силами поверхностного натяжения, можно использовать лазерное излучение (активная доставка). Оно возбуждает в доставляемом фотодинамическом препарате акустические волны и давление, которое может быть намного больше, чем силы гидравлического сопротивления. Как отмечалось выше, при in vivo активной доставке МС излучением Er:YLF или InGaN лазера воздействие лазерного излучения на препарат приводит к растеканию препарата, т.е. он распределяется в ногтевом ложе не только в области ногтевое ложе располагалось непосредственно под микроотверстием, а также по границе ногтевой пластинки и ногтевого ложа вокруг микроотверстия (рис. 2.5 а,б). Для учета вклада этого явления в площадь, с которой происходит диффузия в ногтевое ложе, автор настоящей диссертации использовал

1

коэффициент распределения лекарственного средства ка, определяемый как отношение диаметра амв=2гмв (где гмв - радиус площади ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставляемый препарат) к диаметру микроотверстия в ногтевой пластине а=2г (рис. 2.5 б).

а б

Рисунок 2.5 - Структурная модель микропорированного ногтя для описания активной доставки лекарств (МС) через ногтевую пластину - до (а) и после (б)

доставки МС через микроотверстия.

Эффект растекания связан с действием лазерного излучения только на препарат в микропорах и поэтому не влияет на диффузию препарата через часть ногтевой пластины, не имеющую микропор. В связи с этим вклад коэффициента распределения лекарств ка следует учитывать только в первом члене уравнения (8), связанном с кр^цнсЕ.

Исходя из вышеизложенного, коэффициент проникновения лекарственного средства через лазерно-микропорированную ногтевую пластину в ногтевое ложе с учетом капиллярных эффектов, коэффициента проницаемости ногтевой пластины кр_пай и коэффициента распределения лекарственного средства ка определяют как:

к„ ^ = — = 4пгкл •

> _

Я

р d

(1+^) •л.+

жт Ц

мв

К Г)

• ЦпаИ-bed ^

+ (1 - пр жт2 )• к

р _ пай

, (9)

где Ях - диффузионное сопротивление проникновению препарата через микропорированный ноготь и ногтевое ложе с учетом капиллярных эффектов,

коэффициента проницаемости ногтевой пластины и коэффициента распределения препарата.

Конечное уравнение (9) в 2.1.2, позволяющее оценить коэффициент проникновения фотодинамического препарата через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке содержит два параметра, которые зависят от свойств лазерного излучения: коэффициент распределения лекарственного средства (^ и плотность заполнения площади ногтя микроотверстиями Первый параметр (^ впервые обнаружен автором

настоящей диссертации и зависит от длины волны X. Второй параметр (пг) зависит от диаметра пучка лазерного излучения (<3) и косвенно связан с коэффициентом распределения лекарственного средства kd. В п 2.1.2 настоящей диссертационной работы указано, что при доставке под ноготь водного раствора метиленового синего с помощью излучения Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм при d=220 мкм коэффициент распределения лекарственного средства равен kd = 1.42±0.22, а при доставке с помощью излучения 1пОаК лазера с длиной волны 450 нм при ^1.1 мм коэффициент распределения лекарственного средства равен kd = 1.82±0.19, что связано с различием в процессах микропорации ногтевой пластины и доставки при разных длинах волн.

Для последующего моделирования были приняты следующие коэффициенты: DMB = 0,38-10-5см2/с [197], коэффициент диффузии препарата (МС) в ногтевом ложе Dnail-bed = 1,98-10-6см2/с [198], коэффициент ^=5,58 [98].

Результаты моделирования коэффициента проникновения (кр) МС через ногтевую пластину в ногтевое ложе в зависимости от плотности заполнения микропорами внешней (дорсальной) поверхности ногтя микропорами (пД при различных приближениях (см. ф.1-4, 7, 9), для диаметра микропоры 220 мкм и kd= 1.42 и диаметра микропоры 450 мкм и kd = 1.82 показаны на рисунке 2.6.

Рисунок 2.6 - Зависимость коэффициента проникновения МС через ногтевую пластину от плотности заполнения дорсальной поверхности ногтя

микропорами

На рисунке 2.6 видно, что интактная ногтевая пластина имеет минимальный коэффициент проникновения, согласно уравнению (4) (зеленая линия) кр_паи= 3,224-10"8 см/с. При отсутствии ногтевой пластины коэффициент проникновения по уравнению (2) (черная линия) максимален и соответствует кр_па_паИ= 28,6110-5 см/с.

При диаметре микропор 220 мкм максимально возможная плотность заполнения области ногтя микропорами без их перекрытия соответствует 2066 микропор/см2. При диаметре микропор 450 мкм максимально возможная плотность заполнения области ногтя микропорами без их перекрытия соответствует 493 микропор/см2. Видно, что без учета капиллярных эффектов и коэффициента проницаемости ногтевой пластины коэффициент проникновения лекарственного средства через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе согласно уравнению (3) (синяя кривая) кр_по_г = 6,15 10-5 см/с при г = 220 мкм и плотность заполнения 2066 микропор/см2, а также (синяя пунктирная кривая) крпоГ = 4,83 10-5 см/с при г = 450 мкм и плотность заполнения 493 микропор/см2. Результаты расчета коэффициента проникновения препарата с учетом капиллярных эффектов по уравнению (7) очень близки к результатам расчета с

учетом капиллярных эффектов и коэффициента проницаемости ногтевой пластины по уравнению (8) (серая линия). Значение коэффициента проникновения препарата с учетом капиллярных эффектов и коэффициента проницаемости ногтевой пластины, полученное по уравнению (8) (серая кривая), составляет кр =3.506 10-5 см/с при г = 220 мкм и плотность заполнения 2066 микропор/см2, а также (серая пунктирная кривая) крпоГ = 1,51-10-5 см/с при г = 450 мкм и плотность заполнения 493 микропор/см2, то есть в 1.75 и 3.20 раз меньше значения коэффициента проникновения, полученного по уравнению (3) соответственно. Очевидно, этот результат связан с сопротивлением проникновению жидкости в микроотверстие ногтевой пластины, вызванным силами поверхностного натяжения, и сопротивлением диффузии проникновению препарата через ногтевую пластину. При этом вклад диффузионного сопротивления в проникновение препарата через ногтевую пластину незначителен по сравнению с вкладом сопротивления проникновению жидкости в микроотверстие в ногтевой пластине, вызванного силами поверхностного натяжения.

Модель, учитывающая помимо капиллярных эффектов и коэффициента проницаемости ногтевой пластины кр_паи коэффициент распределения лекарственного средства к^ увеличивает коэффициент проникновения лекарственного средства через микропористую ногтевую пластину и ногтевое ложе за счет увеличения область, на которой раствор МС диффундирует в ногтевое ложе. В этом случае при плотности заполнения 2066 микропор/см2, г = 220 мкм и ^ = 1.42 согласно уравнению (9) (красная кривая) коэффициент проникновения препарата через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе увеличивается пропорционально ^ относительно модели, учитывающей только капиллярные эффекты и коэффициент проницаемости ногтевых пластин, и достигает кр_2=4.978 10-5 см/с. При плотности заполнения 493 микропор/см2, г = 450 мкм и £¿=1.82 согласно уравнению (9) (красная пунктирная кривая) коэффициент проникновения препарата через микропорированную ногтевую пластину и ногтевое ложе увеличивается пропорционально ^ относительно модели,

учитывающей только капиллярные эффекты и коэффициент проницаемости ногтевых пластин, и достигает кр_г=2.74-10-5 см/с.

