Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.16, кандидат биологических наук Торгашина, Ирина Геннадьевна

• Торгашина, Ирина Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Торгашина, Ирина Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическое тестирование в экологическом мониторинге.

1.1.1. Задачи биологического мониторинга.

1.1.2. Биологическое тестирование водных объектов.

1.2. Биолюминесцентные биотесты.

1.2.1. Биотесты основанные на светящихся бактериях.

1.2.2. Биотесты, основанные на использовании ферментативных реакций светящихся бактерий.

1.2.3. Характеристика тест-объекта - ферментов светящихся бактерий.

1.3. Использование иммобилизованных ферментов в биотестировании.

1.3.1. Методы иммобилизации биолюминесцентных систем.

1.3.2. Преимущества и недостатки различных способов иммобилизации биолюминесцентных систем.

1.3.3. Гели на основе крахмала и желатина - носители для иммобилизации биолюминесцентной биферментной системы.

1.4. Обоснование задачи.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Методы получения иммобилизованных ферментов.

2.3. Измерение активности биолюминесцентных биотестов.

2.4. Методы определения чувствительности биолюминесцентных биотестов к действию модельных поллютантов и сточных вод целлюлозно-бумажного комбината.

2.5. Определение кинетических параметров биолюминесцентных биотестов.

2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Разработка биотеста на основе иммобилизованной биферментной системы светящихся бактерий.

3.1.1. Выбор условий иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза.

3.1.2. Особенности катализа иммобилизованными ферментами биферментной системы светящихся бактерий.

3.1.3. Зависимость чувствительности иммобилизованной биферментной системы к сульфату меди от состава реакционной смеси.

3.1.4. Создание многокомпонентного иммобилизованного реагента.

3.2. Подбор условий проведения ферментативного биотестирования с использованием многокомпонентного иммобилизованного реагента.

3.2.1. Влияние рН реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.2.2. Влияние ионной силы реакционной смеси на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.2.3. Влияние температуры на активность ферментативных биолюминесцентных реагентов.

3.3. Анализ чувствительности иммобилизованных ферментативных реагентов для экологического биолюминесцентного биотестирования.

3.3.1. Подбор методики биолюминесцентного анализа с использованием иммобилизованной биферментной системы.

3.3.2. Исследование чувствительности иммобилизованной биферментной системы к действию модельных поллютантов.

3.3.3. Исследование влияния сточных вод Енисейского целлюлозно-бумажного комбината на биолюминесцентную реакцию, катализируемую биферментной системой НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование чувствительности иммобилизованного ферментативного реагента для экологических биолюминесцентных тестов»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время для решения различных задач экологического мониторинга используется более 200 методов биологического тестирования. В биотестах контролируется влияние факторов токсичности среды на такие параметры жизнедеятельности живых организмов как летальный исход, скорость роста, интенсивность дыхания и другие параметры жизнедеятельности, в основе которых лежат разнообразные метаболические процессы. Наряду с биотестами, где в качестве тест-объектов используются живые организмы, такие как бактерии, простейшие, водоросли и др., в последнее время в биотестах для экологического мониторинга широко используются разные ферментативные системы, отвечающие за важнейшие функции живых организмов. Очевидными преимуществами так называемых ферментативных биотестов является их высокая чувствительность, экспрессность, но главное - высокая надежность и точность анализа по сравнению с тестами с использованием живых объектов с постоянно меняющимися характеристиками. Такой подход дает возможность не только определить степень загрязнения окружающей среды, но и понять механизмы действия тех или иных токсикантов на живые организмы в экосистеме. Однако примеров ферментативных биодатчиков для контроля за токсичностью природных и сточных вод в настоящее время можно привести только два. Это датчик, созданный на основе холинэстеразы, а также ферментативные биотесты с использованием моноферментной и биферментной систем светящихся бактерий.

Новое направление биолюминесцентного анализа - люциферазные биотесты - было предложено и развивается в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН с использованием биолюминесцентных реакций бактерий (Кратасюк, 1994; Kratasyuk, 1990). Были найдены условия для конструирования биолюминесцентных ферментативных биотестов по заказу их пользователя под определенные задачи и с требуемыми характеристиками, например, для определения цветения водоемов, чувствительностью на уровне ПДК, высокой точностью, временем анализа -не более 5 минут и другими характеристиками (Есимбекова, 2000).

Однако широкое использование ферментов светящихся бактерий в качестве тест-объектов в биотестах имеет некоторые ограничения и недостатки по сравнению с общепринятыми биотестами, так как анализ проводят на растворимой смеси ферментов: НАДН: ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы. Разные партии реагентов (лиофилизованных препаратов этих ферментов) различаются по своим характеристикам, к тому же ферменты в растворах достаточно быстро теряют свою активность во время измерений. Это является причиной дороговизны и невысокой точности при длительном (например, ежедневно в течение месяца) использовании люциферазных биотестов в экологическом мониторинге. Наряду с нестабильностью препаратов ферментов при использовании и хранении, а также при различных воздействиях (повышенных температурах, экстремальных значениях рН и т.д.) по сравнению с тестом на бактериях, метод более сложный, так как в одном измерении надо дозировать 5 компонентов реакционной смеси (раствор ферментов, альдегида, ФМН, НАДН и буферный раствор).

