Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Таха Абдул Саттар

• Таха Абдул Саттар
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Таха Абдул Саттар

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о гидролитических ферментах

1.1. Основные характеристики карбогидраз

1.2. Физико - химические свойства инулиназы

ГЛАВА 2. Иммобилизация гидролитических ферментов

2.1. Методы иммобилизации гидролаз

2.2. Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине и аналитической практике

2.3. Иммобилизация инулиназы на различных носителях 37 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объект исследования

3.2. Методы исследования

3.2.1. Культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus

3.2.2. Определение содержания белка в препарате методом Лоури

3.2.3. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментных препаратах модифицированным методом Лоури

3.2.4. Метод определения активности инулиназы

3.2.5. Метод определения активности иммобилизованной инулиназы

3.2.6. Очистка и определение молекулярной массы инулиназы методом гель-хроматографии

3.2.7. Подготовка ионообменных материалов к иммобилизации

3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации инулиназы

ГЛАВА 4. Выделение, очистка, физико-химические свойства препаратов инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori 52 4.1. Исследование условий экстракции и очистки препарата инулиназы Aspergillus awamori

4.2. Изучение условий выделения и очистки инулиназы из Kluyveromy-ces marxianus

4.3. Некоторые физико-химические свойства инулиназ из Kluyveromy-ces marxianus и Aspergillus awamori

ГЛАВА 5. Адсорбционная иммобилизация инулиназы из Kluyveromy-ces marxianus на различных носителях

5.1. Исследование условий иммобилизации инулиназы Kluyveromyces marxianus на некоторых ионообменных смолах

ГЛАВА 6. Изучение кинетико-термодинамических аспектов катализа свободной и иммобилизованной инулиназой Kluyveromyces marxianus

6.1. Исследование кинетики реакции гидролиза инулина адсорбционно связанной инулиназой Kluyveromyces marxianus

6.2. Кинетико-термодинамические аспекты процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus

6.3. Исследование закономерностей процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus методом дифференциально-термического анализа

6.4. Основные закономерности процесса термической инактивации инулиназы Kluyveromyces marxianus, иммобилизованной на ВИОН-КН

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой»

Современные тенденции развития теории биологического катализа связаны с изучением ферментативных реакций, которые при всей их сложности протекают в полном соответствии с законами химической кинетики и термодинамики. Однако уникальные свойства ферментов, способность осуществлять регуляцию всех процессов жизнедеятельности на внутримолекулярном уровне определяются исключительно сложной структурой полипептидной цепи и активного центра белковой макромолекулы.

Исследование структурно-функциональных свойств карбогидраз и кинетико-термодинамических аспектов ферментативного гидролиза полимерных субстратов являются необходимым условием изучения полиферментных систем, локализованных в различных клеточных органеллах и нужны для создания теоретической базы ферментации возобновляемого растительного сырья и получения продуктов с заданными свойствами.

Особую значимость приобретают в настоящее время работы по иммобилизации ферментов, расщепляющих полисахариды и полифруктозиды и переводящих фермент из гомогенных катализаторов в гетерогенные, имеющие ряд технологических преимуществ.

Фермент инулиназа (2,1-р-0-фруктанфруктаногидролаза, КФ 3.3.1.7), специфически гидролизует Р-1,2-связи инулина до фруктозы и фруктоолигосахаридов в более мягких условиях по сравнению с кислотным гидролизом, требующим значительной концентрации ионов водорода, высокой температуы и применения специального кислотоустойчивого оборудования. В этой связи особую значимость приобретают работы по изучению структурно-функциональных свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулинсодержащего сырья, а также ряд теоретических и практических вопросов, связанных с изучением влияния природы носителя на сохранение и поддержание каталитической активности инулиназы.

Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета, входящей в Координационный план научно-исследовательских работ РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными инулиназами из микромицета Aspergillus awamori и дрожжей Kluyveromyces marxianus.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи: разработка методов выделения и очистки инулиназы из Aspergillus awamori и Kluyveromyces marxianus; изучение физико-химических свойств инулиназы из Aspergillus awamori и Kluyveromyces marxianus; определение кинетико-термодинамических параметров реакции гидролиза инулина свободными и иммобилизованными на различных носителях препаратами инулиназ Kluyveromyces marxianus; исследование закономерностей процессов термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы Kluyveromyces marxianus.

