Иммунобиологические свойства полиштаммной вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Зыбина Татьяна Николаевна

• Зыбина Татьяна Николаевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Зыбина Татьяна Николаевна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Определение болезни, этиология, спектр патогенности возбудителя

2.2 Распространенность болезни

2.3 Экономическая значимость заболевания

2.4 Экологические и популяционно-генетические факторы, определяющие вариабельность фенотипа вируса

2.5 Патогенез инфекционной бурсальной болезни

2.6 Иммунитет при инфекционной бурсальной болезни

2.7 Специфическая профилактика ИББ

2.8 Иммуногенные компоненты вирусвакцин против ИББ

2.9 Действие вирусвакцин против ИББ

2.10 Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Вируссодержащий материал

4.1.2 Вируссодержащий гомогенат тканей эмбрионов

4.1.3 Биологическая активность вакцинных вирусов в составе тканевого гомогената

4.2 Получение полиштаммного иммуногенного компонента для вирусвакцины. Составление смеси из штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» вируса ИББ

4.2.1 Определение эффективных иммунизирующих доз исследуемых штаммов по критерию достижения протективного уровня гуморального

иммунитета

4.3 Оценка напряженности иммунитета после прививки полиштаммной вирусвакциной

4.3.1 Приготовление полиштаммной вирусвакцины

4.3.2 Оценка гуморальной иммунной реакции

4.3.3 Оценка протективной функции поствакцинального иммунитета

4.4 Разработка количественных показателей вирулентности штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни

4.4.1 Разработка относительного коэффициента атрофии бурсы

4.4.2 Сравнение реактогенности штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ», а также смеси данных штаммов

4.4.3 Оценка показателей относительной вирулентности полевых изолятов вируса ИББ, образцов коммерческих вакцин, вакцинных

штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ», а также смеси указанных штаммов

4.5 Определение порогового титра трансовариальных антител, при котором полиштаммная вирусвакцина способна вызывать активную иммунную

реакцию птицы

4.6 Оценка иммунодепрессивного действия полиштаммной вирусвакцины и составляющих ее штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ»

4.7 Стабильность инфекционной активности полиштаммной вирусвакцины при хранении

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1 Выводы

5.2 Практические предложения

5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

7.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунобиологические свойства полиштаммной вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема инфекционной бурсальной болезни (ИББ), или болезни Гамборо, в течение последних четырех десятилетий сохраняет свою актуальность. Вирус ИББ широко распространен в мире и представляет для промышленного птицеводства большую потенциальную опасность, которая возрастает в связи с ростом международных экспортно-импортных операций в сфере птицеводства (торговля цыплятами высокопродуктивных родительских линий, мясом бройлеров, кормами, кормовыми добавками и т.п.) [29]. При этом страны-импортеры могут быть неблагополучными по ИББ. Это касается как развивающихся стран [80; 83; 107; 108], так и стран общего рынка. Например, опубликованные в 2016 г. исследования, проведенные на территории Канады (провинция Саскачеван) в период 2007 - 2011 г.г., показали, что в 43% обследованных птицеферм циркулировали не вакцинные штаммы вируса ИББ, что служило причиной повышенной смертности и снижения коэффициента конверсии корма. Совокупные потери составили значительный объем недополученной продукции [53].

Заболевание птиц ИББ клинически проявляется диареей, летальностью, характеризуется поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями [12]. У птиц-реконвалесцентов присутствуют иммунопатологии [20]. Перечисленные явления составляют совокупный экономический ущерб.

Важно подчеркнуть, что циркулирующие в естественных условиях, штаммы вируса ИББ (в том числе и вакцинные) эволюционируют, и некоторые вирусные популяции становятся высоковирулентными [7; 50; 107].

Высокая вероятность риска возникновения ИББ требует обязательной специфической профилактики данной болезни практически во всем мире [4; 12, 61]. В этой связи совершенствование препаратов специфической профилактики ИББ представляется актуальным.

Степень разработанности проблемы. Для создания активного иммунитета к вирусу ИББ у молодняка используют живые вирусвакцины, у которых иммуногенным компонентом являются природно-ослабленные или искусственно аттенуированные штаммы указанного возбудителя (вакцинные штаммы). Известно, что наиболее важными фенотипическими признаками вакцинных штаммов вируса ИББ являются: инвазивность, реактогенность и иммуногенность [94, 95, 97; 113; 120].

Как правило, фенотипические признаки известных вакцинных штаммов связаны, т.е. более инвазивный штамм будет более реактогенным и иммуногенным. На этом основании вакцинные варианты вируса ИББ принято различать [4; 95; 99; 110; 112; 114] как «мягкие», «промежуточные» и «горячие», в зависимости от их возрастающей способности преодолевать трансовариальный иммунитет (быть устойчивыми к нейтрализующему действию циркулирующих материнских антител) и повреждать лимфоцитарные фолликулы ткани бурсы [76; 78; 104], что вызывает истощение лимфоцитарных запасов (возникновение иммунодефицита) и возрастание вероятности развития оппортунистических инфекций [20; 51].

Однако следует отметить, что связь перечисленных признаков носит в большей степени статистический характер и не является строго функциональной [46]. Кроме этого, воздействие вакцинного вируса на макроорганизм является дозозависимым [12; 114].

Современный уровень ветеринарной вирусологии позволяет дать развернутую характеристику вакцинного штамма вируса ИББ в виде количественных показателей, характеризующих соответствующие фенотипические признаки.

Инвазивность штамма может быть выражена в виде наибольшей (критической) концентрации материнских антител, при которой вирус способен развиваться в макроорганизме (пороговый титр). Например, для штамма «БГ» показано [12], что соотношение между оценками напряженности трансовариального иммунитета и значением титра поствакцинальных антител

демонстрирует явную отрицательную связь. Прослеживается вероятная пороговая концентрация предшествующих антител, которую способен преодолеть вакцинный вирус.

Представляется, что для конкретной вирусвакцины, на фоне распада трансовариальных антител, необходимо установление величины порогового титра, что позволит определить возраст цыплят, при котором следует проводить вакцинацию [66; 67; 77; 81]. Важно отметить, что своевременное внедрение в организм птицы вакцинного вируса препятствует развитию полевого штамма возбудителя до включения иммунной реакции в связи с конкуренцией за клеточные рецепторы в тканях органов-мишеней [104].

Наиболее надежным показателем реактогенности вакцинного вируса является оценка метрик бурсы или бурсального индекса (отношение массы органа к массе тела птицы) [59]. Для многих вакцинных штаммов ИББ изучено повреждающее действие фолликулярной ткани бурсы [14; 35; 46; 78; 82; 120]. Предложен относительный коэффициент, который позволяет соотнести повреждающую способность вакцинного вируса и высоковирулентного возбудителя [32].

Для характеристики иммуногенности штамма может быть использован критический титр поствакцинальных циркулирующих антител, при котором вероятность развития инфекционного процесса в организме минимальна (протективный титр). В этом случае оценкой иммуногенности штамма будет результат сопоставления величин протективного и фактического поствакцинального титров. Опубликованные данные о соотношении величины поствакцинального титра антител и протективного эффекта [12] однозначно указывают на объективное присутствие некой необходимой напряженности приобретенного иммунитета. Соотношение между величиной поствакцинального титра антител и протективным эффектом вакцин против ИББ было выражено в виде модели связи [35], согласно которой для диагностического набора «/оейБ» значение среднего титра ^Т=3,394 (или Т=2477) соответствует защищенности 95% вакцинированных птиц.

Рассмотрим ряд примеров. Известны вирусвакцины против ИББ компании «Zoetis» [14] из «среднего» («intermedium») штамма «Lukert» или из «горячего» штамма «У877». Перечисленные штаммы используют в определенных прививных дозах. В инструкции по применению указано, что перед использованием того или иного препарата требуется точная оценка эпизоотологической ситуации в хозяйстве, однако соответствующие количественные показатели не приведены.

Для вирусвакцины на основе штамма «V877» определен пороговый титр материнских антител (1:1100, в диагностическом наборе «IDEXX»). Однако, величина поствакцинального титра для сравнения с протективным показателем не указана [67].

В инструкциях по использованию вирусвакцин против ИББ компании «Seva Sante Animale», Франция [24] есть указание на необходимость учета напряженности трансовариального иммунитета птиц перед вакцинацией, однако конкретных количественных показателей не дано.

В инструкции к вирусвакцине «Нобилис Гамборо D78» компании «Intervet International B.V., Netherlands [14], указан титр трансовариальных антител, при котором может быть применена вакцина, однако других необходимых количественных показателей не представлено.

В отношении оценки повреждающего действия вируса ИББ (в том числе вакцинных штаммов) следует отметить, что в подавляющем числе публикаций, где использованы оценки степени разрушения ткани бурсы в виде «бурсального индекса» или «бурсального отношения» [14; 46; 78; 82; 120] нет четких указаний на фазу воспалительного процесса. Однако известно [59], что при ИББ фабрициева сумка вначале находится в острой фазе воспаления, которая сопровождается значительным отеком тканей, и далее наступает фаза атрофии. При этом масса органа в указанных фазах может изменяться в 6 раз. Данное обстоятельство, очевидно, требует стандартизации методики оценивания.

Сущность разработки полиштаммной вакцины против БГ. Использование в качестве иммуногенного компонента смеси вакцинных штаммов известно на примере вирусвакцин против болезни Марека (БМ). А именно, препарат «ШзрепБ СУ1 988 + НУТ», Мепа1, содержащий вакцинные штаммы «ШзрепБ СУ1-988» и «БС 126» [37], а также линейка полиштаммных вирусвакцин производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» [15], или другие препараты против БМ, которые представляют собой смеси двух или трех вакцинных штаммов [11]. Считается, что эффективность таких препаратов основана на синергическом воздействии на иммунную систему фенотипически различных вирусных популяций, которые одновременно репродуцируются в макроорганизме [118; 98].