Решение вышеизложенных проблем возможно при изучении возможности замены лиофилизованных и растворимых ферментов на иммобилизованный препарат. Однако успех получения такого препарата определяется выбором подходящего носителя и метода иммобилизации. В настоящее время предложено более десятка способов и носителей для иммобилизации ферментов светящихся бактерий (Kratasyuk, Esimbekova, 2003). Среди них наиболее перспективными для получения иммобилизованного реагента для экологических биотестов являются методы включения ферментов в полимерные гели, так как они позволяют создать оптимальное микроокружение для ферментов, и тем самым сохранить их высокую каталитическую активность и обеспечить стабильность препаратов при длительном хранении. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы. В качестве носителей для иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий могут быть выбраны гели различной природы: желатиновый и крахмальный. Выбор крахмального геля, как полисахарида, обусловлен его нетоксичностью и нейтральностью. В то же время использование желатинового геля, как белкового носителя для иммобилизации биферментной системы, позволяет понять закономерности функционирования ферментов in vivo, поскольку многие ферменты в клетке функционируют в тесном контакте с другими ее компонентами, в частности с липидами и белками. Более того, крахмал и желатин являются относительно дешевыми реактивами, а процедура иммобилизации ферментов в гели не трудоемка, что немаловажно с точки зрения коммерциализации полученных реагентов. Все это доказывает, что при иммобилизации люциферазы в гели возможно получение стабильного, удобного в использовании и дозированного реагента, включающего все необходимые компоненты для биолюминесцентных ферментативных биотестов.

Необходимым этапом для разработки чувствительных биодатчиков на основе иммобилизованных ферментов НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и успешного использования разработанных биодатчиков в экологическом мониторинге является исследование влияния полимерной матрицы на активность и чувствительность ферментов, кинетико -термодинамические параметры, а также особенности взаимодействия ферментов с субстратами и ингибиторами.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Исследование взаимодействия ферментов и субстратов в гелевом окружении в зависимости от условий иммобилизации для создания многокомпонентного иммобилизованного реагента, предназначенного для ферментативного биотестирования при проведении экологического мониторинга водных систем.

Основные задачи исследования:

1. Изучение условий иммобилизации биферментной системы светящихся бактерий для разработки реагента, обеспечивающего высокую чувствительность к действию поллютантов.

2. Сравнение фермент-субстратных взаимодействий в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза для понимания условий работы реагента в биолюминесцентных ферментативных биотестах.

3. Сравнение чувствительности растворимого и иммобилизованного реагента к действию антропогенных поллютантов с целью разработки нового ферментативного биотеста с использованием иммобилизованного реагента.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучено взаимодействие ферментов и субстратов при совместной иммобилизации ферментов (НАДН:ФМН-оксидоредуктазы и люциферазы) и субстратов (тетрадеканаль, ФМН и НАДН). Проведено сравнение влияния полимерных носителей различной природы на чувствительность и активность биферментной системы светящихся бактерий. Изучены механизмы стабилизации смесей ферментов и субстратов при смене микроокружения в различных условиях (температура, рН и т.д.). Получены зависимости чувствительности люциферазных биотестов от условий иммобилизации.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые разработан многокомпонентный иммобилизованный реагент для экологических ферментативных биотестов, отличающийся следующими преимуществами: простота проведения анализа, высокая стабильность при хранении и использовании, а также при воздействии повышенных температур, экстремальных значений рН и т.д. На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического мониторинга водных экосистем и других видов мониторинга. Метод и реагент пригодны для использования, как в лабораторных, так и в полевых условиях.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Многокомпонентный иммобилизованный дозированный реагент для биолюминесцентных ферментативных биотестов: условия получения и применения в экологическом мониторинге водных экосистем.

2. Фермент-субстратные взаимодействия в иммобилизованной и растворимой биолюминесцентной биферментной системе: НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза как основа для увеличения чувствительности ферментативных биотестов.

3. Сравнительный анализ чувствительности экологических ферментативных биотестов с использованием растворимого и иммобилизованного реагента.

4. Новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга с использованием иммобилизованного многокомпонентного реагента.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на 41-ой Международной научной студенческой конференции, «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); 11-ой Всероссийской студенческой научной конференции «Экология и проблемы защиты окружающей среды» (Красноярск, 2004); Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков «Физика и Эйнштейн» (Красноярск, 2005); Всероссийской научной конференции «Современные аспекты экологии и экологического образования» (Казань, 2005); IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005); Школе-конференции «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Социально-экологические проблемы природопользования в центральной Сибири» (Красноярск, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 10 тезисов и материалов конференций.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, главы с изложением результатов работы, заключением, выводов и списка литературы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 16 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 124 источника, в том числе 65 - зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Экология», Торгашина, Ирина Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия получения многокомпонентного иммобилизованного дозированного реагента для экологического мониторинга водных систем, включающего ферменты (НАДН:ФМН-оксидоредуктазу и люциферазу) и субстраты (тетрадеканаль, НАДН) биферментной системы светящихся бактерий. Реагент не требует специальных условий хранения и сохраняет 100 % активности в течение 2-х лет.

2. При иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в крахмальный и желатиновый гели наблюдается повышение устойчивости ферментов к химическим и физическим факторам среды: рН-оптимум расширяется как в кислую, так и щелочную области, повышается устойчивость ферментов к высоким концентрациям солей, а также термостабильность.

3. Иммобилизация биферментной системы в крахмальный и желатиновый гели не приводит к существенной потери чувствительности ферментативных реагентов к действию модельных токсических веществ. Увеличение чувствительности иммобилизованного многокомпонентного реагента достигается варьированием состава реагента и выбором носителя для иммобилизации.

4. Предложен новый подход для создания ферментативных биотестов для экологического и других видов мониторинга, заключающийся в использовании иммобилизованного многокомпонентного реагента, позволяющего оптимизировать проведение ферментативного биотестирования.

87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов иммобилизации ферментов без существенной потери их активности имеет неоценимое значение для развития как энзимологических исследований фундаментального характера, так и создания новых ферментативных аналитических методов и конструирования биологических датчиков.

В работе показано, реагенты, полученные путем иммобилизации биферментной системы, обладают рядом несомненных преимуществ по сравнению с растворимыми препаратами ферментов: они сохраняют свою стабильность в более широком температурном диапазоне, являются более устойчивыми к изменению химического окружения (например, рН или ионной силы), хранятся в течение длительного времени без обеспечения специальных условий хранения.

С точки зрения тиражирования иммобилизованных реагентов немаловажным является факт простоты процедуры иммобилизации и дешевизна используемых носителей (крахмала и желатина). Более того, применение иммобилизованных препаратов, включающих помимо ферментов также субстраты биферментной системы, позволяет максимально упростить процедуру проведения анализов. На основе иммобилизованного реагента разработан новый подход для создания ферментативных датчиков для экологического биолюминесцентного биотестирования и различных видов мониторинга. Метод и реагент пригоден для использования, как в лабораторных, так и в полевых условиях. Таким образом, полученный реагент имеет коммерческую значимость.

Данная работа показывает одно из возможных применений иммобилизованной биферментной системы: экологический мониторинг сточных вод промышленных предприятий. В тоже время, реагент может служить основой создания биологической части биолюминесцентного биосенсора. Несомненно, направление создания иммобилизованных сенсоров весьма перспективно и востребовано в различных областях человеческой деятельности: в том числе в медицинских исследованиях, пищевой промышленности для анализа качества пищевых продуктов, аналитической биохимии для анализа активности различных ферментов и их субстратов и т.д.

В заключение автор выражает искреннюю признательность своему руководителю и наставнику Кратасюк Валентине Александровне, а также своему учителю и научному консультанту за руководство работой Есимбековой Е.Н., за участие в обсуждении результатов Кудряшевой Н.С.

86

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Торгашина, Ирина Геннадьевна, 2007 год

1. Артюхова В.И. Мониторинг вод рек Подмосковья методами биотестирования / В.И. Артюхова, А.Г. Дмитриева, Е.Ф. Исакова, В.Е. Ларин, А.И. Утинцев, О.Ф. Филенко // Вод. ресурсы., 1991.-N 1. - С. 115-121.

2. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко, А.В. Левашов, К. Мартинек // В 8 кн.Биотехнология; М.: Высшк. шк, 1987.- 159 с.

3. Болдырева Н.М. Метод биотестирования сточных и природных вод на культуре инфузорий / Н.М. Болдырева // Методы биотестирования вод. -Черноголовка, 1988. С. 42-43.

4. Брагинский Л.П. Интегральная токсичность водной среды и ее оценка с помощью методов биотестирования / Л.П. Брагинский // Гидробиол. журн., 1993.-Т. 29,N6.-С. 66-73.

5. Бузинова Н.С. Патологические изменеия активности пищеварительных ферментов рыб / Н.С. Бузинова // Теоретические проблемы водной токсикологии. Норма и патология. М.: Наука, 1983. - С. 131-137.

6. Васьковец Л.А. Биотестирование закисленных вод по пассивным электрическим параметрам крови рыб / Л.А. Васьковец, А.Н. Крайнюкова // Охрана вод реч. бассейнов Харьков, 1987. - С. 153-156.