Научная новизна. впервые осуществлена иммобилизация инулиназы Kluyveromyces marxianus на гранулярных и волокнистых ионообменниках АВ-16 ГС, АМ-21-А, ВИОНКН-1; установлены оптимальные условия функционирования иммобилизованной инулиназы; обнаружено, что при адсорбционной иммобилизации инулиназы имеет место многоточечное связывание с носителем, приводящее к увеличению значений Кт и АН, уменьшению значений Vmax и AS;

• с помощью дифференциального термического анализа и классических методов исследован процесс термической инактивации свободной и иммобилизованной инулиназы в интервале температур 50-85 "С. Рассчитаны активационные параметры термоинактивации инулиназы (kin, Еакт, АН, AS). Выявлено, что адсорбционный способ иммобилизации инулиназы повышает устойчивость фермента к денатурирующим факторам среды (рН, температура); предложена модель перехода глобула-клубок, включающая промежуточные стадии процесса термического разворачивания белковой молекулы инулиназы; ■ разработаны эффективные методы выделения и очистки инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxianus. Выявлены оптимальные режимы функционирования инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori. Практическая значимость. Результаты диссертационной работы расширяют представления о функционировании инулиназы в свободном и иммобилизованном состоянии, дают информацию о влиянии иммобилизации на процессы термической инактивации ферментов, вносят вклад в исследование механизмов реакций гидролиза инулина. Рассчитанные кинетико-термодинамические параметры реакции гидролиза инулина позволяют прогнозировать поведение свободного и иммобилизованного фермента в технологических условиях. Полученные данные могут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов университетов и высших учебных заведений технологического профиля курсов «Биотехнология», «Химическая энзимология», «Молекулярная биология», «Биофизика».

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); на X Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных процессов»

Воронеж, 2004); конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), 8th Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); IX Conference of Food Microbiology (Lubljana, Slovenia, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 3 статьи и 4 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Разработаны эффективные методы выделения и очистки препаратов инулиназ из дрожжей Kluyveromyces marxianus и микромицета Aspergillus awamori с высокой каталитической активностью.

2. Созданы гетерогенные биокатализаторы на основе инулиназы из Kluyveromyces marxianus, адсорбционно иммобилизованной на АВ-16 ГС, АМ-21-А, ВИОН КН-1, выявлены оптимальные условия их функционирования.

3. Плавление вторичной структуры свободной инулиназы Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку наблюдаются стадии упорядоченная глобула — хаотический клубок и ред промежуточных микросостояний.

4. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы — кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значений термодинамических параметров.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 118 страниц машинописного текста; состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы (118 источников). Иллюстрационный материал включает 23 рисунка, 14 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Таха Абдул Саттар

выводы

1. Разработан эффективный метод выделения и очистки препарата инулиназы из дрожжей Kluyveromyces marxianus, включающий стадии выращивания культуры глубинным способом, осаждения изопропиловым спиртом и гель-хроматографии на сефадексе G-150, который позволил получить гомогенный препарат фермента с 17,9-кратной степенью очистки. Получен препарат инулиназы из микромицета Aspergillus awamori путем осаждения куль-туральной жидкости ацетоном, фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации на сефадексе G-25 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе.

2. Оптимальными условиями ферментативного гидролиза инулина для инулиназ из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori являются: температура катализа 50 °С; рН катализа 4,7; концентрация субстрата 5,4*10"4 моль/л.

3. Предложен адсорбционный способ иммобилизации инулиназ различного происхождения на следующих носителях: промежуточно-основном анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике полистирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Иммобилизованные препараты инулиназ сохраняютт 17,8 %; 14,5 %; 27,5 % активности соответственно, по сравнению с растворимыми формами ферментов.

4. Оптимальная температура гидролиза инулина при адсорбционной иммобилизации во всех случаях повышается на 20 °С; оптимум рН сдвигается вправо на 0,5 единиц; наблюдается увеличение значении Кт и уменьшение Vmax по сравнению с нативной формой фермента.

5. Иммобилизация инулиназы Kluyveromyces marxianus приводит к увеличению значений энергии активации и энтальпии активации гидролиза. Отрицательные значения AS для реакции гидролиза, осуществляемого свободной и иммобилизованной липазой, свидетельствуют о том, что расщепление эфирных связей субстрата характеризуется высокой упорядоченностью.