Предполагая возможность синергизма, считали целесообразным использовать в качестве иммуногенного компонента вирусвакцины против ИББ комбинацию штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ».

Штамм «Винтерфилд 2512» относится к «интермедиальной» группе и минимально повреждает ткани бурсы [32], однако характеризуется слабой иммунной инвазивностью (высокие титры трансовариальных антител ограничивают развитие вируса), вследствие чего поствакцинальный иммунитет может быть не достаточно напряженным [12]. При этом, штамм «БГ» относится к «горячим» вариантам, и способен преодолевать достаточно напряженный материнский иммунитет [12], однако демонстрирует более выраженную повреждающую способность ткани бурсы [32].

Полагали, что полиштаммный иммуногенный компонент вирусвакцины сможет сочетать в себе положительные свойства обоих вариантов вируса. А именно, инвазивность по отношению к трансовариальному иммунитету и низкую реактогенность.

Приняли, что в состав смеси указанные штаммы войдут в дозах, которые обеспечат проявление перечисленных свойств. Пропорцию вируса каждого штамма оптимизировали как по параметру иммуногенности, так и по параметру реактогенности.

Результатом проведенной разработки явилась полиштаммная вирусвакцина против ИББ, имеющая коммерческое название «Гамборомикс». Иммуногенным компонентом данного препарата является смесь штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ», которые в заданном соотношении показывают признаки синергизма и эффективно индуцируют иммунную реакцию птицы.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение иммунобиологических свойств полиштаммной вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни на основе штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512». В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

- сравнить действие различных иммунизирующих доз штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512» по скорости достижения протективного уровня гуморального иммунитета к вирусу ИББ и определить их оптимальную пропорцию в составе полиштаммного препарата;

- оценить протективную функцию поствакцинального иммунитета птиц после применения полиштаммного препарата при искусственном заражении;

- установить критическую величину титра трансовариальных антител, при которой полиштаммный препарат способен индуцировать активную форму иммунитета;

разработать способ количественной оценки относительной вирулентности штаммов вируса ИББ с использованием положительного контроля и сравнить вирулентность инфекционных вирусных материалов различной природы, в том числе полиштаммного препарата и составляющих его штаммов;

- сравнить иммунодепрессивное действие полиштаммной вирусвакцины и составляющих ее штаммов;

- оценить изменение биологической активности полиштаммной вирусвакцины при хранении.

Научная новизна результатов исследований. В процессе выполнения исследований были получены результаты, имеющие научную значимость:

- показан феномен усиления иммунной реакции птицы на препарат, содержащий полиштаммный иммуногенный компонент в сравнении с отдельно испытанными составляющими его штаммами вируса ИББ;

- установлен критический титр трансовариальных антител, при котором полиштаммная вирусвакцина способна индуцировать активную форму иммунитета. Данный показатель позволяет определять минимальный возраст цыплят, допускающий проведение иммунизации и предотвратить возможную нейтрализацию вакцинного вируса в организме птицы;

предложен метод количественной оценки относительной вирулентности штаммов вируса ИББ на основе показателей инфекционности, летальности и коэффициента атрофии бурсы. Данный метод позволяет комплексно характеризовать изучаемые штаммы вируса и проводить соответствующие сравнения.

Теоретическая и практическая значимость исследований. На

основании результатов проведенных исследований подготовлена нормативная документация на вирусвакцину против инфекционной бурсальной болезни живой сухой «Гамборомикс», которая одобрена ученым советом ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и утверждена директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» в установленном порядке.

- «Стандарт ФГБУ «ВНИИЗЖ» Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни живая сухая "Гамборомикс" (СТО 00495527-0279-2017)» (приложение 1);

- «Инструкция по ветеринарному применению вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни живой сухой "Гамборомикс"» (приложение 2);

«Промышленный регламент по изготовлению и контролю вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни живой сухой "Гамборомикс"» (приложение 3).

Препарат производится по стандартам GMP и по основным характеристикам соответствует требованиям, изложенным в «Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals». Вирусвакцина прошла полный комплекс доклинических и клинических испытаний, после чего была зарегистрирован в РФ (номер регистрационного удостоверения 12-1-15.17-3946, №. ПВР-1-15.17/03402).

В рамках темы диссертации разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Методические рекомендации по оценке вирулентности штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни с использованием относительных коэффициентов летальности и атрофии фабрициевой сумки» (11.05.2018 г.) (приложение 4).

Методология исследований. В соответствии с поставленными задачами были использованы методы: а) вирусологические (культивирование вируса ИББ на СПФ-эмбрионах и определение его инфекционной активности); б) серологические (оценки титра антител к вирусу ИББ в сыворотках крови подопытных птиц); - в) патоморфологические (оценка повреждающего действия тканей бурсы в результате воздействия различными штаммами вируса ИББ).

Результаты проведенных экспериментов интерпретировали после статистической обработки полученных данных.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- определение эффективных иммунизирующих доз вакцинных штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» по критерию скорости достижения протективного

уровня гуморального иммунитета к вирусу ИББ и составление полиштаммного иммуногенного компонента вирусвакцины;

- особенности развития гуморальной иммунной реакции птицы на вакцину, содержащую полиштаммный иммуногенный компонент в сравнении с препаратами на основе не смешанных штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ»;

- оценка протективной функции поствакцинального иммунитета птиц после применения полиштаммного препарата при искусственном заражении;

- критическая величина титра трансовариальных антител птицы, при которой полиштаммный препарат способен индуцировать активную форму иммунитета;

- метод количественной оценки относительной вирулентности штаммов вируса ИББ на основе показателей инфекционности, летальности и коэффициента атрофии бурсы;

- оценка изменения биологической активности вирусвакцины на основе полиштаммного иммуногенного компонента при хранении.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Большая теоретическая и практическая помощь была оказана коллективом лаборатории профилактики болезней птиц. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали сотрудники лаборатории эпизоотологии и мониторинга, а также отдела биологического и технологического контроля и коллекции штаммов микроорганизмов, за что автор выражает им глубокую признательность.

Исследования по диссертационной работе выполнены в период с 2016 по 2020 гг. в соответствии с планами НИР в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Степень достоверности и апробации результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого

совета и методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты исследований были опубликованы в материалах научной конференции «Микромир/макропроблемы», (ФИЦВиМ, 2018 г.), а также на V Международной научно-практической конференции «Достижение молодых ученых - в ветеринарную практику», (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019 г.). Материалы диссертации вошли в научные отчеты и были представлены ученому совету ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2016-2020 гг.

Публикации научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для докторских и кандидатских диссертаций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, заключение, список сокращений и условных обозначений, список литературы. Список литературы включает 120 источников, в том числе 76 зарубежных. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 12 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Определение болезни, этиология, спектр патогенности возбудителя

Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) или болезнь Гамборо (Bursitis infectiosa galli — лат., Infestiosus bursae disease — англ.) - остро протекающая вирусная болезнь кур, характеризуется апатией, анорексией, диареей, поражением фабрициевой бурсы, обширными внутримышечными геморрагиями, поражением почек [9; 10].

Возбудителем ИББ является РНК - вирус, относящийся к семейству Birnaviridae (от англ. bi — двойной, гпа — рибонуклеиновая кислота), роду Avibirnavirus. Вирион не имеет липопротеидного суперкапсида и представляет собой икосаэдр, построенный из 92 капсомеров, диаметром 18—22 нм. Геном вируса - двуспиральная линейная РНК [101].

Существуют 2 серотипа вируса ИББ (обозначены как серотипы 1 и 2). Клинически заболевание проявляется только у кур до 10-недельного возраста и связано только с серотипом 1. Все коммерческие вакцины готовятся только против этого серотипа [108]. Описаны случаи естественного инфицирования индеек и уток, однако экспериментального подтверждения этим феноменам нет [10].

По возрастным группам невакцинированных кур заболеваемость может составить: 0-15 суток - 2,1%; 16-30 суток - 38,3%; 31-45 суток - 36,2% [12]. Показано, что летальность при ИББ у неиммунных кур в возрасте 28-35 суток может быть от 43,3% до 95,8% [49].

2.2 Распространенность болезни

Первое клиническое проявление ИББ было зарегистрировано в 1957г. у бройлеров на полуострове Delmarva (США). К 1965 г. болезнь распространилась практически во все регионы США с развитым птицеводством. В 1967 г. был определен этиологический агент и начаты разработки препаратов специфической профилактики болезни [93].

Стремительное распространение ИББ произошло в начале 90-х г. в РФ и странах СНГ. По данным Международного эпизоотического бюро к 1992 г. ИББ было зарегистрировано в 80% стран мира [1].

Потенциальная опасность заноса ИББ возрастает в связи с увеличением международных экспортно-импортных операций в сфере птицеводства (торговля цыплятами высокопродуктивных родительских линий, мясом бройлеров, кормами, и кормовыми добавками) [29]. При этом страны-импортеры могут быть неблагополучными по ИББ. За последние 20 лет неблагополучие по данной болезни установлено как в развивающихся странах, так и в странах общего рынка [53; 73, 80; 83, 86; 107; 108].

Здесь также следует указать на устойчивость вируса ИББ к воздействию физико-химических факторов, в том числе, к дезинфекционным средствам, когда тщательная санация предприятия по истечение 3-х месяцев после вспышки ИББ не давала должных результатов [3].

Высокая вероятность риска возникновения ИББ требует обязательной специфической профилактики данной болезни практически во всем мире [12; 112].

2.3 Экономическая значимость заболевания

ИББ является одним из наиболее экономически важных заболеваний птицеводческой отрасли во всем мире [83]. Убытки возникают вследствие гибели до 10—20% поголовья, высокого процента выбраковки тушек, в результате подкожных, внутримышечных кровоизлияний и истощения птиц. Большие потери наносятся косвенными факторами: ослабление устойчивости поголовья к инфекционным агентам, снижение эффективности профилактических прививок, а, следовательно, возможное возникновение вспышек новых болезней и отрицательное влияние на будущую продуктивность птицы [9].