Это можно объяснить тем, что поскольку второй член (1—прпг1ук^р)_пац в уравнении (9) пренебрежимо мало, то изменение кр_х в основном определяется коэффициентом распределения лекарственного средства к^ То есть за счет эффекта растекания, при сохранении общей площади области под ногтем, в которую был доставлен препарат и без изменения кр_х можно пропорционально ^ снизить плотность заполнения дорсальной поверхности ногтя микропорами, что при лазерной микропорации позволит также пропорционально ^ снизить среднюю мощность лазерного излучения и тем самым повысить производительность и безопасность процедуры.

Следует отметить, что значения кр паи = 3.224-10-8 см/с и кр_х =4.978 10-5 см/с, полученные в данной работе согласно уравнениям (4) и (9), позволяют сделать вывод, что воздействие излучения Бг:УЬЕ лазера увеличивает проницаемость лекарственного средства (МС) ногтевой пластины пропорционально отношению этих коэффициентов, то есть в 1544 раза. Значения кр паи = 3.224-10-8 см/с и кр_х=2.7410-5 см/с, позволяют сделать вывод, что воздействие излучения 1пОаК лазера увеличивает проницаемость лекарственного средства (МС) ногтевой пластины ~ в 850 раз.

Известно [198], что для эффективной ФДТ онихомикоза при нанесении МС на поверхность ногтевой пластины, не содержащей микропор, требуется 8 сеансов, разделенных интервалом в 2 недели (длительность каждого сеанса 480 с, в том числе 180 с на аппликацию препарата и 300 с на фотодинамическое облучение). В результате наблюдалось достоверное снижение индекса тяжести онихомикоза (0Б1), а 70 % пациентов достигли полного излечения через 12 недель после окончания терапии. Таким образом, лазерная микропорация и доставка МС под ногтевую пластину излучением Бг:УЬЕ-лазера и 1пОаК лазера с учетом эффекта растекания может позволить добиться аналогичного лечебного эффекта,

значительно снижая продолжительность аппликации препарата (до 0.12 с и 0.6 с соответственно).

2.1.3 Экспериментальная оценка коэффициента проникновения фотодинамического препарата через микропорированную ногтевую

пластину при лазерной доставке

В рамках настоящей диссертационной работы впервые в эксперименте in vitro исследовали проницаемость фотодинамического препарата (МС) через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке (рис. 2.7). Для активной доставки МС использовали излучение ErYLF-лазера (X = 2810 нм) и InGaN лазера (X = 450 нм) с параметрами, используемыми в п.2.1.1. В исследовании использованы образцы биоткани, представляющие собой фрагменты экстрагированных здоровых ногтевых пластин человека от 3-х добровольцев. Всего было исследовано 10 образцов. Перед началом эксперимента образцы ногтевых пластин человека, средняя толщина которых составила 370±20 мкм, были механически очищены от грязи и промыты дистиллированной водой.

а] 1

с /3

5 /4

_/

У ал

J i

аЗг1-

Рисунок 2.7 - Схема экспериментального стенда для исследования проникновения водного раствора МС через микропорированную ногтевую пластину в кожу: 1 - Er:YLF или InGaN лазер; 2 - собирающая линза, 3 - раствор МС; 4 - ногтевая пластина; 5- кожа свиньи; 6 - бумажная подложка, 7-стеклянная пластина, 8 - цифровой USB-микроскоп «DTX90» (Levenhuk, Inc.,

США), 9- компьютер

В процессе активной лазерной доставки излучением ErYLF-лазера и InGaN лазера под ногтевую пластину сначала создавалось микроотверстие в ногтевой пластине, а затем осуществлялась активная лазерная доставка водного раствора МС (Смассовая(мс/Н20)=0.001 %) аналогично методу, описанному в п.2.1.1. Пассивная доставка МС (Смассовая(МС/Н20)=0.001 %) осуществлялась через микропору в ногтевой пластине, созданную излучением ErYLF-лазера или InGaN лазера с параметрами аналогичными в п.2.1.1., при нанесении препарата толщиной 100 мкм и добавлении препарата каждые 30 секунд на поверхность ногтевой пластины, которое было необходимо при испарении препарата на воздухе. Материалом для исследования проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину послужили образцы кожи свиньи, которые плотно прилегали к вентральной поверхности ногтевой пластины.

Процесс доставки МС под ногтевую пластину контролировался цифровым USB-микроскопом, соединенного с компьютером и размещенного с тыльной стороны кожи. Момент доставки фотодинамического препарата через слой кожи толщиной 100±10 мкм, 200±10 мкм и 300±10 мкм определялся по окраске бумажной подложки в цвет препарата (синий) и регистрировался цифровым USB-микроскопом. Сразу после этого осуществлялась диффузия МС в кожу. Все измерения проводились при комнатной температуре.

Статистическая обработка данных, полученных в экспериментах, заключалась в определении средних значений и стандартного отклонения измеренных величин и проводилась в программном пакете «Statgraphics 5.0» (Statgraphics Technologies, Inc., США).

Внешний вид дорсальной стороны ногтевой пластины, обращенной к микроскопу стороны кожи свиньи, на которой размещался образец ногтевой платины и бумажной подложки, на которой размещался образец кожи в момент доставки через кожу водного раствора МС (Смассовая(мс/Н20)=0.001 %), представлен на рис. 2.8. Оценка диаметра МС проводилась с помощью оптико-микроскопической регистарации внешенего вида дорсальной пверхности кожи.

Диаметр МС измеряли в двух взаимно ортогональных направлениях и усредняли по 10 фотографиям кожи, полученным после пассивной или активной лазерной доставки МС.

Рисунок 2.8. Внешний вид дорсальной стороны ногтевой пластины (a,T), кожи свиньи, на которой размещался образец ногтевой платины (б,д) и бумажной

подложки, на которой размещался образец кожи (в,е) в момент доставки через кожу водного раствора МС лазерным излучением с длиной волны 2810 нм (а-в) и

450 нм (г-е).

В ходе исследования было установлено, что при in vitro активной доставке водного раствора МС излучением Er:YLF лазера и InGaN лазера воздействие лазерного излучения на МС приводит к растеканию препарата по поверхности кожи, при этом при пассивной доставке водного раствора МС через микропоры в ногтевой пластине растекания препарата не происходит (рис 2.9 и 2.10).

Внешний вид дорсальной поверхности кожи свиньи после in vitro пассивной и активной доставки МС (CмассоваЯ(MC/ffio)=0.001 %) под микропорированную ногтевую пластину лазерным излучением с энергией 4±0.1 мДж показан на рисунке 2.9.

a б

Рисунок 2.9 - Внешний вид дорсальной поверхности кожи после пассивной (а) и активной лазерной доставки (DSLADD) излучением Er:YLF лазера (б) водного раствора фотодинамического препарата (метиленовый синий (MC) in

vitro.

В результате обработки всего массива фотографий после пассивной доставки МС через микропору, созданную с помощью лазерного излучения Er:YLF лазера было установлено, что при диаметре микропоры составляет 220±10 мкм, средний диаметр участка ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставленное лекарство (MC) составляет 245±30 мкм и не существенно отличается от диаметра микропоры. Таким образом, при пассивной доставке водного раствора МС через микропоры в ногтевой пластине растекания препарата не происходит

При активной доставке МС излучением Er:YLF лазера, средний диаметр участка ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставленное лекарство (MC) составляет 385±42 мкм. При активной лазерной доставке in vitro излучением Er:YLF лазера и InGaN лазера коэффициент распределения лекарственного средства составил kd = 1.75±0.29 и kd = 2.09±0.16, что в 1.23 и 1.15 раза соответственно превышает коэффициент распределения лекарственного средства, полученный при in vivo активной лазерной доставке.Это может быть связано с отсутствием у использованной в in vitro эксперименте коже свиньи набора гребней, который присутствует на вентральной части ногтевой пластины человека в in vivo эксперимете и препятствует распространению препарата вдоль границы между ногтевой пластиной и ногтевым ложем.

