Исследование конкуренции между сплайсингом и полиаденилированием у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Тихонов, Максим Васильевич

• Тихонов, Максим Васильевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Тихонов, Максим Васильевич

Оглавление

Оглавление

Список используемых сокращений

1. Введение

1.1 Актуальность работы

1.2 Цели и задачи исследования

1.3 Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

1.4 Положения, выносимые на защиту

1.5 Степень достоверности и апробация результатов

2. Обзор литературы

2.1 Роль С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса

2.2 Распределение фосфорилирования С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II как маркер стадии транскрипции

2.3 Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события

2.4 Ко-транскрипционный сплайсинг

2.5 Процессинг 3'-конца мРНК

2.6 Упаковка транскрипта и связь с другими ко-транскрипционными процессами

2.7 Расщепление/полиаденилирование детерминирует терминацию транскрипции

2.8 Формирование петель у генов

3. Материалы и методы

3.1 Объекты

3.2 Молекулярное клонирование

3.2.1 Работа с бактериями

3.2.2 Общие методы работы с ДНК

3.2.3 Создание векторов с репортерной системой

3.3 Работа с культурой клеток S2 дрозофилы

3.3.1 Ведение культуры клеток S2 Drosophila melanogaster

3.3.2 Трансфекция клеток культуры S2 Drosophila melanogaster

3.4 Измерение активности люцифераз

3.5 Работа с РНК

3.5.1 Выделение РНК

3.5.2 Разделение ядерной и цитоплазматической фракций РНК

3.5.3 Нозерн-блот анализ

3.5.4 Количественная ОТ-ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

3.6 Генетические методы

3.6.1 Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий

3.6.2 Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях

3.6.3 Генетические скрещивания

3.7 Методы компьютерной обработки данных

3.7.1 Предсказание СПА

3.7.2 Поиск генов, полностью расположенных в интроне другого гена

3.7.3 Анализ паттерна экспрессии изоформ на основе данных секвенирования РНК

4. Результаты

4.1 СПА широко представлены в интронах Drosophila melanogaster

4.2 Экспериментальное подтверждение функционирования СПА в экзонах, но не

в интронах генов

4.3 СПА, встроенные в интрон, функционально выключены

4.3.1 Создание модельной системы для определения эффективности работы СПА

4.3.2 Проверка активности СПА в модельной системе

4.3.3 Установление особенностей работы терминатора в интроне гена yellow

4.3.4 Исследование активности инсулятора 1А2 и сигнала полиаденилирования в интроне тепа yellow в трансгенных линиях Drosophila melanogaster

4.3.5 Проверка активности СПА внутри искусственного интрона

4.4 Использование СПА внутри интронов - редкое явление в геноме и, по всей видимости, является индуцибельным

5. Обсуждение

6. Выводы

Список цитированной литературы

Благодарности

Приложение

Список используемых сокращений

З'СС 3'-сигнал сплайсинга

5'СС 5'-сигнал сплайсинга

CF Im Cleavage factor Im - фактор расщепления I млекопитающих

CPSF Cleavage and polyadenylation specificity factor - специфичный фактор

расщепления/полиаденилирования

CstF cleavage stimulation factor - фактор, стимулирующий расщепление

CTD carboxy terminal domain - С-концевой домен РНК-полимеразы II

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid - этилендиаминтетрауксусная кислота

Flue Firefly luciferase - люцифераза светлячка

1RES Internal Ribosome Entry Site - сайт внутренней инициации трансляции

MOPS morpholinopropanesulphonic acid -

3-[1М-Морфолино]пропансульфоновая кислота

PIPES piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)

Rluc Renilla Luciferase - люцифераза медузы рода Renilla

SDS sodium dodecyl sulfate - додецилсульфат натрия

snRNP small nuclear ribonucleic particles - малые ядерные рибонуклеиновые частицы

SSC saline-sodium citrate - NaCl-цитратный буфер

SV40 Simian vacuolating virus 40, вирус SV40

ТАЕ Трис-ацетатный буфер

TBE Tris/Borate/EDTA - трис-боратный буфер

Tris tris(hydroxymethyl)aminomethane - трис(гидроксиметил)аминометан

ДМСО Диметилсульфоксид

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

мяРНК Малые ядерные РНК

ОТ-ПЦР ПЦР с обратной транскрипцией

ПЦР Полимеразная цепная реакция

п.н. пара нуклеотидов

РНК

РНКП II

СПА

т.н.

т.п.н.

Ап

Рибонуклеиновая кислота РНК-полимераза II сигнал полиаденилирования тысяча нуклеотидов тысяча пар нуклеотидов

Обозначение позиции аминокислотного остатка в полипептидной цепи, где А - однобуквенное обозначение аминокислоты, а п -позиция в аминокислотной последовательности. Например, Б2 -второй аминокислотный остаток, серин; 111810 - аргинин, 1810-й аминокислотный остаток в полипептиде.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование конкуренции между сплайсингом и полиаденилированием у Drosophila melanogaster»

1. Введение

1.1 Актуальность работы

Транскрипция - важнейший процесс в жизнедеятельности организмов. По мере изучения и накопления данных приходило понимание того, что это не просто ферментативный процесс синтеза РНК-посредника, а ключевой этап в регуляции этапов реализации генетического материала. Транскрипция представляет собой последовательность процессов, которые сменяют и влияют друг на друга: инициация, элонгация, терминация. Во время синтеза РНК подвергается ко-транскрипционным изменениям, в результате которых получается подготовленная для экспорта и трансляции молекула. В процессе созревания мРНК эукариот подвергаются кэпированию, сплайсированию и полиаденилированию. Молекулярные механизмы, ответственные за эти изменения, связаны друг с другом и с транскрипционным аппаратом [1], [2], [3], [4], [5].

Отличительной особенностью генов высших эукариот является наличие большого количества изоформ, разнообразие которых обеспечивается альтернативными инициацией, сплайсингом и расщеплением/полиаденилированием. Это свойство эукариотического генома значительно увеличивает генное разнообразие, но и добавляет трудности для корректной реализации генетического материала. Поэтому процесс транскрипции должен представлять строгую последовательность действий, при которой каждый этап должен запускаться строго по определенной команде. По всей видимости, в качестве таких пусковых сигналов выступают завершающие стадии предыдущих этапов. Так, успешная инициация транскрипции запускает кэпирование, добавление кэпа способствует преобразованию полимеразного комплекса в элонгационный, сплайсинг одного интрона стимулирует прохождение сплайсинга следующего, расщепление/полиаденилирование меняет статус полимеразного комплекса, способствуя его замедлению и остановке, что, в конечном итоге, приводит к терминации, и, наконец, освобождение транскрипта осуществляется только после

сплайсинга последнего интрона. Данные о белок-белковых взаимодействиях между компонентами комплексов дополнительно подтверждают существование таких связей.

Изложенная выше логика подразумевает, что должны существовать определенные механизмы, которые предотвращают прохождение этапов транскрипции не в свое время.

В частности, настоящая работа посвящена изучению некоторых аспектов регуляции данного процесса и в ней показано, что функция сигналов полиаденилирования заблокирована внутри интронов.

1.2Цели и задачи исследования

Целью данной работы стало изучение особенностей функционирования сигналов полиаденилирования при расположении их в интронах генов. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Определить, насколько часто встречаются скрытые СП А в интронах генов ОгозоркИа melanogaster; выявить случаи, когда СПА одних генов располагаются в интронах других генов.

2) Проверить эффективность процессинга 3'-конца на СПА в экзонах и интронах эндогенных локусов.

3) Создать транзиентную репортерную систему для определения эффективности прохождения процессинга 3'-конца на тестируемых элементах.

4) Проверить функционирование СПА в экзонах и интронах в транзиентной репортерной системе, определить влияние делеции донорного сайта на активность СПА в случае его расположения в интроне.

5) На основе данных секвенирования РНК определить частоту встречаемости случаев, когда происходит полиаденилирование в интроне.