Важно отметить, что снижение экономических показателей предприятия связано и с циркулирующими слабовирулентными штаммами вируса ИББ, которые не обуславливают внешних клинических признаков болезни.

Например, исследования, проведенные в Канаде в 2016 г., показали, что 43% бройлерных птицеферм в провинции Саскачевана содержали инфицированное поголовье, в котором был выявлен геном полевых вариантов вируса ИББ. Среднегеометрический титр антител к вирусу ИББ (установленный в диагностических наборах «IDEXX», Westbrook, Maine, USA) у инфицированных птиц, в сравнении с интактными стадами, составил 1:4236 и 1:157, соответственно. Стада, положительные на вирус ИББ, имели среднюю смертность 8,6%. Аналогичный показатель в здоровом поголовье составил 6,1%. Средняя масса на одну зону выращивания в возрасте 37 дней составляла 29,3 кг/м2 в инфицированных стадах и 34,0 кг/м2 в стадах без инфекции вируса ИББ. Был сделан вывод, что в результате воздействия циркулирующих штаммов возбудителя ИББ, производство мяса бройлеров в провинции теряет 3,9 миллиона килограммов продукции в год [53].

Производственные показатели благополучных хозяйств и хозяйств, где ИББ протекает субклинически, могут быть почти одинаковыми. Однако в отдельные периоды эксплуатации птицы экономические потери на таких предприятиях значительно возрастают, что связано с иммуносупрессивным воздействием вируса и проявлением на этом фоне у птицы вторичных инфекций [5].

2.4 Экологические и популяционно-геиетические факторы, определяющие вариабельность фенотипа вируса

Одной из важнейших биологических особенностей вирусов является их потенциальная способность к быстрым эволюционным изменениям. Очевидно, что эти изменения в естественных условиях протекают в направлении, благоприятном для сохранения возбудителя как биологического вида в данной экосистеме [44].

Вирус - облигатный внутриклеточный паразит и не может в вегетативной форме существовать вне клетки организма-хозяина. Это означает, что он должен обладать инфекционностью, т.е. - способностью к развитию в клетках организма-хозяина (включая инвазивность - способность

преодолевать защитные системы макроорганизма) и иметь возможность экскреции с перспективой дальнейшего распространения на чувствительные объекты. Перечисленные свойства являются фенотипическими признаками вирусной популяции, которые, в конечном счете, проверяются отбором и определяют адаптационную ценность данного варианта вируса.

В случае постоянства (неизменности) условий существования, отбор будет стабилизирующим и «сохранит» некий средний наиболее адаптированный фенотип. В случае изменений внешних условий, произойдет утрата адаптационной ценности имеющегося фенотипа, отбор становится направленным и обусловит селективное накопление нового фенотипа [17]. Располагая определенным генофондом, любая вирусная популяция постоянно воспроизводит «преадаптационный пул», т.е. - представительство вируса, не обладающее в данный момент адаптационной ценностью, которое незамедлительно будет использовано в случае направленного отбора [44].

Предугадать вектор естественного отбора невозможно. В реальных условиях могут возникать как высоковирулентные штаммы, так и фенотипы, близкие к аттенуированным вариантам [85]. Конкретные причины изменений вирусного генома могут быть различны.

Например, показано, что наследуемые изменения фенотипа вируса ИББ, отличающие изученные образцы от применявшихся в данном регионе вакцинных штаммов, были связаны с существенной перестройкой генома. Считают, что могла иметь место рекомбинация [12; 107].

Установлено, что из 300 образцов вируса ИББ, выделенных в последние 10 лет на территории США, одна треть имела изменения в структуре капсидного пептида УР2, что предполагает антигенную неидентичность родительской популяции вируса и может отразиться на эффективности применения известных вакцин. [50].

Циркулируя в естественных условиях, штаммы вируса ИББ, в том числе и вакцинные, неизбежно совершенствуют адаптированность и накапливают необходимую сумму «полезных для выживания» фенотипических свойств. На

практике это во многих случаях ведет к увеличению вирулентности возбудителя [50; 107].

Показано, что выделенные в период с 1997 по 2005 годы во время вспышек ИББ из 18 стран на территориях 4-х континентов, вирусные изоляты в большинстве (71/113) были отнесены к высоковирулентным штаммам [7].

Географические места очагов ИББ и выделения возбудителя по состоянию на 2016 г., а также разграничение штаммов вируса по изученным свойствам представлены на рисунке 1.

• Clàaaical virulent IBDV Varient I6DY • VfryVkrulfiM fBiJV Squrcc; Скип Intnrn.i. Ij.iîj

Рисунок 1 - География очагов, где был выделен вирус ИББ по состоянию на 2016 r.(Publication by Christophe Cazaban, Yannick Gardin and Rick van Oort from Ceva Santé Animale (Ceva).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зыбина Татьяна Николаевна, 2021 год

* / / / /

Рисунок 6 - Результаты иммунизации птиц вирусвакциной «Гамборомикс» из комбинации штаммов «Винтерфилд 2512» (1000

ЭИД50) и «БГ» (100 ЭИД50)

Представлены средние логарифмические значения титров сывороточных антител (^'Т, п=10) к вирусу ИББ, полученные через 14 и 21 сутки (Ь) в трех подопытных группах. Стандартные отклонения оценок ^'Т находились в диапазоне (0,09-Ю, 13) Пунктиром показана общая средняя тенденция. Ось абсцисс построена в точке протективного титра (1^1=3,349).

Из данных, представленных на рисунке 6, следует, что протективный уровень поствакцинального гуморального иммунитета (1§Т=3,394, Т=2477) после прививки вирусвакциной на основе полиштаммного иммуногенного компонента был достигнут менее чем через 14 суток после прививки. При этом средняя величина титра антител на 14-е и 21-е сутки превосходила аналогичные оценки, установленные ранее для составляющих штаммов вируса (смотри рисунки 4 и 5). Результаты сравнения (статистического анализа) соответствующих значений титров приведены в таблице 6.

Из данных таблицы 2 следует, что на зачетных временных интервалах оба испытанных штамма с высокой достоверностью (|3=(1-р)х100 > 99,9%) индуцировали меньшие титры антител, чем их смесь, где эти штаммы присутствовали в таких же дозах как и в монопрепаратах.

Таблица 2 - Сравнение значений титров сывороточных антител ('Т8) к вирусу ИББ через 14 и 21 сутки после иммунизации птиц вирусвакцинами из штаммов «Винтерфилд 2512», «БГ» и полиштаммной вирусвакциной «Гамборомикс» в рекомендованных _ прививных дозах (статистический анализ)**_

Штамм «Винтерфилд 2512» «БГ» Полиштаммная вирусвакцина

Сутки 14 21 14 21 14 21

^'Т (8;п)*** 3,35* (0,13; 10) 3,55 (0,12; 10) 3,43 (0,16; 10) 3,63 (0,12; 10) 3,71 (0,08; 30) 3,78 (0,07; 30)

24,72 8,74 49,84 24,39 н.о.### н.о.

р## « 0,01 <0,01 « 0,01 « 0,01 н.о. н.о.

Примечания:

* - смотри рисунки 2 и 3;

** - использован метод множественных сравнений Шеффе [34, с. 182]; *** . ^'Т - среднее значение, в скобках указаны: Б - стандартное отклонение; п - число измерений ; #- значение статистического оператора (Тх>- = (Х-У)2/(Б/пх + Б/пу) для сравнения с табличным критерием Фишера (рР{У1;у2}), где: X и У -сопоставляемые средние величины; Б - общая дисперсия группы; пх и % - объемы сопоставляемых выборок; ##- вероятность (ошибки прогноза), при которой неравенство Рху> РР{У1;у2} выполняется; ###- не определяли.

Через 14 суток величина титра антител после применения полиштаммной вирусвакцины, при прочих равных условиях, возросла относительно монопрепаратов из штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» в 2,3 и в 1,9 раза, соответственно. Через 21 сутки показатели прироста составили 1,7 и 1,4 раза. Это указывает на возможность синергического воздействия смеси вакцинных штаммов вируса ИББ на иммунную систему птицы в составе смешанного препарата.

4.3.3 Оценка протективной функции поствакцинального иммунитета

Параллельно исследовали протективное действие вирусвакцин из штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» и полиштаммной вирусвакцины.

Из цыплят, выведенных из БРГ-яиц, в возрасте 15 суток образовали три подопытных и одну контрольную группы численностью по 30 голов. Птиц в подопытных группах иммунизировали вирусвакцинами из штаммов «Винтерфилд 2512» в дозе 1000 ЭИД50, и из штамма «БГ» в дозе 100 ЭИД50, а также полиштаммной вирусвакциной, содержащей смесь данных штаммов в

указанных дозах. В контрольной группе иммунизацию не проводили. Группы содержали в изолированных боксах.

Через 14 суток после прививки по 15 голов от каждой группы птиц подвергали заражению вирулентным штаммом «52/70» вируса ИББ в дозе 100 ЭИД50. Аналогичную операцию проводили через 21 сутки. В течение 10 суток после искусственного заражения птица два раза в сутки проходила клинический осмотр. Учитывали клиническое проявление ИББ и обусловленную возбудителем летальность. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Заболеваемость вакцинированных и не вакцинированных птиц вирусом ИББ после искусственного заражения через 14 и 21

сутки после иммунизации

Заболеваемость вакцинированных и невакцинироваиных птиц вирусом ИББ после искусственного заражения через 14 и 21 сутки после прививки

Препарат Время после иммунизации (сутки)

14 21

Вирусвакцина из штамма «Винтерфилд 2512» 2/15**(1)*** 0/15

Вирусвакцина из штамма штамм «БГ» 1/15 0/15

Полиштаммная вирусвакцина 0/15 0/15

Контроль* 15/15 (6) 15/15 (5)

Примечания:

* - неиммунизированная птица; ** - в числителе - количество птиц, имеющих признаки ИББ; в знаменателе - общее число инфицированных птиц; * * * - в скобках указано количество павших птиц из числа заболевших.