7. Григорьев Ю.С. Оперативные методы и аппаратура для биоиндикации и биотестирования загрязнения окружающей среды. / Ю.С. Григорьев // Вестн. Хакас, гос. ун-та. Сер. 4. 1997. - N 4. - С. 60-62.

8. Гиль Т.А., Балаян А.Э., Стом Д.И. Гашение люминесценции светящихся бактерий как тест для оценки токсичности фенольных компонентов стоков / Т.А. Гиль, А.Э. Балаян, Д.И. Стом //Микробиология, 1983.-Т.52,N6.-С. 1014-1016.

9. Гиль Т.А. Элиминирование хинонов из водных сред фенолами и влияние их смесей на люминесценцию бактерий Vibrio harvey / Т.А. Гиль,

10. B.И. Нечаева, А.Э. Балаян, Г.В. Шахова // Биолог, науки: МГУ, 1985. N1.1. C. 58-62.

11. Гроздов А.О. Использование морских инфузорий для биотестирования донных грунтов / А.О. Гроздов // Вод. токсикол. и оптимиз. биопродукц. процессов в аквакультуре. М., 1988. - С. 53-57.

12. Джунковская И.П. Действие продукта окисления керогена на рост и люминесценцию Photobacterium fischeri / И.П. Джунковская, В.И. Сухаревич, В.Е. Шкинке, Л.А. Виестуре // Микробиология, 1985. Т.54, N1. - С. 89-92.

13. Диунов А.Г. Качество природных вод реки Волги в пределах города Ярославля по данным биотестирования / А.Г. Диунов, Г.П. Жариков, А.В. Павлов, Г.Е. Сабуров ; Яросл. мед. ин-т; Ярославль, 1993. - 8 с.

14. Егорова К.В. Токсикологическая оценка нефтезагрязненных почв / К.В. Егорова, С.К. Зарипова, Г.П. Каюкова, Г.В. Романов; Казан, гос. ун-т -Казань, 1998.-С. 20.

15. Есимбекова Е.Н. Исследование чувствительности трехферментных систем с бактериальной люциферазой при биотестировании водных экосистем: Автореф. дис. . канд. биолог, наук / Е.Н. Есимбекова. -Красноярск, 2000. С. 17.

16. Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестироания в России. / М: Междун.дом сотрудничества, 1997.-С. 148.

17. Истамов Х.И. Биотестирование производственных сточных вод / Х.И. Истамов, Е.П. Савельев // Загрязнение окруж. среды: Пробл. токсикол. иэпидемиол.: Тез. докл. междунар. конф., Москва-Пермь, 11-19 мая, 1993 -Пермь, 1993.-С. 58.

18. Карпович Т.А. Рекомендации к разработке комплексного, экспрессного метода биотестирования сточных вод с использованием рыб в качестве тест-объекта / Т.А. Карпович, В.И. Лукьяненко // Эксперим. вод. токсикол, 1990. -N 14.-С. 232-237.

19. Кириллова И.П., Зайцева Л.А., Дмитриева Л.В. Биолюминесцентный анализ и его возможности. / И.П. Кириллова, Л.А. Зайцева, Л.В. Дмитриева // Общие вопросы микробиологической промышленности, 1983. С. 44.

20. Колосова Л.В. Использование для токсикологических исследований прудовика обыкновенного / Л.В. Колосова, О.П. Данильченко, Н.С. Бузинова // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - Вып. 1. - С. 98-103.

21. Король В.М. Использование элодеи для биотестирования качества водной среды / В.М. Король // Физиол. и токсикол. гидробионтов. -Ярославль, 1989.-С. 98-103.

22. Крайнюкова А.Н. Метод биотестирования сточных вод по реакции ухода рыб из токсичной среды / А.Н. Крайнюкова, Г.А. Вальтер, С.В. Антонов, Г.Н. Катриченко // Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988.-С. 66-68.

23. Кратасюк В.А. Люциферазное биотестирование: биофизические основы, методы и применение: Дис. . док. биолог, наук / В.А. Кратасюк -Красноярск, 1994. М. 377 с

24. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон //Успехи микробиологии, 1987 N21 - С. 3-30.

25. Кратасюк В.А. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы // В.А. Кратасюк, О.Н. Дмитриева, П.И. Белобров; Люминесцентный анализ в медико биологических исследованиях, сб. науч. ст. - Рига: РМИ, 1986. - С 93 - 97.

26. Кудряшева Н.С. Закономерности ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro хинонами и фенолами компонентами сточных вод / Н.С. Кудряшева, Е.В. Шалаева, Е.Н. Задорожная, В.А. Кратасюк // Биофизика, 1994. - Т.39, N3. - С. 455-464.

27. Кудряшева Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова; Краснояр. гос. ун-т. Красноярск, 2002. -154 с.

28. Лапина Н.Ф. Использование пролина в качестве биотеста загрязненности почвы металлами / Н.Ф. Лапина, П.Е. Тулупов, Л.А Ласточкина // Миграция загрязняющ. веществ в почвах и сопредел. средах -Л., 1989.-С. 334-338.

29. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер // М.: Мир, 1974. 960 с.

30. Макарова Т.А. Возможности использования ядрышкового критерия для биотестирования / Макарова Т.А. //40 Науч.-техн. конф. проф.-преп. состава Астрах, гос. техн. ун-та: Тез. докл. Астрахань, 1996 - С. 94-95.

31. Максимов В.Н. Биотестирование вод, загрязненных сульфонолом. / В.Н. Максимов, X. Нагель, С.А. Остроумов, Т.Н. Ковалева // Вод. Ресурсы, 1988.-N 1.-С. 165-168.

32. Мецлер Д. Биохимия / Д. Мецлер М: Мир, 1960. - Т.1.

33. Михайлова JI.В. Накопление и выведение водорастворимой фракции нефти бокоплавами Gammarus Lacustris при различной температуре воды и вырьирующих концентрациях. / Л.В. Михайлова // Экспер.водн.токсикол, 1987.-Вып. 12.-С. 137-153.

34. Остроумов С.А. Биотестирование вод, загрязненных поверхностно-активными веществами. / С.А. Остроумов, B.C. Хорошилов // Изв. АН. Сер. биол. Россия, 1992. N 3. - С.452-458.

35. Остроумов С.А. Биотестирование токсичности поверхностно-активного вещества (сульфонола) с использованием проростков риса как тест-объекта. / С.А. Остроумов, А.Э. Головко // Гидробиол. ж, 1992. Т. 28, N 3.- С. 72-75.

36. Петушков В.Н. Термоинактивация бактериальной люциферазы / В.Н. Петушков, Г.А. Кратасюк, В.А. Кратасюк, П.И. Белобров // Биохимия, 1982. -Т.47, вып.11. С. 1773-1777.

37. Помазовская И.В. Биотестирование качества воды, поступающей в Онежское озеро с водосбора / И.В. Помазовская, Е.В. Флинк, Л.В. Дубровина // Притоки. Онеж. оз. Петрозаводск, 1988. - С. 25-29.

38. Потапова Н.А. Метод биотестирования загрязненных вод с помощью культур водных микроорганизмов. / Н.А. Потапова, Т.В. Королевская // Методы биотестирования вод. Черноголовка, 1988. - С. 17-18.

39. Равин-Щербо М.И. Физическая и коллоидная химия / М.И. Равин-Щербо, Т.А. Анненков // М. ВШ, 1964.

40. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002. - 118 с.

41. Сазонова В.Е. Сравнительный анализ чувствительности двух биотестеров для определения степени токсичности воды / В.Е. Сазонова, Е.В. Панькина // Вод. Ресурсы, 1998. Т. 25, N 1. - С. 80-84.

42. Скуриатов Ю.И. Экотоксикологические особенности сточных вод предприятий лесопромышленного комплекса / Ю.И. Скуриатов, Н.Е.

43. Гусельникова, Е.В. Штамм, Н.Б. Козлова // Водоснабж. и сан. техн, 1998. -N 2. С. 24-28.

44. Стрельцов А.Б. Региональная система биологического мониторинга на основе анализа стабильности развития / А.Б. Стрельцов, В.М. Захаров // Использование и охрана природных ресурсов в России, 2003. N 4. - С.47

45. Стручкова H.JI. Биотестирование как способ экологического контроля качества сточных вод / H.JI Стручкова. // Молодежь и экол. Москвы Тез. докл. Науч.-техн. конф. 22-23 дек. 1986. М., 1986. - С. 145-146.

46. Тернест JL Современная органическая химия / JI. Тернест М: Мир, 1981.-Т.2.

47. Тимофеева С.С. Активность окислительных ферментов как биотест для оценки токсичности природных и сточных вод / С.С. Тимофеева // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. JL: Гидрометеоиздат, 1987.-Вып. 1.-С. 76-84.

48. Тимофеева С.С. Использование биотестирования для оценки способов утилизации шламов сточных вод / С.С. Тимофеева, А.Э. Балаян // Эксперим. водная токсикология, 1990. Вып. 14. - С. 238-245.

49. Тривен М. Иммобилизованные ферменты / М. Тривен М.: Мир, 1983. - с 213.

50. Тушмалова Н.А. Метод биотестирования природных и сточных вод по уровню двигательной активности инфузорий спиростомы. / Н.А. Тушмалова, О.П. Данильченко, М.Д. Бресткина // Методы биотестирования вод -Черноголовка, 1988. С. 44-46.

51. Тюрин А.Н., Христофорова Н.К. Выбор тестов для оценки загрязнения морской среды. Докл. Междунар. совещ. по мор. биотестир., Владивосток,авг. 1994 / А.Н. Тюрин, Н.К. Христофорова // Биол. Моря, 1995. Т. 21, N 6. -С. 361-368.