Внешний вид дорсальной поверхности кожи свиньи после пассивной и активной доставки in vitro метиленового синего через одиночное микроотверстие в результате воздействия непрерывного лазерного излучения InGaN лазера с мощностью 1.9±0.05 Вт в течение 0.6 с представлен на рисунке 2.10.

a б

Рисунок 2.10 - Внешний вид дорсальной дорсальной поверхности кожи после пассивной (а) и активной лазерной доставки излучением InGaN лазера (б) водного раствора фотодинамического препарата (метиленовый синий (MC) in

vitro.

В результате обработки всего массива фотографий после пассивной доставки МС через микропору, созданную с помощью лазерного излучения InGaN лазера было установлено, что при диаметре микропоры составляет 450±10 мкм, средний диаметр участка ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставленное лекарство (MC) составляет 460±35 мкм и не существенно отличается от диаметра микропоры. Таким образом, при пассивной доставке водного раствора МС через микропору в ногтевой пластине растекания препарата не происходит

При активной доставке МС излучением InGaN лазера, средний диаметр участка ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставленное лекарство (MC) составляет 940±50 мкм. В результате, при активной доставке in vitro излучением InGaN лазера коэффициент распределения лекарственного средства kd = 2.09±0.16. Коэффициент распределения лекарственного средства, полученный при in vitro лазерной доставке в 1.15 раза превышает коэффициент распределения лекарственного средства, полученный при in vivo лазерной

доставке, что может быть связано с отсутствием на коже свиньи набора гребней, которые присутствуют на вентральной части ногтевой пластины и способствуют адгезии между ногтевой пластиной и ногтевым ложем.

При воздействии на ноготь излучением InGaN лазера средний диаметр микроотверстия составляет 450±20 мкм, средний диаметр участка ногтевого ложа под ногтевой пластинкой, содержащей доставленное лекарство (MC) составляет 821±40 мкм. В результате, при последовательной микропорации и активной доставке МС in vivo излучением InGaN лазера коэффициент распределения лекарственного средства kd = 1.82±0.19.

Для проверки адекватности модели было проведено экспериментальное исследование проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке МС in vitro излучением Er:YLF лазера. Экспериментально коэффициент проникновения МС определялся как отношение толщины слоя кожи ко времени, необходимому для доставки фотосенсибилизирующего препарата через микропорированную ногтевую пластину и слой кожи свиньи толщиной 100±10 мкм, 200±10 мкм и 300±10 мкм.

Было установлено, что время, необходимое для пассивной доставки через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и слой кожи толщиной 100±10 мкм, 200±10 мкм и 300±10 мкм, составляло 348±32 с, 666±51 с и 912±70 с соответственно. Время, необходимое для активной доставки излучением Er:YLF лазера через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и слой кожи толщиной 100±10 мкм, 200±10 мкм и 300±10 мкм, составляло 186±11 с, 378±35 с и 546±43 с соответственно. Таким образом, коэффициент проникновения МС через ногтевую пластину и кожу при пассивной доставке через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера составлял 2.873-10-5±0.264-10-5 см/с, 3.003-10-5±0.230-10-5 см/с и 3.289-10-5±0.252-10-5 см/с, а при активной доставке составил 5.376-10-5±0.318-10-5 см/с, 5.291-10-5±0.490-10-5 см/с и 5.495-10-5±0.433-10-5 см/с при толщине слоя кожи 100±10 мкм, 200±10 мкм и 300±10 мкм соответственно.

Зависимость коэффициента проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину и кожу от толщины слоя кожи представлена на рисунке 2.11.

0.000070 ! 0.000065 г 0.000060 j 0.000055 I 0.000050 | 0 000045 L 0.000040 I 0.000035 [ 0.000030 Н 0.000025 : 0.000020 0.000015 -

0005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035

■ экспериментальный • теоретический

1 ■ 1

1

Толщина кожи, см

а б

Рисунок 2.11 - Зависимость коэффициента проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и кожу от

толщины слоя кожи.

Небольшое увеличение экспериментального коэффициента проникновения МС через ногтевую пластину и кожу при увеличении толщины слоя кожи может быть связано с увеличением пористости кожи по толщине. Величина измеренного в эксперименте in vitro коэффициента проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину и кожу свиньи при пассивной доставке МС составила 3.1-10"5±0.9-10"5 см/с, при активной доставке МС - 5.Ф10-5±1.Ы0-5 см/с.

На рисунке 2.11 представлены теоретические и экспериментальные значения коэффициентов проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и кожу при пассивной и активной доставке МС излучением Er:YLF лазера.

Рисунок 2.12 - Теоретические и экспериментальные (in vitro) значения коэффициентов проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера и кожу при пассивной и активной доставке

МС излучением Er:YLF лазера

Видно что экспериментальное и теоретическое значения коэффициента проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину излучением БгУЬБ лазера и кожу при пассивной и активной доставке МС близки друг к другу, то есть разработанная аналитическая модель лазерной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину адекватна эксперименту.

2.2 Исследование гидроакустических процессов при воздействии на водный раствор фотодинамического препарата (метиленовый синий) излучения Er:YLF лазера

Лазерное излучение ближнего и среднего ИК-диапазона возбуждает различные гидродинамические процессы в жидкости, такие как возникновение термоупругих волн, перепады давления и кавитация. Воздействие гидродинамических процессов позволяют разрушать мягкие биоткани или осуществлять активную доставку лекарств в биоткани. При активной доставке скорость проникновения микрочастиц и жидкостей в биоткань значительно возрастает в результате воздействия индуцированных излучением Бг лазеров гидродинамических ударных волн. Воздействие импульса излучения Бг лазера на

жидкое лекарственное средство вызывает повышение температуры, что может привести к его испарению и образованию парогазовых пузырей. В этом случае, как импульсы давления отдачи на фронте испарения, так и потоки жидкости, возникающие в результате коллапса пузырьков, могут способствовать доставке лекарственного средства через созданные лазерным излучением микропоры в ногтевой пластине.

Автором диссертации исследованы гидроакустические процессы, стимулируемые в водном растворе метиленового синего (Смассовая(мс/Н20)=0.001 %) излучением Бг:УЬБ лазера с параметрами, используемыми при активной лазерной доставке лекарства в ногтевую пластину человека. В настоящей работе было проведено воздействие на водный раствор МС (Смассовая(мс/Н20)=0.001 %) импульсами излучения с длиной волны 2810 нм при частоте повторения импульсов f = 30 Гц (длительность импульса т=270 мкс) с энергиями излучения Е = 1, 2, 3 и 4 мДж, а также при Е = 4 мДж с различными f = 10, 30 и 100 Гц.

Были исследованы гидродинамические процессы для групп импульсов: с первого по четвёртый (далее - 1-4) и с 7-го по 10-й (далее - 7-10). Для активной доставки лекарства после микропорации под слоем препарата необходим короткий промежуток времени для накопления лекарства над микропорой.

Схема экспериментального стенда для исследования гидродинамических процессов, возникающих в МС при воздействии лазерного излучения, показана на рисунке 2.13.

Синхронизация высокоскоростной камеры и лазера осуществлялась следующим образом. Кремниевый фотодиод регистрировал рассеянное излучение лазера накачки, выходящее из отверстий корпуса лазера и возникающее за счёт потерь при вводе излучения диодного модуля в оптическое волокно. Сигнал с фотодиода поступал на вход генератора импульсов "Г5-63", который запускался этим сигналом и генерировал прямоугольный импульс амплитудой 10 В. Импульс с генератора подавался на синхронизационный вход высокоскоростной камеры.