1.3 Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В диссертационной работе было обнаружено, что функционирование сигналов полиаденилирования, расположенных внутри интронов,' заблокировано. Установлено, что скрытые сигналы полиаденилирования широко представлены в интронах БгозоркИа те1апо§аз1ег. Проведен анализ встречаемости генов, полностью расположенных в интронах других генов, и установлено, что перекрытие в сигналах полиаденилирования достаточно частое явление, затрагивающее около 17% всех генов. Показано, что внутри интронов сигналы полиаденилирования подавлены: они функционируют, находясь в экзонах, но не в интронах. Это явление подтверждено в экспериментах с транзиентной репортерной системой на культуре клеток, а также в исследовании локусов в геноме. Показано, что удаление 5'-сайта сплайсинга, превращающее последовательность интрона в продолжение экзона, приводит к восстановлению функции ранее заблокированных сигналов полиаденилирования. Согласно проведенному в работе анализу транскриптома ИгозоркПа melanogaster, сигналы полиаденилирования внутри интронов используются очень редко. В работе приведены данные, подтверждающие, что транскрипционный аппарат игнорирует преждевременные сигналы полиаденилирования до тех пор, пока они расположены в интроне. В работе подробно обсуждается наблюдаемое явление, и предлагаются модели, объясняющие возможные механизмы процесса.

Диссертационная работа вносит существенный вклад в развитие представлений о функционировании аппарата транскрипции. Практическая значимость работы состоит в возможности использования теоретических выводов и методических подходов в медицине и биотехнологии. Разработанная модельная система тестирования последовательностей на наличие сигналов полиаденилирования и их силу может найти применение при подборе элементов при создании экспрессионных векторов. Искусственные интроны, разработанные и использованные в работе, могут применяться в биотехнологической промышленности для увеличения выхода целевого белка.

1.4Положения, выносимые на защиту

1) Сигналы полиаденилирования (СПА) широко представлены в интронах генов Drosophila melanogaster. В 30% всех интронов предсказываются СПА. 6% генов (внешние) содержат внутри своих интронов гены, обладающие своими СПА (вложенные).

2) Один и тот же СПА функционирует, когда расположен в экзоне, но не в интроне гена.

3) Для определения активности СПА в культуре клеток S2 Drosophila melanogaster может использоваться разработанная транзиентная репортерная система.

4) В транзиентной репортерной системе СПА, размещенные в интронах генов, не функционируют. Удаление 5'-сайта сплайсинга приводит к восстановлению функции сигналов полиаденилирования.

5) СПА гена yellow в трансгенных линиях Drosophila melanogaster теряет свою активность при размещении его в интроне гена. Прилегающий к СПА инсулятор не способен усиливать активность сигнала полиаденилирования.

6) В геноме Drosophila melanogaster изоформы транскриптов, оканчивающиеся в интроне, встречаются редко: только 403 гена, возможно, имеют такие формы транскриптов. Только у 16 из 70 проанализированных генов найдены обе изоформы.

1.5 Степень достоверности и апробация результатов

Работа выполнена на высоком научном уровне с использованием современных методов молекулярной генетики и молекулярной биологии. Цели, поставленные в работе, достигнуты.

Статьи в научных журналах:

1. М.В. Тихонов, П.Г. Георгиев, О.Г. Максименко. «Конкуренция внутри интронов: Сплайсинг побеждает полиаденилирование посредством общего механизма». Acta Naturae. Том 5, № 4 (19), 2013, С.52-61.

2. М.В. Тихонов, академик П.Г. Георгиев, О.Г. Максименко. «Исследование активности инсулятора 1А2 и сигнала полиаденилирования в интроне гена yellow Drosophila melanogaster». Доклады Академии наук. Том 456, № 2, Май 2014, С. 241-245.

Патенты:

1. О. Максименко, М. Тихонов, С. Тощаков, Е. Зарайский, П. Георгиев. Способ идентификации элементов, обладающих способностью терминировать транскрипты. Патент 2476597. Дата приоритета 16.06.2009.

Тезисы конференций:

1. Tikhonov М., Georgiev P., Maksimenko О. "Competition within introns: Splicing wins over polyadenylation via a general mechanism". ESE-EMBO Symposium, "Systems Biology of Drosophila Development". Pultusk, Poland, 2012.

2. Тихонов M. «Блокирование терминации транскрипции в интронах». XIX международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов». Москва, Россия, 2012.

2. Обзор литературы

Большинство этапов биогенеза мРНК: транскрипция, кэпирование 5'-конца, сплайсинг, расщепление/полиаденилирование - могут быть воссозданы in vitro независимо, но в ядре они происходят одновременно и в непосредственной близости друг от друга [6], [7], [8]. Когда различные этапы созревания мРНК происходят ко-транскрипционно, в одно время, в одном месте, появляется возможность для их взаимовлияния. Завершение одного этапа способствует прохождению следующего, увеличивая его эффективность и точность. Также возможен обратный процесс: этапы могут конкурировать между собой, приводя к появлению различных форм транскриптов, увеличивая генное разнообразие и возможности регуляции экспрессии гена.

Связь между процессами, сопровождающими транскрипцию, выявляется, когда мутации в факторе, отвечающем за один этап, влияют на другие процессы биогенеза мРНК. Например, связь между транскрипцией РНК-полимеразой II (РНКП II) и процессингом мРНК подтверждается тем фактом, что делеция в С-концевом домене (CTD) большой субъединицы РНК-полимеразы II приводит к ухудшению процессинга [9], хотя это влияние также зависит и от конкретного транскрибируемого гена [10]. В ряде работ были установлены функциональные связи между транскрипцией, процессингом и упаковкой мРНК in vitro [11], [12], [13].

Взаимодействие транскрипционного аппарата, процессов созревания мРНК и модификаций хроматина может осуществляться несколькими способами. Наиболее простой способ - собрать все факторы в одном месте на элонгационном комплексе РНКП II, ускоряя при этом процессы, идущие медленно по отдельности. Поэтому комплекс РНКП II должен обладать рядом характеристик, позволяющих собрать множество компонентов в одном месте.

Транскрипционный аппарат эукариот очень сложен в своем устройстве и функционировании. В отличие от бактерий, у которых гены транскрибируются одной РНК-полимеразой, эукариоты обладают тремя типами РНК-полимераз, специализирующихся на транскрипции определенных наборов генов. Все три полимеразы представляют собой мультисубъединичные комплексы из 10-12

компонентов и, несмотря на общую функцию, имеют только небольшое число общих компонентов.

РНКГТ II, транскрибирующая большинство генов эукариот, состоит из 12 субъединиц (рис. 1), по большей части глобулярных, с большим центральным активным

Э.ротЬе ВЫДР II

Вид спереди

5.сегеу1з1ае РЫАР II

сзади

Рис. 1. Структура РНКП II на примере 8. ротЬе (слева) и Б. сегеУ181ае (справа). Разными цветами отмечены 12 субъединиц, из которых состоит РНКП II. Рисунок взят из [15].

сайтом, куда заходит транскрибируемая ДНК [14]. Каналы, ведущие в активный сайт, позволяют проникать нуклеотидам внутрь активного сайта и выходить синтезированной РНК. Рядом с каналом для РНК располагается неструктурированный С-концевой домен (СТО) большой субъединицы комплекса [16]. Хотя этот домен и не выполняет каталитической функции, его роль в транскрипции и процессинге мРНК огромна [17], [18], [19], [20]. Во-первых, домен является местом посадки транскрипционных факторов и факторов кэпирования, сплайсинга, полиаденилирования, элонгации, терминации и модификаций хроматина [21]. А во-вторых, распределение модифицированных аминокислотных остатков характеризует текущее функциональное состояние комплекса и определяет дальнейшее развитие событий.

Прямое взаимодействие с СТО показано для фермента кэпирования Cgtl, фактора расщепления/полиаденилирования РсП1, метилтрансферазы гистонов 8е12 и фактора терминации транскрипции №с11 [16], [22].

Второй способ организации сопряжения ко-транскрипционных процессов -аллостерическое регулирование, принцип которого заключается в том, что присутствие какого-либо компонента изменяет активность другого. К примеру, фосфорилирование СТО активирует гуанилтрансферазу, фермент кэпирования [23].

Третий способ «кинетического взаимодействия» направляет созревание мРНК по тому или иному направлению, изменяя длительность прохождения последовательных процессов. «Кинетическое взаимодействие» между элонгацией транскрипции и скоростью сборки сплайсосомы может регулировать альтернативный сплайсинг [4].