Из данных таблицы 3 следует, что после искусственного заражения протективная функция иммунитета против ИББ, индуцированная тестируемыми вакцинными препаратами, выражена была неодинаково.

Искусственное заражение цыплят, проведенное через 14 суток после прививки, показало, что препарат из штамма «Винтерфилд 2512» в дозе 1000 ЭИД50 не обеспечил абсолютный протективный эффект. Заболеваемость в указанной группе составила 2/15, при этом одна заболевшая птица погибла.

Заболеваемость в группе птиц, иммунизированных вирусвакциной из штамма «БГ» в дозе 100 ЭИД50, составила 1/15. Вакцина на основе полиштаммного иммуногенного компонента полностью защитила птиц от инфекции вирулентного вируса. Заболеваемость и летальность в контрольной группе составили оценки 15/15 и 6/15, соответственно.

Искусственное заражение цыплят, проведенное через 21 сутки после прививки, показало, что во всех подопытных группах, вакцинные препараты обеспечили абсолютный протективный эффект от инфекции вирулентного штамма гомологичного вируса. Заболеваемость и летальность в контрольной группе составили оценки 15/15 и 5/15, соответственно.

Был сделан вывод, что через 14 суток после прививки полиштаммная вирусвакцина против ИББ на основе смеси штаммов «Винтерфилд 2512» (в дозе 1000 ЭИД50) и «БГ» (в дозе 100 ЭИД50), способна обеспечить более быстрый протективный эффект, чем вирусвакцины из указанных штаммов, примененные в указанных дозах.

4.4 Разработка количественных показателей вирулентности штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни

Для проведения анализа вирусных штаммов по параметру вирулентности были приняты следующие положения:

- вирус как облигатный внутриклеточный паразит существует за счет ресурсов инфицированных клеток, провоцирует воспалительные процессы и нарушает гомеостаз организма-хозяина. Вирус всегда патогенен;

вирулентность является мерой патогенности возбудителя и характеризуется степенью нарушения гомеостаза организма-хозяина;

- в эксперименте признаками (показателями) вирулентности вируса служат следующие среднегрупповые оценки: заболеваемость (представительство особей, демонстрирующих клиническое проявление заболевания), летальность (доля летальных исходов болезни, подтвержденных результатами патологоанатомических исследований) и повреждающее

действие (средняя степень поражения бурсы как основного органа-мишени для возбудителя);

- все оценочные показатели вирулентности тестируемых штаммов выражаются как относительные величины от соответствующих оценок, установленных в группе положительного контроля, где использован штамм с известной (высокой) степенью патогенности;

- результирующей оценкой относительной вирулентности тестируемого штамма является совокупная величина, рассчитанная на основе перечисленных показателей.

4.4.1 Разработка относительного коэффициента атрофии бурсы

Если порядок вычисления показателей заболеваемости и летальности был достаточно очевиден, то для получения оценки повреждающего действия вируса считали необходимым провести специальное исследование.

За основу приняли широко известный показатель бурсального соотношения (Глик, 1956) или бурсальный индекс - отношение массы бурсы к массе тела птицы. Однако данная оценка не является универсальной, поскольку зависит от породы, возраста, пола и хозяйственного назначения птицы [32]. В связи с этим, считали целесообразным для характеристики реактогенности вируса расширить позицию оценивания и разработать показатель, который включает индекс физиологической нормы органа (отрицательный контроль) и индекс органа, пораженного заведомо высоковирулентным вариантом вируса (положительный контроль). Кроме этого, считали необходимым определить на какой фазе воспалительного процесса различия степени поражения органа будут наиболее выражены.

В работе использовали следующие материалы вируса ИББ: штамм «Винтерфилд 2512» в дозе 1000 ЭИД50; штамма «БГ» в дозе 100 ЭИД50 и вирулентный штамм «52/70» в дозе 100 ЭИД50.

Эксперимент проводили на цыплятах кросса «Хайсекс белый», серонегативных к вирусу ИББ в возрасте 26-ти суток (100 голов). Птицы были

разделены по 25 голов на четыре группы (три подопытные и одна контрольная). Все группы содержали в изолированных боксах.

Инфицирование в подопытных группах птиц выполняли с помощью пипетки-дозатора путем принудительного выпаивания каждой птице 1 см3 вирусного материала, содержащего одну инфицирующую дозу. Контрольной группе птиц аналогичным способом в таком же объеме выпаивали буферный раствор.

В течение 16-ти суток после инфицирования (период эксперимента) во всех группах ежедневно проводили клинический осмотр птицы. Регистрировали признаки развития инфекционной бурсальной болезни и, с заданной периодичностью, отбирали по 3 птицы для бурсэктомии.

В хронологическом порядке было установлено:

- через 72 часа в группе «52/70» у 6-ти голов были отмечены первые клинические признаки, характерные для ИББ (угнетение, отказ от корма, взъерошенность перьевого покрова, диарея). В течение последующих 120 часов все цыплята данной группы были больны. В интервале 5-11 суток 7 голов (28%) погибло. При патологоанатомическом вскрытии у всех погибших птиц установлена активная фаза воспаления бурсы (гиперемия и отек). Улучшение состояния переболевших птиц наблюдали через 12 суток;

- в течение всего эксперимента в группах «Винтерфилд 2512» и «БГ», а также в группе «Контроль» каких-либо заметных признаков отклонения от нормы у птиц не обнаружено.

Для проведения бурсэктомии живых птиц отбирали в случайном порядке. У павших цыплят данную операцию проводили обязательно.

У каждой птицы, отобранной в заданный период времени, определяли ее собственный вес до вскрытия г) и вес извлеченной бурсы г).

Полученные результаты соответственно изучаемым штаммам вируса ИББ (группам птиц) в хронологическом порядке представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты определения веса цыплят (\¥о, г) и веса извлеченных бурс (\¥1, г) соответственно испытанному вирусному препарату и времени после инфицирования (сутки)

Сутки Штаммы вируса

Контроль* Винтерфилд 2512 БГ 52/70

Шо \У1 Шо \У1 Шо \У1 Шо \У1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2 91,8 0,32 80,5 0,23 110,4 0,45 96,5 0,34

105,4 0,35 89,3 0,25 71,6 0,24 80,6 0,22

79,1 0,22 96,7 0,39 72,4 0,25 122,8 0,51

3 108,7 0,46 78,7 0,30 103,2 0,31 92,1 0,30

90,1 0,26 81,5 0,42 94,0 0,39 91,6 0,45

132,3 0,49 61,7 0,15 86,7 0,32 99,8 0,44

4 82,0 0,23 107,2 0,51 113,1 0,56 89,1 0,30

103,1 0,46 114,9 0,34 95,6 0,44 142,9 0,66

91,5 0,30 122,1 0,38 117,5 0,40 106,3 0,65

5 113,4 0,41 100,2 0,38 90,5 0,38 106,1 0,34

104,1 0,38 105,5 0,49 109,5 0,46 73,6 0,33

120,6 0,40 116,4 0,54 88,2 0,19 109,5 0,33

6 109,5 0,41 114,2 0,55 87,0 0,20 96,6 0,30

106,5 0,44 117,6 0,49 103,6 0,30 100,2 0,24

117,2 0,42 110,3 0,38 118,0 0,26 119,2 0,50

7 131,3 0,53 112,8 0,45 123,4 0,29 111,3 0,54

125,9 0,46 129,2 0,42 131,8 0,52 102,3 0,27

139,9 0,73 116,3 0,43 104,0 0,37 130,1 0,33

10 137,0 0,44 210,1 0,47 168,3 0,32 189,1 0,23

131,4 0,33 218,9 0,71 169,7 0,20 179,4 0,23

14 229,3 0,91 221,8 0,43 188,0 0,31 240,2 0,20

211,4 0,91 201,0 0,49 178,0 0,26 253,0 0,23

213,8 0,84 171,0 0,52 220,3 0,34 200,0 0,19

16 240,0 0,80 199,6 0,38 250,6 0,29 245,9 0,25

241,4 1,13 240,6 0,65 247,20 0,38 182,0 0,15

Пояснения: * - инфицирование не проводили (здоровая птица)

На основании полученных первичных данных, для каждой птицы, соответственно группе и временному интервалу, по формуле (2) определяли величину бурсального индекса (В1):

В1 = ФМо, (2)

Для удобства проведения дальнейшего анализа значения В1 представляли в виде их десятичных логарифмов (^В1). Данные показатели

являлись отрицательными величинами, но всегда имели целую часть и не необходимое число значащих цифр после запятой.

Установленные в процессе эксперимента величины соответственно исследуемым штаммам вируса, в хронологическом порядке представлены в виде диаграмм на рисунке 7.

Диаграммы, приведенные на рисунке, демонстрируют результат воздействия вируса на орган-мишень в организме хозяина в опытных группах и в группах отрицательного и положительного контролей, полученные результаты позволяют сделать следующие заключения:

- в период 2-5 суток большинство оценок полученных у всех инфицированных птиц, указывают на увеличение массы бурсы. Вероятно, что данный период соответствовал активной фазе воспалительного процесса.

- в период 5-8 суток значения индексов во всех опытных группах заметно снизилось, что, вероятно, было обусловлено атрофическими процессами в тканях органа. При этом падение показателей было наиболее выражено для штаммов «52/70» и «БГ». Штамм «Винтерфилд 2512» обусловил меньшее снижение оценок

- диапазон 10-16 суток характеризовался видимой стабилизацией значений во всех опытных группах. Возможно, что в указанном диапазоне развитие постинфекционных атрофических процессов в тканях бурсы приостановилось.