Камера осуществляла видеосъёмку в течение 10 секунд после поступления синхроимпульса.

Рисунок 2.13 - Схема экспериментального стенда для исследования гидроакустических процессов при воздействии на водный раствор фотодинамического препарата (метиленовый синий) излучения Er:YLF лазера: 1 -блок системы накачки и охлаждения Er:YLF-лазера (À=2810 нм); 2 - Er:YLF-лазер, включающий систему фокусировки излучения; 3 - Si-фотоприёмник; 4 -кювета с МС; 5 - осветитель "DCR III" (Schott, Германия); 6 - волоконный жгут

осветителя; 7 - осциллограф "TDS2022B" (Tektronix, США); 8 - генератор импульсов "Г5-63" (СССР); 9 - высокоскоростная камера "FASTCAM SA4 RV"

(Photron, Япония); 10 - ноутбук.

Задержка между импульсом накачки и синхроимпульсом не превышала 5 мкс. В качестве источника излучения использовался Er:YLF лазер с длиной волны генерации À = 2810 нм. Излучение Er:YLF лазера фокусировалось на поверхности водного раствора фотодинамического препарата (МС) линзой с фокусным расстоянием F = 50 мм. Каустика лазерного пучка Er:YLF лазера приведена на рисунке 2.14.

F+ 10 см

F + 20 см

F

2<о = 900 мкм

•Ь

О

S

чэ о о

2

2

Рисунок 2.14 - Каустика лазерного пучка Er:YLF лазера (по уровню e-1)

Из рисунка 2.14 видно, что диаметр пятна по уровню e-1 в фокальной плоскости линзы составляет d = 220 мкм. Водный раствор МС наполовину заполнял кварцевую кювету с внутренними размерами 40х18х34 мм. Исследуемая область взаимодействия лазерного излучения с раствором МС подсвечивалась непрерывным излучением широкого спектра (белый свет) волоконного осветителя "DCR III" (Schott, Германия). Мощность галогенной лампы осветителя составляла 150 Вт, а мощность излучения подсветки - 1 Вт. Высокоскоростная съёмка стимулируемых лазерным излучением процессов осуществлялась при помощи камеры FASTCAM SA4 RV" (Photron, Япония). При проведении экспериментов кадровая частота составляла 50000 кадров/с, следовательно интервал между кадрами составлял 20 мкс. В эксперименте был зарегистрирован внешний вид формируемых под действием Er:YLF лазерного излучения в водном растворе МС парогазовых микроканалов (см. рис.2.15) и исследованы зависимости длины и ширины парогазового канала от энергии лазерного импульса (Е), значения которой варьировались от 1 до 4 мДж (рис.2.16).

Из графиков, представленных на рисунке 2.16, видно, что при фиксированной частоте повторения лазерных импульсов f = 30 Гц с увеличением энергии импульса в рассматриваемом диапазоне её значений (от 1 до 4 мДж) длина и ширина парогазового канала линейно возрастают. Максимальные значения длины, ширины и объема канала для импульсов 1-4 при E = 1 мДж равны

480 ± 20 мкм, 99 ± 6 мкм и 0.017± 0.001 мм3, а для импульсов 7-10 - 490 ± 40 мкм, 140 ± 10 мкм и 0.026± 0.002 мм3 соответственно.

Рисунок 2.15 - Типичные высокоскоростные фотографии парогазовых полостей формируемых под действием Er:YLF лазерного излучения в водном растворе МС при £=1-4 мДж (на 500 ± 100 мкс относительно начала лазерного

импульса)

а 1,2

го

<я

¡0,8

■ 1-4 импульсы • 7-10 импульсы

......Г"

■ 1

Е, мДж

2 0,7

а о,4 а

Я о,-Ч

I импульсы 10 импульсы

■ 1-4 импульсы • 7-10 импульсы " "

{

:

<

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Е, мДж

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 Е, мДж

а б в

Рисунок 2.16 - Графики зависимостей длины (а) и ширины (б) и объема (в)

парогазового канала (мм) формируемого под действием Er:YLF лазерного

излучения в водном растворе МС от энергии импульса Er:YLF лазерного

излучения Е

При увеличении энергии импульса до 2 мДж максимальные значения длины, ширины и объема канала достигали 880 ± 60 мкм, 320 ± 80 мкм и 0.14± 0.01 мм3 для импульсов 1-4, а для последних импульсов (7-10) - 940 ± 50 мкм, 270 ± 60 мкм и 0.16± 0.01 мм3 соответственно. Энергии импульса Е = 3 мДж соответствуют следующие значения максимальной длины, ширины и объема канала: 1,35 ± 0,05 мм, 0.49 ± 0.06 мм и 0.2± 0.02 мм3 (1-4 импульсы) и 1,36 ± 0,05 мм, 0,38 ± 0,03 мм и 0.47± 0.04 мм3 (7-10 импульсы). При Е = 4 мДж максимальные значения длины, ширины и объема парогазового канала составляли 1,58 ± 0.07 мм, 0.7 ± 0.1 мм и 0.34± 0.03 мм3для импульсов 1-4 и 1.58 ± 0,08 мм, 0.43 ± 0.08 мм и 0.65± 0.15 мм3 для импульсов 7-10 соответственно.

Дальнейшее исследование зависимости размеров парогазового канала проводилось для импульсов с энергией Е = 4 мДж, поскольку такие импульсы формируют каналы наибольшего объёма, а также обеспечивают наиболее эффективную доставку лекарственного средства. Для импульсов 1 -4 максимальный объём 0.33±0.05 мм3 достигается на 500 ± 100 мкс относительно начала лазерного импульса, а для импульсов 7-10 максимальный объем 0.66 ± 0.14 мм3 достигается на 515 ± 150 мкс. Ввиду того, что частота повторения импульсов и их энергия высока, образовавшиеся парогазовые полости не успевают достигнуть поверхности МС или схлопнуться до прихода следующего импульса. Иллюстрация развития парогазовой полости при Е = 4 мДж и f = 30 Гц содержится в таблице 1. Ширина кадров, представленных в таблице, составляет 1 мм.

Таблица 1 - Стадии парогазовых полостей (каналов), наблюдаемые в МС при Е = 4мДж и f = 30Гц

Стадия Период развития, мкс Комментарии Фотография явления

Образование канала 0-500 Для импульсов 1 -4 максимальная длина - 1.57 мм, максимальная ширина - 0.43 мм. Максимальный объём достигается к концу лазерного импульса, то есть на 415 мкс от его начала. Для импульсов 7-10 макс длина -1.58 мм, макс ширина - 0.73 мм. 1

Разрыв канала 500-760 Нижняя часть канала после разрыва начинает преобразовываться в парогазовую полость

Образование сферической парогазовой полости 760-1780 После разрыва канала его нижняя часть начала принимать сферическую форму, которая находится на расстоянии 0.19 мм от поверхности через 360 мкс от момента разделения канала. Диаметр полости - 0.5±0.1 мм. |

Начало движение сферической парогазовой полости 1780-9460 Сферическая парогазовая полость некоторое время стоит на месте, незначительно сжимаясь и расширяясь, а затем начинает движение вверх •

Рассмотрим формирование пузыря при частоте повторения импульсов f = 30 Гц и энергии импульса Е = 1 мДж. Для импульсов 1-4 максимальный объём (2.19 ± 0.05) • 10-3 мм3 достигается на 310 ± 105 мкс относительно начала лазерного импульса, а для импульсов 7-10 максимальный объем (3.7 ± 0.1) • 10-3 мм3

достигается на 335 ± 126 мкс. Максимальная длина пузыря составляет 485 мкм, а максимальная ширина - 99 мкм для 1-4 импульсов. Для импульсов 7-10 максимальная длина пузыря составляет 493 мкм, а максимальная ширина - 138 мкм. При данных параметрах лазерного излучения полость образуется сразу на жесткой границе МС. При увеличении энергии лазерного импульса до 2 мДж для импульсов 1-4 максимальный объём достигает 0.07 ± 0.01 мм3 на 385 ± 52 мкс относительно начала лазерного импульса, а для импульсов 7-10 максимальный объем 0.11±0,05 мм3 достигается на 345 ± 82 мкс. При других параметрах лазерного излучения (Е = 3 мДж и f = 30 Гц) для импульсов 1-4 максимальный объём 0.203±0.046 мм3 достигается на 335±57 мкс относительно начала лазерного импульса, а для импульсов 7-10 максимальный объем 0.48±0.05 мм3 достигается на 440±63.