6. Показано, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы Kluyveromyces marxianus не является кооперативным процессом, поскольку наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

7. Термоденатурация иммобилизованной инулиназы Kluyveromyces marxianus - кооперативный процесс, в котором упорядоченная глобула переходит в состояние хаотического клубка в узком интервале температур и сопровождается резким изменением значения термодинамических параметров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При исследовании структурно-функциональных свойств инулиназы нами была разработана методика получения ферментного препарата из дрожжей Kluyveromyces marxianus и микромицета Aspergillus awamori с высокой степенью очистки. Показано, что оптимальное значение температуры гидролиза инулина ферментами дрожжевого и плесневого происхождения одинаковы (50 °С), но инулиназа Aspergillus awamori обладает более широким диапазоном температур, определяющих скорость расщепления субстрата. При сравнении первичных структур инулиназ Kluyveromyces marxianus и Aspergillus awamori обнаружено, что молекула дрожжевого фермента содержит 15 остатков триптофана, то есть на 2 остатка меньше, чем инулиназа плесени. Данный факт позволяет нам сделать предположение о том, что именно триптофану принадлежит ключевая роль в проявлении инулиназами термостабильности. Показано, что в обоих случаях кинетика реакции гидролиза инулина не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен, кривые A(S) характеризуются наличием изломов, которые могут свидетельствовать о наличии четвертичной структуры у изучаемых ферментов.

Изучение физико-химические свойств инулиназ позволило выявить более выраженную кислотную устойчивость инулиназы Aspergillus awamori по сравнению с препаратом, выделенным из дрожжей, что может быть обусловлено более высоким содержанием остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот в молекуле фермента, выделенного из плесени.

В диссертационной работе продемонстрирована возможность адсорбционной иммобилизации инулиназы на агранулярных и волокнистых носителях: анионообменнике АВ-16-ГС, сильноосновном анионообменнике поли-стирольной природы АМ-21-А и катионообменном волокне ВИОН КН-1. Определены оптимальные условия иммобилизации: рН 4,7; концентрация фермента в растворе 10"5 моль/л; время адсорбции - 1,5 часа. Установлено, что применение волокнистого сорбента приводит к образованию комплекса с наибольшей каталитической активностью (27,5 % активности свободного фермента).

При адсорбционной иммобилизации инулиназы связывание с носителем происходит за счет водородных, электростатических взаимодействий между карбоксильными группами фермента и аминогруппами ионообменни-ков. Иммобилизованные ферментные препараты характеризуются более высокой оптимальной температурой гидролиза инулина (по сравнению со свободным ферментом).

Кинетика реакций гидролиза гетерогенными катализаторами носит более сложный характер, чем для нативного ферментного препарата инулиназы, наблюдается увеличение значений Кт и уменьшение - Утах- Сравнительный анализ значений основных кинетических параметров реакций гидролиза инулина полученными иммобилизованными препаратами инулиназы Kluyveromyces marxianus позволяют заключить, что наибольшее сродство к субстрату проявляет инулиназа, адсорбционно связанная с ионообменным волокном ВИОН КН-1. Очевидно, ионообменное волокно ВИОН КН-1, во-первых, достаточно прочно связывается с инулиназой, обеспечивая более высокую термо- и рН-стабильность белка, во-вторых, нарушения нативной конформации субъединиц инулиназы по сравнению с двумя предыдущими носителями выражены в меньшей степени, поскольку иммобилизованный фермент проявляет достаточно высокую каталитическую способность после взаимодействия с матрицей волокна. Вышеизложенное позволяет рекомендовать ионообменное волокно ВИОН КН-1 для многократного использования в лабораторных и промышленных условиях.

При анализе экспериментальных данных по исследованию термостабильности инулиназы Kluyveromyces marxianus можно сделать предположение о частичном разрушении под воздействием температуры слабых электростатических и, возможно, водородных связей, поддерживающих кон-формацию белковой молекулы, что сопровождается потерей гидролитической активности фермента.

Показано, что действие высоких температур на препарат инулиназы сопровождается увеличением ЕаКт, АН*, AS* реакции гидролиза инулина до фруктозы. Графики Аррениуса для определения энергии активации характеризуются наличием излома, указывающего на протекание последовательной реакции катализа.

Отрицательные значения AS* для реакции гидролиза инулина свидетельствуют, что реакция гидролиза инулина протекает с большой скоростью и характеризуется высокой упорядоченностью. Возрастание AS* при увеличении температуры связано с переходом молекул инулиназы из упорядоченной глобулы в хаотический клубок. Небольшие значения изменения AS указывают на преимущественное разрушение слабых связей (водородных и электростатических), приводящее к наименьшей потере каталитической активности.