Регрессионный анализ, проведенный во всех группах в диапазоне 7^-16 суток показал, что коэффициенты регрессии (к+т) оценок установленные в группах «Контроль», «Винтерфилд 2512», «БГ» и «52/70», образовали возрастающий ряд: -(0,003±0,007); -(0,014±0,004); -(0,038±0,007); -(0,067±0,008), соответственно.

Рисунок 7 - Логарифмические значения бурсальных индексов (^Ш), установленные у цыплят соответственно испытанному штамму вируса ИББ и времени после инфицирования (Сут), где: А - контроль (не инфицированные птицы); В -вирусвакцина из штамма «Винтерфилд 2512»; С - вирусвакцина из штамм «БГ»; Б - вирулентный штамм «52/70». Показаны: оценки индексов (0); средняя тенденция (непрерывная линия); регрессия индексов в диапазоне 7+16 суток (пунктир), регрессионный коэффициент и его стандартная ошибка (к±в)

В биологическом смысле это означало, что через 7 суток все исследуемые штаммы вируса болезни Гамборо обусловили достоверное (р<0,05) снижение массы бурсы. При этом коэффициенты к, характеризующие скорость потери массы, при взаимном сопоставлении, имели статистические различия (р<0,05). Атрофические процессы развивались более интенсивно при инфицировании птиц штаммом «52/70», при этом вирус штамма «Винтерфилд 2512» обусловил наименьшую скорость развития атрофии бурсы.

Анализировали период 10-16 суток после инфицирования птиц. Приняли, что относительными оценками повреждающего действия вируса на заданном интервале времени могут быть коэффициенты, вычисляемые по формуле (3):

R = (К+ - К-) - (S - К-), или R = (АК) - (S - К-), (3)

где: R - относительный (логарифмический) коэффициент атрофии бурсы; К+ -значение lgBI в группе, инфицированной вирулентным штаммом (положительный контроль); К" - значение lgBI в контрольной группе неинфицированных птиц (отрицательный контроль); S - значение lgBI в группе испытуемого вирусного материала.

Коэффициент R представляет собой логарифмическую величину доли атрофического эффекта вирулентного штамма, который может обусловить испытуемый штамм (на данном временном интервале, с учетом оценки отрицательного контроля). В свою очередь, значение antilg(R)=C показывает, насколько повреждающее действие испытуемого штамма приближается к вирулентному агенту (положительному контролю) или превышает его.

Используя оценки lgBI, установленные во всех группах птиц в период 10-16 суток после инфицирования, для штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» по формуле (3) получили соответствующие выборки R-коэффициентов.

Поскольку, при данных условиях постановки эксперимента, количество полученных R-показателей было небольшим, и корректно определить вид их распределений в выборках было невозможно, то дальнейший анализ проводили, используя непараметрические методы. Результирующие

показатели реактогенности определяли в виде выборочных медиан ("Я). Далее выборки объединяли, упорядочивали и устанавливали ранг (Ъ) каждого значения Я и средний ранг показателей данной выборки (Н). Полученные результаты приведены в таблице 5.

Приведенные в таблице 5 результирующие показатели реактогенности вирусвакцин из штаммов «Винтерфилд 2512» (I) и «БГ» (II) в виде медиан составили величины "^=(-0,403) и "Кц=(-0,206). В размерности долей полученные оценки имели вид "С1=апй^(-0,403)=0,395 и "Сц=апй^(-0,206)=0,622.

Таблица 5 - Относительные коэффициенты атрофии бурсы (Я*), установленные в период 10-16 суток после инфицирования птиц _штаммами «Винтерфилд 2512» и «БГ»_

Сут Бурсальные индексы В1) соответственно группам птиц Коэффициеь вирусвакци) 2512» (I) и «] 1ты Я соответственно дам из штаммов «Винтерфилд »Г» (II), а также их ранги (И)

Контроль (К") «Винтер. 2512» (I) «БГ» (II) «52/70» (К+) Я: Ь Яп Ь

10 -2,493 -2,650 -2,721 -2,915 -0,265 9 -0,194 12

10 -2,600 -2,489 -2,929 -2,892 -0,403 4 0,037 14

14 -2,401 -2,712 -2,783 -3,080 -0,367 5 -0,297 6

14 -2,366 -2,613 -2,835 -3,041 -0,428 3 -0,206 11

14 -2,406 -2,517 -2,812 -3,022 -0,505 2 -0,211 10

16 -2,477 -2,720 -2,937 -2,993 -0,272 7 -0,056 13

16 -2,330 -2,568 -2,813 -3,084 -0,516 1 -0,271 8

Результирующие оценки ("Я** и -0,403 4,43 -0,206 10,57

Примечания:

* - Я = (К+ - К") - (8 - К"), где: К+ - значение 1§В1 в группе,

инфицированной вирулентным штаммом (положительный контроль); К" - значение 1§В1 в контрольной группе неинфицированных птиц (отрицательный контроль); Б - значение 1§В1 в группе испытуемого штамма.

** - медиана выборки Л-коэффициентов; *** - значение среднего ранга выборки Л-коэффициентов.

Биологический смысл приведенных показателей состоял в том, что степень повреждающего действия вирусных материалов штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» относительно вирулентного варианта «52/70» составила 39,5% и 62,2%, соответственно.

Для сравнения повреждающего действия исследуемых штаммов использовали их средние ранги (Н). Определяли достоверность различий

показателей Н1=4,43 и Нц=10,57. Использовали метод, предложенный Миллером [43, с. 141], в соответствии с которым для двух выборок (к=2) вычисляли разность 2=| Н[-Нп и оператор с|= Далее,

используя табличные величины [43, с. 340], определяли вероятность (р) ошибки прогноза о том, что Н^Нц.

Установили, что величина д=|4,43-10,57|/(>/(2(2х7+1)/12))=3,88 соответствует табличному показателю вероятности, который находится в диапазоне 0,005<р<0,01. Это означало, что средние ранговые эквиваленты коэффициентов Я изучаемых штаммов, имеют различия. Вероятность ошибки прогноза составляет менее 1%.

Было сделано заключение, что материал штамма «БГ» обладал большим повреждающим действием, чем материал штамма «Винтерфилд 2512».

Полученные результаты позволили считать, что относительные коэффициенты атрофии бурсы ("Я), характеризующие повреждение органа в долях ("С=апй^ Я) от оценки атрофического эффекта контрольного штамма, могут быть использованы для сравнения штаммов вируса ИББ. В отношении вакцинных штаммов, у которых проявление клинических признаков заболевания и летальных эффектов исключается, оценки "Я или "С могут быть рассмотрены в качестве показателей их реактогенности.

4.4.2 Сравнение реактогенности штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ», а

также смеси данных штаммов

Использовали цыплят, выведенных из БРБ-яиц в возрасте 16-ти суток. Птицы были разделены на пять групп: по 18 голов отрицательный контроль (К"), положительный контроль (К+), и три подопытные группы («Винтер», «БГ» и «Смесь»), Все группы содержались в изолированных боксах.

Эксперимент был построен по аналогии с предыдущим опытом. Изучаемые штаммы вируса испытывали в следующих дозах (ЭИД50): «Винтерфилд 2512» - 1000; «БГ», - 100; штамм «52/70» - 100. Один прививной объем смешанного препарата содержал (ЭИД50): штамма «Винтерфилд 2512» - 1000 и штамма «БГ» - 100. Вирусный материал вводили орально, с помощью

пипетки-дозатора в объеме 1 см3. Контрольной группе птиц аналогичным способом в таком же объеме выпаивали буферный раствор.

Продолжительность эксперимента составила 12 суток. Два раза в сутки у птиц проводили клинический осмотр. Характерные признаки ИББ наблюдали в группе «К+», где на 4-е сутки все птицы были больны и в течение последующих 7 суток 6 из 18 (33%) цыплят погибли. При патологоанатомическом вскрытии у всех погибших цыплят присутствовали выраженные признаки гиперемии и отека бурсы. В остальных группах клинических признаков ИББ не наблюдали.

Через 12 суток после инфицирования (на фазе развития атрофического процесса) всех оставшихся птиц подвергли эвтаназии. Далее во всех группах определяли показатели В выборках контрольных групп вычисляли

медианы, значения которых составили: 'К" = - 2,451 (п=11) и 'К+ = -2,954 (п=18).

В подопытных группах отдельно для каждой птицы на основании индекса а также значений 'К" и 'К+, по формуле (3) вычисляли Я-

коэффициент. Поскольку медианы контрольных выборок были постоянными величинами, то формулаЯ= ((-2,954) - (-2,451) - (^В1 - (-2,451)) была упрощена и приобрела вид Я= (-2,954)-^В1. Полученные результаты приведены в таблице 6.

Из данных таблицы 6 следует, что повреждающее действие тестируемых вирусных препаратов было не одинаково. Материал штамма «БГ», имеющий показатель "С«бг»=0,640, с высокой достоверностью (|3= (1-р)хЮ0 » 99,9%) был более реактогенен, чем материал штамма «Винтерфилд 2512», который продемонстрировал оценку "С«винтерфилД 2512»=0,399. Однако, присутствуя в составе смеси, в такой же дозе, штамм «БГ» снизил реактогенное действие. Показатель повреждающего эффекта смеси "С«смесь» = 0,492 был близок к средней величине между соответствующими оценками, которые были установлены отдельно для составляющих штаммов.