Таким образом в экперименте показано, что при воздействии ЕгТЬГ лазерного излучения на водный растовр МС аналогичном воздействию при микропорации ногтевой пластины под слоем препарата на первой стадии DSLADD в слое препарата формируются парогазовые каналы с аспектным соотношением (глубина-ширина) от 5 (при Е=1мДж) до 2.2 (при Е=4мДж). Длина микроканалов может при 1мДж достигать 480 ± 20 мкм, а при 4мДж - 1580 ± 70 мкм, что сопоставимо или превосходит среднюю толщину ногтя (и соответственно, возможную глубину микропоры в ногтевой пластине) и эргономически оправданную (не требующую специальных приспособлений) толщину слоя препарата наносимого на ногтевую пластину. Установлено, что объем парогазового канала с ростом Е увеличивается, при этом прирост объема (мм3/Дж) для 7-10 импульсов выше, чем для 1-4 импульсов из 10-и импульсов и это различие связано в основном с расличием в приросте ширины канала. Общая тенденция к увеличению объёма канала с увеличением энергии импульсов может быть связана с увеличением мощности тепловыделения в облучаемом объёме жидкости, а больший прирост объёма для 7-10 импульсов - с эффектом накопления тепла к моменту воздействия этих импульсов.

2.3 Выводы по главе 2

Впервые исследована и продемонстрирована in vivo возможность активной лазерной доставки (DSLADD) фотодинамического препарата (МС) под ногтевую пластину излучением ErYLF-лазера. Впервые исследована и продемонстрирована in vivo возможность последовательной микропорации ногтевой пластины и активной лазерной доставки фотодинамического препарата (МС) под ногтевую пластину излучением InGaN лазера. Экспериментально оценен коэффициент распределения лекарственного средства kd, который определяется как отношение диаметра площади ногтевого ложа под ногтевой пластиной, содержащей доставленное лекарственное средство, к диаметру микропоры в ногтевой пластине. Разработана оригинальная относительно простая аналитическая модель для оценки проникновения лекарственного средства через ногтевую пластину с лазерным микропорированием. В модели учитывается вклад эффекта растекания препарата под ногтевой пластиной, вызванного воздействием лазерного излучения на лекарство при активной лаазерной доставке и сопротивление, вызванное силами поверхностного натяжения. В результате эксперимента и расчетов в рамках разработанной модели установлено, что при DSLADD водного раствора МС излучением Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм, энергией лазерного импульса 4 ± 0.1 мДж коэффициент распределения препарата под ногтевой пластиной kd = 1.42 ± 0.22 и при плотности заполнения дорсальной поверхности ногтя микропорами np = 2066 микроопор/см2 коэффициент проникновения МС через микропористую ногтевую пластину и ногтевое ложе достигает kp_z= ~5 10-5см/с, что в 1.42 раза выше чем kp_z без учета вклада эффекта растекания. Установлено, что при активной лаазерной доставке водного раствора МС излучением InGaN лазера с длиной волны 450 нм, с мощностью 1.90±0.05 Вт. коэффициент распределения препарата под ногтевой пластиной kd = 1.82 ± 0.19 и при плотности заполнения дорсальной поверхности ногтя микропорами np = 493 микроопор/см2 коэффициент проникновения МС через микропористую ногтевую пластину и

ногтевое ложе достигает kp_z= 2.74 • 10-5см/с, что в 1.82 раза выше чем kp_z без учета вклада эффекта растекания. Для проверки адекватности модели было проведено экспериментальное исследование проникновения МС через микропорированную ногтевую пластину при лазерной доставке МС in vitro излучением Er:YLF лазера и InGaN лазера. Установлено, что результаты теоретических исследований совпадают с результатами эксперимента в пределах погрешностей экспериментальных исследований. Таким образом, аналитическая модель лазерной доставки фотодинамических препаратов под ногтевую пластину адекватна.

Проведено экспериментальное исследование парогазовых полостей возникающих в водном растворе метиленового синего под воздействием излучения Er:YLFлазера с параметрами, используемыми при активной лазерной доставке (DSLADD) в ногтевую пластину человека, Впервые показано, что в слое препарата формируются парогазовые каналы с аспектным соотношением (глубина-ширина) от 5 (при Е=1мДж) до 2.2 (при E=4мДж). Длина микроканалов может при 1мДж достигать 480 ± 20 мкм, а при 4мДж - 1580 ± 70 мкм, что сопоставимо или превосходит среднюю толщину ногтя (и соответственно, возможную глубину микропоры в ногтевой пластине) и эргономически оправданную (не требующую специальных приспособлений) толщину слоя препарата наносимого на ногтевую пластину. Установлено, что объем парогазового канала с ростом E увеличивается, при этом прирост объема (мм3/Дж) для 7-10 импульсов выше, чем для 1-4 импульсов из 10-и импульсов и это различие связано в основном с расличием в приросте ширины канала.

ГЛАВА 3. ПАССИВНАЯ И АКТИВНАЯ ДОСТАВКА ЛЕКАРСТВ ИЗЛУЧЕНИЕМ ЛАЗЕРОВ ВИДИМОГО и ИК ДИАПАЗОНОВ

3.1. Пассивная доставка лекарств (метиленового синего) под ногтевую

пластину

3.1.1 Оборудование и методы для исследования пассивной доставки водного и водно-спиртового раствора метиленового синего под ногтевую пластину

Для настоящего in vitro исследования использовались образцы здоровых ногтевых пластин человека. Средняя толщина ногтевой пластинки, измеренная по свободному краю ногтя, составила 365±20 мкм. Перед экспериментами образцы были механически очищени от грязи и промыты дистиллированной водой.

Массив микропор в ногтевой пластине человека формировался с помощью излучения Er:YLF лазера с длиной волны 2810 нм и энергией импульса 4±0.01 мДж при частоте повторения импульсов 30 Гц. Длительность импульса генерации Er:YLF лазера составляла 270 мкс. Микропора в ногтевой пластине образовывалась при воздействии на неё 15 импульсами лазерного излучения. Диаметр пучка лазерного излучения на поверхности ногтевой пластины составлял 220±15 мкм. Увеличение диаметра микропор достигалось путем наложения четырех пор друг на друга (рисунок 3.1), при этом диаметр микропоры изменялся с изменением параметра А (смещение центра лазерного пучка).

При XY-сканировании лазерного пучка по поверхности ногтевой пластины человека изменялась плотность упаковки микропор в массиве от 100 до 950 отв/см2. Для контроля формы, глубины и плотности расположения микропор проводилась оптико-микроскопическая регистрация внешнего вида лазерно-индуцированных микроповреждений ногтевой пластины и внешнего вида их продольных шлифов микроскопом "Zeiss Axio Scope.A1" ("Carl Zeiss", Германия).