52. Урванцева Г.А. Применение методов биотестирования в оценке загрязнения вод тяжелыми металлами. / Г.А. Урванцева // 10 объед. пленум сов. и респ.ком.по прогр. Юнеско Человек и биосф. Тез. докл. Всес.конф. -Алма-Ата, 1988. С. 68.

53. Хоружая Т.А. К проблеме создания системы биотестирования уровня токсического загрязнения природных вод / Т.А. Хоружая // Биотестир. в решении экол. пробл: Зоол. ин-т РАН; СПб, 1991. - С. 63-70.

54. Хоружая Т.А. Методы биоиндикации и биотестирования в исследованиях пресноводных экосистем при аварийном и экстремально высоком загрязнении / Т.А. Хоружая, В.А. Брызгало, Л.М. Предеина, Е.И. Короткова// Гидрохим. матер, 1991. Т. 100. - С. 47-68.

55. Щербань Э.П. Биотестирование токсичности воды нижнего Днестра для планктонных ракообразных / Э.П Щербань // Гидробиол. ж.; Киев, 1989. -С. 121.

56. Backhaus T. Toxicity testing with Vibrio fischeri: A comparison between the long term (24 h) and the short term (30 min) bioassay / T. Backhaus, K. Froehner, R. Altenburger, L.H. Grimme // Chemosphere, 1997. Vol. 35, N 12. -P. 2925-2938.

57. Barah M. The use of luminous bact eria for determination of phagdcytoses / M. Barah, S. Ulitzur, D. Merzbach // Immunol. Meth, 1983. V.64. - P. 353-363.

58. Beach M.J., Pascoe D. The role of Hydra vulgaris (Pallas) in assessing the toxicity of freshwater pollutants / M.J. Beach, D. Pascoe // Water Res, 1998. Vol. 32, N 1. - P. 101-106.

59. Bulich A.A Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulich, D.Z. Isenberg // Instrum. Soc. Am. Tranc., 1981. V.20,N1.-P. 29-33.

60. Chang M. Activities, stabilities, and reaction kinetics of three free and chitosan-clay composite immobilized enzymes / M. Chang, R Juang // Enzyme and Microbial Technology, 2005. V.36, - P. 75-82.

61. Chawla G.Algal bioassay of water pollutants. / G. Chawla, P.N. Viswanathan // Manual Aquat. Ecotoxicol.: Proc. Indo-Dutch Train. Course Aquat. Ecotoxicol., Lucknow, 1988 New Delhi etc.; Dordrecht etc., 1988. - P.294-297.

62. Curtis C. Evaluation of a bacterial bioluminescence bioassay as a method for predicting acute toxicity of organic chemicals to fish / C. Curtis, A. Lima, S.J. Lozano, G.D. Veith // ASTM Spec. Tech. Pabl., 1982. V.766. - P. 170-178.

63. De Groote J. Environmental monitoring of dredging operations in the Belgian nearshore zone. / J. De Groote, G. Dumon, M. Vangheluwe, C. Jansen // Terra et aqua., 1998. N 70. - P. 21-25.

64. Diehl K. Biotests zur Beurteilung der Reinigungslei stung von Deponiesicker-wasserbehandlungsverfahren. / K. Diehl, U. Hagendorf, J. Hahn // Entsorg. Prax., 1995. N 3. - P. 47-50.

65. Dinnel P.A., Stober Q.J. Application of the sea urchin sperm bioassay to sewage treatment efficiency and toxicity in marine waters / P.A. Dinnel, Q.J. Stober//Mar. Environ. Res., 1987. V. 21, N 2. - P. 121-133.

66. Esimbekova E.N. Bioluminescent method non-specific endotoxicosis in therapy / E.N. Esimbekova, V.A. Kratasyuk, V.V. Abakumova // Luminescence, 1999.-N 14.-P. 197-198.

67. Felkner I.C. Quantitative bioassay using laser-monitored bacteria to assess toxicology and metabolism of bioactive Group IV compounds / I.C. Felkner, B.E. Worthy // Sci. Total Environ., 1992. Vol. 112, N 2 - 3. - P. 177-188.

68. Gaur Abha Toxicity of selected chromium compounds in microbial bioassay system / Abha Gaur, J.W. Bhattacherjee // Water. Air. and Soil. Pollut., 1991. -Vol. 59, N 1-2. P. 193-197.

69. Gellert G. Development of an optimal bacterial medium based on the growth inhibition assay with Vibrio fischeri. / G. Gellert, A. Stommel, A.B. Trujilano // Chemosphere., 1999. Vol. 39, N 3. - P. 467-476.

70. Gerhardt A. New online biomonitoring system for Gammarus pulex (L.) (Crustacea): In situ test below a copper effluent in south Sweden / A. Gerhardt, A. Carlsson, C. Ressemann, K.P. Stich // Environ Sci Technol., 1998. V. 32, N 1. -P. 150-156.