2.1 Роль С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II в организации транскрипционного комплекса

СТО представляет собой гибкую платформу для посадки факторов процессинга мРНК и модификаторов хроматина [21]. Длина СТО во много раз превышает размеры глобулярной части РНКП II [16], обеспечивая достаточное пространство для связи с множеством партнеров. Домен состоит из повторяющегося гептамера УЗРТЗРБ. Количество повторов у разных организмов различно: дрожжи содержат 26 повторов,

ОгозорИПа - 44, человек - 52. Кроме увеличения длины СТО у сложно устроенных организмов также наблюдаются изменения в некоторых позициях. У дрожжей почти все повторы идентичны, в то время как у высших эукариот часть аминокислот в некоторых гептамерах заменена [24] (рис. 2).

S. Cerevislae (budding yeast)

FSPTSPT YSPTSPA (YSPTSPS)3-16 YSPTSPA (YSPTSPS) 18-21 YSPTSPN (YSPTSPS) 23 YSPTSPG YSPGSPA (YSPKQDE) 26 QKHNENENSR

S. Pombe (fission yeast)

YGLTSPS

YSPSSPG

YSTSPA

YMPSSPS

(YSPTSPS) 5-8

YSATSPS

(YSPTSPS) 10-29

D. rerio (zebra fish)

YSPTSPA YEPRSPGG YTPQSP (YSPTSPS)4-5 YSPTSPN (YSPTSPS) 7-21 (YSPTSP ) 22 YSPTSPN YTPTSPS (YSPTSPS) 25 (YSPTSP ) 26

Y PTSPN

Y PTSP

(YSPTSPS) 29-30 YSPSSPR YTPQSPT YTPSSPS YSPSSPS YSPTSPK YTPTSPS YSPSSPE YTPTSPK YSPTSPK YSPTSPK YSPTSPT YSPTTPK YSPTSPT YSPTSP YTPTSPK YSPTSPT YSPTSPK YSPTSPT YSPTSPKGST YSPTSPG YSPTSPT (YS )52 ISPDDSDEENN

H. Sapiens (human)

YSPTSPA YEPRSPGC YTPQSPS (YSPTSPS)4-5 YSPTSPN (YSPTSPS)7-21 YSPTSPN YSPTSPN YTPTSPS (YSPTSPS) 25 YSPTSPN YT PTSPN (YSPTSPS)28 (YSPTSPS) 29-30 YSPSSPR YTPQSPT YTPSSPS YSPSSPS YSPTSPK YTPTSPS YSPSSPE YTPTSPK YSPTSPK YSPTSPK YSPTSPT YSPTTPK YSPTSPT YSPTSPV YTPTSPK YSPTSPT YSPTSPK YSPTSPT YSPTSPKGST YSPTSPG YSPTSPT (YSLTSPA)52 ISPDDSDEEN

Рис. 2. Сравнительный анализ последовательностей CTD разных организмов: S.cerevisiae, S.pombe, D.rerio, H.sapiens. Консенсусный гептамер YSPTSPS отмечен красным, числа рядом - номера повторов. CTD S.pombe состоит из 29 повторов, 24 из которых - консенсусные; у S.cerevisiae - 19 из 26. CTD человека и рыбы содержат по 52 повтора. Отличия аминокислотной последовательности рыбы от человека отмечены желтым. Отклонения от консенсуса отмечены синим. Рисунок взят из Hsin et al [28].

Потенциально, все аминокислотные остатки СТО могут подвергаться модификациям: фосфорилированию, гликозилированию, убиквитинилированию. Аминокислотные остатки в позициях Б5 и Б7 (серин в позиции 2, 5, 7) гептамеров фосфорилируются и дефосфорилируются киназами и фосфатазами в зависимости от стадии транскрипционного цикла [16], [21] (рис. 3). Остаток аргинина (Я 1810) в позиции 7 неконсервативного 31-го гептамера преимущественно подвергается метилированию [25], в то время как остаток К7 дистальных неконсервативных гептамеров может метилироваться, сумоилироваться и убиквитинилироваться [25], [26], [27]. Кроме того, два пролина могут менять свою конформацию путем изомеризации (рис. 3).

Рис. 3. Модификации CTD. CTD может подвергаться фосфорилированию (главным образом, по остаткам Ser2 и Ser5), гликозилированию и цис/транс-изомеризации пролинов. CDK7 (киназа из комплекса TFIIH) и CDK8 фосфорилируют CTD по остатку Ser5. Кроме того, CDK8 модифицирует Ser2. Киназа CDK9 из комплекса P-TEFb, в основном, задействована в фосфорилировании Ser2. SSU72 - фосфатаза Ser5. FCP1 может дефосфорилировать как Ser2, так и Ser5. После терминации транскрипции FCP1 может направлять РНКП II на новый раунд транскрипции. Фактор FCP1 может быть ответственным за регуляцию статуса фосфорилирования во время транскрипции. Малые фосфатазы CTD (SCPs), характерные для высших эукариот, преимущественно дефосфорилируют остаток Ser5. Изомеризацию пролина осуществляют Essl дрожжей и PIN1 млекопитающих. Конформация пролинов влияет на фосфорилирование CTD и на связывание других белковых факторов. Рисунок взя г из Saunders et al [31].

Тот факт, что каждая аминокислота CTD может подвергаться модификации независимо, говорит о том, что CTD может принимать колоссальное количество форм. Дополнительно это число может быть увеличено за счет изменений в конформации пролинов. Изомераза Pinl (Essl у дрожжей) обладает способностью менять пространственную ориентацию пролинов РЗ и Р6, переводя их либо в цис-, либо в транс- форму [26]. Изменение конформации CTD влияет на факторы, которые могут связываться с ним: например, Ssu72, фосфатаза остатка S5 у дрожжей, связывается исключительно с цис-конформацией [29], [30].

Таким образом, уникальная структура CTD в сочетании с комбинацией модификаций может быть представлена как некий «код», в терминологии, предложенной Buratowski, S. [17].

In vitro CTD усиливает кэпирование, сплайсинг и процессинг 3'-конца. Делеция CTD нарушает эти процессы [32]. Хотя CTD и необходим для эффективного прохождения процессинга мРНК, его присутствие не является достаточным. Перенос CTD на Т7 РНК-полимеразу или РНК-полимеразу I не приводил к запуску эффективного процессинга транскрипта [33].

Транскрипционный комплекс РНКП II и ассоциированные с ним факторы обладают большой молекулярной массой и размером. При высокой скорости транскрипции, РНКП II, многочисленные факторы, сидящие на ней, и синтезируемая РНК, вероятно, испытывают большое вязкое трение при движении в нуклеоплазме. Поэтому, возможным решением этой гидродинамической задачи является не движение комплекса по ДНК, а протягивание матрицы с хроматином через неподвижную машину транскрипции [34].

2.2Распределение фосфорилирования С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II как маркер стадии транскрипции

Полногеномные исследования дрожжей ([35], [36], [37], [38], [39], [40]) определили распределение фосфорилирования CTD на протяжении транскрибируемых генов и

выявили, что переход от одной метки к другой соответствует определенным участкам единицы транскрипции (рис. 4).

[ Tarminttfon íjInitiation

Re-lnltiation

Promotor \

i TSS ■

Early

elongation Productiva j/ elongation

Y1P S2P T4P S5P S7P

Рис. 4. Распределение фосфорилирования С-концевого домена большой субъединицы РНК-полимеразы II. Во время транскрипционного цикла уровень фосфорилирования остатков Tyrl, Ser2, Thr4, Ser5 и Ser7 изменяется по-разному, что отображено на рисунке интенсивностью цвета: Tyrl - фиолетовый, Ser2 -зеленый, Thr4 - оранжевый, Ser5 - красный, Ser7 - синий. Во время сборки преинициаторнш о комплекса остатки Ser5 и Ser7 фосфорилируются. Фосфорилироваиный остаток Ser7-P необходим для привлечения комплекса, ответственного за процессинг З'-конца мяРНК; роль этой метки для белок-кодирующих генов неизвестна. Остаток Ser5-P ускоряет переход РНКП II в элонгирующую форму и привлечение ферментов кэпирования и фактора терминации Nrdl. В то время как уровень Ser5-P уменьшается к З'-концу, уровень фосфорилирования Ser2-P, Thr4-P и Tyrl-P повышается в процессе элонгации транскрипции. Привлечение факторов терминации транскрипции Rttl03 и Pcfl 1 ослаблено при наличии метки Tyrl-P. Перед СПА уровень фосфорилирования Tyrl-P значительно снижается, a Ser2-P остается на прежнем уровне, что приводит к привлечению Rttl03 и Pcfl 1. После дефосфорилирования CTD, РНКП II высвобождается с матрицы и входит в новый раунд транскрипции. Рисунок с небольшими изменениями взят из[27].