А

Рисунок 3.1. Схема смещения центра лазерного пучка на величину А для увеличения диаметра микропор (ЕгУЬБ лазер)

Для фиксации момента проникновения водного раствора МС (Смассовая(мс/Н20)=0.25 %) под ногтевую пластину с или без массива микропор помещалась бумажная подложка с плотностью бумаги 80 г/м и толщиной 100 мкм. Ногтевая пластина и бумажная подложка прижимались к стеклянной подложке в четырех точках таким образом, чтобы обеспечить между ними плотный контакт. В качестве лекарственного средства использовались дистиллированная вода, 0.25% водный (в соотношении 250 мг порошка метиленового синего на 100 г дистиллированной воды) и 0.25% водно-спиртовой (смесь этанола (96%) и 0.5 % водного раствора метиленового синего в объемном соотношении 50:50) растворы метиленового синего. Данные концентрации безопасны для организма человека и эффективны против грибков и бактерий. Метиленовый синий широко используется при фотодинамической терапии грибковых заболеваний, в том числе онихомикоза. Выбор этого лекарственного средства обусловлен также тем, что оно имеет насыщенный синий цвет и хорошо визуализируется на бумаге.

В данном исследовании использовалась пассивная доставка МС, что означает проникновение препарата под ногтевую пластину преимущественно за счет сил тяжести и скольжения, без внешнего воздействия на препарат. Капля воды, водного или водно-спиртового раствора метиленового синего с объемом 0.003 мл наносилась на поверхность ногтевой пластины (с или без массива микропор)

каждые 30 секунд до равномерного распределения препарата на бумаге. Проникновение препарата фиксировалось цифровым USB-микроскопом "DTX90" (Levenhuk Inc., США), который располагался под стеклянной подложкой. Экспериментальный стенд для исследования скорости проникновения растворов метиленового синего через ногтевую пластину показан на рисунке 3.2.

По полученным с цифрового USB-микроскопа динамическим изображениям (видео) определялись: время проникновения растворов метиленового синего через одно микроотверстие (Tsp) в массиве, время проникновения раствора МС через два микроотверстие и его соединения (Tdp), а также время (Tmp) необходимое для равномерного распределения этого препарата на бумаге, расположенной под ногтевой пластиной с массивом микропор для каждой комбинации параметров (диаметр и плотность упаковки микропор).

При обработке результатов динамические изображения (видео) с цифрового USB-микроскопа преобразовывались в статические (отдельные кадры). Далее из полученных статических изображений выделялся фрагмент с изображением массива микропор (рисунок 3.3). Площадь этого фрагмента (Sarray) составляла в

Y

X

Рисунок 3.2 . Схема экспериментального стенда для исследования пассивной доставки местных препаратов (растворы МС)

зависимости от плотности расположения микропор от 110% до 120% площади занимаемой массивом микропор (S).

Рисунок 3.3 - Схематическое изображение массива микропор в ногтевой пластине (область Бап-ау показана красным цветом, область £ - синей линией, Ь -

После этого с помощью разработанной автором диссертации компьютерной программы в Маthcad 14.0 (PTC, Inc, Канада) изображение бинаризировалось, т.е. яркость пикселей изображения принимала только два значения - 0 или 1. Перевод изображения из цветного в черно-белое (бинарное) осуществлялся по следующему принципу: яркость пиксела принимала значение 1 (черный цвет), если интенсивность цвета на изображении была не менее 90% от максимальной интенсивности цвета, в остальных случаях цвет пикселя - белый (яркость пикселя принимала значение 0). Максимальная интенсивность цвета изображения определялась по контрольному изображению бумаги с нанесенным на нее раствором метиленового синего. Коэффициент заполнения (filling factor - FF) препаратом области с площадью Sarray определялся как отношение количества пикселей Ndrug с яркостью 1 (площадь изображения с проникшим под ногтевую пластину препаратом - Sdrug) к общему на площади Sarray количеству пикселей Narray в изображении (формула 10):

©-©4F©

расстояние между центрами микропор)

FF = Ndms N

array

Распределение раствора метиленового синего считалось равномерным, если значение ЕЕ, становилось больше 0.9. Скорость проникновения препарата через одиночное микроотверстие у!р определялась как отношение глубины кратера в ногтевой пластине ко времени Тр.

3.1.2 Результаты исследования влияния диаметра и плотности упаковки микропор в ногтевой пластине на порог и скорость пассивной доставки водного и спиртового раствора метиленового синего

При помощи излучения Er:YLF лазера были получены микроотверстия трех различных диаметров (наибольший линейный размер): 220 мкм, 300 мкм и 350 мкм (рисунок 3.4).

Диаметр микроотверстия

220±10 мкм 300±10 мкм 350±10мкм

Щ т ■уг* ' Ач.-* * *

щ % К ш г й щ

Рисунок 3.4 - Изображения ногтевых пластин человека после воздействия излучения Ег:УЬЕ-лазера: вид сверху микропор и вид их продольных разрезов

Микроотверстия с диаметром 300 мкм (А = 40 мкм) и 350 мкм (А = 80 мкм) имели отличную от круга форму т.к. формировались путем наложения нескольких пучков со смещением А, при этом также наблюдалось уменьшение конусности кратера. Для всех микропор поверхность их стенки была шероховатая, микротрещины отсутствовали, присутствовали признаки плавления.

Массивы микропор на поверхности ногтевой пластины различались по плотности упаковки (ЕЕ), которая принимала значения 100 отв/см2, 400 отв/см2 и 950 отв/см2 (рисунок 3.5).

Диаметр микроотверстия

22(>±Ю мкм ЗШ>± 10 МКМ 350± 10 мкм

V. 1' I,' '¡11 , я ШГ тТ Т «1

N ' 4 ' '1 ш > ^ > 1 «

й О 14л К * <■ >4 ш' - 1 к' 1

К. ТА я* * , Ж Г -'<' * , •

§ N — С о ? т Ж * Щ.ф * »1 *•'•'. -Г*};'! 4 ■> •Ж , ;

N « '»»* * * - V' л

10(1 отв/см 1 ■ Кг Jiji.li .и

Рисунок 3.5 - Изображения массивов микропор в ногтевой пластине человека после воздействия излучения Ег: УЬБ лазера

В экспериментах было установлено, что вода, 0.25% водный и водно -спиртовой растворы метиленового синего не проникают через ногтевую пластину без микропорации. Это связано с низкой диффузионной способностью ногтевой пластины. Диффузия лекарственного средства в ногтевую пластину зависит от физико-химических свойств ногтя, активного агента, а также растворителя. Поскольку ногтевая пластина состоит из множества нитей кератина, удерживаемых вместе через дисульфидными связями, пространство между нитями действует как молекулярное сито. Молекулярная масса метиленового синего составляет более 300 Da, поэтому проникновение его раствора в ногтевую пластину без микропорации затруднительно.

Проникновение воды и водного раствора метиленового синего (Смассовая(мс/Н20)~0.25%) сквозь массив микропор в ногтевой пластине также оказалось неэффективным: препарат не проникал к вентральному слою ногтя. Скорее всего, это связано с высоким коэффициентом поверхностного натяжения, который у воды в 5 раз выше, чем у этанола. Доставка водно-спиртовых растворов лекарственных средств через ногтевую пластину оказалась более эффективной, в том числе возможно и потому что этанол способен усиливать проникание лекарственных веществ через ногтевую пластину, растворяя липидные

компоненты рогового слоя или действуя как сорастворитель, т.е. увеличивать термодинамическую активность лекарственных субстанций в роговом слое.