71. Gil G. A biosensor for the detection of gas toxicity using a recombinant bioluminescent bacterium / G.C. Gil, R.J. Mitchell, S.T. Chang, M.B. Gu // Biosens. Bioelectron, 2000. -N 15. P. 23-30.

72. Gossiaux D.C. A survey of Saginaw River and Saginaw Bay, Lake Huron, sediments using two bioassay with the amphipod Diporeia spp / D.C. Gossiaux, P.F. Landrum, V.N. Tsymbal // J. Great Lakes Res., 1993. V. 19, N 2. - P. 322332.

73. Kirby M.F. Assessment of water quality in estuarine and coastal waters of England and Wales using a contaminant concentration technique. / M.F. Kirby,

74. M.A. Blackburn, J.E. Thain, M.J. Waldock // Mar.Pollut.Bull., 1998. Vol. 36, N 8.-P. 631-642.

75. Kossler F. Physiologische Untersuchungen zur Autmung von Vibrio Luminosus Beijerinck/F. Kossler// Arch. Microbiol., 1968. V.64. - P. 146-157.

76. Kratasyuk V.A. Principle of luciferase biotesting. / V.A. Kratasyuk // In: Proceeding of the First International School "Biological Luminescence". -Singapore, 1990. World Scientific Publishing Co., 1990. - P. 550-558.

77. Kratasyuk V.A. Polymer Immobilized Bioluminescent System for Biosensor and Bioinvestigations / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova // PBM Series 2003.-V.1/-P 307-341.

78. Kudryasheva N.S. Development of the bioluminescent bioindicators for analysis of environmental pollution /N.S. Kudryasheva, V.A, Kratasyuk E.N. Esimbekova, E.V. Vetrova // Field Analytical Chemistry and Technology, 1998. -N2.-P. 277-280.

79. Lucan Bouche M.L. Experimental study of the lethal effects induced by copper and lead on the Oligochaeta Tubifex tubifex / M.L. Lucan Bouche, S. Biagianti Risbourg, F. Habets , G. Vernet // Bull Soc Zool Fr., 1997. V. 122, N 4. -P. 389-392.

80. Maeda M. Flow injection determination of glucose, bile acid and ATP using immobilized enzyme reactor and chemiluminescent assay of NAD(P)H / M. Maeda, A. Tsuji, N. Ohshima, M. Hukuoka // J. Biolumin. Chemilumin,1993. -V.8, N 5. P. 241-246.

81. Marigomez J.A. Copper treatment of the digestive gland of the slug, Arion ater L. 1. Bioassay conduction and histochemical analysis / J.A. Marigomez, E. Angulo, J. Moya // Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 1986. V. 36, N 4. - P. 600-607.

82. Matthiessen P. Use of a Gammarus pulex bioassay to measure the effects of transient carbofuran runoff from farmland / P. Matthiessen, D. Sheahan, R. Harrison, M. Kirby // Ecotoxicol. and Environ. Safety., 1995. V. 30, N 2. - P. 111-119.

83. McGibbon S. Routine toxicity testing of toxicants using a sea urchin gamete bioassay / S. McGibbon, A.G.S. Moldan // Mar. Pollut. Bull., 1986. V. 17, N 2. -C. 68-72.

84. NaleczJawecki G. Toxicity of inorganic compounds in the spirotox test: A miniaturized version of the Spirostomum ambiguum test / G. NaleczJawecki, J. Sawicki // Arch Environ Contam Toxicol., 1998. V. 34, N 1. - P. 1-5.

85. Naveh M. A new rapid and sensitive bioluminescence assay for antibiotics that inhibit protein synthesis / M. Naveh, S. Ulitzur // J. Appl.Bacteriol., 1984. -V.56, N3.-P. 457-463.

86. Nendza M. Quantitative structure-toxicity relationships and multivariate data analysis for ecotoxic chemicals in different biotestsystems/ M. Nendza, J.K. Seydel // Chemosphere, 1988a. V.17, N 8. - P. 1575-1584.

87. Poulton M. Disruption of precopula in Gammarus pulex (L.) Development of a behavioural bioassay for evaluating pollutant and parasite induced stress / M. Poulton, D. Pascoe // Chemosphere., 1990. - V. 20, N 3-4. - P. 403-415.

88. Puget K. Studies in bioluminescence. Bacterial NADH: FMN -oxidoreductase / K. Puget, A.M. Michelson, S. Adrameas // Anal. Biochem .,1977. -V.79.-P. 447-456.

89. Reynoldson T.B. A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm tubifex tubifex / T.B. Reynoldson, S.P. Thompson, J.L. Bamsey // Environ. Toxicol, and Chem., 1991. V. 10, N 8. - P. 1061-1072.

90. Richardson M. Ecotoxicity monitoring use of Vibrio Fischeri / M. Richardson // Arh.Hig.Rada.Toksikol., 1996. V.47, N4. - P. 389-396.