Обнаружено, что кривая процесса термической денатурации изучаемого ферментного препарата инулиназы характеризуется наличием двух эндотермических пиков, имеющих различные площади. Выявлено, что наблюдаемая температура, соответствующая минимуму первого пика кривой, составляет 54 °С; второго - 65 °С.

Исследование термостабильности инулиназы, кинетико-термодинами-ческих параметров термоинактивации, а также дифференциальный термический анализ конформационных переходов в белковой глобуле позволяет представить разворачивание молекулы фермента под действием высоких температур как промежуточное состояние в виде «расплавленной глобулы», в которой не сохраняется уникальная упаковка боковых групп. В расплавленной глобуле они приобретают свободу движений, теряют энергию плотного контакта. При этом наблюдаются локальные флуктуации, распад большинства дальних по цепи контактов.

Следовательно, сравнение данных по исследованию термостабильности препарата инулиназы, кинетико-термодинамических параметров термоинактивации и дифференциального термического анализа позволяет заключить, что плавление вторичной структуры свободной инулиназы не является кооперативным процессом и наблюдается прохождение стадий упорядоченная глобула-расплавленная глобула-хаотический клубок и промежуточных микросостояний.

Анализируя данные по термоустойчивости свободной и иммобилизованной инулиназы, полученные посредством ДТА и классическими методами, можно сделать заключение, что кривая ДТА для иммобилизованной инулиназы отличается «сглаженностью» эндотермических пиков. Если для свободной инулиназы наблюдалось два пика, то в случае иммобилизованного фермента наличие одного пика соответствует температуре полной инактивации. Следовательно, при инактивации иммобилизованной инулиназы промежуточные стадии между полностью развернутой и упорядоченной формами молекулы отсутствуют. При термоинактивации адсорбционно связанной с носителем белковой молекулы степень упорядоченности главной цепи полностью сохраняется. Расплавленной глобулы, в которой наблюдаются локальные перестройки при отдельных температурах, при иммобилизации не наблюдается.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Таха Абдул Саттар, 2005 год

1. Абелян В А. Характеристика экзо-инулиназ Kluyveromyces marxianus и Bacillus lichenioformis / ВА. Абелян, Л.С. Манукян / Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 61, №6. - С. 1028-1036.

2. Александровский Я.А. Ферментный датчик для определения глюкозы / Я.А. Александровский, П.К. Агасян, A.M. Егоров // Журн. аналит. химии. 1978. - Т. 33, №9. - С. 1833-1837.

3. Беленький Д.М. Особенности ферментативного гидролиза а-1,4-глюкозидных связей / Д.М. Беленький // Успехи биол. химии. 1971. - Т. 34, вып. 12. - С. 164-181.

4. Березин И.В. Новый тип носителя для разделения биологических смесей / И.В. Березин, А.А. Карякин // Инженерная энзимология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 60-61.

5. Биосинтез ферментов грибами рода Ризопус / А.Я. Панкратов, Л.В. Антипова, Г.П. Шуваев и др. // Воронеж: Изд-во Воронеж, ун-та, 1993. -183 с.

6. Блиева P.K. Синтез гидролитических ферментов иммобилизованными микромицетами / Р.К. Блиева // Инженерная энзимология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 61-62.

7. Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма / А.Е. Браунштейн. М. : Наука, 1987. - 546 с.

8. Бреслер С.Е. Введение в молекулярную биологию. М.: Наука, 1966.-512 с.

9. Волькенштейн М.В. Биофизика. М.: Наука, 1981. - 575 с.

10. Влияние активаторов на структурно-функциональные связи иммобилизованной нулазы / Т.А. Ковалева и др. // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования : материалы второго междуно-род. симп. Пущино, 1997. - Т.2. - С.48-50.

11. Вольф М. Лечение ферментами / М. Вольф, К. Рансбергер. М. : Мир, 1976.-231 с.

12. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов / И.П. Галич. Киев : Нау-кова думка, 1987. - 192 с.

13. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб М. : Мир, 1982. - Т. 1.-389 с.

14. Блинов Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Блинов. СПб. : Наука, 1995.-600 с.

15. Ермолаев М.В. Биологическая химия / М.В. Ермолаев. М. : Медицина, 1978.-320 с.

16. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности / Н.А. Жеребцов. М. : Легкая и пищ. пром-сть, 1984. - 160 с.

17. Землянухин А.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений : учеб. пособие / А.А. Землянухин, Л.А. Землянухин. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1996. - 188 с.

18. Иммобилизованные клетки и ферменты / под ред. Дж. Вудворда. -М. : Мир, 1988.-206 с.

19. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др.. М. : Высш. шк., 1987. - 159 с. - (Биотехнология : в 8 кн. : учеб. пособие для ВУЗов ; кн. 7).

20. Иммобилизованные ферменты. Современное состояние и перспективы / под ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, К. Мартинека. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. - Т. 1. - 296 с.

21. Ионообменные методы очистки веществ / под ред. Г.А. Чикина, О.Н. Мягкого. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1984. - 372 с.

22. Использование дрожжевых инулаз для гидролиза растительного сырья / В.Л. Куев и др. // Достижения биотехнологии агропромышленному комплексу : тез. докл. Всесоюз. конф. - Черновцы, 1991. - Т. 1. - С. 141.

23. Исследование глюкоамилазы с использованием хроматографиче-ских методов / Чикин Г.А. и др. // Хроматография в биологии и медицине : тез. докл. 1 Всесоюз. конф. М., 1983. - С. 186.

24. Кантор Ч. Биофизическая химия / Ч. Кантор, Р. Шиммел. М. : Мир, 1979.-280 с.

25. Квеситадзе Г.И. Грибные и бактериальные амилазы / Г.И. Квеси-тадзе. Тбилиси : Мецниерба, 1984. - 154 с.

26. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М. : Мир, 1990. - 350 с.

27. Кестнер А.И. Иммобилизованные ферменты / А.И. Кестнер // Успехи химии. 1974. - № 8. - С. 1480-1511.

28. Кинетика и термодинамика реакции гидролиза синтеза ацетил-L-метионина, катализируемой ацилазой I свиной почки / В.К. Швядас и др. // Биохимия. - 1980. - Т. 50, вып. 10. - С. 1833-1835.

29. Ковалева Т.А. Иммобилизация инулазы на ионообменных смолах / Т.А. Ковалева, В.Ф. Селеменев, Е.В. Небольсина // Кислотно-основный и температурный гомеостаз: физиология биохимия и клиника : межвуз. сб. науч. тр. Сыктывкар, 1994 . - С. 103-108.

30. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинами-ческие аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами : автореф. дис. . д-ра биол. наук / Т.А. Ковалева. Воронеж, 1998. - 48 с.

31. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов / Ю.Ю. Кулис. Вильнюс : Мокслас, 1981. - 200 с.

32. Кулис Ю.Ю. Создание и внедрение в производство амперометри-ческих электродов / Ю.Ю. Кулис, В.А. Лауринавичюс // Инженерная энзи-мология : материалы VI Всесоюз. симп. Вильнюс, 1988. - Ч. 1. - С. 142143.

33. Кушнер В.П. Конформационная изменчивость и денатурация биополимеров. -Л.: Наука, 1977. -274 с.

34. Кяйвяряйнен А. И. Динамическое поведение белков в водной среде и их функции. Л. : Наука, 1980. - 272 с.

35. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер. М. : Мир, 1985.-Т. 1.-329 с.

36. Логинова Л.Г. Новые формы термофильных бактерий / Л.Г. Логинова, Л.А. Егорова. М. : Наука, 1977. - 175 с.

37. Мартинек К. Иммобилизованные ферменты / К. Мартинек. М. : 1984.- 100 с.

38. Морозов В. М. Структурно-функциональный анализ аминокислотных последовательностей через Internet // Молекулярная биология. 1996. -Т. 30, вып. 2. - С. 387-393.

39. Мустафаев P.M. Биосинтез и некоторые физико-химические свойства инулазы Aspergillus awamori BKMF 808 : автореф. дис.канд. биол. наук. Воронеж, 1991. - 24 с.

40. Номенклатура ферментов / под ред. А.Е. Браунштейна. М. : ВИНИТИ, 1979.-320 с.

41. Об особенностях строения активного центра и механизм действия инулазы / Т.А. Ковалева и др. // Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов : материалы международ, симп. Воронеж, 1995. - С. 68-72.

42. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. -М. : Просвещение, 1987. 815 с.

43. Поляновский О.Л. Роль функциональных групп белка в ферментах. / О.Л. Поляновский // Ферменты. М., 1964. - С. 101-117.

44. Попова Т.Н. Основные принципы выделения и очистки ферментов / Т.Н. Попова. Воронеж, 1995. - 38 с.

45. Розенфельд Е.А. Специфичность и механизм действия гликозиза-даз / Е.А. Розенфельд // Механизм и кинетика ферментативного катализа. -М., 1964.-С. 158-169.