Таблица 6 - Оценки реактогенности штаммов «Винтерфилд 2512», «БГ» и полиштаммного препарата

Относительные коэффициенты атрофии бурсы (К*), установленные

соответственно испытанным вирусным материалам

Материал: шт. «Винтерфилд 2512» шт. «БГ» Полиштаммный препарат

-0,266 ** 31 -0,192 42 -0,474 8

-0,267 30 -0,201 39 -0,300 26

-0,340 21 0,051 54 -0,395 17

-0,393 18 -0,283 29 -0,498 6

-0,505 5 -0,116 46 -0,366 20

-0,524 3 -0,196 41 -0,054 51

-0,566 1 -0,293 27 -0,431 11

-0,313 24 -0,550 2 -0,112 48

Я -0,431 11 -0,168 43 -0,405 15

-0,512 4 -0,051 52 -0,018 53

-0,420 14 -0,220 37 -0,431 11

-0,493 7 -0,198 40 -0,255 33,5

-0,286 28 -0,102 49 -0,255 33,5

-0,329 22 -0,159 45 -0,241 35

-0,441 9 -0,114 47 -0,161 44

-0,403 16 -0,098 50 -0,266 32

-0,388 19 -0,306 25 -0,428 13

-0,215 38 -0,221 36 -0,315 23

« А А - 0,398 [-(0,441)-н-0,313)] -0,194 [(-0,221)"к-0,114)] -0,308 [(-0,428)-н(-0,255)]

"С = апй^ "Ы 0,399 [0,362 -н 0,486] 0,640 [0,601-ю,769] 0,492 [0,373- 0,556]

Результаты сравнительного анализа тестируемых материалов (сравнение

средних значений рангов)

шт. «Винтерфилд 2512» (I) шт. «БГ» (II) Полиштаммный препарат

16,67## 39,11 26,72

1(16,67) - р « 0,001### 0,1<р

II (39,11) - - 0,025<р<0,05

Примечания:

* - Я = (К+ - К") - (Б - К"), где: К+ - медиана выборки I в положительном

контроле (п=11); К" - медиана выборки I в отрицательном контроле (п=18); Б - значение 1§В1 в группе испытуемого штамма (п=18); ** - значение Я-коэффициента и его ранг (Ъ) в объединенной выборке всех Я-коэффициентов, установленных в подопытных группах (подстрочный шрифт); ***- "Я - медиана выборки Я-коэффициентов в данной подопытной группе и границы соответствующего доверительного интервала для р=0,05 [21 с. 236];

# - использован метод множественных сравнений Миллера [ 43 с. 142.]; ## - средний ранг (Н=^Ь/п) Я-коэффициентов данной подопытной группы;

### вероятность ошибки прогноза о том, что Н17ЗД2 для данной позиции сопоставления средних рангов (Н1 и Нг).

Достоверность отклонения показателя "С«смесь» от С«бг», составила величину (3 >95%. Статистических различий между показателями повреждающего действия штамма «Винтерфилд 2512» и смешанного препарата в данном эксперименте установлено не было.

4.4.3 Оценка показателей относительной вирулентности полевых изолятов вируса ИББ, образцов коммерческих вакцин, вакцинных штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ», а также смеси указанных штаммов Целью данного этапа исследований была проверка практической пригодности принятой методики определения относительной вирулентности штаммов вируса ИББ, имеющих различное происхождение.

Вирусные изоляты, доставлены из птицефабрик в виде замороженных образцов ткани бурс, изъятых от клинически больных и/или погибших цыплят. Наличие генома вируса ИББ в образцах ткани бурс было установлено в ПЦР в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ». Наименования изолятов и соответствующие эпизоотологические справки приведены в таблице 7.

Таблица 7 - Наименования изолятов и условия их выделения

Обозначение изолята Регион выделения и эпизоотическая ситуация

г/ЬиЬ Кировская обл. Птицефабрика яичного направления. Эпизоотическая ситуация: - у птиц в возрасте 25-35 суток наблюдали превышение технологических норм падежа (от 3,5 до 5,7 % в месяц); - видимых клинических признаков ИББ не установлено: - при патологоанатомическом вскрытии у части птиц обнаружены кровоизлияния на мышцах бедер и воспаление бурсы.

С/Маг Республика Марий Эл. Птицефабрика яичного направления. Эпизоотическая ситуация не известна.

Б/А^ Кировская обл. Птицефабрика яичного направления. Эпизоотическая ситуация: - у птиц в возрасте 32-34 суток наблюдали превышение технологических норм падежа (до 0,8 % за месяц); - видимых клинических признаков ИББ не установлено; - при патологоанатомическом вскрытии у части птиц обнаружены признаки воспаления бурсы.

Вирусные изоляты освежали на СПФ-цыплятах. Из исходных образцов биоматериала на физиологическом растворе готовили гомогенаты (20 %), которые осветляли центрифугированием (1000g). Далее материалы пропускали через бактериальный фильтр (0,22 мкм) и вводили цыплятам, перорально в объеме 1 см3. В интервале 72^-96 часов после инфицирования цыплят подвергали эвтаназии и извлекали бурсы, которые, в виде тканевого гомогената, использовали для исследований.

В испытаниях участвовали два образца коммерческих живых вакцин против ИББ. Препараты были условно обозначены как «San» и «Hip» и применены для иммунизации в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Кроме этого, были испытаны штаммы «Винтерфилд 2512», «БГ» и смесь данных штаммов. Положительным контролем являлся штамм «52/70»

В качестве подопытных птиц в эксперименты использовали СПФ-цыплят (выведенных из СПФ-яиц) в возрасте 25 суток. Для испытания каждого вирусного материала образовали отдельные группы птиц по 15 голов (п=15), которые содержали в изолированных боксах. Отрицательным контролем являлась группа интактных птиц.

Порядок проведения испытаний полностью соответствовал методике, описанной в предыдущем опыте (4.4.1). В течение эксперимента (12 суток) во всех группах птиц два раза в сутки проводили клинические наблюдения, регистрировали клиническое проявление ИББ (заболеваемость) и специфическую гибель птиц (летальность). По завершению опыта у выживших птиц оценивали повреждающее действие вируса (атрофию бурсы).

Для каждого тестируемого изолята (j) по формуле (4) определяли показатель относительной заболеваемости ("Ij).

•% = (^-Г)/(1+-Г), (4)

где: Ij - заболеваемость в j-той группе и в группах положительного (+) и отрицательного (-) контролей; 1=С1/п, где С1 - число клинически больных птиц, установленное в данной группе в течение эксперимента.

По аналогии с оценкой в подопытных группах по формуле (5) определяли показатели относительной летальности ("1^).

•Ъ^(ЬГЬ")/(Ь+-Ь"), (5)

где: Ь, - летальность в ¡-той и в контрольных группах; Ь=М/п, где М - число птиц, павших в данной группе в течение эксперимента.

Через 12 суток после инфицирования во всех группах провели эвтаназию птиц и извлечение бурс.

В контрольных группах, соответственно 'п-числу птиц, сохранившихся на дату завершения эксперимента, вычислили средние логарифмические оценки индексов ('К=(Х^в1)/'п) и получали величины 'К+и'К . В подопытных группах для каждой птицы по формуле (3) определяли оценку Я. Соответственно группам (]) получали выборки указанных значений, оценивали «нормальность» распределения переменных в выборках, определяли средние логарифмические величины = (ХкУ'11]) и

относительные коэффициенты атрофии бурсы ("С^ = апй^ "1^). Полученные в ходе проведенных испытаний показатели вирулентности вирусных материалов приведены в таблице 8.

Таблица 8 - Показатели вирулентности*, установленные соответственно испытанных штаммов вируса ИББ

1 2 3 4 5

Отрицат. контроль (К", интактные птицы) Положит, контроль (К+, шт. 52/70) Изолят «ХИмЪ » Изолят «О/Маг» Изолят «8/А§г»

1=0/15 1+=15/15 1=15/15 1=15/15 1=5/15

"1=1/1=1 "1=1/1=1 "1=1/1=0,333

Ь"=0/15 Ь+=6/15 Ь=1/15 Ь=2/15 Ь=0/15

"Ь=Ь/Ь+=0,167 "Ь=Ь/Ь+=0,333 "Ь=Ь/Ь+=0

\Уо \У| 1ёШ** \Уо \У| 1ёВ1 Wo \Уо \У| Я \Уо \У| Я

98,3 0,324 -2,482 64,4 0,072 -2,952 101,3 0,122 -0,098 83,6 0,115 -0,155 94 0,194 -0,332

97,6 0,338 -2,461 97,8 0,073 -3,127 91,1 0,119 -0,133 86,9 0,095 -0,056 119,4 0,107 0,031

94,1 0,205 -2,662 119,1 0,132 -2,955 103,2 0,158 -0,202 95,2 0,116 -0,103 113,9 0,098 0,048

95 0,292 -2,512 85,1 0,086 -2,995 89,7 0,159 -0,266 98,4 0,104 -0,041 98,7 0,200 -0,324

103,13 0,38 -2,434 77,9 0,077 -3,005 99,5 0,142 -0,171 94,2 0,131 -0,160 115,3 0,299 -0,431

96,4 0,338 -2,455 88,9 0,087 -3,009 119,2 0,184 -0,206 106,7 0,125 -0,086 69 0,267 -0,605

103,1 0,318 -2,511 100,1 0,071 -3,149 109,1 0,177 -0,227 80,2 0,104 -0,130 92,4 0,219 -0,392

78,7 0,182 -2,636 96,1 0,096 -3,000 84,1 0,119 -0,168 105,7 0,099 0,011 110,6 0,302 -0,453

98,5 0,437 -2,353 89,1 0,098 -2,959 93,9 0,134 -0,171 68,9 0,066 0,002 109,9 0,356 -0,527