На рисунке 3.6 представлены изображения, полученные с цифрового ШВ-микроскопа (рисунок 3.6(а-в)) и бинарные изображения выделенной области с массивом микропор в ногтевой пластине (рисунок 3.6(г-е)) для различных комбинаций параметров массива микропор (диаметра микропоры и плотности упаковки).

а

б

в

г д е

Рисунок 3.6 - Изображения белой бумажной подложки после проникновения водно-спиртового раствора МС через массив микропор в ногтевой пластине (а-в) и бинарные изображения выделенной пунктирной линией области

(г-е). Т0 - время нанесения MС; Тзр - время проникновения МС через одно микроотверстие; Тар - время проникновения МС через два микроотверстия и его соединения; Ттр - время, необходимое для равномерного распределения МС.

Зависимости ЕЕ проникновения водно-спиртового раствора МС от времени наблюдения при различных значениях плотности упаковки микропор в массиве (ЕЕ) представлены на рисунке 3.7. Они имеют нелинейных характер.

а б в

Рисунок 3.7 - Зависимость FF проникновения водно-спиртового раствора МС от времени для различных значений плотности упаковки микропор (PD) a -PD = 100 отв/см2, б - PD = 400 отв/см2, в - PD = 950 отв/см2

При плотности расположения микропор 100 отв/см2 и 400 отв/см2 в течение достаточно большого промежутка времени можно наблюдать проникновение препарата через отдельные отверстия, тогда как при 950 отв/см2 препарат быстро и равномерно распространялся по площади Sarray из-за очень малого расстояния между отверстиями.

На рисунке 3.8 представлена зависимость Tsp и скорости проникновения vsp водно-спиртового раствора МС от диаметра микропоры в массиве при различной плотности упаковки микропор. Видно, что время Tsp и скорость проникновения метиленового синего через одно микроотверстие (vsp) в основном определяются диаметром микропор.

Значение скорости проникновения метиленового синего через одно отверстие (vsp) находится в диапазоне 3-6 мкм/с для диаметров микропор 220350 мкм. Наибольшая скорость проникновения метиленового синего через одно отверстие (vsp) наблюдалась при диаметре пор 350 мкм и плотности упаковки 950 отв/см2 и достигала величины около 6.3 мкм/с. Скорость vsp для микропор с диаметром 300 мкм и 350 мкм и плотностью упаковки 100 отв/см2 и 400 отв/см2 всего на 5 % отличалась от максимальной. C уменьшением диаметра отверстия от 350 мкм до 220 мкм скорость vsp уменьшалась почти в 2 раза.

Диаметр микро отверстия, мкм

а б

Рисунок 3.8 - Зависимость времени Тзр (а) и скорости проникновения узр (б) водно-спиртового раствора МС через одиночную микропору в ногтевой пластине

от диаметра микроотверстия

На рисунке 3.9 представлена зависимость времени проникновения Тар водно-спиртового раствора МС от диаметра одиночной микропоры в массиве при различной плотности упаковки микропор. Видно, что время Тар уменьшается с увеличением диаметра микропор и плотности их упаковки.

270 п 240 210 180

и 150 ¥120

90

60

30

о

_ 100 огв/см;

400 отв/см

к' 1950 огв/см:

№

220

300

350

Диаметр микроотверстия, мкм Рисунок 3.9 - Зависимость времени проникновения Тар водно-спиртового раствора МС через два микроотверстия от диаметра микроотверстия

Увеличение плотности упаковки микропор с 100 отв/см2 до 950 отв/см2 приводит к уменьшению Тар в 2 раза при одинаковом диаметре микропор, а увеличение диаметра микропор с 220 мкм до 350 мкм - также к уменьшению этого времени в 2 раза при одинаковой плотности упаковки. Одновременное увеличение

плотности упаковки микропор с 100 отв/см2 до 950 отв/см2 и диаметра микропор с 220 мкм до 350 мкм приводит к уменьшению Тар в 4 раза.

Зависимость времени, необходимого для равномерного распределения препарата под ногтевой пластиной (Ттр), от диаметра микропоры и плотности упаковки микропор представлена на рисунке 3.10. С увеличением этих параметров наблюдается уменьшение времени Ттр. Например, при диаметре микроотверстия 220 мкм и плотности упаковки 100 отв/см2 время равномерного распределения препарата под ногтевой пластиной составляло 360 с, а при увеличении этих параметров до 350 мкм и 950 отв/см2 время уменьшалось до 180 с.

350 300 250 * 200 / 150 100 50

220 мкм 300 мкм

| 13 50 мкм

ЙЁЬ

100 400 950

а

Плогносгь упаковки мнкроотверстий. отв/сы" б

Рисунок 3.10 - Зависимость времени , необходимого для равномерного распределения водно-спиртового раствора МС под ногтевой пластиной, от диаметра микропоры (а) и плотности упаковки микропор (б)

Наименьшее время, необходимое для равномерного распределения препарата под ногтевой пластиной (Ттр), наблюдалось при диаметре микропоры равном 350 мкм и плотности расположения микропор 950 отв/см2, и составляло около 180 ± 10 с. Наименьшие значения Ттр для плотностей упаковки микропор 100 отв/см2 и 400 отв/см2 были одинаковы - 240 ± 10 с и наблюдались при диаметре микроотверстия равном 350 мкм. Увеличение плотности упаковки микропор почти в 10 раз (с 100 отв/см2 до 950 отв/см2) приводит к уменьшению времени Ттр на 30 ± 5 % при одинаковом диаметре микропор. Для достижения того же эффекта (уменьшение времени равномерного распределения препарата под ногтевой

пластиной до 30 ± 5 %) достаточно, при одинаковой плотности упаковки микропор, увеличить диаметр микропор всего в 1.6 раз. Можно сделать вывод, что большее влияние на Тт оказывает изменение диаметра микропор. Изменение диаметра микропор с 220 мкм до 350 мкм и плотности их упаковки с 100 отв/см2 до 950 отв/см2 приводит к уменьшению времени Ттр в 2 раза.

Таким образом, установлено, что вода и водный раствор метиленового синего (Смассовая(МС/т0)~0.25%) не проникают через ногтевую пластину человека с или без массива микропор. Водно-спиртовой раствор (Смассовая(А1с/т0)~50%) МС не проникает проникает только через микропорированную ногтевую пластину, при этом минимальное значение времени равномерного распределения такого раствора МС под ногтевой пластиной Тт составляет 180±10 с (< =350 мкм, РБ=950 отв/см2), а наибольшая скорость пассивной доставки фотодинамического препарата через одиночную микропору узр составляет 6.3 м/с. Следует отметить, что современные фотодинамические препараты имеют водную, а не спиртовую основу, поэтому для эффективной доставки водных растворов была исследована активная лазерная доставка.

3.2 Активная доставка фотодинамических препаратов излучением

видимого и ИК- диапазона

Эффективность доставки фотодинамических препаратов на водной основе может быть увеличена за счёт возбуждения гидродинамических эффектов, индуцируемых лазерным излучением (активная доставка) [163-166]. К сожалению, до настоящего времени в литературе не описан способ, сочетающий микропорацию и активную доставку лекарств лазерным излучением, при лечении заболеваний ногтя. Это подвигло автора настоящей работы к исследованию микропорации ногтевой пластины человека и активной доставки препаратов под ногтевую пластину лазерным излучением с диной волны 1540 нм, 2810нм и 450 нм для фотодинамической терапии онихомикоза.