46. Савельев В.Р., Сергеев В.Р., Фирсов Л.М. Изучение активного центра глюкоамилазы из Asp. awamori // Биохимия. Т. 10, № 5. - С. 390396.

47. Сергеев В.Р., Фирсов JI.M. Анализ модели для глюкоамилазы из Asp. awamori с помощью ингибиторов // Биохимия. 1985. - Т. 50, №2. -С. 300-306.

48. Синицын А.П. Иммобилизованные клетки микроорганизмов / А.П. Синицын. М. : Изд-во Моск. ун-та, 1994. - 126 с.

49. Сорбционные и хроматографические препаративные методы разделения микробных ферментов / JI.K. Шатаева и др. // Биотехнология. -1988.-Т. 4, №6. -С. 745-759.

50. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков: учебник для биол. спец. вузов / В.М. Степанов ; под ред. А.С. Спирина. М. : Высш. шк., 1996. - 334с.

51. Тертычная Т.Н. Исследование биосинтеза и некоторых физико-химических свойств инулазы Aspergillus awamori BKMF 2250 : автореф. дис.канд. биол. наук. Воронеж, 1994. - 24 с.

52. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен. М. : Мир, 1983.-213 с.

53. Уэндлант У. Термические методы анализа. М.: Мир, 1978. - 513 с.

54. Фениксова Р.В. Получение концентрированных ферментных препаратов / Р.В. Фениксова. М. : ЦИНТИ Пищепром, 1960. - 154 с.

55. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М. : Мир, 1980.-432 с.

56. Финкелынтейн А.В. Физика белка / А.В. Финкельштейн, О.Б. Птицын. М. : Кн. дом «Университет», 2002. - 376 с.

57. Фримантл М. Химия в действии / М. Фримантл. М. : Мир, 1991. -582 с.

58. Хорлин А .Я. Активные центры карбогидраз / А.Я. Хорлин // Структура и функции активных центров ферментов. М., 1974. - С. 39-69.

59. Чернавский Д.С. Белок машина. Биологические макромолекулярные конструкции / Д.С. Чернавский, Н.М. Чернавская. -М„ 1999. - С. 775-781.

60. Шульц Г. Принципы структурной организации белков / Г.Шульц, Р. Ширмер. М. : Мир, 1982. - 369 с.

61. Энциклопедия полимеров. М. : Сов. энциклопедия, 1972. - Т. 1. -860 с.

62. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа / В.А. Яковлев. -М. : Наука, 1985.-248 с.

63. Allais J. Continuous production of ethanol with Zymomonas mobilis growing on Jerusaleum artichoke juice / J. Allais, E. Torres // Biotechnol Bio-eng. 1987. - Vol. 29, № 6. - P. 778-782.

64. Characterization of the high-molecular weight of fructan isolated from garlic (Allium Sativum L.) / S. Baumgartner et al. // Carbohydrate Research. -2000-Vol. 328-P. 177-183.

65. Chibata I. Industrial application of immobilized enzyme system / I. Chibata // Pure and Appl. Chem. 1978. - Vol. 50, №7. - P. 667-675.

66. Cho Y. Purification and characterization of an endoinulinase from Xanthomonas orysae / Y. Cho, J.Yun // Process Biochemistry. 2002 - Vol. 37, № 5. - P. 1325-1331.

67. Claassens G. Purification and propeties of on unulinase from chicory roots (Cichorium intibus) / G. Claassens, A. Van Laere, M. De Proft // J. Plant. Physiol. 1990. - Vol. 136, № 1. - P. 35-39.

68. Cloning and sequencing of the inulinase gene of Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 12424 / O. Laloux et al. // Federation of European Biochemical Societies. 1991 - Vol. 289, № 1 - P. 64-68.

69. Continuous production of fructoce syrups from inulin by immobilized inulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1995. - Vol. 80, № 2. - P. 164-169.

70. Chibata J., Tosa T. Industrial applications of immobilized enzymes and immobilized microbic cells // Appl Biochem Microbiol. 1976. - P. 325357.

71. Ettalibi M. Molecular and kinetic properties of Aspergillus ficium inu-linases / M. Ettalibi, J. Baratti // Agr. and Biol. Chem. 1990. - Vol. 54, № 1. -P. 61-68.

72. Evolution of inulinase production by Kluyveromyces bulgaricus ATTC 16045 / S. Kalil et al. // Enpromer'99 P : II Congresso de Engenharia de processos do Mercosul, 30 de Agosto a 02 de Setembro de, 1999. Florianopo-lis; Santa Catarina; Brasil, 1999.