109,4 0,35 -2,495 95,4 0,166 -0,258 99,8 0,078 0,090 103,4 0,165 -0,220

96,1 0,468 -2,312 112,8 0,187 -0,237 104,6 0,141 -0,147 106,8 0,137 -0,125

84,1 0,261 -2,508 94 0,139 -0,187 95,8 0,099 -0,031 101,3 0,097 0,002

101,6 0,344 -2,470 99,9 0,141 -0,167 83,7 0,079 0,008 113,3 0,092 0,073

97,5 0,362 -2,430 101,5 0,168 -0,236 99,4 0,124 -0,113

101,1 0,408 -2,394 119,4 0,201 -0,243

Ср. значение# -2,474 -3,017 -0,195 -0,061 -0,241

§## 0,092 0,072 0,048 0,077 0,220

д### 3,822 2,721 3,524 3,247 3,080

"С = апШо§ ("Я)#### 0,638 0,869 0,574

Вакцина «Бап» Вакцина «Ир» шт. «Винтерфилд 2512» шт. «БГ» смесь шт «Винт.» + «БГ»

1=0/15 1=0/15 1=0/15 1=0/15 1=0/15

"1=1/1=0 "1=1/1+=0 "1=1/1+=0 "1=1/1=0 "1=1/1=0

1 2 3 4 5

Ь=0/15 Ь=0/15 Ь=0/15 Ь=0/15 Ь=0/15

Продолжение таблицы 8 - Показатели вирулентности*, установленные соответственно испытанных штаммов

вируса ИББ

с ъ=ь/ь+=о с ъ=ь/ь+=о с ъ=ь/ь+=о с ъ=ь/ь+=о с ъ=ь/ь+=о

\Уо Я \Уо \У| Я \Уо \У| Я \Уо \У| Я \Уо \У| Я

108,5 0,268 -0,410 69 0,167 -0,401 107 0,192 -0,271 120 0,208 -0,256 117,7 0,202 -0,252

92,1 0,267 -0,479 92,4 0,219 -0,392 117,8 0,385 -0,531 99 0,22 -0,364 129,6 0,404 -0,511

106,1 0,228 -0,349 110,6 0,22 -0,316 109,3 0,201 -0,282 103 0,204 -0,314 120,2 0,211 -0,430

118,7 0,297 -0,415 109,9 0,256 -0,384 110 0,481 -0,658 118,1 0,144 -0,103 97,2 0,254 -0,434

95,3 0,247 -0,431 103,4 0,265 -0,426 107 0,414 -0,605 155,3 0,37 -0,394 119,4 0,297 -0,413

117,1 0,307 -0,436 106,8 0,162 -0,198 98,7 0,14 -0,169 136,8 0,287 -0,339 108,2 0,269 -0,413

106,1 0,264 -0,413 101,3 0,197 -0,306 117 0,123 -0,039 144,5 0,355 -0,407 113,6 0,110 -0,273

105,2 0,308 -0,484 113,3 0,292 -0,428 108,5 0,228 -0,340 109 0,31 -0,471 121,0 0,505 -0,638

107 0,297 -0,460 99,4 0,224 -0,370 92,1 0,217 -0,389 120 0,208 -0,256 116,6 0,435 -0,589

117,8 0,285 -0,401 119,4 0,301 -0,419 106,1 0,428 -0,623 99 0,22 -0,364 107,6 0,144 -0,144

109,3 0,211 -0,303 94 0,214 -0,374 118,7 0,397 -0,541 103 0,272 -0,439 127,5 0,127 -0,015

110 0,381 -0,557 119,4 0,247 -0,333 95,3 0,247 -0,431 118,1 0,209 -0,265 118,3 0,112 0,007

107 0,214 -0,318 113,9 0,178 -0,211 117,1 0,47 -0,621 109 0,31 -0,471 100,4 0,224 -0,366

98,7 0,24 -0,403 98,7 0,153 -0,207 106,1 0,264 -0,413 150,3 0,297 -0,313 108,2 0,310 -0,474

117 0,323 -0,458 115,3 0,399 -0,556 105,2 0,108 -0,028 142,3 0,286 -0,320 121,1 0,409 -0,546

Ср. значение# -0,421 -0,355 -0,396 -0,338 -0,366

Б ## 0,065 0,097 0,207 0,096 0,195

д### 3,890 3,697 3,037 3,813 3,298

"с = сщтм 0,379 0,442 0,402 0,459 0,431

Примечания:

*

** ***

подробное описание показателей даны в тексте; логарифм бурсального индекса: 1§В1 =1§(\У1/\Уо);

относительный коэффициент атрофии бурсы: Я= (-3,017)-1§В1, где (-3,017) - ср. знач. выборки 1§В1 положит, контроля; # - среднее значение выборки вида Х=Ех/п; ## - стандартное отклонение выборки вида 8=л/(0/(п-1)), где <3=(ЕХ2М(Ех)2/п); ### - оператор для проверки «нормальности» распределения выборочных переменных: А=(хмах - хмш)/8. Для всех выборок на уровне р=0,05 условие АР"<А< Ар+, где Ар" и Ар+ критериальные (табличные) значения, выполнялось [21, с.299]; #### - относительный повреждающий коэффициент вируса.

Представленные в таблице 8 показатели "I, "Ь и "С считали количественными характеристиками вирулентности штаммов вируса ИББ. При этом указанные величины рассматривали как взаимодополняющие и использовали их для вычисления комплексных оценок ("V, %). Соответствующие расчеты выполняли по формуле (6).

= (('%+ "Ь] +"С0/3) х 100. (6)

Величина представляет собой условную долю патологических изменений в организме птицы, которые произошли в связи с развитием заведомо патогенного вируса в положительном контроле.

В таблице 9 приведен расчет результирующих оценок относительной вирулентности инфекционных материалов, содержащих вирус ИББ.

Таблица 9 - Оценки относительной вирулентности ("V, %) испытанных инфекционных материалов, содержащих вирус ИББ

Образцы вируса (j) "Vj = (("Ij + "Lj +"Cj)/3) x 100

"I "L "С "V, %

Изолят «Z/Lub» 1 0,167 0,638 60,1

Изолят «G/Mar» 1 0,333 0,869 73,4

Изолят «S/Agr» 0,333 0 0,574 30,2

Вакцина «San» 0 0 0,379 12,6

Вакцина «Hip» 0 0 0,442 14,7

шт. «Винтерфилд 2512» 0 0 0,402 13,4

шт. «БГ» 0 0 0,459 15,3

Вакцина «Гамборомикс» 0 0 0,431 14,3

Примечания:

"I - показатель относительной инфекционности: "Щ = (1] - I )/(1+ - I ), где: 1] -заболеваемость в]-той группе и в группах отрицательного (-) и положительного (+) контролей; 1=С1/п; С1 - количество клинически больных особей, установленное в данной группе из п-числа птиц в течение эксперимента; I =0/15; 1+=15/15;

"Ь - показатель относительной летальности: "Ц = (Ц - Ь )/(Ь+ - Ь ), где: Ц -летальность в ]-той и в группах отрицательного (-) и положительного (+) контролей; Ь=М/п; М - количество особей, павших в данной группе из п-числа птиц в течение эксперимента; Ь =0/15; Ь+=6/15;

"С - относительный коэффициент атрофии бурсы: "С^ = апШ§ "1^; "Р^КК-К )-(8]-К ), где: К и К+ средние оценки I в группах отрицательного (-) и положительного (+) контролей; Б] -значение 1§В1 у птиц, инфицированных тестируемым вирусным материалом (]);

В1= \У1/\Уо; - масса бурсы; \Уо - масса цыпленка; К"=(-2,474); К+=(-3,017)

Из данных таблицы 9 следует, что полученные соответственно тестируемых вирусных материалов оценки "V имели очевидные различия. Это свидетельствует о том, что фенотипы исследуемых вирусных популяций по параметру вирулентности были не одинаковы. Наибольшую оценку вирулентности имел изолят О/Маг ("Уо/маг = 73,4%). Далее следовали изоляты ZILWo ("У/./1,ць = 60,1%) и БМ^г ("Уба^г = 30,2%). Все вакцинные варианты вируса имели приближенно одинаковые оценки, которые находились в интервале от "УБг = 15,3% до "УвинтеРфилд2512= 13,4%.

Предложенная система оценки относительной вирулентности позволила количественно охарактеризовать фенотипы исследуемых штаммов и пригодна для сравнения инфекционных вирусных материалов.

4.5 Определение порогового титра трансовариальных антител, при котором полиштаммная вирусвакцина способна вызывать активную

иммунную реакцию птицы

Исследовали развитие активной поствакцинальной гуморальной иммунной реакции на фоне пассивного иммунитета птиц. У птицы, обладающей материнским иммунитетом, показателем развития активного иммунитета считали величину прироста титра сывороточных антител. Определяли величину порогового титра трансовариальных антител, который способен преодолеть вакцинный вирус.

В эксперименте использовали односуточных цыплят кросса «Хай-Лайн», обладающих трансовариальными антителами к вирусу ИББ. Сформировали три опытные группы птиц (по 15 голов в каждой, где каждую особь индивидуально промаркировали) и одну контрольную группу (8 голов). Группы содержали в изолированных боксах.

Вакцинацию проводили по группам птиц через заданные интервалы времени. Группы обозначили соответственно возрасту птиц в сутках (1), когда они были вакцинированы: 5; 13; 26. Контрольную группу (К) не вакцинировали.

Птиц прививали полиштаммной вирусвакциной, содержащей в одной прививной дозе 1000 ЭИД50 штамма «Винтерфилд 2512» и 100 ЭИД50 штамма «БГ». Препарат принудительно выпаивали в объеме 1 см3 пипеткой-дозатором.

В каждой возрастной группе определяли титр сывороточных антител до вакцинации (Тол), то есть титр трансовариальных (пассивных) антител на день прививки и, далее, через 14 суток - титр активных антител (Тмл).

В контрольной группе отбор проб сывороток производили в последний день эксперимента (возраст птиц 47 суток).