Первые две метки появляются на промоторе, где происходит гиперфосфорилирование 5-го и 7-го остатков серина (Б5 и 87) в гептамерах. Оба маркера устанавливаются на сайте начала транскрипции, при этом их дальнейшая судьба различается. Фосфорилированный Б5 присутствует в большом количестве на промоторе, но в дальнейшем замещается фосфорилированным 82. Уровень фосфорилирования 87 остается высоким на протяжении всего гена [41], [42], [43], [35], [44].

Остаток 85 фосфорилируется киназами СЭК7 и СОК8 (Кт28/Мсз6 и БгЫ 0 у дрожжей). СБК7-зависимое фосфорилирование функционально связано с кэпированием, а у дрожжей также и с привлечением №с11, фактора ранней терминации транскрипции неполиаденилируемых транскриптов [45], [22]. СТО играет важную роль в кооперации транскрипции и ремоделирования хроматина: так, было показано, что фосфорилированный 85 необходим для привлечения метилтрансферазы гистонов 8ЕТ1 и деацетилазы гистонов ЯрЬЗ [46], [47], [48]. Фосфорилирование 85 снижается по мере продвижения транскрипционного аппарата к 3'-концу гена. 8ви72 и Шг1 дрожжей, 11РАР2 человека и 8ср1 млекопитающих - фосфатазы, ответственные за дефосфорилирование остатка 85 [49], [16], [50], [51], [52], [53], [54]. Однако у некоторых генов фосфорилирование 85 сохраняется до З'-конца [55], [39], [35].

Существование фосфорилирования остатка 87 установлено недавно [56], [38], [37], [43], [57]. Ответственной за внесение данной метки является киназа СОК7. Уровень фосфорилирования остатка 87 остается высоким до самого конца транскрипционной единицы. Фосфорилирование СТО по остатку 87 связано с транскрипцией белок-кодирующих генов и мяРНК. Высокий уровень этой метки характерен для сильно транскрибируемых белок-кодирующих генов, но его роль так и не выяснена. Замена серина на аланин сильно влияет на транскрипцию мяРНК, но не на белок-кодирующие гены. Показано, что фосфорилированный 87 служит местом посадки комплекса, ответственного за процессинг мяРНК, для которых характерен свой путь созревания, не связанный со сплайсингом и полиаденилированием. Это говорит об особой роли фосфорилированного отстатка 87 в процессинге продуктов мяРНК [54], [38], [35]. У дрожжей к концу транскрипционного цикла остаток 87 дефосфорилируется ферментом 8зи72, отвечающим также за отщепление фосфатов от остатка 85. Фосфатаза ЯРАР2

млекопитающих, обнаруженная на 5'-концах транскриптов, также привлекается на 3'-концы генов мяРНК за счет фосфорилированного остатка S7 [39], [58].

Еще одной модификацией CTD является фосфорилирование остатка S2. Обогащение по данной модификации наблюдается ниже промотора и остается высоким на протяжении всей кодирующей области гена. Обе фосфорилированные модификации S5 и S2 могут сосуществовать при транскрипции через тело гена. Наличие двойного фосфорилирования важно для привлечения факторов сплайсинга и хроматин-модифицирующих ферментов [59], [60], [61], [62], [63], [64]. Фосфорилирование киназой CDK9 остатка S2, главным образом, связано со сплайсингом и терминацией транскрипции. У дрожжей некоторые другие киназы способны фосфорилировать S2, в то время как у многоклеточных CDK9 считалась до недавнего времени единственной киназой, отвечающей за фосфорилирование S2. Установлено, что CDK13 способна фосфорилировать CTD in vitro, a CDK12, по всей видимости, фосфорилирует большинство остатков S2 у элонгирующей полимеразы [65], [66], [67], [68]. Двойное фосфорилирование CTD по остаткам S2 и S5 является сигналом для привлечения метилтрансферазы SET2, метилирующей остаток К36 гистона НЗ. Метилирование H3K36 приводит к привлечению деацетилаз гистонов, которые предотвращают транскрипцию со скрытых промоторов [38], [37], [69]. Дефосфорилирование остатка S2 осуществляется фосфатазой Fcpl, которая передвигается вместе с РНКП II и дефосфорилирует S2 на конце гена [70], [47], [71], [72].

2.3 Процесс кэпирования и его влияние на другие ко-транскрипционные события

Пре-мРНК модифицируется на 5'-конце добавлением 7-метил-гуанидина [73], когда длина синтезируемого транскрипта составляет порядка 25-50 нуклеотидов. Кэпирование 5'-конца РНК-транскрипта во многом определяет его дальнейшую судьбу в клетке. Кэп необходим для регуляции транскрипции, стимуляции прохождения сплайсинга, процессинга З'-конца мРНК, регуляции транспорта РНК между ядром и цитоплазмой, защиты транскрипта от деградации под действием экзонуклеаз,

стимуляции трансляции. Копирование - трехстадийный процесс, который не требует специальных последовательностей в составе РНК. РНК-трифосфатаза отщепляет у-фосфат от первого нуклеотида, затем ГТФ добавляется к РНК с помощью фермента гуанилтрансферазы и, в конце, гуанин метилируется. У многоклеточных, фермент кэпирования обладает двумя активностями: трифосфатазной и гуанилтрансферазной. Гуанилтрансферазная реакция обратима. Направление процесса кэпирования задается согласованной деятельностью двух ферментов: гуанилтрансферазой и метилтрансферазой, хотя эти ферменты не ассоциированы друг с другом [73]. Однако, оба фермента способны напрямую связываться с фосфорилированным CTD [73]. Когда инициируется транскрипция, фосфорилирование CTD по остатку S5 делает возможным посадку фермента кэпирования на транскрипционный комплекс и аллостерическую активацию гуанилтрансферазы [23]. Связь между ферментами кэпирования и РНКП II служит примером двустороннего характера взаимодействий факторов процессинга и транскрипционного аппарата. Не только эффективность кэпирования усиливается при взаимодействии с CTD, но и сами ферменты могут стимулировать или ингибировать инициацию транскрипции и/или начальную стадию элонгации [74], [75], [76]. Пауза полимеразного комплекса на 5'-конце генов, характерная для многих генов многоклеточных, по всей видимости, важна для ко-транскрипционного кэпирования. Задержка РНКП II на 5'-концах генов регулируется ассоциированным с ней фактором Spt5, который также аллостерически активирует гуанилтрансферазу [77]. Другой регулятор элонгации, белок Tat из вируса иммунодефицита человека, также активирует гуанилтрансферазу и усиливает кэпирование вирусных транскриптов, повышая их стабильность [78]. Кэпирование может быть согласовано с выходом РНКП II из состояния паузы. Тем самым гарантируется, что полимераза вступает в продуктивную фазу элонгации с правильно модифицированным 5'-концом. Напротив, пауза РНКП II может содействовать кэпированию, благодаря небольшому расстоянию между 5'-концом транскрипта и ферментами кэпирования, сидящими на CTD. Кэпирование обычно не рассматривается как регулируемый этап работы генов, но, тем не менее, привлечение факторов кэпирования может определяться фактором Spt5 или фосфорилированием CTD.

Влияние ферментов кэпирования не ограничивается 5'-концами транскриптов. Кэпирующие ферменты человека найдены не только на 5'-конце, но и на протяжении всего гена, включая фланкирующую 3'-конец область, более т.п.н. ниже сайта полиаденилирования [79]. Таким образом, факторы кэпирования задерживаются на РНКГТ II значительно дольше, и поэтому потенциально могут влиять на элонгацию, терминацию, процессинг 3'-конца. В дополнение ко всему, предполагается, что ферменты кэпирования могут содействовать образованию R-петель и тем самым влиять на элонгацию транскрипции [80].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тихонов, Максим Васильевич, 2014 год

Список цитированной литературы

1. Auboeuf, D., et al., A subset of nuclear receptor coregulators act as coupling proteins during synthesis and maturation of RNA transcripts. Mol Cell Biol, 2005. 25(13): p. 5307-16.