73. Falb R. Covalent bonding of protein to solid surfaces / R. Falb, G. Grode //Federation Proceedings. 1971. - Vol. 30, № 5. - P. 1688-1691.

74. Gavel D. Fluorescence investigation of immobilized enzymes / D. Gavel // Biotechnol Bioeng. 1974. - Vol. 2, № 2. - P. 165-168.

75. Hamdy H. Purification and some important characters of extracellular inulinase of Alternaria alternata (Fr.) / H. Hamdy // Indian J Exp Biol. 2002. -Vol. 40, № 12. - P. 1393-1398.

76. Hoschke A. A study of the role of histidine side chains at the active center of anxiolytic enzymes / A. Hoschke, E. Laslo, J. Hollo // Biol. Chem. -1980. - Vol. 81, № 1. - P. 145-156.

77. Impact of tryptophan residues of Humicola lanuginosa lipase on its thermal stability / K. Hsu et al. // Biochim Biophys Acta. 2001. - Vol. 1547, №2. -P. 329-338.

78. Kim C. Ethanol production Jerusaleum artichoke by inulinase and Zymomonas mobilis / C. Kim, S. Rhee // Appl. Biochem Biotechnol. 1990. -Vol. 23, №2.-P. 171-180.

79. Kim W. Hydrolysis of inulinum from Jerusalem artichoke by inulase immobilized on aminoethylcellulose / W. Kim, S. Byun // Enzyme Microb. Technol. 1982. - Vol. 4, № 2. - P. 239-244.

80. Kovaleva T.A. Immobilization of amylolytic enzymes on the iones changing rosins / T.A. Kovaleva, V.F. Selemenev, G.V. Shmyreva // Molecular order and mobility in polimer system: abstr. 2 nd International symposium. S. Petersburg, 1996.-P. 158-164.

81. Kusunoki M. X-ray structure and catalytic mechanism of taka-amylase A / M. Kusunoki, Y. Matsura // J. Sap. Soc. Starch. Sci. 1983. - Vol. 30, № 2. P. 141-147.

82. Laoux D. Purification and partial characterization of the inulinase of Klyveromyses fragilis / D. Laoux, J. Delcour, J. Vandenhaute // Arch. int. physiol. et biochim. 1989. - Vol. 97, № 6. - P. 161-165.

83. Leon A. Utilization of enzyme mixtures to retard bread crumb firming 1 A. Leon et al. // J Agric Food Chem. 2002. - Vol. 58, № 6. - P. 1416-1419.

84. Mijmoto K. On the insolubilized enzyme activities using adsorbents ionexchangers / K. Mijmoto, T. Fujii, J. Miura // J. Ferment. Technol. 1971. -Vol. 49.-P. 565-573.

85. Molecular Cloning and Sequence Analysis of an Endoinulinase Gene from Penicillium sp. Strain TN-88 / H. Akimoto et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000 - Vol. 64, № 11. - P. 2328-2335.

86. Molecular cloning and sequence analysis of two endoinulinase genes from Aspergillus niger / K. Ohta et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998 -Vol. 62, №9.-P. 1731-1738.

87. Nakamura T. Action and production of inulinase / T. Nakamura, S. Nakatsu // J. Jap. Soc. Starch. Sci. 1988. - Vol. 35, № 2. - P. 121-130.

88. Nakamura T. Action and production of inulinase / T. Nakamura, S. Nakatsu // J Jap Soc Starch Sci. 1988. - Vol. 35, № 2. - P. 121-130.

89. Occurrence of two forms of extracellular endoinulinase from Aspergillus niger mutant 817 / T. Nakamura et al. // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84, № 4. - P. 313-318.

90. Ohta K. Purification and properties of an Extracellular inulinase from Rhizopus sp. Strain TN-96 / K. Ohta, N. Suetsugu, T. Nakamura // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2002 - Vol. 94, № 1. - P. 78-80.

91. Oiwa H. Acetonobutanol production from Dahlia inulin by Clostridium pasterianum / H. Oiwa, M. Naganuma, S. Ohnima // Agr Biol Chem. -1987. Vol. 51, № 10. - 2819-2820.

92. Perutz M. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M. Perutz// Nature. 1970. -Vol. 277, № 9. - P. 17041-17047.

93. Pessoa A. Inulinase from Kluyveromyces marxianus. Culture medium composition and enzyme extraction / A. Pessoa, M.Vitolo // Braz. J. Chem. Eng. 1999 - Vol. 16, № 3. p. 324-340.