3.2.1 Микропорация ногтевой пластины и активная доставка лекарств лазерным излучением с длиной волны 1540 нм (Yb,Er:Glass лазера) 3.2.1.1 Микропорация ногтевой пластины лазерным излучением с длиной волны 1540 нм (Yb,Er:Glass лазера)

В исследовании Yb,Er:Glass лазер работал в режиме модуляции полезных потерь. Резонатор лазера был образован тремя высокоотражающими зеркалами (рисунок 3.11). В качестве активного модулятора в лазере использовался затвор на основе эффекта нарушения полного внутреннего отражения (НПВО-затвор). На рисунке 3.11 представлена схема лазерного резонатора, которая позволяла получать импульсы от сотен наносекунд до единиц микросекунд.

Рисунок 3.11 - Схема резонатора Yb,Er:Glass лазера: 1 - высокоотражающие зеркала (R>99,5%); 2 - квантрон; 3 - активный элемент (иттербий-эрбиевое фосфатное стекло); 4 - импульсная ксеноновая

лампа; 5 - НПВО-затвор

Схема экспериментального стенда для in vitro исследования микропорации ногтевой пластины человека излучением Yb,Er:Glass лазера представлена на рисунке 3.2 (а). Френелевский ослабитель использовался для изменения энергии лазерного импульса с сохранением его длительности, временной и пространственной структуры. Лазерное излучение фокусировалось (F=11 мм) на ногтевой пластине, размещенной на стеклянной подложке. В экспериментах общая длительность импульсов генерации Yb,Er:Glass лазера (по основанию) составляла

4.5±0.1 мкс (рисунок 3.12 (б)), а энергия в импульсе изменялась вплоть до 100 мДж на выходе френелевского ослабителя.

Рисунок 3.12 - Схема экспериментального стенда (a) и осциллограмма импульсов излучения (б) Yb,Er:Glass лазера

1 - Yb,Er:Glass лазер; 2 - френелевский ослабитель; 3 - собирающая линза с фокусным расстоянием 11 мм; 4 -образец ногтевой пластины на стеклянной подложке; 5 - фотоприёмник (Ge); 6 - осциллограф

Микропорация ногтевых пластин осуществлялась при воздействии микросекундных 1, 10 и 100 импульсов лазерного излучения с длиной волны 1540 нм и энергией до 100±1 мДж (при f=1 Гц). Регистрация энергии лазерных импульсов осуществлялась с помощью измерительной головки "PE50BF-C" ("OPHIR Photonics", Израиль) и измерителя энергии "OPHIR Nova II" ("OPHIR Photonics", Израиль).

Для изучения эффектов, возникающих в результате воздействия лазерного излучения при различных комбинациях параметров на ногтевую пластину, проводилась оптико-микроскопическая регистрация внешнего вида лазерно-индуцированных микроповреждений ногтевой пластины микроскопом "Zeiss Axio Scope.A1" ("Carl Zeiss", Германия). После изготавливались продольные срезы микроповреждений ногтевой пластины и проводилась оптико-микроскопическая регистрация их внешнего вида. Продольные срезы ногтевой пластины были получены путем постепенного абразивного шлифования (F320 грит по FEPA

стандарту) с использованием малооборотного электромотора (2000 об/мин). Процесс шлифования визуально контролировался с использованием оптического микроскопа «МСП-1» (ЛОМО, Россия). Анализ полученных изображений позволил определить форму и глубину микрократеров и микропораций. Скорость абляции определялась согласно (11):

к

V —, (11)

где И - глубина микрократера, N - количество лазерных импульсов. Эффективность абляции определялась согласно (12):

к

Е=- (12)

где Е - энергия лазерного импульса.

После воздействия на ногтевую пластину лазерного излучения с длиной волны 1540 нм наблюдался эффект отбеливания (при N=1, Е=60±1 мДж), эффект карбонизации (N=1, Е=100±1 мДж). После воздействия 50 импульсов излучения Yb,Er:Glass лазера с энергией 100±1 мДж наблюдалась микропорация ногтевой пластины. Таким образом, плотность энергии (порог) достаточная для появления эффекта отбеливания (рисунок 3.13) под действием излучения Yb,Er:Glass лазера -54±3 Дж/см2 (N=1), для появления эффекта карбонизации - 91±5 Дж/см2 (N=1) Для микропорации ногтевой пластины при 91±5 Дж/см2 требуется N=50. Поверхность формируемого микрократера шероховатая, имеет множество значительных микротрещин. Их источником могут являться акустические волны, возникающие при оптическом пробое ногтевой пластины.

Рисунок 3.13 - Фотографии ногтевых пластин, выдержанных в воздухе, после воздействия излучения Yb,Er:Glass лазера: вид микроповреждений ногтевой пластины сверху (а-г) и вид продольных шлифов (д-з)

Результаты измерения скорости и эффективности абляции ногтевой пластины человека излучением Yb,Er:Glass лазера на воздухе и через слой водного раствора МС (Смассовая(мс/Н20)=0.001 %) толщиной 100 мкм и 1000 мкм представлены на рисунке 3.14.

■ на кпду&е

• черпслой МС(Ь-100 мкм I А чср» стой МС (Ь" 1000 дом)

+

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Плотность энергии, Дж ем"

а 15 £ 4

к

= 3"

2-

И Л

и о

Л

■ ни »отдухе • чере* С ТОЙ МС <Ь-100 А черет с-кй МС (Ь-1000 ш)

20 23 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Плотность энергии, Дж/см"

|5 -

13 §

г

■ на вицухе • черс! с№Й МС СИ-100 мкм) А черю слой МС (11=1000 мкм)

1 *

и 1 0 200 300 100 500 600

Количество импульсов

а

б

в

Рисунок 3.14. Зависимость эффективности (а) и скорости абляции (б) ногтевой пластины от плотности энергии (Же) при #=100, а также скорости абляции при (в) ногтевой пластины от количества лазерных импульсов (Ы) при

Ж=68Дж/см2 с длиной волны 1540 нм

Все графики скорости и эффективности абляции лазерным излучением показывает четкую зависимость их значений от плотности энергии. Максимальная скорость абляции излучением с длиной волны 1540 нм наблюдалась на воздухе и составляла 5.5 мкм/имп (при WE=68±2 Дж/см2), а эффективность абляции -0.07±0.001 мкм/мДж (при WE=68±2 Дж/см2).

3.2.1.2 Активная доставка метиленового синего под ногтевую пластину излучением с длиной волны 1540 нм (Yb,Er:Glass лазера)

В экспериментах in vitro использованы образцы здоровых ногтевых пластин человека. Обработка и хранение образцов были аналогичны п.3.1.1.

Для формирования микропор в ногтевой пластине использовалось излучение Er:YLF лазера с длиной волны Х=2810 нм. Сквозное одиночное микроотверстие диаметром ~220 мкм формировалось в ногтевой пластине при воздействии 15-ти импульсов лазерного излучения.

Схема экспериментального стенда для исследования процесса активной доставки водного раствора МС (CмассоBaЯ(Mc/H2o)=0.001 %) излучением Yb,Er:Glass лазера через миропорированную ногтевую пластину излучением Er:YLF лазера показана на рисунке 3.15 (а).

В исследовании импульсы излучения Yb,Er:Glass лазера длительностью 1.5±0.5 мкс по основанию, используемые для активной доставки МС под ногтевую пластину, имели выраженный высокоинтенсивный "лидирующий" пичок (рисунок 3.15(б)), наличие которого приводит при воздействии в жидкости к генерации в ней акустического сигнала с большей чем при отсутствии этого пичка амплитудой [199]. Энергия лазерного импульса находилась в диапазоне от 10 до 100 мДж.