Полученные результаты представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Титры трансовариальных антител (Тол) и титры антител (Тш), установленные через 14 суток после прививки полиштаммной вирусвакциной, соответственно возрасту птиц (1)

Возраст птиц 0, сут) ^Тол ^ Т14Л

1 2 3

3,468 2,442

3,148 2,712

3,300 2,089

3,872 2,888

2,928 2,182

2,908 2,648

5 3,337 3,001

3,261 2,928

3,371 2,966

3,300 2,908

3,300 2,442

3,759 3,065

3,653 3,474

3,379 2,648

3,474 3,065

3,364 (0,069) 2,764(0,095)

кг**,% 7,6 13,2

3,230 3,719

3,379 3,740

1,829 3,648

13 2,866 3,715

2,182 3,653

3,261 3,577

3,531 3,648

2,866 3,572

Продолжение таблицы 10 - Титры трансовариальных антител (ТОЛ)

и титры антител (Т14Л), установленные через 14 суток после

прививки полиштаммнои вирусвакцинои, соответственно возрасту

птиц (1)

2,535 3,639

3,362 3,604

2,712 3,698

3,230 3,525

3,281 3,543

2,908 3,759

2,948 3,566

2,941 (0,122) 3,640 (0,019)

КУ,% 12,2 1,9

26 2,328 3,759

2,820 3,609

2,442 3,513

2,535 3,531

2,843 3,555

3,034 3,681

3,172 3,624

2,328 3,663

2,576 3,634

2,613 3,814

2,491 3,723

2,648 3,824

2,182 3,672

2,681 3,619

3,050 3,707

'ЫТ2б(±*) 2,650 (0,074) 3,662 (0,024)

КУ,% 10,9 2,6

контроль (47)*** 2,491 -

2,328 -

1,829 -

2,089 -

2,491 -

2,576 -

2,388 -

2,535 -

'ЫТ47М 2,341 (0,047) -

КУ,% 11,0 -

Примечания:

* - '1§Т - среднее значение; в скобках дана стандартная ошибка

измерения: $=л1((^/(п-1)хп), где: 0 = (1('1ёт)2) - (1с^т))/п; п - объем выборки;

** - КУ - коэффициент вариации выборки: КУ= (8/'1§Т)х 100), где:8-стандартное отклонение выборки: 8=а/((3/(п-1)); *** - птицы не вакцинировались (в скобках указан возраст птиц в сутках).

Исследовали хронологические изменения титров трансовариальных антител. Строили модель связи между возрастом птицы в сутках (независимый параметр) и оценками титра трансовариальных антител (зависимый параметр). С целью приближения модели к линейному виду, в качестве единицы измерения независимого параметра приняли логарифм возраста цыплят в сутках (Ь = суток). Полученные результаты в графическом виде представлены на рисунке 8.

вирусу ИББ, установленных соответственно возрасту птиц (Ь=1»(сут))

Показана регрессионная модель вида = (-1,040)Ь+4,098, где: -ожидаемая

величина титра соответственно заданному значению Ь; (-1,040) - регрессионный коэффициент ((1§"То)/Ь); 4,098 - параметр положения линии регрессии по ординате.

Данные, представленные на рисунке 8, демонстрировали очевидную зависимость оценки ^То от величины Ь. В биологическом смысле это означало, что в логарифмических координатах между возрастом птиц и концентрацией трансовариальных антител присутствует выраженная линейная связь.

Соответствующий коэффициент корреляции составил величину Я=0,732. Оценка статистической неопределенности коэффициента имела вид

(V)

- К2)]/[^(п-2)]=0,065, (7)

По шкале Чеддока значение полученного коэффициента соответствовало нижней границе высокой степени детерминированности параметров.

По способу наименьших квадратов была построена регрессионная модель вида (8)

1ё"То = (-1,040)Ь+4,098, (8)

где: ^"То -ожидаемая величина титра соответственно заданному значению Ь; (-1,040) - регрессионный коэффициент ((^"То)/Ь); 4,098 - параметр положения линии регрессии по ординате.

Построенная модель (8) позволяла прогнозировать среднюю величину титра трансовариальных антител (^"То) соответственно возрасту цыплят до проведения вакцинации.

Определяли минимальный возраст цыплят, при котором происходил прирост показателя титра. С этой целью во всех подопытных группах по данным таблицы 11 вычисляли оценки прироста титра вида (9)

й = №4.Г \gTo.u (9)

Было установлено, следующее:

1 .У цыплят, привитых в возрасте 5 суток, где средний титр пассивных антител составлял величину ^'Т5.о=3,364±0,069, через 14 суток после вакцинации средняя величина прироста титра снизилась до отрицательного значения ('с15.14= - 0,600±0,082). Положение показателя 'сЬ.м в отрицательной области графика свидетельствовало о том, что в данном возрасте активная иммунная реакция у птиц отсутствовала.

2. У цыплят, привитых в возрасте 13 суток (^'Тхз о=2,941±0,122), через 14 суток показатель прироста составил положительное значение Сс11з.14= 0,699±0Д 18.

3. Вакцинация птиц в возрасте 26 суток (^'Т2б.о=2,650±0,074) показала, что через 14 суток оценка прироста измерялась значением 'сЬб.14= 1,012±0,080.

Далее исследовали связь между логарифмическими показателями возраста птиц (Ь=1§(сут)) и установленными значениями <1. Строили соответствующую модель связи. Полученные результаты представлены в виде диаграммы на рисунке 9.

Рисунок 9 - Показатели отклонений (с1) титров антител соответственно возрасту цыплят, где (11 = ^Т14- ^ТО; Т14 - величина титра через 14 суток после прививки; ТО - титр трансовариальных антител; Ь =

^(сутки)

Показана регрессионная модель вида "с! = 2,305Ь-2,110, где: "с1 -ожидаемая величина отклонения титра соответственно заданному значению Ь; 2,305 - регрессионный коэффициент ("с1/Ь); 2,110 - параметр положения линии регрессии по ординате.

Представленные на рисунке 7 данные демонстрировали выраженную зависимость показателя (1 от величины Ь, то есть возраст птиц значимо влиял

на величину отклонения титра антител после прививки полиштаммным

препаратом. Коэффициент корреляции составил R±s = 0,857±0,128, что свидетельствовало о высокой положительной связи исследуемых параметров.

На этом основании считали возможным для дальнейшего анализа использовать построенное регрессионное уравнение (10):

"d = 2,305L-2,110, (10)

где: "d -ожидаемая величина отклонения титра соответственно заданному значению L; 2,305 - регрессионный коэффициент ("d/L); 2,110 -ордината линии регрессии.

Уравнение (10) позволило определить ожидаемый возраст птицы (antilg("L)), после которого показатель отклонения титра приобретает положительное значение (т.е. "d > 0). Искомая величина численно соответствовала точке пересечения оси абсцисс и построенной линии регрессии. Соответствующее значение составило "L = 2,110/2,305 = 0,915, или antilg("L) = 8,23 суток. Полученная оценка была рассмотрена как минимальный ожидаемый возраст птицы, при котором на фоне трансовариального иммунитета была возможна активная иммунная реакция.

Далее, по уравнению (8), для использованного диагностического набора «Zoetis, USA» произвели расчет прогнозируемой величины порогового титра пассивных антител, при котором полиштаммная вирусвакцина способна у цыпленка индуцировать активную иммунную реакцию. Искомая величина составила lg"T0 = (-1,040)0,915+4,098 = 3,146, или "Т0 = antilg 3,146 = 1400. Статистическая неопределенность полученной логарифмической оценки (стандартная ошибка модели) имела значение ±0,1 lg, что соответствовало положению прогнозируемой оценке титра в границах 1112 < "То < 1762.

4.6 Оценка иммунодепрессивного действия полиштаммной вирусвакцины и составляющих ее штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» Исследовали иммунодепрессивный эффект, вызванный вирусвакцинами из штаммов «Винтерфилд 2512» и «БГ» вируса ИББ, а также полиштаммного препарата, являющегося смесью указанных штаммов.

В эксперименте использовали серонегативных к вирусу ИББ и к вирусу ньюкаслской болезни (НБ) цыплят кросса «Хайсекс белый» в возрасте 16-ти суток.

Изучаемые штаммы вируса испытывали в следующих дозах (ЭИД50): «Винтерфилд 2512» - 1000; «БГ» - 100. Одна доза полиштаммного препарата содержала (ЭИД50): штамма «Винтерфилд 2512» - 1000 и штамма «БГ» - 100.

Подопытных птиц разделили на четыре группы по 15 голов (п=15). Вирусный материал вводили орально, с помощью пипетки-дозатора в объеме 1 см3. Контрольной группе птиц аналогичным способом в таком же объеме выпаивали буферный раствор.

Через 21 сутки после прививки у птиц определяли титр сывороточных антител к вирусу ИББ как показатель результативности иммунизации. Медианы выборок логарифмических оценок титров, установленные соответственно подопытным группам «Винтерфилд 2512», «БГ», «Полиштаммный препарат» и «Контроль», составили значения (в скобках указаны антилогарифмы): 3,323 (2104); 3,471 (2958); 3,419 (2624); и 2,205 (160). Это означало, что во всех подопытных группах вакцинный вирус обусловил полноценный иммунный ответ. Контрольная группа иммунитетом к вирусу ИББ не обладала.

Исследование иммунодепрессивного действия вакцинных штаммов ИББ проводили согласно «Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» [111]. Согласно принятому положению показателем эффекта иммунодепрессии в результате воздействия вируса ИББ является снижение гуморальной иммунной реакции птицы на вакцину против болезни Ньюкасла.

Через 21 сутки после прививки вирусвакцинами против ИББ все птицы в подопытных и в контрольной группах были вакцинированы против болезни Ньюкасла (БН). Использовали вакцину из штамма «Ла-Сота» в дозе 6,7 ЭИД50, интраназально (в соответствии с инструкцией по применению препарата).