94. Pessoa A. Inulinase from Kluyveromyces marxianus: culture medium, composition and enzyme extraction / A.Pessoa, M.Vitolo // Braz J Chem Eng. -1999.-Vol. 16, №3.-P. 21-28.

95. Pessoni R. Extracellular inulinases from Penicillium janczewskii, a fungus isolated from the rhizosphere of Vernonia herbacea (Asteraceae) / R.

96. Pessoni, R. Figueiredo-Ribeiro, M. Braga. // J Appl Microbiol. 1999 - Vol. 87 -P. 141-147.

97. Production, purification and characterization of an extracellular inuli-nase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / R. Kushi et al. / Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 2000. - Vol. 25. - P. 63-69.

98. Production, purification and properties of an endoinulinase of Penicil-lum sp. TN-88 that Liberates inulotriose / T. Nakamura et al. / Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. - Vol. 84, № 4. - P. 313-318.

99. Purification and characterization of an exoinulinase from Aspergillus fumigatus / L. Zhang et al. // Appl Biochem Biotechnol. 2004. - Vol. 117, № 1. - P. 19-32.

100. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / L. Zhang et al. // Protein Expression and Purification. 2004. - P. 1121-1127.

101. Purification and characterization of inulinase from Aspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris / W. Jing et al. // Curr Microbiol. 2003. -Vol. 47, №2.-P. 109-112.

102. Purification and Properties of an Extracellular Exoinulinase from Penicillium sp. Strain TN-88 and Sequence Analysis of the Encoding Gene / S. Moriyama et al. //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. - Vol. 66, № 9, p. 1887-1896.

103. Purification, characterization, gene cloning and preliminary X-ray data of the exo-inulinase from Aspergillus awamori / M. Arand et al. // Bio-chem.J. 2002. - Vol. 362. - 131-135.

104. Quiroga E. Purification and characterization of the invertase from Pycnoporus sanguineus / E. Quiroga, M. Vattuone M, A.Sampietro // Biochim Biophys Acta. 1995. - Vol. 1251, № 2. - P. 75-80.

105. Recent developments in microbial inulinases. Its production, properties, and industrial applications / A. Pandey et al. // Appl Biochem Biotechnol. 1999.-Vol. 81.-P. 35-52

106. Refined molecular structure of pig pancreatic a-amylase at 2,1 A resolution / S.B. Larson et. al. // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 235, № 5. - P. 1560-1584.

107. Schuleit M. Enzyme immobilization in silica-hardened organogels / M. Schuleit, P. Luisi // Biotechnol Bioeng. 2001. - Vol. 72, № 2. - P. 249253.

108. Screening for microorganismus that produce only endo-inulinase / R. Gern et al. //Appl Microbiol Biotechnol. 2001. - Vol. 55. - P. 632-635.

109. Selvakumar P. Comparative studies on inulinase synthesis by Staphylococcus sp. And Kluyveromyces marxianus in submerged culture / P. Selvakumar, A. Pandey // Bioresource Technologiy. 1999. - Vol. 69. - P. 123127.

110. Seon B. Analysis of disulfide preparation of its reduced carboxy-methylated derivative / B. Seon, H. Toda, K. Narita // Biochem. 1975. - Vol. 58, № 4. - P. 348-356.

111. Shuichi O. Immobilization of endo type inulinase with К - carra-geenin and characterization of the immobilized enzyme / O. Shuichi, S. Nario // J. Coll. Dairing. - 1989. - Vol.14, № 1. - p. 17-21.

112. The calcium requirement for stability and enzymatic activity of two isoforms of barley aleurone a amylase / D. Bush et al. // J Biol Chem. -1989. - Vol. 264, № 32. - P. 19392-19398.

113. Tredberg F. NMR spectra for distinguishing a- and p-amylase action / F. Tredberg, A. Turner, C. Storm // Naturwissenschaften. 1985. - Vol. 72, № 19. - P. 486-487.

114. Xiao R. Purification and some properties of endoinulinase from Chrysosporium pannorum / R. Xiao, M. Tanida, S. Tokao // J. Ferment. Tech-nol. 1989. - Vol. 67, № 4. - P. 244-248.

115. Yacon (Polimnia sanchifolia) extract as a substrate to produce inuli-nase by Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / M. Cazetta et al. // J. Food Engineering. 2004. - Vol. 1. - P. 129-138.

116. Zitton L. Enzymatic hydrolysis of inulin and alternative way to fructose production // Die Starche. 1981. - Vol. 33, №11.- P. 373-377.