91. Ringwood A.H. Seed clam growth: An alternative sediment bioassay developed during EMAP in the Carolinian Province / A.H. Ringwood, C.J. Keppler // Environ Monit Assess., 1998. V. 51, N 1-2. - P. 247-257.

92. Ruiz M.J. Toxicity assessment of pesticides using the microtox test: application to environmental samples / M.J. Ruiz, L. Lopez-Jaramillo, M.J. Redonto, G. Font // Bull.Environ.Contam.Toxicol., 1997. V.59, N4. - P. 619-625.

93. Salama M.S. Toxicity assessment of pollutants in the marine environment of Kuwait using microbial bioassay. / M.S. Salama, A.A. Salem // Toxicity Assess., 1990. Vol. 5, N 3. P. 237-252.

94. Santiago-Faundino V.J.R. The effects of nikel and cadmium on the growth rate of Hydra littoralis and an assesment of the rate of uptake of 63Ni and 14C by the same organism / V.J.R. Santiago-Faundino // Water Res., 1983. V. 17 N 8, - P. 917-923.

95. Sauvant M.P. Tetrahymena pyriformis: a tool for toxicological studies. A review / M.P. Sauvant, D. Pepin, E. Piccinni // Chemosphere., 1999. V. 38, N 7. -P. 1631-1669.

96. Serat W.F. Evaluation of biological effects of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // J. Bacterid., 1965. V.90, N3. -P. 832-833.

97. Serat W.F., Budinger F.E., Mueller F.K. Toxicity evaluation of air pollutants by use of luminescent bacteria / W.F. Serat, F.E. Budenger // Atmospher. Environ., 1967.- V.I.- P. 21-32.

98. Simmers J.W. Bioassay and biomonitoring assessments of contaminant mobility from dredged material / J.W. Simmers, R.G. Rhett, S.H. Kay, J.M. Marquenie // Sci. Total Environ., 1986. V. 56. - P. 173-182.

99. Smith S. Use of aquatic macrophytes as a bioassay method to assess relative toxicity, uptake kinetics and accumulated forms of trace metals. / S. Smith, M.K.H. Kwan //Hydrobiologia, 1989. V. 188-189. - P. 345-351.

100. Stom D.I. Bioluminescent method in studying the complecs effect of sewage components / D.I. Stom, T.A. Gill, A.E. Balayn, O.I. Shahova // Arch.Environ.Toxicol., 1992. V.22. - P. 202-203.

101. Sunderaraman V. Paramecium bioassay for fresh water pollution Анализ загрязнения пресных вод по парамеции. / V. Sunderaraman // Manual Aquat.

102. Ecotoxicol.: Proc. Indo-Dutch Train. Course Aquat. Ecxtoxicol., Lucknow, 1988 -New Delhi etc., Dordrecht etc., 1988. P. 311-313.

103. Tchan J.T. A new rapid specific bioassay method for photosynthesis inhibiting herbicides / J.T. Tchan, I.E. Roseby, G.R. Funnel // Soil Biol. Biochem., 1975.- V.7.- P. 39-44.

104. Ulitzur S. Determination of antibiotic activities with the aid of luminous bacteria / S. Ulitzur//Methods Enzymol., 1986a.- V. 133. P. 275-284.

105. Ulitzur S. A new sensitive and simple bioluminescence test for mutagenic compounds / S. Ulitzur, I. Weiser, S. Yannai // Mutant Res., 1980. V.74, N2. - P. 113-124.

106. Ulitzur S. Factors affecting the cellular expression of bacterial luciferase/ S. Ulitzur, A. Reinhertz, J.W. Hastings // Arch. Microbiol., 1981a. V.129. - P. 6771.

107. Ulitzur S. H-NS Protein Represses Transcription of the lux Systems of Vibrio fischeri and Other Luminous Bacteria Cloned into Escherichia coli / S. Ulitzur, A. Matin, C. Fraley, E. Meighen // Curr. Microbiol., 1997. V. 35. - P. 336-342.

108. Waring, C.P. Sublethal effects of a carbamate pesticide on pheromonal mediated endocrine function in mature male Atlantic salmon (Salmo salar L) parr / C.P. Waring, A. Moore // Fish Physiol Biochem., 1997. V. 17, N 1-6. - P. 203211.

109. Yang Y. M.Immobilization of glucose oxidase on chitosan-Si02 gel / Y. M. Yang, J. W. Wang, R. X. Tan // Enzyme and Microbial Technology, 2004. V.34, -P. 126-131.

110. Yordan A.Z. Toxicant detector / A.Z. Yordan, E.R. Schnauss, E.H. Sie, A. Thanos // Pat. USA, 1968 N 3370175.

111. Zhang T. Use of duckweed (Lemna minor L.) growth inhibition test to evaluate the toxicity of acrylonitrile, sulphocyanic sodium and acetonitrile in China / T. Zhang, H.J. Jin // Environ Pollut., 1997. V. 98, N 2. - P. 143-147.