2. Bentley, D.L., Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors. Curr Opin Cell Biol, 2005. 17(3): p. 251-6.

3. Calvo, O. and Manley, J.L., Strange bedfellows: polyadenylation factors at the promoter. Genes Dev, 2003. 17(11): p. 1321-7.

4. Kornblihtt, A.R., et al., Multiple links between transcription and splicing. RNA, 2004. 10(10): p. 1489-98.

5. Maniatis, T. and Reed, R., An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature, 2002. 416(6880): p. 499-506.

6. Bauren, G., Belikov, S., and Wieslander, L., Transcriptional termination in the Balbiani ring 1 gene is closely coupled to 3'-end formation and excision of the 3'-terminal intron. Genes Dev, 1998. 12(17): p. 2759-69.

7. Beyer, A.L. and Osheim, Y.N., Splice site selection, rate of splicing, and alternative splicing on nascent transcripts. Genes Dev, 1988. 2(6): p. 754-65.

8. Rasmussen, E.B. and Lis, J.T., In vivo transcriptional pausing and cap formation on three Drosophila heat shock genes. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(17): p. 7923-7.

9. McCracken, S., et al., The C-terminal domain of RNA polymerase II couples mRNA processing to transcription. Nature, 1997. 385(6614): p. 357-61.

10. Ryman, K., et al., The C-terminal domain of RNA Pol II helps ensure that editing precedes splicing of the GluR-B transcript. RNA, 2007. 13(7): p. 1071-8.

11. Das, R., et al., SR proteins function in coupling RNAP II transcription to pre-mRNA splicing. Mol Cell, 2007. 26(6): p. 867-81.

12. Hicks, M.J., Yang, C.R., Kotlajich, M.V., and Hertel, K.J., Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol, 2006. 4(6): p. el47.

13. Rigo, F. and Martinson, H.G., Polyadenylation releases mRNA from RNA polymerase II in a process that is licensed by splicing. RNA, 2009. 15(5): p. 823-36.

14. Cramer, P., RNA polymerase II structure: from core to functional complexes. Curr Opin Genet Dev, 2004. 14(2): p. 218-26.

15. Spahr, H., Calero, G., Bushnell, D.A., and Kornberg, R.D., Schizosacharomyces pombe RNA polymerase II at 3.6-A resolution. Proc Natl Acad Sci USA, 2009. 106(23): p. 9185-90.

16. Meinhart, A., et al., A structural perspective of CTD function. Genes Dev, 2005. 19(12): p. 1401-15.

17. Buratowski, S., The CTD code. Nat Struct Biol, 2003. 10(9): p. 679-80.

18. Svejstrup, J.Q., Transcription: another mark in the tail. EMBO J, 2012. 31(12): p. 2753-4.

19. Buratowski, S., Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol Cell, 2009. 36(4): p. 541-6.

20. Perales, R. and Bentley, D., "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol Cell, 2009. 36(2): p. 178-91.

21. Phatnani, H.P. and Greenleaf, A.L., Phosphorylation and functions of the RNA polymerase IICTD. Genes Dev, 2006. 20(21): p. 2922-36.

22. Vasiljeva, L., et al., The Nrdl-Nab3-Senl termination complex interacts with the Ser5-phosphorylated RNA polymerase II C-terminal domain. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(8): p. 795-804.

23. Ho, C.K. and Shuman, S., Distinct roles for CTD Ser-2 and Ser-5 phosphorylation in the recruitment and allosteric activation of mammalian mRNA capping enzyme. Mol Cell, 1999. 3(3): p. 405-11.

24. Napolitano, G., Lania, L., and Majello, B., RNA polymerase II CTD modifications: How many tales from a single tail. J Cell Physiol, 2013.

25. Sims, R.J., et al., The C-terminal domain of RNA polymerase II is modified by site-specific methylation. Science, 2011. 332(6025): p. 99-103.

26. Egloff, S., Dienstbier, M., and Murphy, S., Updating the RNA polymerase CTD code: adding gene-specific layers. Trends Genet, 2012. 28(7): p. 333-41.

27. Heidemann, M., Hintermair, C., VoB, K., and Eick, D., Dynamic phosphorylation patterns of RNA polymerase II CTD during transcription. Biochim Biophys Acta, 2013. 1829(1): p. 55-62.

28. Hsin, J.P. and Manley, J.L., The RNA polymerase II CTD coordinates transcription and RNA processing. Genes Dev, 2012. 26(19): p. 2119-37.

29. Krishnamurthy, S., et al., Ssu72 Is an RNA polymerase II CTD phosphatase. Mol Cell, 2004. 14(3): p. 387-94.

30. Werner-Allen, J.W., et al., cis-Proline-mediated Ser(P)5 dephosphorylation by the RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase Ssu72. J Biol Chem, 2011. 286(7): p. 5717-26.

31. Saunders, A., Core, L.J., and Lis, J.T., Breaking barriers to transcription elongation. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006. 7(8): p. 557-67.

32. Hirose, Y. and Manley, J.L., RNA polymerase II and the integration of nuclear events. Genes Dev, 2000. 14(12): p. 1415-29.

33. Natalizio, B.J., Robson-Dixon, N.D., and Garcia-Blanco, M.A., The Carboxyl-terminal Domain of RNA Polymerase II Is Not Sufficient to Enhance the Efficiency of Pre-mRNA Capping or Splicing in the Context of a Different Polymerase. J Biol Chem, 2009. 284(13): p. 8692-702.

34. Jackson, D.A. and Cook, P.R., The structural basis of nuclear function. Int Rev Cytol, 1995. 162A: p. 125-49.

35. Tietjen, J.R., et al., Chemical-genomic dissection of the CTD code. Nat Struct Mol Biol, 2010. 17(9): p. 1154-61.

36. Coudreuse, D., et al., A gene-specific requirement of RNA polymerase II CTD phosphorylation for sexual differentiation in S. pombe. Curr Biol, 2010. 20(12): p. 1053-64.

37. Mayer, A., et al., Uniform transitions of the general RNA polymerase II transcription complex. Nat Struct Mol Biol, 2010. 17(10): p. 1272-8.

38. Kim, H., et al., Gene-specific RNA polymerase IIphosphorylation and the CTD code. Nat Struct Mol Biol, 2010. 17(10): p. 1279-86.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

Bataille, A.R., et al., A universal RNA polymerase II CTD cycle is orchestrated by complex interplays between kinase, phosphatase, and isomerase enzymes along genes. Mol Cell, 2012. 45(2): p. 158-70.

Drogat, J. and Hermand, D., Gene-specific requirement of RNA polymerase II CTD phosphorylation. Mol Microbiol, 2012. 84(6): p. 995-1004.

Glover-Cutter, K., et al., TFIIH-associated Cdk7 kinase functions in phosphorylation of C-terminal domain Ser7 residues, promoter-proximal pausing, and termination by RNA polymerase II. Mol Cell Biol, 2009. 29(20): p. 5455-64.

Kim, M., Suh, H., Cho, E.J., and Buratowski, S., Phosphorylation of the yeast Rpbl C-terminal domain at serines 2, 5, and 7. J Biol Chem, 2009. 284(39): p. 26421-6. Akhtar, M.S., et al., TFIIH kinase places bivalent marks on the car boxy-terminal domain of RNA polymerase II. Mol Cell, 2009. 34(3): p. 387-93.

Boeing, S., et al., RNA polymerase II C-terminal heptarepeat domain Ser-7 phosphorylation is established in a mediator-dependent fashion. J Biol Chem, 2010. 285(1): p. 188-96.

Gudipati, R.K., Villa, T., Boulay, J., and Libri, D., Phosphorylation of the RNA polymerase II C-terminal domain dictates transcription termination choice. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(8): p. 786-94.

Krogan, N.J., et al., The Pafl complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dotlp: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell, 2003. 11(3): p. 721-9.

Hampsey, M. and Reinberg, D., Tails of intrigue: phosphorylation of RNA polymerase IImediates histone methylation. Cell, 2003. 113(4): p. 429-32.

Govind, C.K., et al., Phosphorylated Pol II CTD recruits multiple HDACs, including Rpd3C(S), for methylation-dependent deacetylation of ORF nucleosomes. Mol Cell, 2010. 39(2): p. 234-46.

Egloff, S. and Murphy, S., Cracking the RNA polymerase II CTD code. Trends Genet, 2008. 24(6): p. 280-8.

Yeo, M., et al., Small CTD phosphatases function in silencing neuronal gene expression. Science, 2005. 307(5709): p. 596-600.

Mosley, A.L., et al., Rtrl is a CTD phosphatase that regulates RNA polymerase II during the transition from serine 5 to serine 2 phosphorylation. Mol Cell, 2009. 34(2): p. 168-78.

Jeronimo, C., et al., Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Mol Cell, 2007. 27(2): p. 262-74.

Egloff, S., et al., The integrator complex recognizes a new double mark on the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain. J Biol Chem, 2010. 285(27): p. 20564-9. Egloff, S., et al., Ser7 phosphorylation of the CTD recruits the RPAP2 Ser5 phosphatase to snRNA genes. Mol Cell, 2012. 45(1): p. 111-22.

Egloff, S., Al-Rawaf, H., O'Reilly, D., and Murphy, S., Chromatin structure is implicated in "late" elongation checkpoints on the U2 snRNA and beta-actin genes. Mol Cell Biol, 2009. 29(14): p. 4002-13.

Chapman, R.D., et al., Transcribing RNA polymerase II is phosphorylated at CTD residue serine-7. Science, 2007. 318(5857): p. 1780-2.

Egloff, S., et al., Serine-7 of the RNA polymerase II CTD is specifically required for snRNA gene expression. Science, 2007. 318(5857): p. Mil-9.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

65.

66,

67,

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

Zhang, D.W., et al., Ssu72 phosphatase-dependent erasure of phospho-Ser7 marks on the RNA polymerase II C-terminal domain is essential for viability and transcription termination. J Biol Chem, 2012. 287(11): p. 8541-51.

David, C.J., Boyne, A.R., Millhouse, S.R., and Manley, J.L., The RNA polymerase IIC-terminal domain promotes splicing activation through recruitment of a U2AF65-Prpl9 complex. Genes Dev, 2011. 25(9): p. 972-83.

Bono, F. and Gehring, N.H., Assembly, disassembly and recycling: the dynamics of exon junction complexes. RNA Biol, 2011. 8(1): p. 24-9.

MacKellar, A.L. and Greenleaf, A.L., Cotranscriptional association of mRNA export factor Yral with C-terminal domain of RNA polymerase II. J Biol Chem, 2011. 286(42): p. 36385-95.

Kizer, K.O., et al., A novel domain in Set2 mediates RNA polymerase II interaction and couples histone H3 K36 methylation with transcript elongation. Mol Cell Biol, 2005. 25(8): p. 3305-16.

Vojnic, E., et al., Structure and carboxyl-terminal domain (CTD) binding of the Set2 SRI domain that couples histone H3 Lys36 methylation to transcription. J Biol Chem, 2006. 281(1): p. 13-5.

Heidemann, M. and Eick, D., Tyrosine-1 and threonine-4 phosphorylation marks complete the RNA polymerase II CTDphospho-code. RNA Biol, 2012. 9(9): p. 1144-6. Bartkowiak, B., et al., CDK12 is a transcription elongation-associated CTD kinase, the metazoan ortholog of yeast Ctkl. Genes Dev, 2010. 24(20): p. 2303-16. Bartkowiak, B. and Greenleaf, A.L., Phosphorylation of RNAPII: To P-TEFb or not to P-TEFb? Transcription, 2011. 2(3): p. 115-119.

Kohoutek, J. and Blazek, D., Cyclin K goes with Cdkl2 and Cdkl3. Cell Div, 2012. 7: p. 12.

Blazek, D., et al., The Cyclin KJCdkl2 complex maintains genomic stability via regulation of expression ofDNA damage response genes. Genes Dev, 2011. 25(20): p. 2158-72.

Workman, J.L., Nucleosome displacement in transcription. Genes Dev, 2006. 20(15): p. 2009-17.

Majello, B. and Napolitano, G., Control of RNA polymerase II activity by dedicated

CTD kinases and phosphatases. Front Biosci, 2001. 6: p. D1358-68.

Cho, E.J., et al., Opposing effects of Ctkl kinase and Fcpl phosphatase at Ser 2 of the

RNA polymerase II C-terminal domain. Genes Dev, 2001. 15(24): p. 3319-29.

Ghosh, A., Shuman, S., and Lima, C.D., The structure of Fcpl, an essential RNA

polymerase II CTD phosphatase. Mol Cell, 2008. 32(4): p. 478-90.

Shuman, S., Structure, mechanism, and evolution of the mRNA capping apparatus. Prog

Nucleic Acid Res Mol Biol, 2001. 66: p. 1-40.

Mandal, S.S., et al., Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(20): p. 7572-7.

Myers, L.C., Lacomis, L., Erdjument-Bromage, H., and Tempst, P., The yeast capping enzyme represses RNA polymerase II transcription. Mol Cell, 2002. 10(4): p. 883-94. Schroeder, S.C., et al., A function of yeast mRNA cap methyltransferase, Abdl, in transcription by RNA polymerase II. Mol Cell, 2004. 13(3): p. 377-87. Wen, Y. and Shatkin, A.J., Transcription elongation factor hSPT5 stimulates mRNA capping. Genes Dev, 1999. 13(14): p. 1774-9.

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

Chiu, Y.L., et al., Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Mol Cell, 2002. 10(3): p. 585-97.

Glover-Cutter, K., Kim, S., Espinosa, J., and Bentley, D.L., RNA polymerase IIpauses and associates with pre-mRNA processing factors at both ends of genes. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(1): p. 71-8.

Kaneko, S., Chu, C., Shatkin, A. J., and Manley, J.L., Human capping enzyme promotes formation of transcriptional R loops in vitro. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(45): p. 17620-5.

Brinster, R.L., et al., Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1988. 85(3): p. 836-40.

Furger, A., et al., Promoter proximal splice sites enhance transcription. Genes Dev, 2002. 16(21): p. 2792-9.

Gornemann, J., Kotovic, K.M., Hujer, K., and Neugebauer, K.M., Cotranscriptional spliceosome assembly occurs in a stepwise fashion and requires the cap binding complex. Mol Cell, 2005. 19(1): p. 53-63.

Lacadie, S.A. and Rosbash, M., Cotranscriptional spliceosome assembly dynamics and the role ofUl snRNA:5'ss base pairing in yeast. Mol Cell, 2005. 19(1): p. 65-75. Listerman, I., Sapra, A.K., and Neugebauer, K.M., Cotranscriptional coupling of splicing factor recruitment and precursor messenger RNA splicing in mammalian cells. Nat Struct Mol Biol, 2006. 13(9): p. 815-22.

Bird, G., Zorio, D.A., and Bentley, D.L., RNA polymerase II carboxy-terminal domain phosphorylation is required for cotranscriptional pre-mRNA splicing and 3'-end formation. Mol Cell Biol, 2004. 24(20): p. 8963-9.

Natalizio, B.J. and Garcia-Blanco, M.A., In vitro coupled transcription splicing. Methods, 2005. 37(4): p. 314-22.

Singh, J. and Padgett, R.A., Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nat Struct Mol Biol, 2009. 16(11): p. 1128-33.

Das, R., et al., Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev, 2006. 20(9): p. 1100-9.

Yu, Y., Das, R., Folco, E.G., and Reed, R., A model in vitro system for cotranscriptional splicing. Nucleic Acids Res, 2010. 38(21): p. 7570-8. Montes, M., Becerra, S., Sanchez-Alvarez, M., and Sune, C., Functional coupling of transcription and splicing. Gene, 2012. 501(2): p. 104-17.

Ahn, S.H., Kim, M., and Buratowski, S., Phosphorylation of serine 2 within the RNA polymerase II C-terminal domain couples transcription and 3' end processing. Mol Cell, 2004. 13(1): p. 67-76.

Ni, Z., et al., Coordination of transcription, RNA processing, and surveillance by P-TEFb kinase on heat shock genes. Mol Cell, 2004. 13(1): p. 55-65. Gu, B., Eick, D., and Bensaude, O., CTD serine-2 plays a critical role in splicing and termination factor recruitment to RNA polymerase II in vivo. Nucleic Acids Res, 2013. 41(3): p. 1591-603.

Chan, D.C., Bedford, M.T., and Leder, P., Formin binding proteins bear WWP/WW domains that bind proline-rich peptides and functionally resemble SH3 domains. EMBO J, 1996. 15(5): p. 1045-54.

Bedford, M.T. and Leder, P., The FF domain: a novel motif that often accompanies WW domains. Trends Biochem Sci, 1999. 24(7): p. 264-5.

97.

98.

99.

100.

101.

102.

103.

104.

105.

106,

107,

108,

109

110

111

112

113

114

115

116

117

Damgaard, C.K., et al., A 5' splice site enhances the recruitment of basal transcription initiation factors in vivo. Mol Cell, 2008. 29(2): p. 271-8.

Long, J.C. and Caceres, J.F., The SR protein family of splicing factors: master regulators of gene expression. Biochem J, 2009. 417(1): p. 15-27. Lin, S., et al., The splicing factor SC35 has an active role in transcriptional elongation. Nat Struct Mol Biol, 2008. 15(8): p. 819-26.

Sapra, A.K., et al., SR protein family members display diverse activities in the formation of nascent and mature mRNPs in vivo. Mol Cell, 2009. 34(2): p. 179-90. de la Mata, M. and Kornblihtt, A.R., RNA polymerase II C-terminal domain mediates regulation of alternative splicing by SRp20. Nat Struct Mol Biol, 2006. 13(11): p. 97380.

Cramer, P., et al., Coupling of transcription with alternative splicing: RNA pol II promoters modulate SF2/ASF and 9G8 effects on an exonic splicing enhancer. Mol Cell, 1999. 4(2): p. 251-8.

Kadener, S., et al., Antagonistic effects of T-Ag and VP 16 reveal a role for RNA pol II elongation on alternative splicing. EMBO J, 2001. 20(20): p. 5759-68. Kadener, S., Fededa, J.P., Rosbash, M., and Kornblihtt, A.R., Regulation of alternative splicing by a transcriptional enhancer through RNA pol II elongation. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(12): p. 8185-90.

Nogues, G., et al., Transcriptional activators differ in their abilities to control alternative splicing. J Biol Chem, 2002. 277(45): p. 43110-4.

de la Mata, M., et al., A slow RNA polymerase II affects alternative splicing in vivo. Mol Cell, 2003. 12(2): p. 525-32.

Boireau, S., et al., The transcriptional cycle of HIV-1 in real-time and live cells. J Cell Biol, 2007. 179(2): p. 291-304.

Darzacq, X., et al., In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(9): p. 796-806.

Batada, N.N., et al., Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(50): p. 17361-4.

Kornblihtt, A.R., Chromatin, transcript elongation and alternative splicing. Nat Struct Mol Biol, 2006. 13(1): p. 5-7.

Mandel, C.R., Bai, Y., and Tong, L., Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci, 2008. 65(7-8): p. 1099-122.

Gall, J.G., Bellini, M., Wu, Z., and Murphy, C., Assembly of the nuclear transcription and processing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol Biol Cell, 1999. 10(12): p. 4385-402.

Licatalosi, D.D., et al., Functional interaction of yeast pre-mRNA 3' end processing

factors with RNA polymerase II Mol Cell, 2002. 9(5): p. 1101-11.

West, S., Proudfoot, N.J., and Dye, M.J., Molecular dissection of mammalian RNA

polymerase II transcriptional termination. Mol Cell, 2008. 29(5): p. 600-10.

Hirose, Y. and Manley, J.L., RNA polymerase II is an essential mRNA polyadenylation

factor. Nature, 1998. 395(6697): p. 93-6.

Kim, M., et al., The yeast Rati exonuclease promotes transcription termination by RNA polymerase II. Nature, 2004. 432(7016): p. 517-22.

Meinhart, A. and Cramer, P., Recognition of RNA polymerase II carboxy-terminal domain by 3'-RNA-processingfactors. Nature, 2004. 430(6996): p. 223-6.

118. Dantonel, J.C., Murthy, K.G., Manley, J.L., and Tora, L., Transcription factor TFIID recruits factor CPSF for formation of 3' end of mRNA. Nature, 1997. 389(6649): p. 399402.

119. Nag, A., Narsinh, K., and Martinson, H.G., The poly(A)-dependent transcriptional pause is mediated by CPSF acting on the body of the polymerase. Nat Struct Mol Biol, 2007. 14(7): p. 662-9.

120. Johnson, S.A., Cubberley, G., and Bentley, D.L., Cotranscriptional recruitment of the mRNA export factor Yral by direct interaction with the 3' end processing factor Pcfll. Mol Cell, 2009. 33(2): p. 215-26.

121. Saguez, C. and Jensen, T.H., Assembly of export-competent mRNP: it's all about being connected. Mol Cell, 2009. 33(2): p. 139-40.

122. Bucheli, M.E., et al., Polyadenylation site choice in yeast is affected by competition between Npl3 and polyadenylation factor CFI. RNA, 2007. 13(10): p. 1756-64.

123. Licatalosi, D.D., et al., HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature, 2008. 456(7221): p. 464-9.

124. Sandberg, R., et al., Proliferating cells express mRNAs with shortened 3' untranslated regions and fewer microRNA target sites. Science, 2008. 320(5883): p. 1643-7.

125. Custodio, N., Vivo, M., Antoniou, M., and Carmo-Fonseca, M., Splicing- and cleavage-independent requirement of RNA polymerase II CTD for mRNA release from the transcription site. J Cell Biol, 2007. 179(2): p. 199-207.

126. Gilbert, W. and Guthrie, C., The Glc7p nuclear phosphatase promotes mRNA export by facilitating association ofMex67p with mRNA. Mol Cell, 2004. 13(2): p. 201-12.

127. Rougemaille, M., et al., THO/Sub2p functions to coordinate 3'-end processing with gene-nuclear pore association. Cell, 2008.135(2): p. 308-21.

128. Visa, N., et al., A nuclear cap-binding complex binds Balbiani ring pre-mRNA cotranscriptionally and accompanies the ribonucleoprotein particle during nuclear export. J Cell Biol, 1996. 133(1): p. 5-14.

129. Daneholt, B., Assembly and transport of a premessenger RNP particle. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(13): p. 7012-7.

130. Custodio, N., et al., In vivo recruitment of exon junction complex proteins to transcription sites in mammalian cell nuclei. RNA, 2004. 10(4): p. 622-33.

131. Pan, F., Hiittelmaier, S., Singer, R.H., and Gu, W., ZBP2 facilitates binding ofZBPl to beta-actin mRNA during transcription. Mol Cell Biol, 2007. 27(23): p. 8340-51.

132. Glisovic, T., Bachorik, J.L., Yong, J., and Dreyfuss, G., RNA-bindingproteins andpost-transcriptional gene regulation. FEBS Lett, 2008. 582(14): p. 1977-86.

133. Cheng, H., et al., Human mRNA export machinery recruited to the 5' end of mRNA. Cell, 2006. 127(7): p. 1389-400.

134. Strasser, K., et al., TREX is a conserved complex coupling transcription with messenger RNA export. Nature, 2002. 417(6886): p. 304-8.

135. Iglesias, N. and Stutz, F., Regulation of mRNP dynamics along the export pathway. FEBS Lett, 2008. 582(14): p. 1987-96.

136. Kohler, A. and Hurt, E., Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): p. 761-73.

137. Casolari, J.M. and Silver, P.A., Guardian at the gate: preventing unsplicedpre-mRNA export. Trends Cell Biol, 2004. 14(5): p. 222-5.

138. Saguez, C., et al., Nuclear mRNA surveillance in THO/sub2 mutants is triggered by inefficient polyadenylation. Mol Cell, 2008. 31(1): p. 91-103.

139. Schmid, M. and Jensen, T.H., Quality control of mRNP in the nucleus. Chromosoma, 2008. 117(5): p. 419-29.

140. Andrulis, E.D., et al., The RNA processing exosome is linked to elongating RNA polymerase II in Drosophila. Nature, 2002. 420(6917): p. 837-41.

141. Burkard, K.T. and Butler, J.S., A nuclear 3'-5' exonuclease involved in mRNA degradation interacts with Poly(A) polymerase and the hnRNA protein Npl3p. Mol Cell Biol, 2000. 20(2): p. 604-16.

142. Vasiljeva, L. and Buratowski, S., Nrdl interacts with the nuclear exosome for 3' processing of RNA polymerase II transcripts. Mol Cell, 2006. 21(2): p. 239-48.

143. Aguilera, A. and Klein, H.L., HPR1, a novel yeast gene that prevents intrachromosomal excision recombination, shows carboxy-terminal homology to the Saccharomyces cerevisiae TOPI gene. Mol Cell Biol, 1990. 10(4): p. 1439-51.

144. Huertas, P. and Aguilera, A., Cotranscriptionally formed DNA:RNA hybrids mediate transcription elongation impairment and transcription-associated recombination. Mol Cell, 2003. 12(3): p. 711-21.

145. Li, X. and Manley, J.L., Inactivation of the SR protein splicing factor ASF/SF2 results in genomic instability. Cell, 2005. 122(3): p. 365-78.

146. Rosonina, E., Kaneko, S., and Manley, J.L., Terminating the transcript: breaking up is hard to do. Genes Dev, 2006. 20(9): p. 1050-6.

147. Steinmetz, E.J., Conrad, N.K., Brow, D.A., and Corden, J.L., RNA-binding protein Nrdl directs poly (A)-independent 3'-end formation of RNA polymerase II transcripts. Nature, 2001. 413(6853): p. 327-31.

148. Kim, M., et al., Distinct pathways for snoRNA and mRNA termination. Mol Cell, 2006. 24(5): p. 723-34.

149. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., and Kleckner, N., Capturing chromosome conformation. Science, 2002. 295(5558): p. 1306-11.

150. O'Sullivan, J.M., et al., Gene loops juxtapose promoters and terminators in yeast. Nat Genet, 2004. 36(9): p. 1014-8.

151. Singh, B.N. and Hampsey, M., A transcription-independent role for TFIIB in gene looping. Mol Cell, 2007. 27(5): p. 806-16.

152. Perkins, K.J., et al., Transcription-dependent gene looping of the HIV-1 provirus is dictated by recognition of pre-mRNA processing signals. Mol Cell, 2008. 29(1): p. 5668.

153. Wu, W.H., Pinto, I., Chen, B.S., and Hampsey, M., Mutational analysis of yeast TFIIB. A functional relationship between Ssu72 and Subl/Tspl defined by allele-specific interactions with TFIIB. Genetics, 1999. 153(2): p. 643-52.

154. Moore, M.J. and Proudfoot, N.J., Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to translation. Cell, 2009. 136(4): p. 688-700.

155. Karess, R.E. and Rubin, G.M., Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell, 1984. 38(1): p. 135-46.

156. Rubin, G.M. and Spradling, A.C., Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science, 1982. 218(4570): p. 348-53.

157. Spradling, A.C. and Rubin, G.M., Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science, 1982. 218(4570): p. 341-7.

158. Cheng, Y., Miura, R.M., and Tian, B., Prediction of mRNA polyadenylation sites by support vector machine. Bioinformatics, 2006. 22(19): p. 2320-5.

159.

160.

161.

162.

163.

164.

165.

166.

167,

168

169

170

171

172

173

174

175

176

Guo, J., Garrett, M., Micklem, G., and Brogna, S., Poly(A) signals located near the 5' end of genes are silenced by a general mechanism that prevents premature 3'-end processing. Mol Cell Biol, 2011. 31(4): p. 639-51.

MeQuilton, P., St Pierre, S.E., Thurmond, J., and Consortium, F., FlyBase 101-the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res, 2012. 40(Database issue): p. D706-14.

Hu, J., Lutz, C.S., Wilusz, J., and Tian, B., Bioinformatic identification of candidate cis-regulatory elements involved in human mRNA polyadenylation. RNA, 2005. 11(10): p. 1485-93.

Graveley, B.R., et al., The developmental transcriptome of Drosophila melcinogaster. Nature, 2011. 471(7339): p. 473-9.

Celniker, S.E., et al., Unlocking the secrets of the genome. Nature, 2009. 459(7249): p. 927-30.

Maksimenko, O.G., Chetverina, D.A., and Georgiev, P.G., [Insulators of higher eukaryotes: properties, mechanisms of action, and role in transcriptional regulation]. Genetika, 2006. 42(8): p. 1029-44.

Golovnin, A., et al., An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development, 2003. 130(14): p. 324958.

Parnell, T.J., et al., An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(23): p. 1343641.

Gaszner, M. and Felsenfeld, G., Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat Rev Genet, 2006. 7(9): p. 703-13.

Geyer, P.K. and Corces, V.G., Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev, 1987. 1(9): p. 996-1004. Qian, S., Varjavand, B., and Pirrotta, V., Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication. Genetics, 1992. 131(1): p. 79-90.

Golic, K.G. and Lindquist, S., The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell, 1989. 59(3): p. 499-509. Siegal, M.L. and Hartl, D.L., Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene coplacement. Methods Mol Biol, 2000. 136: p. 487-95. Mazo, A.M., et al., Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region of gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EM BO J, 1989. 8(3): p. 903-11.

Silicheva, M., et al., Drosophila mini-white model system: new insights into positive position effects and the role of transcriptional terminators and gypsy insulator in transgene shielding. Nucleic Acids Res, 2010. 38(1): p. 39-47.

Dorsett, D., Potentiation of a polyadenylylation site by a downstream protein-DNA interaction. Proc Natl Acad Sci U S A, 1990. 87(11): p. 4373-7.

Langemeier, J., et al., A complex immunodeficiency is based on U1 snRNP-mediated poly(A) site suppression. EMBO J, 2012. 31(20): p. 4035-44.

Langemeier, J., Radtke, M., and Bohne, J., U1 snRNP-mediated poly (A) site suppression: beneficial and deleterious for mRNA fate. RNA Biol, 2013. 10(2): p. 1804.

177. Kaida, D., et al., Ul snRNP protects pre-mRNAs from premature cleavage and polyadenylation. Nature, 2010. 468(7324): p. 664-8.

178. Gunderson, S.I., Polycarpou-Schwarz, M., arid Mattaj, I.W., Ul snRNP inhibits pre-mRNA polyadenylation through a direct interaction between Ul 7 OK and poly (A) polymerase. Mol Cell, 1998. 1(2): p. 255-64.

179. Rigo, F. and Martinson, H.G., Functional coupling of last-intron splicing and 3'-end processing to transcription in vitro: the poly (A) signal couples to splicing before committing to cleavage. Mol Cell Biol, 2008. 28(2): p. 849-62.

180. Berg, M.G., et al., Ul snRNP determines mRNA length and regulates isoform expression. Cell, 2012. 150(1): p. 53-64.

181. West, S., Gromak, N., and Proudfoot, N.J., Human 5' —> 3' exonuclease Xrn2promotes transcription termination at co-transcriptional cleavage sites. Nature, 2004. 432(7016): p. 522-5.

182. Luo, W., Johnson, A.W., and Bentley, D.L., The role of Rati in coupling mRNA 3'-end processing to transcription termination: implications for a unified allosteric-torpedo model. Genes Dev, 2006. 20(8): p. 954-65.

183. Dye, M.J., Gromak, N., and Proudfoot, N.J., Exon tethering in transcription by RNA polymerase II. Mol Cell, 2006. 21(6): p. 849-59.

Благодарности

Автор выражает признательность коллективу лаборатории регуляции генетических процессов ИБГ РАН и сотрудникам группы изучения механизмов активации и репрессии транскрипции за помощь при проведении экспериментов, написании данной работы и моральную поддержку.

Особую благодарность автор выражает своим научным руководителям Оксане Геннадьевне Максименко и Павлу Георгиевичу Георгиеву за помощь и чуткое, последовательное руководство.